I. Wprowadzenie RasMol jest programem stworzonym do wizualizacji białek, kwasów nukleinowych i małych cząstek. Jest to program darmowy, dostępny na stronie: http://www.umass.edu/microbio/rasmol/getras.htm Struktury przestrzenne białek i kwasów nukleinowych pochodzą z badań krystalograficznych (rentgenografia i NMR). Krystalografia jest obecnie wiodącą metodą poznawania struktury przestrzennej makromolekuł. Krystalizowane są nie tylko pojedyncze białka, ale także ich kompleksy, kwasy nukleinowe a nawet tak złożone twory jak rybosomy czy wirusy. Wszystkie opublikowane struktury krystalograficzne gromadzone są w wyspecjalizowanej bazie danych PDB (Protein Data Bank) i są powszechnie dostępne na stronie: http://www.rcsb.org/pdb/ Informacja o strukturze przestrzennej dostarcza biologom molekularnym wielu cennych danych na temat mechanizmów działania enzymów, ich regulacji i oddziaływań z innymi białkami. Wszystkie te dane, poza celami poznawczymi, pozwalają na tworzenie za pomocą inżynierii genetycznej enzymów o nowych aktywnościach czy innych właściwościach biologicznych, a także projektowanie wysoce wyspecjalizowanych nowych leków. 1
II. Podstawy obsługi Aby uruchomić program RasMol, wystarczy dwukrotnie kliknąć lewym klawiszem myszy na ikonie: Rasmol.exe Po otwarciu programu pojawiają się dwa okna: - okno graficzne - okno tekstowe (które pojawia się zminimalizowane, czyli na pasku u dołu ekranu) 2
Okno tekstowe, służy bardziej zaawansowanym opcjom, dlatego też na początek przyjrzyjmy się oknu graficznemu. Główną jego częścią jest czarne pole, w którym pojawia się oglądana struktura. Ponad tym polem znajduje się główne menu (1), składające się z kilku części (File, Edit, Display, Colours, Options, Export oraz Help; wszystkie zostaną omówione później), z których każda, po kliknięciu lewym klawiszem myszy, ulega rozwinięciu. Po prawej stronie i u dołu okna są dwa suwaki (2), służące obracaniu struktury. 3
Aby oglądać strukturę, należy otworzyć plik z jej zapisem. Robimy to, klikając lewym klawiszem na menu File w menu głównym, a następnie na opcję Open... : Po wybraniu Open pojawi się okno, w którym wybieramy strukturę, którą chcemy oglądać. Należy przy tym pamiętać, w którym katalogu znajdują się struktury. 4
Klikając lewym klawiszem na wybraną strukturę, a następnie na przycisk Open w prawym dolnym rogu okna, powodujemy otwarcie pliku. Okno graficzne z otwartym plikiem wygląda na przykład tak: Można teraz oglądać strukturę z różnych stron, przesuwając suwakami, poprzez kliknięcie i przytrzymanie lewego klawisza myszy na którymś z nich. 5
Zamiast suwaków można posługiwać się myszą. Jest ona wygodniejsza i daje więcej możliwości: - kliknięcie i przytrzymanie lewego klawisza myszy na ekranie ze strukturą daje możliwość (poprzez przesuwanie myszy) obracania jej względem osi X i Y; - kliknięcie i przytrzymanie prawego klawisza myszy pozwala na przesuwanie całej struktury; - kliknięcie i przytrzymanie lewego klawisza myszy z jednoczesnym przytrzymaniem jednego z klawiszy Shift na klawiaturze umożliwia dokonywanie zbliżeń i oddaleń struktury; - kliknięcie i przytrzymanie prawego klawisza myszy z jednoczesnym przytrzymaniem klawisza Shift pozwala na obracanie struktury względem osi Z. UWAGA Jest możliwe otwarcie programu RasMol jednocześnie w kilku oknach. Aby tego dokonać, należy po prostu uruchomić program kilka razy. Pracować można tylko w jednym oknie jednocześnie w oknie aktywnym. Aby aktywować dowolne okno, wystarczy na nim kliknąć. 6
III. Opcje okna graficznego Menu główne daje dostęp do szeregu interesujących opcji, ułatwiających analizę struktury. Omówimy teraz pokrótce najważniejsze z nich. 1. Menu File Z tego menu już korzystaliśmy, aby otworzyć plik ze strukturą. Znajdują się tu także opcje Close (służy do zamykania otwartego pliku), Information (otwiera okienko z informacją o wprowadzonej strukturze) oraz Exit (powoduje zamknięcie programu). Bardzo przydatna może okazać się opcja Print, pozwalająca wydrukować widoczną w oknie strukturę. 2. Menu Edit 7
Z tego menu najważniejsza jest opcja Select All, powodująca wybranie wszystkich atomów struktury i pozwalająca na zmianę sposobu ich obrazowania. Wrócimy do tej opcji przy omawianiu okna tekstowego. 3. Menu Display Wszystkie opcje w tym menu dotyczą sposobów obrazowania struktury. Od modelu patyczkowego do wstęgowego. Najlepszym sposobem na ich poznanie jest klikanie kolejno na wszystkie opcje. 4. Menu Colours 8
Kolorowanie pozwala na uwidocznienie różnych detali struktury oraz uzyskanie wielu innych informacji zawartych w pliku. Opcje zawarte w menu okna graficznego dotyczą podstawowych, najczęściej stosowanych sposobów kolorowania. Więcej opcji związanych z kolorowaniem jest dostępnych za pośrednictwem okna tekstowego (zostaną one omówione później) Najważniejsze opcje w menu okna graficznego to: - Monochrome koloruje wszystkie wybrane atomy na jeden kolor; - CPK koloruje każdy pierwiastek na inny kolor, wg schematu: węgiel jasnoszary tlen czerwony wodór biały azot niebieski siarka żółty fosfor, żelazo pomarańczowy chlor zielony brom, cynk brązowy sód jasnoniebieski magnez ciemnozielony wapń ciemnoszary inne ciemnoróżowy - Shapely każdy aminokwas i nukleotyd ma inną barwę; - Group każdy łańcuch jest kolorowany stopniowo od niebieskiego, poprzez zielony, żółty i pomarańczowy aż do czerwonego; N-koniec polipeptydów i 5 -koniec kwasów nukleinowego jest czerwony; C-koniec polipeptydów i 3 -koniec kwasów nukleinowych jest niebieski (niektóre łańcuchy nie muszą obejmować pełnego spektrum); - Chain każdy łańcuch ma inny kolor; - Temperature określa zakres swobody drgań poszczególnych atomów; im cieplejszy kolor, tym większa możliwa oscylacja i odwrotnie; - Structure barwa odpowiada strukturze drugorzędowej białka; α- helisy są purpurowe, β-wstęgi żółte, zwroty jasno niebieskie, pozostałe pozycje białe. 9
5. Menu Options To menu zawiera dodatkowe opcje dotyczące wizualizacji struktury. Opcje Specular i Shadows (najlepiej widoczne przy włączonej opcji Spacefill w menu Display) odpowiadają za dodatkowe efekty optyczne (są one niestety dość kosztowne obliczeniowo i mogą spowodować znaczne spowolnienie pracy komputera). Opcje te mogą być przydatne przy tworzeniu efektownych rysunków. Slab Mode pozwala oglądać strukturę w przekroju. Płaszczyznę przekroju można zmieniać poprzez kliknięcie i przytrzymanie lewego klawisza myszy z jednoczesnym przytrzymaniem jednego z klawiszy Ctrl na klawiaturze. Stereo umożliwia oglądanie struktury w trybie stereoskopowym. Labels powoduje wyświetlenie przy każdym aminokwasie i nukleotydzie nazwy i pozycji (np. LYS385A oznacza lizynę znajdującą się w pozycji 385 łańcucha A). UWAGA: W tym menu wszystkie opcje są włączane (zaznaczane) do momentu ich wyłączenia (odznaczenia). 10
6. Menu Export Menu Export pozwala na zapisanie obrazu z okna graficznego jako pliku graficznego. Dostępnych jest kilka formatów, z których najpopularniejsze są BMP i GIF. Są to formaty czytane przez zdecydowaną większość programów graficznych. Po kliknięciu na wybrany format otwiera się okno zapisu, podobne jak podczas otwierania pliku. Także tu należy wybrać katalog, w którym chcemy zapisać rysunek, a ponadto w ramce na dole okna w polu File name: podać nazwę, jaką nadamy naszemu plikowi. 7. Menu Help To menu pozwala na przeczytanie informacji o danej wersji programu (About RasMol) a także uzyskanie dostępu do pełnej instrukcji w języku angielskim (User Manual). 11
IV. Opcje okna tekstowego Okno tekstowe, pomimo swej nieatrakcyjnej formy, jest niezwykle przydatne i daje znacznie większą kontrolę nad pracą programu. Daje dostęp do wszystkich opcji osiągalnych przez okno graficzne a także do wielu nowych. Należy pamiętać, że program RasMol zawsze otwiera oba okna: graficzne i tekstowe. Jednakże okno tekstowe może być od początku pracy programu zminimalizowane. Aby je odzyskać, wystarczy kliknąć lewym klawiszem myszy na ikonie programu (RasMol Command Line) na dole ekranu. Aby uaktywnić okno tekstowe, wystarczy kliknąć w jego obrębie lewym klawiszem myszy. Kiedy jest ono aktywne (znajduje się w nim migający kursor), można przystąpić do pracy. Użyteczną własnością okna tekstowego jest także wyświetlenie nazwy atomu, na który kliknięto lewym klawiszem myszy w oknie graficznym, co pozwala na szybką identyfikację interesującej grupy. Praca z oknem tekstowym polega na wpisywaniu odpowiednich komend (każdą komendę należy zakończyć wciśnięciem klawisza Enter na klawiaturze). W tej części pominiemy funkcje dostępne za pośrednictwem okna graficznego, a skupimy się na najważniejszych, specyficznych dla okna tekstowego. 12
1. Funkcja select Funkcja ta służy wybieraniu określonych partii struktury. Wpisanie tylko select lub select all działa podobnie jak wybranie Select All z menu Edit okna graficznego i powoduje wybranie wszystkich atomów struktury. Funkcji select towarzyszy zwykle określenie czego ma dotyczyć funkcja. Może to być dowolny aminokwas lub grupa aminokwasów. Obowiązują trzyliterowe skróty aminokwasów. Przykładowo wpisanie select ala powoduje wybranie wszystkich alanin występujących w strukturze (jeśli takie się w strukturze znajdują). Przy prawidłowym użyciu funkcji select na ekranie zostanie wyświetlony komunikat: x atoms selected!, gdzie x oznacza liczbę atomów wchodzących łącznie w skład wybranych aminokwasów. Jeśli nie został wybrany żaden aminokwas (co mogło być spowodowane brakiem aminokwasów danego typu w strukturze lub nieprawidłowo wpisanym poleceniem), pojawi się napis: No atoms selected!. Istnieją także inne określenia, umożliwiające selekcję różnego rodzaju aminokwasów lub innych cząsteczek. Poniżej zamieszczono najważniejsze z nich: amino neutral charged basic acidic nucleic at cg pyrimidine purine ligand cystine wszystkie aminokwasy aminokwasy neutralne aminokwasy naładowane aminokwasy zasadowe aminokwasy kwasowe kwasy nukleinowe pary AT w kwasach nukleinowych pary GC w kwasach nukleinowych pirymidyny puryny wszystkie ligandy mostki dwusiarczkowe 13
Należy pamiętać, że od momentu zastosowania tej funkcji dalszym przekształceniom będą ulegać tylko wybrane atomy. Niezależnie, czy będzie to zmiana koloru czy sposobu wyświetlania z menu Display. Aby ponownie manipulować wszystkimi atomami, należy wybrać opcję Select All z menu Edit lub wpisać select all w oknie tekstowym. 2. Funkcja color Jest to funkcja umożliwiająca kolorowanie wybranych atomów. Koloruje się atomy wybrane uprzednio za pomocą funkcji select. Na przykład: select neutral color blue Poniżej zamieszczamy dostępne kolory wraz z ich angielskimi nazwami: blue black cyan green greenblue magenta orange purple red redorange violet white yellow niebieski czarny błękitny zielony zielononiebieski ciemnofioletowy pomarańczowy purpurowy czerwony czerwono pomarańczowy fioletowy biały żółty 3. Funkcja hbonds Ta funkcja pozwala analizować wiązania wodorowe. Nie są one normalnie widoczne w strukturze. Wpisanie polecenia hbonds lub hbonds on powoduje wyświetlenie wiązań wodorowych w postaci przerywanych linii. Przy pierwszym wpisaniu tego polecenia w oknie tekstowym zostanie także wyświetlony komunikat o liczbie wiązań wodorowych występujących w strukturze. Wizualizację wiązań wodorowych wyłącza się poleceniem hbonds off. 14
Należy zwrócić uwagę, że przy włączonej opcji Spacefill w menu Display wiązania wodorowe nie będą widoczne. V. Ćwiczenia Na płycie znajduje się zestaw wybranych struktur. Poniżej zamieszczamy ich listę: Struktury drugorzędowe białek: beta kartka równoległa beta kartka antyrównoległa alfa helisa Białka: hemoglobina fragment Klenowa syntaza ATP EcoRV helikaza kolagen TATA binding protein glikozylaza DNA Kwasy nukleinowe: DNA trna Złożone kompleksy: nukleosom polimeraza RNA Wirusy: bakteriofag alfa 3 Vp2 parvowirus Przypominamy o możliwości pobrania innych struktur z bazy PDB za pośrednictwem Internetu. Poniżej prezentujemy kilka ćwiczeń możliwych do wykonania przy zastosowaniu programu RasMol. Oczywiście nie są to jedyne ćwiczenia, jakie można wykonać z zestawem struktur załączonych do płyty i powinny jedynie stanowić inspirację. 15
Niektóre ze struktur nie pojawiają się w proponowanych ćwiczeniach, są jednakże zamieszczone na płycie, gdyż pojawiają się w programie nauczania (np. hemoglobina, wirusy, nukleosom). 1. Struktury drugorzędowe białek W katalogu Struktury drugorzędowe białek znajdują się cztery pliki. W trzech z nich zapisane są pojedyncze struktury, wypreparowane z pełnych struktur białek. Czwarty zawiera zapis wszystkich tych struktur jednocześnie. Przebieg ćwiczenia: - otwórz w trzech oknach osobno pliki zawierające każdą ze struktur lub w jednym oknie plik ze wszystkimi strukturami; - za pomocą polecenia hbonds on włącz wizualizację wiązań wodorowych; - w celu łatwiejszej analizy zmień tryb wizualizacji w menu Display na Backbone, Sticks lub Ribbons; - przeanalizuj układ wiązań wodorowych w poszczególnych strukturach (ze szczególnym uwzględnieniem obu beta kartek) i ich wpływ na stabilność tych struktur; - w razie problemów z rozróżnieniem beta kartek włącz opcję Cartoons w menu Display. 2. Jak zbudowane jest białko globularne? Plik Glikozylaza DNA znajduje się w katalogu Bialka. Jest to typowe białko globularne, złożone z wewnętrznej beta kartki i peryferycznie rozmieszczonych alfa helis. Przebieg ćwiczenia: - otwórz plik ze strukturą; - wybierz reprezentację Spacefill z menu Display; - w oknie tekstowym wpisz kolejno komendy (po każdej wciskając klawisz Enter ): color blue, select hydrophobic, 16
color yellow; w efekcie wszystkie aminokwasy hydrofobowe mają barwę żółtą, pozostałe natomiast niebieską; - kliknij na Select All w menu Edit lub wpisz komendę select all w oknie tekstowym (aby wszystkie kolejne operacje dotyczyły wszystkich atomów); - używając opcji Slab Mode z menu Options przeanalizuj rozkład aminokwasów hydrofobowych i hydrofilowych w strukturze (kiedy opcja Slab Mode jest włączona, można zmieniać płaszczyznę przekroju ruszając myszką z jednocześnie wciśniętym lewym klawiszem i z wciśniętym klawiszem Ctrl na klawiaturze); - wyłącz opcję Slab Mode (nie powinno być przy niej zaznaczenia); - nie zmieniając ustawień kolorystycznych, włącz opcję Cartoons w menu Display; - obejrzyj strukturę w tej reprezentacji; przeanalizować hydrofobowość struktur drugorzędowych; - zmień reprezentację w menu Display na Wireframe; - wpisz w oknie tekstowym komendę select 168-181 (zaznacza aminokwasy o pozycjach w podanym zakresie; jest to jedna z helis); - wybierz reprezentację Ribbons z menu Display (jako model wstęgowy powinna być widoczna tylko wybrana helisa); - przeanalizuj rozkład aminokwasów hydrofobowych w wybranej helisie względem całego białka. 3. Syntaza ATP jako przykład białkowego kanału transbłonowego UWAGA: Struktura syntazy ATP obejmuje tylko węgle alfa, w związku z czym możliwe dla niej są tylko opcje Backbone i Spacefill z menu Display. 17
Przebieg ćwiczenia: - otwórz plik ze strukturą Syntaza ATP ; - włącz tryb Spacefill z menu Display; - w oknie tekstowym wpisz kolejno komendy (po każdej wciskając klawisz Enter ): color blue, select hydrophobic, color yellow; w efekcie wszystkie aminokwasy hydrofobowe mają barwę żółtą, pozostałe natomiast niebieską; - przeanalizuj rozmieszczenie aminokwasów hydofobowych w domenie katalitycznej i transbłonowej białka; - kliknij na Select All w menu Edit lub wpisz komendę select all w oknie tekstowym (aby wszystkie kolejne operacje dotyczyły wszystkich atomów); - w menu Colours wybierz opcję Chain (każdy łańcuch peptydowy będzie miał inny kolor) - zwróć uwagę na budowę domeny katalitycznej i transbłonowej oraz na liczbę łańcuchów wchodzących w skład każdej z nich. 4. Białko strukturalne na przykładzie kolagenu Przebieg ćwiczenia: - otwórz plik ze strukturą Kolagen ; - włącz opcję Monochrome z menu Colours oraz Backbone z menu Display; -przeanalizuj strukturę białka włóknistego; zwróć uwagę na różnice między białkiem włóknistym a globularnym; - w oknie tekstowym wpisz kolejno komendy: select gly i color green (wszystkie glicyny w strukturze zostaną pokolorowane na zielono); następnie wpisz select pro i color red (na czerwono zostaną pokolorowane proliny); - zwróć uwagę na częstość powtarzania się w łańcuchach wyszczególnionych aminokwasów (glicyna ma małą grupę 18
boczną; prolina wprowadza zmianę kierunku łańcucha peptydowego). 5. Białko oddziałujące z DNA Przebieg ćwiczenia: - otwórz plik ze strukturą TATA binding protein ; - wybierz reprezentację Spacefill z menu Display; - w oknie tekstowym wpisz kolejno komendy (po każdej wciskając klawisz Enter ): color blue, select hydrophobic, color yellow; w efekcie wszystkie aminokwasy hydrofobowe mają barwę żółtą, pozostałe natomiast niebieską; UWAGA: funkcja select hydrophobic nie obejmuje nukleotydów DNA - wpisz polecenia: select nucleic i color red; - w menu Display wybierz opcję Wireframe (ten tryb prezentacji nie przesłania widoku na strukturę białka, które powinno być w formie Spacefill); - zwróć uwagę jakie aminokwasy (hydrofobowe czy hydrofilowe) znajdują się na powierzchni oddziałującej z hydrofobowymi zasadami DNA, a jakie na powierzchni stykającej się z hydrofilowym szkieletem cukrowofosforanowym. 6. DNA Struktura DNA (a także trna) znajduje się na płycie w katalogu Kwasy nukleinowe. Przebieg ćwiczenia: - otwórz plik DNA ; - obejrzyj strukturę, korzystając z różnych opcji menu Display i wybierz ten typ wizualizacji, który ci najbardziej odpowiada; 19
- w oknie tekstowym wpisz kolejno komendy (po każdej wciskając klawisz Enter ): select pyrimidine, color red, select purine, color blue; puryny powinny być niebieskie, a pirymidyny czerwone; - wpisz komendę hbonds on w celu wizualizacji wiązań wodorowych; - wpisz komendy select at, color yellow,a następnie select cg, color green; pary zasad A-T zostaną pokolorowane na żółto, natomiast C-G na zielono; - przeanalizuj wiązania wodorowe w parach A-T i G-C. 7. Złożone kompleksy i wirusy W katalogach Zlozone kompleksy i Wirusy zawarte są struktury dużych kompleksów. Są to dość duże pliki, które mogą bardzo wolno działać na starszych komputerach. Z tego też względu nie poleca się włączania w ich przypadku opcji Specular i Shadows. Ze względu na stopień skomplikowania, struktury te nie zawsze nadają się do przeprowadzenia ćwiczeń analogicznych do tych zamieszczonych wyżej, są jednak bardzo interesujące i mogą posłużyć jako pomoce naukowe. 20