Dr n.przyr. Ewa Chmara CZYNNIKI GENETYCZNE WPŁYWAJĄCE NA DZIAŁANIE LEKÓW Farmakogenetyka - kerunek badań koncentrujący się na: - dziedzicznie uwarunkowanych różnicach w działaniu leku, a także ich przyczynach na poziomie molekularnym; - znaczeniu klinicznym zmienionego działania leku; - testach umożliwiających identyfikację zagrożonych pacjentów przed rozpoczęciem leczenia (terapia celowana); - poszukiwaniu genów oporności; - mutagennym działaniu leków i ksenobiotyków Głównym celem farmakogenetyki jest zapewnienie pomocy w podawaniu i dawkowaniu chorym takich leków, których stosowanie stwarza największe prawdopodobieństwo odniesienia korzyści terapeutycznych i najmniejsze prawdopodobieństwo wystąpienia reakcji niepożądanych. Farmakogenetyka wychodziła od nietypowej reakcji na lek, aby przez badanie fenotypu dotrzeć do odpowiedzialnej za tę reakcję mutacji genu. Farmakogenomika jest próbą odwrócenia podejścia do problemu odmienności osobniczych: Wychodzi od odkrytych wielu różnic genetycznych, takich jak liczne SNP, aby poprzez analizę DNA, RNA (transkryptomika) i powstającego białka (proteomika) dotrzeć do osobniczych reakcji będących sumą tych wszystkich czynników.
Efekt farmakologiczny zależy od: genetycznie uwarunkowanej aktywności enzymów metabolizujących leki (procesy I i II fazy biotransformacji) ekspresji genów kodujących białka biorące udział w mechanizmie działania leków (receptory, kanały jonowe, transportery neuroprzekaźników) ekspresji genów kodujących białka transporterów dla leków (gen ABCB1 kodujący glikoproteinę P) Procesy farmakokinetyczne determinowane genetycznie: 1. Wchłanianie 2. Dystrybucja 3. Metabolizm 4. Wydalanie Molekularne mechanizmy polimorfizmu genetycznego mogą polegać na: Mutacji pojedynczego nukleotydu SNP (Single Nucleotide Polymorphism) Mutacjach dotyczących całego genu, jego fragmentu, zwielokrotnienia, powtórzenia nukleotydu (haplotypy) Bazy danych NCBI NCBI (National Center for Biotechnology Information) bazy danych są ze sobą powiązane poprzez unikalny system wyszukiwania i pobierania, zwany Entrez: www.ncbi.nlm.nih.gov
BADANIE GENOTYPU Precyzyjna ocena, czy zaburzenie szybkości metabolizmu leków jest związane z defektem genetycznym, czy też wynikiem oddziaływania dodatkowych czynników niegenetycznych takich jak np.: Związana z wiekiem niedojrzałość enzymatyczna wątroby, Wiek, płeć, masa ciała, Ciąża Infekcja, choroba, stres Leki towarzyszące (interakcje) Zmienność dobowa i sezonowa Dieta, suplementy diety Czynność układu sercowo naczyniowego Czynność układu immunologicznego Czynność wątroby, nerek, płuc Spożycie alkoholu, palenie tytoniu Zanieczyszczenia środowiska GENETYCZNIE UWARUNKOWANE ZABURZENIA WCHŁANIANIA LEKÓW Przyczyna - zwiększona ekspresja genu ABCB1 dawniej nazywanego MDR1 (ang.:multi Drug Resistance 1, gen oporności wielolekowej) odpowiedzialnego za wytwarzanie białka P glikoproteiny (20 odmian polimorficznych) Leki będące substratami podlegającymi transportowi przez P-gp: - leki sercowo-naczyniowe (digoksyna, chinidyna, celiprolol, talinolol, werapamil) - leki przeciwnowotworowe (aktynomycyna D, doksorubicyna, daunorubicyna, etopozyd, irynotekan, paklitaksel, winblastyna) - leki immunosupresyjne (cyklosporyna A, takrolimus) - steroidy (aldosteron, hydrokortyzon, deksametazon) - opioidy (morfina, metadon) - leki przeciwgruźlicze (ryfampicyna) - leki różne (cefazolina, kolchicyna, atorwastatyna, erytromycyna, flufenazyna, lowastyna, perfenazyna, ondansetron, fenytoina, tamoksyfen, tiorydazyna, loperamid).
GENETYCZNIE UWARUNKOWANE ZABURZENIA METABOLIZMU LEKÓW Polimorfizm utleniania (cytochromu P-450) Polimorfizm acetylacji Genotyp utleniania Cytochrom P-450 (CYP-450) Jest hemoproteiną obecną w mikrosomach komórek wątrobowych (także: nabłonek jelitowy i płuca) Funkcja: CYP jest końcową oksydazą, która prowadzi do utleniania wielu leków (ok. 80%) Liczba izoenzymów CYP-450 jest olbrzymia, a do klasycznych należą: CYP2D6, CYP2C19, CYP2C9, CYP1A2, CYP3A4 Antidepresants Antihypertensives Anti-arrhytmics Analgetics, opiates Antidiabetics, Beta-blocers.. NSAIDs Anti-epileptics, Anticoagulants EtOH, Antirheumatics. Lovastatin, Simvastatin, Atovarstatin Cyclosporine HIV protease inhibitors, Calcium channel blockers Erythromycin, clarithromycin SSRI, TCAs.. TCAs, Theophylline, Estrogens The percentage of individual isoenzymes Quantitative differences www.pharmacologyweekly.com
Farmakogenetyka leków przeciwbólowych CYP2D6 : kodeina Hydrokodon Oksykodon Metadon Tramadol Częstość w populacji: PM: 5-10% UM: 2-3% EM: 80-90% CYP2C9: Diklofenak Ibuprofen Ketoprofen Naproksen Meloksykam Piroksykam Indometacyna Celekoksyb Częstość w populacji: CYP2C9*2: 10,7 12.5% CYP2C9*3: 7,4 8,5% Statyny metabolizowane w układzie P-450: fluwastatyna, ceriwastatyna, atorwastatyna, lowastatyna, simwastatyna Statyny praktycznie niemetabolizowane w układzie P-450: pitawastatyna, prawastatyna, rosuwastatyna Polimorfizm utleniania / fenotypowe grupy: EM (Extensive Metabolizers) - szybcy metabolizerzy (osoby dobrze, w znacznym stopniu utleniający) PM (Poor Metabolizers) osoby wolno, słabo utleniający IM (Intermediate Metabolizers) osoby o pośrednim metabolizmie UM (Ultrarapid Metabolizers) osoby ze zwielokrotnioną liczbą aktywnych genów Ważniejsze induktory i inhibitory metabolizmu leków: Induktory: fenobarbital, fenytoina, karbamazepina, ryfampicyna, aminoglutetimid Inhibitory: amiodaron, allopurynol, cymetydyna, diltiazem, erytromycyna, disulfiram, enoksacyna, flukonazol, izoniazyd,ketokonazol, klarytromycyna, metronidazol, omeprazol, rytonawir, werapamil,
Polimorfizm reakcji II fazy biotransformacji N-acetylotransferaza (NAT1/2) S-transferaza glutationowa UDP-glukuronylotransferaza S-metylotransferaza tiopuryny NAT2 enzym odpowiedzialny za acetylację leków i ksenobiotyków bedacych aryloaminami lub hydrazynami. Znanych jest ponad 100 odmiennych alleli: Allel NAT2*4 koduje szybką acetylację; Allele NAT2*5A, *5B, *5D, *6A, *7A, *7B, *14B są przyczyną wolnej acetylacji. W populacji kaukaskiej fenotyp wolno acetylujący : 40-60% ludzi Przykłady leków metabolizowanych przez N-acetylotransferazę NAT1 i NAT2 NAT1: kwas p-aminosalicylowy, kwas p-aminobenzoesowy, sulfametoksazol, sulfanilamid NAT2: izoniazyd, sulfametazyna, hydralazyna, dapson, prokainamid, nitrazepam, kofeina, 2- aminofluoren WYBRANE POLIMORFIZMY 1. Paracetamol / S- transferaza glutationowa Prawidłowy metabolizm paracetamolu: - utlenianie do bardzo toksycznej N-acetylo-p-benzochinoiminy (NAPQI) - koniugacja z glutationem. Mutacja deaktywująca sprzęganie z glutationem ( GSTM1 i GSTT1) Efekt mutacji : już małe dawki paracetamolu mogą prowadzić do objawów zatrucia!
dawka > 10-15 g: hipoglikemia, martwica wątroby, śpiączka, zgon dawka 6 g (dawka toksyczna): osoby z chorobami wątroby, alkoholicy Odtrutka N-acetylocysteina (ACC) lub węgiel aktywny zalecenia Polskiego Towarzystwa Toksykologicznego!!!! 2. Leki przeciwkrzepliwe Klopidogrel Polimorfizm genów: 1. ABCB1 związany z absorpcją (Glikoproteina P) 2. CYP3A5, CYP2C19 związane z aktywacją proleku w aktywny metabolit w wątrobie 3. P2RY12, ITGB3 związane z aktywnością receptorów płytkowych Warfaryna i acenokumarol Optymalizacja leczenia antagonistami witaminy K - rola polimorfizmów genowych (CYP2C9 i VKORC1) ) Polimorfizm : CYP2C9 Polimorfizm genetyczny związany z różnym tempem metabolizmu Acenokumarolu i Warfaryny a wysokością dawki terapeutycznej oraz występowaniem powikłań krwotocznych. Allele: CYP2C9*2 ( 8-12% chorych) i CYP2C9*3 (3-8% chorych) warunkują wolniejszy metabolizm (większe ryzyko krwawień) Mniejsza dawka jest skuteczna!
Polimorfizm: VKORC1 Polimorfizm podjednostki 1 reduktazy epoksydu witaminy K (VKORC1) istotnie wpływa na skuteczność działania antykoagulantów doustnych, antagonistów witaminy K. Allele: VKORC1*2 mniejsza o ok. 50% ilość enzym VKORC1*3 i *4 oporność na VKA Polimorfizm genów CYP2C9 i VKORC1 łącznie odpowiadają za 50% zmienności odpowiedzi farmakologicznej na warfarynę stabilnej dawki antagonistów witaminy K 4. Genetycznie uwarunkowany polimorfizm dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej- G6PD Istnieje ponad 80 typów G6PD-najbardziej znane: Afrykański (A) : niedobór hemoliza powoduje zniszczenie tylko starszych krwinek 63-67 dniowych Śródziemnomorski (B): niszczone wszystkie krwinki czerwone konieczność przetoczenia krwi Konsekwencje: nie wolno przyjmować: leków o właściwościach utleniających, bobu (fawizm), agrestu, czerwonej porzeczki!!! 5. Wrażliwość na sukcynylocholinę Sukcynylocholina jest lekiem stosowanym pomocniczo w narkozach w celu zmniejszenia napięcia mięśni szkieletowych. Działanie leku jest zazwyczaj krótkotrwałe (3-5 minut), ponieważ sukcynyclocholina jest metabolizowana przez cholinoesterazę (ChE). Nadwrażliwość na sukcynylocholinę jest uwarunkowana genetycznie. U ludzi z tą enzymopatią prawidłowa dawka sukcynylocholiny może spowodować długotrwały bezdech, prowadzący niekiedy nawet do śmierci. Reakcja taka spowodowana jest nieprawidłowym genem cholinesterazy rzekomej. W populacji kaukaskiej u ok. 1 na 3000-3500 osób blokada nerwowomięśniowa po tym leku przedłuża się nawet do 3-4 godzin, co z powodu całkowitego porażenia
mięśni oddechowych i bezdechu, stwarza niebezpieczeństwo dla życia ( wystarcza 1/60 zwykłej dawki leku)! 6. Genetycznie uwarunkowana predyspozycja do hipertermii a stosowanie środków znieczulenia ogólnego i zwiotczającego U osób z dziedziczną predyspozycją do złośliwej hipertermii (Malignant Hyperthermia MH) gwałtownie wzrasta ciepłota ciała (do 43-44 C), wzrasta napięcie mięśni, pojawia się przyspieszenie akcji serca, duszność, sinica, rozwija się kwasica metaboliczna i oddechowa, wzrasta stężenie potasu, zmniejsza się stężenie wapnia we krwi, rozwija rabdomioliza. U osób będących nosicielami zmutowanego genu RYDR kodującego wytwarzanie receptora rianodynowego (Rianodine Receptor - RYDR), kontrolującego kanał wapniowy, zachodzi niekontrolowany napływ jonów Ca do komórki. Aktywne usuwanie z komórki jonów Ca przez dążący do homeostazy organizm powoduje wytwarzanie dużej ilości ciepła. Częstość występowania hipertermii: 1 / 5000 znieczuleń Do najsilniejszych aktywatorów należą: Anestetyki dożylne: ketamina Anestetyki wziewne: halotan, izofluran, eter dwuetylowy, metoksyfluran Środki zwiotczajace: suksametonium, deksametonium, galamina Leki sympatykomimetyczne Leki nasercowe: glikozydy naparstnicy, wapń 7. Genetycznie uwarunkowany polimorfizm glukuronylotransferazy (UGT1A1) Substratem UGT1A1 jest Irynotekan.
U słabych metabolizerów (PM) - nosicieli allela UGT1*28 po podaniu leku przeciwnowotworowego - irynotekanu aktywny metabolit (SN-38) ulega kumulacji, czego następstwem może być ciężka toksyczność ( biegunka, neutropenia, małopłytkowość). 8. Herceptin (Trastuzumab) - stosowany w leczeniu raka piersi i beta-komórkowego chłoniaka nieziarniczego. Jest monoklonalnym przeciwciałem skierowanym swoiście przeciwko receptorowi HER2, którego białko jest kodowane przez gen ERBB2. Nadekspresja tego receptora obserwowana jest w 25-30 % przypadków raka piersi i jest skorelowana ze złośliwością nowotworu i zwiększonym prawdopodobieństwem nawrotu choroby i śmierci. Trastuzumab wiąże się specyficznie z receptorem, który uległ nadekspresji, wskazując tym samym komórki rakowe do zniszczenia przez system immunologiczny specyficznie działający lek dla nowotworów z nadekspresją HER2/ERBB2 Możliwość skutecznej, celowanej terapii, powstanie nowej grupy leków, takich jak: cetuksymab, lapatynib i pertuzumab 9. Analiza genu KRAS - analiza 12 i 13 kodonu sekwencji genu (miejsca najczęstszych mutacji). jakościowo, sekwencjonowanie automatyczne. Gen KRAS koduje białko, które jest jednym z najczęściej aktywowanych onkoprotein w rakach trzustki, tarczycy, jelita grubego, płuc oraz białaczkach szpikowych u ludzi. Forma genu decyduje o powodzeniu terapii celowanej w leczeniu raka jelita grubego (Panitumumabem, Cetuximabem itd.), opartej na hamowaniu namnażania komórek poprzez inhibitory receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), epidermal growth factor receptor) Określenie statusu genu KRAS jest konieczne przed przystąpieniem do tej terapii, ponieważ w przypadku występowania mutacji dowiedziono jej nieskuteczność.
Występowanie zmutowanego genu KRAS stwierdza się u ok.45-50% chorych na raka jelita grubego!!!! 10. Efektywności Albuterolu w leczeniu astmy Albuterol (salbutamol): agonista receptora -2 adrenergicznego (ADRB2); łagodzi objawy astmy Badania wykazały związek pomiędzy polimorfizmem w rejonie kodującym genu ADRB2 (warianty alleliczne Arg-16 lub Gly-16) a odpowiedzią na lek. Pacjenci homozygotyczni (dwa allele Arg-16) wykazywali pięciokrotnie silniejszą odpowiedź na leczenie niż homozygoty Gly-16. U pacjentów heterozygotycznych (Arg-16/Gly-16) odpowiedź na lek była 2.3 razy wyższa w porównaniu do homozygot Gly-16. 11. Nadwrażliwość na Abacavir Abacavir inhibitor transkryptazy, stosowany w terapii AIDS 4.3 % pacjentów leczonych abacavirem nadwrażliwość: gorączka, wysypka, biegunka, w ostateczności śmierć. Objawy nadwrażliwości cofały się po zaprzestaniu terapii Badania genetyczne: rejon HLA: allel HLA-B*5701 jest znacząco skorelowany z nadwrażliwością. Testy genetyczne mogą okazać się skuteczną metodą uniknięcia przypadków nadwrażliwości na abacavir. 12. Farmakogenetyka nowotworów Imatinib (Gleevec): lek stosowany w terapii przewlekłej białczki szpikowej(cml) Działanie: Wiąże i inaktywuje białko BCR-ABL kinazę tyrozynową aktywującą proliferację leukocytów (przyczyna CML). Problem: mutacje BCR-ABL mogą prowadzić do oporności na imatinib (inhibicja wiązania leku)
Badania farmakogenetyczne: zidentyfikowano kilka somatycznych mutacji w BCR-ABL, z czego 6 stanowi 60-70 % wszystkich obserwowanych mutacji Wskazania do określenia genotypu metabolizmu leku 1. Leki stosowane w formie proleku lub których metabolit ma istotne znaczenie farmakologiczne/terapeutyczne: enkainid, proguanil, kodeina; 2. Leki o małej wartości indeksu terapeutycznego lub o dużej farmakokinetycznej zmienności (czyli takie, dla których jedyna lub główna droga metabolizmu jest katalizowana przez polimorficzny enzym), wykazujące znaczne/ niebezpieczne efekty uboczne 3. Leki mające możliwość alternatywnego metabolizmu, prowadzącego do powstania związku toksycznego, np.fenacetyna. Korzyści wynikające z wykonania testu genotypowania 1. Możliwość szybkiego podjecie decyzji dotyczącej dawki leku, a zatem zwiększenie jego skuteczności i tolerancji; 2. Osoby słabo metabolizujące": uniknięcie odstawienia leku z powodu braku jego tolerancji 3. Osoby ultraszybko metabolizujące": uniknięcie odstawienia prawidłowo wybranego leku wskutek braku efektu terapeutycznego spowodowanego zbyt małym jego stężeniem w krwi, a w przypadku monitorowania stężenia leku w osoczu uniknięcie niesłusznego posądzenia pacjenta o niestosowanie się do zaleceń lekarza (noncompliance); 4. Genotypowanie może w dużym stopniu zastąpić monitorowanie stężenia leku w klinice, co ma szczególne znaczenie w przypadku pacjentów nie reagujących na lek, nie tolerujących leku oraz osób starszych ze współistniejącymi schorzeniami układu krążenia, wątroby, nerek; 5. Wykonanie jednego z powyższych testów umożliwia (ułatwia) prawidłowe wprowadzenie nowego leku do terapii przez zastosowanie bezpiecznej dawki;
6. Ponieważ test taki wystarczy wykonać raz w życiu, czas i koszty są usprawiedliwione, zwłaszcza w przypadku leczenia długotrwałego lekami nasercowymi lub psychotropowymi. Zalecenia FDA Markery farmakogenetyczne przeprowadzane przed podaniem leków (ponad 150 markerów farmakogenetycznych na liście FDA) Farmakogenetyka w grupach etnicznych - zróżnicowanie międzypopulacyjne wpływa również na działanie niektórych leków Genotypowanie - etapy 1. Izolacja DNA z materiału biologicznego i kontrola jakości : Metoda chloroformowo-fenolowa Metoda wysalania Adsorpcja na kolumnach z krzemionką i solami chaotropowymi Z zastosowaniem cząstek magnetycznych (Fe3 O4 z krzemionką) 2. Amplifikacja fragmentu DNA (PCR) specyficzność procesu. 3. Rozdział elektroforetyczny (na żelach agarozowych i poliakryloamidowych) 4. Wizualizacja (bromek etydyny z dwuniciowym DNA wykazuje zdolność do fluorescencji w świetle UV ) 6. Obliczenia częstości występowania alleli. Metody analityczne - podstawowe techniki biologii molekularnej PCR / RFLP (ang. Polymerase Chain Reaction - Łańcuchowa Reakcja Polimerazy / ang. Restriction Fragment Length Polymorphismanaliza fragmentów DNA po cięciu enzymami restrykcyjnymi); RT/PCR (ang.reversetranscription Polymerase Chain Reaction),
Czyli kombinowana metoda z udziałem enzymu odwrotnej transkryptazy w połączeniu z techniką PCR; Real Time PCR daje możliwość detekcji przyrostu ilości produktu PCR w czasie rzeczywistym; Mikromacierze (ang.dna microarrays), chipy DNA - badanie profilu molekularnego komórek i tkanek przez równoczesną hybrydyzację izolowanego z nich RNA do wielu tysięcy sond oligonukleotydowych możliwość badania całego genomu podczas jednej analizy! Sekwencjonowanie; Pirosekwencjonowanie; Sekwencjonowanie nowej generacji TORRENT. Epigenetyka Pojęcie: ekspozom - idea, że środowisko, w którym żyją geny ma większe znaczenie od samych genów. Opinie ponad 70% chorób ma związek z ekspozycją na czynniki środowiskowe. Zestaw czynników, które decydują o zdrowiu i chorobach: toksyny, jedzenie, mikroby, wewnętrzne substancje chemiczne, w tym wszystkie aktywne biologicznie cząsteczki kontrolujące stany zapalne, stres oksydacyjny, mikroflora jelitowa i inne naturalne procesy. Epigenomika, nutrigenomika, mikrobiomika, toksygenomika..i inne omiki!!!!