MIKROORGANIZMY W PRODUKCJI KOSMETYKÓW I WYBRANYCH FARMACEUTYKÓW wykłady 1
TEMATYKA WYKŁADÓW 1. Biotechnologia farmaceutyczna 2. Produkcja biomasy 3. Produkcja probiotyków 4. Nadprodukcja metaboliczna jako źródło aminokwasów 5. Fermentacja etanolowa 6. Produkcja kwasów organicznych 7. Witaminy i sterydy otrzymywane w bioprocesach 8. Biotechnologia antybiotyków 9. Surowce, szczepionki i adiuwanty jako produkty 10. Przeciwciała monoklonalne 11. Peptydomimetyki i rekombinanty białkowe leki nowej generacji 12. Insulina i jej analogi 13. Otrzymywanie cytokin jako przykład nowoczesnej produkcji biotechnologicznej 14. Biotechnologia a kosmetologia 2
LITERATURA 3
BIOTECHNOLOGIA FARMACEUTYCZNA 4
GŁÓWNE KIERUNKI PRACY BIOTECHNOLOGII 1) Techniki fermentacyjne 2) Techniki kultur komórkowych 3) Produkcja enzymów 4) Oczyszczanie ścieków 5) Kultury startowe w przemyśle spożywczym. 6) Biotechnologia farmaceutyczna. 5
DZIEDZINY BIOTECHNOLOGII Technologia środków spożywczych Technologia środowiskowa Rolnictwo i leśnictwo Technologia procesów chemicznych BIOTECHNOLOGIA FARMACEUTYCZNA 6
BIOTECHNOLOGIA FARMACEUTYCZNA Europejskie Stowarzyszenie Biotechnologii Farmaceutycznej definiuje biotechnologię farmaceutyczną jako dziedzinę wiedzy wykorzystującą metody naukowe i technologiczne do rozwoju, badania oraz wytwarzania leków. Pozostaje w ścisłym związku z techniką bioprocesową, bioanalityką, technologią genową oraz farmaceutyczną. 7
Substancje małocząsteczkowe: Np. zmodyfikowane syntetycznie lub chemicznie substancje naturalne ze źródeł biologicznych. Substancje wielkocząsteczkowe: Rekombinowane białka Szczepionki Przeciwciała monoklonalne Przykłady znajdujących się na rynku produktów farmaceutycznych: Rekombinowany interferon α-2a (Roferon ) Interferon β (Betaferon ) Ludzka insulina (Huminsulin ) Czynnik wzrostu kolonii granulocytów G-CSF (Neupogen ) Tkankowy aktywator plazminogenu t-pa (Activase ) 8
Wybrane leki otrzymywane metodami biotechnologii farmaceutycznej 9
Historia biotechnologii farmaceutycznej Rok od 1150 Wydarzenie Wytwarzanie spirytusu winnego (etanolu) 1915 Opracowanie przez Weizmanna metody otrzymywania butanolu i acetonu 1920 Otrzymywanie kwasu cytrynowego w procesach powierzchniowych 1928 Odkrycie penicyliny przez Fleminga 1943 Rozpoczęcie produkcji penicyliny w skali przemysłowej 1944 Odkrycie streptomycyny przez Schatza i Waksmana 1948 Odkrycie chlorotetracykliny przez Duggara od 1949 Wytwarzanie witaminy B12 1975 Kohler i Milstein opisują produkcję przeciwciał monoklonalnych 1978 Firma Genetech rozpoczyna produkcję ludzkiej insuliny z użyciem E.coli 1978 Somatostatyna ludzki hormon otrzymywany techniką rekombinowanego DNA 1982 Dopuszczenie do stosowania w Europie I szczepionek, które otrzymano za pomocą technik zrekombinowanego DNA 1983 Dopuszczenie do stosowania I leku uzyskanego techniką genową ludzkiej insuliny. 1985 Rozpoczęcie projektu badawczego Human Genome Project (do 2001) 1988 Opublikowanie metody łańcuchowej reakcji polimerazy PCR. 10
OBSZARY ZAINTERESOWAO 14
KORZYŚCI PŁYNĄCE Z ZASTOSOWANIA METOD BIOTECHNOLOGICZNYCH Szybszy skrining substancji czynnych Nowe systemy testowe Wyjaśnienie mechanizmów aktywności biologicznej Niemal nieograniczony rezerwuar drobnoustrojów Techniki syntezy substancji czynnych mogą zostad wzbogacone o reakcje biotransformacyjne. 15
ŹRÓDŁA SUBSTANCJI BIOLOGICZNIE CZYNNYCH Rocznie bada się ponad milion kultur bakteryjnych, wydając na to w skali światowej 9 mld $... Metabolity bakteryjne: głównie Gram-dodatnie bakterie glebowe z rzędu Actinomycetales Związki przeciwbakteryjne: promieniowce z rodzaju Streptomyces Grzyby: związki o działaniu cytotoksycznym lub sercowo-naczyniowym Eukarionty: grzyby niedoskonałe (Penicillium, Fusarium, Aspergillus) i niektóre podstawczaki. Miksobakterie: wyizolowano m.in. epotylony (wybitna cytotoksycznośd: hamowanie proliferacji komórek poprzez stabilizowanie mikrotubul) 16
METODY POSZUKIWANIA SUBSTANCJI CZYNNYCH Pobranie próbek Etapy prac i ich kolejnośd przy pozyskiwaniu substancji biologicznie czynnych Ekstrakcja Określenie aktywności Taksonomia Oczyszczanie Badania spektoskopowe Dereplikacja Potwierdzenie struktury Optymalizacja, badania toksykologiczne itd. 17
POBIERANIE PRÓBEK Siedliska, w których mechanizmy selekcyjne są słabe Obszary o olbrzymiej różnorodności makroflory i fauny Izolacja czystych hodowli (np. rozcieoczenie sterylnymi pożywkami i umieszczenie na podłożach agarowych uniwersalnych lub selektywnych; proces powtarza się z pojedynczymi koloniami do uzyskania homogeniczności) Problem: odmienne wymagania poszczególnych gatunków 18
PRZECHOWYWANIE SZCZEPÓW Z czystych kultur tworzy się trwałe preparaty Suszenie w stanie zamrożenia (liofilizacja) Bakterie: zamrożenie w postaci zawiesiny (+ krioprotektanty) Przechowywanie w ciekłym azocie Organizmy sporulujące można przechowywad jako hodowle glebowe. 19
HODOWLA DROBNOUSTROJÓW Skrining wstępny szczepów produkcyjnych i wykazanie ich wydajności metabolicznej Bakterie namnaża się jako hodowle wgłębne Grzyby na podłożach stałych Stosowane są różnego typu podłoża (standardowe, zdefiniowane) Rola czynników stresowych Metabolity wtórne tworzą się najczęściej w fazie stacjonarnej Ekstrakcja metabolitów wtórnych 20
SKRINING WSTĘPNY 21
SKRINING CHEMICZNY Określa się parametry chemiczne i fizyczne Wykrycie wszystkich metabolitów Celem jest określenie struktury związków Łatwo przeoczyd śladowe ilości składników Chromatografia cienkowarstwowa Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) ze spektrometrią (UV, NMR lub masową) 22
SKRINING BIOLOGICZNY Z użyciem żywych organizmów lub modeli receptorowych Nie są rozpoznawane substancje nieaktywne Metoda dyfuzji agarowej Charakter ilościowy, tanie, proste w wykonaniu Długi czas, duży rozrzut wyników, mała czułośd ograniczona wiarygodnośd W nowoczesnym skriningu wady te są kompensowane przez niezwykle dużą przepustowośd próbek (roboty laboratoryjne) oraz przez użycie wysoce selektywnych modeli testowych. 23
HAMOWANIE REDUKTAZY HMG-CoA Lowastatyna Mewastatyna Stosowane w praktyce jako leki przeciwmiażdżycowe 24
Mikrobiologiczne spektra hamowania wzrostu drobnoustrojów Porównanie widm MS, UV, NMR Połączenie metod HPLC/NMR Znakomitą metodą jest spektrometria masowa MALDI-TOF. DEREPLIKACJA Rozpoznanie i wyeliminowanie znanych już związków w jak najwcześniejszym stadium poszukiwao. Łatwo rozpoznawalne właściwości porównuje się z danymi literaturowymi. Identyfikacja związków Ograniczenie pola poszukiwao. 27
RACJONALNE ULEPSZANIE PROCESU Staranna optymalizacja procesu fermentacyjnego w celu maksymalnej ekspresji genów Dokładna znajomośd biogenezy i biosyntezy jako podstawy racjonalnego ulepszenia procesu Wykorzystanie do tego celu organizmów zmodyfikowanych genetycznie 31
HODOWLA SZCZEPÓW WYSOKOWYDAJNYCH Szczep wysokowydajny - szczep o określonym potencjale metabolicznym w zakresie biosyntezy, biodegradacji lub biotransformacji uwarunkowany genotypowo Pierwsza forma projektowania metabolizmu Stosowana do hodowli szczepów przemysłowych, również rekombinowanych Wymagana modyfikacja genetyczna szczepu 32
HODOWLA SZCZEPÓW WYSOKOWYDAJNYCH Klasyczne metody hodowli Metody inżynierii genetycznej Optymalizacja warunków wzrostu Metody nieukierunkowanych zmian genetycznych Wytwarzanie, fuzja i odnawianie protoplastów komórek zdolnych do namnażania się, itd. Amplifikacja genów biosyntezy szlaku Zwiększenie oporności na antybiotyki Zwiększenie wydzielania produktu Manipulacja na genach regulatorów ogólnych lub specyficznych dla szlaku Usunięcie etapów limitujących szybkośd metabolizmu Wyłącznie genów Przeniesienie procesu biosyntezy do innego organizmu produkcyjnego. 33
PROJEKTOWANIE METABOLIZMU METABOLITY PIERWOTNE Mała ilośd biosynteza jest poznana Powszechne występowanie pozwala na łatwe znalezienie drobnoustroju nadającego się do produkcji metabolitu Łatwośd w planowaniu metabolizmu Przykładami są np. E. coli, Saccharomyces cerevisiae Kombinacja hodowli klasycznej, technologii genetycznej i optymalizacja prowadzenia procesu biotechnologicznego METABOLITY WTÓRNE Duża ilośd biosynteza nie jest w pełni poznana. Rozgałęzione i bardziej złożone szlaki syntezy Złożone mechanizmy regulacji metabolizmu wtórnego, mnogośd enzymów. Koniecznośd poznania szlaku biosyntezy Klasyczne metody ulepszania szczepów Wytwarzanie substancji naturalnych z użyciem biokombinatoryki Produkcja poza komórką gospodarza 34