BADANIE PORÓWNAWCZE TECHNIK I PIXE W ZASTOSOWANIU DO ANALIZY MATERIAŁÓW ORGANICZNYCH i -,, o.: f\j Magdalena Boruchowska 17, Marek Lankosz 17, Jerzy Ostachowicz 17, Marian Jaskóła 27, Andrzej Korman 27, Dariusz Adamek 37 Wydział Fizyki i Techniki Jądrowej, Akademia Górniczo-Hutnicza, Kraków J Instytut Problemów Jądrowych, Otwock-Świerk Instytut Neurologii, Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloński, Kraków Abstract COMPARATIVE STUDY OF AND PIXE TECHNIQUES IN APPLICATION FOR ANALYSIS OF ORGANIC MATERIALS X-Ray Fluorescence () spectrometry and Particle Induced X-Ray Emission (PIXE) techniques were used for determination of elements in selected organic materials i.e. lyophilized human brain tissue. The main goal of this study was to compare possibilities for qualitative and quantitative analyses of biomedical materials using these two techniques. Human brain tissue samples were taken from areas of white and grey matter. The Standard Reference Materials SRM 1577b and SRM 1566a were used for calibration of the spectrometer in PIXE technique and for evaluation of accuracy of analysis. For excitation of the elemental characteristic X-rays monochromatic beam of photons of average energy equal to 17.4 kev and 2 MeV protons were applied respectively in and PIXE technique. For both methods detection limits were calculated. The results showed that PIXE technique reveals significantly better detectability for the elements below Co. For Cu and Zn the values of detection limits are comparable for both techniques. For the higher elements spectrometry is more suitable. The measurements were performed in air therefore determination of elements below K was not possible. The elements like P, S, C1 and Mn were additionally detected using PIXE technique. The elemental mass fractions calculated for brain tissue were comparable for both techniques. Application of these two methods significantly extend possibilities of elemental analysis of organic materials. 1. WPROWADZENIE Przeprowadzone dotychczas badania pokazują, że obszary anatomiczne mózgu charakteryzują się zróżnicowaną zawartością niektórych pierwiastków śladowych [1]. Ponadto obserwowane są anomalie koncentracji tych pierwiastków w przypadku wybranych schorzeń neurologicznych. Wiele uwagi poświęca się analizom dotyczącym żelaza, miedzi oraz cynku z uwagi na fakt, że pierwiastki te mogą brać udział w procesach neurodegeneracyjnych [2, 3]. Jednak związek pierwiastków śladowych ze stanami patologicznymi centralnego układu nerwowego (CUN) człowieka pozostaje nadal niewyjaśniony. Badania porównawcze składu pierwiastkowego tkanki mózgu oraz biologicznych materiałów odniesienia przy wykorzystaniu spektrometrii (X-Ray 341
Fluorescence) oraz techniki PIXE (Particle Induced X-Ray Emission) miały na celu sprawdzenie możliwości stosowania tych technik do analiz materiałów pochodzenia organicznego, ze szczególnym uwzględnieniem tkanki CUN. Analiza ilościowa tego typu materiałów wiąże się z koniecznością eliminacji efektów matrycy, spowodowanych przez pierwiastki lekkie (głównie C, O, N i H). Pierwiastki te stanowią ponad 90% wszystkich składników tkanki i nie są mierzalne zastosowanymi w badaniach technikami. Wykonanie analizy ilościowej próbek o masie kilkuset miligramów wymagało zastosowania odpowiednich procedur analitycznych. W pomiarach techniką zawartość pierwiastków w tkankach wyznaczano w oparciu o metodę współczynników fundamentalnych po uprzednim oszacowaniu średniej liczby atomowej lekkiej, niemierzalnej matrycy. W technice PIXE wykonana została kalibracja spektrometryczna przy użyciu materiałów odniesienia SRM (Standard Reference Material) 1577B (liofilizowana bycza wątroba) oraz SRM 1566a (liofilizowana tkanka ostryg). W celu porównania przydatności obu technik dla celów analitycznych wyznaczone zostały granice wykrywalności pierwiastków. 2. MATERIAŁ BADAWCZY I METODY POMIAROWE Analiza porównawcza technik i PIXE została wykonana na próbkach pobranych podczas autopsji z obszarów istoty białej i szarej mózgu. Materiał poddawano liofilizacji i homogenizacji, a następnie prasowano w pastylki o średnicy 13 mm. Przebadano 20 przypadków stanowiących grupę kontrolną (bez schorzeń neurologicznych) o rozpiętości wiekowej pacjentów wynoszącej 71 lat (17-88 lat). Ponadto, w badaniach wykorzystano próbki materiałów odniesienia SRM 1577b oraz SRM 1566a, przygotowane do analizy w ten sam sposób co próbki mózgu. Pomiary techniką zostały wykonane za pomocą rentgenowskiego spektrometru fluorescencyjnego z dyspersją energii [4]. Jako źródło promieniowania wzbudzającego zastosowana została lampa rentgenowska z anodą molibdenową. Pierwotną wiązkę wzbudzającą monoenergetyzowano poprzez stosowanie wtórnej tarczy molibdenowej uzyskując promieniowanie o średniej energii 17,4 kev. Średnica wiązki promieniowania wzbudzającego wynosiła około 3 mm. Pomiary prowadzono w powietrzu. Czas pomiaru każdej próbki wynosił 3000 s. Wzbudzone promieniowanie X rejestrowano za pomocą detektora półprzewodnikowego Si(Li) o zdolności rozdzielczej 170 ev dla energii 5,9 kev. Analizę widm przeprowadzono stosując program komputerowy AXIL- QXAS [5]. Zawartości pierwiastków śladowych w badanych materiałach biomedycznych wyznaczono na podstawie metody współczynników fundamentalnych przy wykorzystaniu programu AXIL-QXAS. Kalibrację spektrometru wykonano 342
w oparciu o pomiar wzorców pierwiastkowych o znanych masach powierzchniowych. Do wyznaczenia zawartości pierwiastków w materiałach organicznych niezbędne było oszacowanie średnich liczb atomowych matrycy badanych próbek. W tym celu wykorzystano zmierzony stosunek natężeń promieniowania wzbudzającego rozproszonego koherentnie i niekoherentnie [6]. Do kalibracji użyto próbek wykonanych z czystych pierwiastków lub związków chemicznych o liczbach atomowych zawartych pomiędzy 6 (węgiel) a 16 (siarka). Akcelerator elektrostatyczny typu Van de Graaffa wykorzystano jako źródło protonów w pomiarach prowadzonych techniką PIXE [7]. Próbki umieszczone w komorze próżniowej bombardowano wiązką protonów o energii 2 MeV i średnicy 2 mm. Stosowane w pomiarach natężenie prądu wiązki pierwotnej wynosiło ok. 30 na, natomiast wartość całkowitego ładunku mierzonego na powierzchni próbki była równa ok. 50 \ic. Wzbudzone charakterystyczne promieniowanie X pierwiastków rejestrowano detektorem półprzewodnikowym Si(Li) o zdolności rozdzielczej 160 ev przy energii 6,4 kev. Uzyskane widma PIXE analizowano programem AXIL-QXAS. Do kalibracji spektrometru zastosowano materiały odniesienia SRM 1577b i SRM 1566a. Udziały wagowe pierwiastków w tkance mózgu wyznaczono na podstawie krzywej wydajności sporządzonej dla próbek wzorcowych SRM 1566a i SRM 1577b, przy założeniu proporcjonalności sygnału natężenia promieniowania charakterystycznego pierwiastków do zawartości pierwiastków w próbce. Szczegółowy opis metodyki pomiarów zawiera praca [8]. 3. WYNIKI I DYSKUSJA Widma uzyskane dla wybranej próbki mózgu technikami i PIXE przedstawione zostały na rys. 1. Analiza umożliwiła detekcję pierwiastków o liczbach atomowych zawartych pomiędzy 19 (potas) a 38 (stront). Pomiary techniką PIXE, zgodnie z rys. l, dają dodatkowo możliwość analizy pierwiastków, takich jak P, S, Cl oraz Mn. Pierwiastki wykrywane każdą z technik wyszczególniono w tabeli l. Analiza pierwiastkowa materiałów referencyjnych SRM 1577b i SRM 1566a posłużyła do określenia dokładności metody zastosowanej w analizie. Porównanie wyników pomiarów z wartościami certyfikowanymi zawiera tabela 2. Zawartości wszystkich pierwiastków z wyłączeniem potasu są porównywalne w granicach niepewności z wartościami certyfikowanymi. Względna rozbieżność zawartości K w stosunku do wartości certyfikowanej jest rzędu 10%. W tabeli l zestawiono wyniki analizy PIXE wybranych próbek tkanki mózgu z wynikami analizy dla tych samych próbek. W celu porównania przydatności każdej z technik do analizy pierwiastkowej materiałów orga- 343
nicznych wyznaczono granice wykrywalności pierwiastków dla próbek tkanki mózgu, jak również materiałów odniesienia SRM 1566a i SRM 1577b. Wartości granic wykrywalności określono dla warunków pomiarowych podanych w paragrafie 2 niniejszej publikacji. Do wyznaczenia wartości granic wykrywalności pierwiastków wykorzystano zależność: 100000 10000-1 1000 10 12 14 16 8 20 22 b) 1000000 100000 1 1000 Zn 100 H 10- Se Br Rb Sr l O 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Rys. 1. Widma uzyskane dla próbki tkanki mózgu technikami: a), b) PIXE (linie K-L 2.3 pierwiastków). 344
gdzie: DL, - granica wykrywalności /-tego pierwiastka, C, - zawartość /-tego pierwiastka, F, - powierzchnia piku (netto) odpowiadającego /-temu pierwiastkowi, B j - wartość tła dla /-tego pierwiastka [9]. Tabela 1. Rezultaty analizy i PIXE wybranych próbek tkanki mózgu. p s Cl K Ca Mn Fe Cu Zn Br Rb Sr 1600(200) 2530(180) 239,9 (7,0) 26,0(1,5) 92,6(2,2) 8,49 (0,57) 2,89 (0,44) 6,36 (0,50) Próbka 1 P1XE 16840(530) 7520 (84) 1118(59) 2007(16) 2340(110) 4.9(1,1) 251(22) 26,4(1,4) 100,2(6,6) 6,72 (0,25) 3,8(1.4) 5,9(1,2) 1360(200) 2790(190) 267,8 (7,3) 26,8(1,5) 76,0 (2,0) 1,63(0,42) 1,37(0,41) 8,05 (0,52) Próbka 2 PIXE 12880(550) 6102(80) 689 (94) 1327(17) 2510(170) 4,95(1,5) 271 (24) 27,9(1,3) 82,9 (6,8) 2,5(1,1) * 5,2(1,9) 810(170) 1790(160) 156,6(5,6) 34,5(1,6) 75,3 (2,0) 1,30(0,43) Próbka 3 5,09 (0,49) PIXE 18960(530) 8534 (77) 392(18) 821,4(7,4) 1980(230) 1,22(0,68) 158(23) 31,2(1,5) 85(15) 6,5 (2,4) 500(150) 1170(130) 109,3(4,6) 14,8(1,2) 51,0(1,6) 2,10(0,45) 1,1 (0,41) 4,08 (0,47) Próbka 4 W nawiasach podano niepewności udziałów wagowych na poziomie ufności 95%. * Poniżej granicy wykrywalności. PIXE 12480(350) 6168(57) 245,2 (7,0) 430,5 (3,1) 1120(108) 2,03 (0,53) 122,8(6,1) 14,7(1,3) 54,8 (7,0) Tabela 2. Porównanie doświadczalnych i certyfikowanych udziałów wagowych pierwiastków w SRM 1566a oraz SRM 1577b. Wyniki uzyskane w pomiarach. K Ca Fe Cu Zn As Se Br Rb Sr SRM 1566a Certyfikat 8720 (460) 7900 (47) 1830 (200) 1960 (190) 518 (12) 539 (15) 65,1 (2,6) 66,3 (4,3) 812,0 (7,0) 830 (57) 15,07 (0,88) 14,0 (1,2) 1,90 (0,57) 2,21 (0,24) 62,0 (1,3) 2,8 (1,2) 3 10,79 (0,60) 11,1 (1,0) SRM 1577b Certyfikat 10700 (460) 9940 (20) 116 (4) 186,0 (7,0) 184 (15) 154,0 (4,0) 160 (8,0) 120,0 (3,0) 127 (16) 10,78 (0,65) C - udziały wagowe; wartości w nawiasach reprezentują niepewności C na poziomie ufności 95%. 345 9,7 12,1 (1,4) 13,7 (1,1)
Uzyskane rezultaty zilustrowano na rys. 2. Łatwo zauważyć, że technika PIXE ma znacząco lepszą wykrywalność (od kilkuset do kilku razy w miarę wzrostu liczby atomowej) dla pierwiastków o liczbach atomowych mniejszych od 26. Pierwiastki takie jak miedź i cynk posiadają porównywalne wartości granic wykrywalności w obu technikach. Dla pierwiastków o liczbach atomowych powyżej 30 wykrywalność jest lepsza w technice. Zestawione w tabeli l rezultaty analizy ilościowej próbek tkanki mózgu wykonanej techniką oraz PIXE, w większości przypadków, wykazują zgodność udziałów wagowych pierwiastków w granicach niepewności doświadczalnych. Wynik taki sugeruje, że do analizy ilościowej tkanki mózgu metodą PIXE można w celach kalibracji spektrometrycznej wykorzystać materiały odniesienia SRM 1566a 1000 jo B 100,0 o, SRM 1566a o, SRM 1577b A, tkanka mózgu PKE.SRM 1566a PKE, SRM 1577b PKE,tkanka mózgu 10,0 - ^a 1,0-0,1 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Liczba atomowa 32 34 36 38 Rys. 2. Granice wykrywalności pierwiastków w SRM * 1566a, SRM 1577b oraz tkance mózgu dla technik i PIXE. i SRM 1577b. Jest to szczególnie istotne w przypadku, gdy nie ma możliwości posłużenia się odpowiednim programem komputerowym czy zastosowania innej metody umożliwiającej analizę ilościową, np. wewnętrznej standaryzacji. Tkanka mózgu zawiera ponad 50% związków lipidowych [10], co uniemożliwia homogeniczne rozprowadzenie wzorca wewnętrznego. Zgodnie z tabelą l koncentracje takich pierwiastków, jak brom, rubid i stront są niższe lub nieznacznie przekraczają granice wykrywalności techniki PIXE. Do analizy tych pierwiastków w materiałach biomedycznych wskazane jest więc stosowanie techniki. Spektrometria, przy zastosowanych warunkach pomiarowych, nie jest jednak odpowiednia do oznaczania pierwiastków Iżej- 346
szych od potasu, których promieniowanie charakterystyczne jest absorbowane w powietrzu na drodze próbka-detektor. Wykazane różnice w wykrywalności pierwiastków w obu metodach mogą okazać się szczególnie istotne przy zagadnieniach dotyczących analizy ukierunkowanej na badanie konkretnych pierwiastków. Uzyskane rezultaty pokazują, że równoległe stosowanie obu metod znacząco rozszerza możliwości analizy materiałów organicznych. Analiza pierwiastkowa tkanki mózgu przy wykorzystaniu technik i PIXE pozwoliła na stwierdzenie różnic zawartości wybranych pierwiastków w obszarach anatomicznych mózgu, takich jak istota biała i szara. Wyniki pomiarów wskazują na występowanie wyższych zawartości wapnia, żelaza, miedzi, cynku oraz siarki (tej ostatniej oznaczanej techniką PIXE) w istocie szarej niż w istocie białej mózgu. Ponadto zaobserwowano wzrost zawartości cynku wraz z wiekiem pacjenta w istocie białej. Zagadnienia dotyczące rozkładu pierwiastków w wybranych obszarach anatomicznych mózgu oraz wpływu wieku pacjenta na akumulację pierwiastków w tkance mózgu, w oparciu o wyniki analizy PIXE, przedstawiono szczegółowo w pracy [8]. 4. WNIOSKI Techniki i PIXE pozwalają na analizę materiałów organicznych dając możliwość detekcji pierwiastków na poziomie mg/kg. Technika charakteryzuje się lepszą wykrywalnością pierwiastków o liczbach atomowych powyżej 30 w stosunku do techniki PIXE. Nie umożliwia jednak detekcji pierwiastków lżejszych od potasu oraz np. manganu. Analiza PIXE pozwala oznaczać pierwiastki począwszy od fosforu, jednak granice wykrywalności bromu, rubidu i strontu są porównywalne, bądź wyższe od zawartości tych pierwiastków w tkance. Dlatego też do ich analizy wskazane jest stosowanie spektrometrii. W wyniku zastosowanych metod analizy ilościowej w obu technikach uzyskano zbliżone udziały wagowe pierwiastków w tkance mózgu. Materiały referencyjne SRM 1566a i SRM 1577b mogą więc być wykorzystywane do kalibracji spektrometrycznej w analizie pierwiastkowej materiałów biomedycznych przy wykorzystaniu techniki PDCE. Zastosowanie obu metod w znaczący sposób poszerzyło możliwości analizy pierwiastkowej badanych materiałów organicznych. LITERATURA [1]. Duflou H., Maenhaut W., De Reuck J.: Trace Elements in Human Brain: Regional Distribution and Alterations in Structured Affected by 347
Cerebral Infarction. W: Trace Element Analytical Chemistry in Medicine and Biology. T.5. Walter de Gruyter, Berlin 1988, s. 483-490. [2]. Cornett C.R., Markesbery W.R., Ehmann W.D.: Imbalances of trace elements related to oxidative damage in Alzheimer's disease brain. Neurotoxicology, 19 (3), 339-345 (1998). [3]. Kienzl E., Jellinger K., Stachelberger H., Linert W.: Iron as catalyst for oxidative stress in the pathogenesis of Parkinson's disease. Life Sci., 65 (18-19), 1973-1976(1999). [4]. Holynska B., Ostachowicz B., Ostachowicz J., Ostrowski A., Ptasinski J., Wegrzynek D.: Multifunctional system for energy dispersive X-ray fluorescence analysis. J. Trace and Microprobe Techniques, J_3_ (2), 163-175 (1995). [5]. Van Espen P., Nullens H., Adams F.: A computer analysis of X-ray fluorescence spectra. Nucl. Instr. Methods, 142, 243-250 (1977). [6]. Lankosz M., Pella P.A.: A Procedure Using Polychromatic Excitation and Scattered Radiation for Matrix Correction in X-Ray Microfluorescence Analysis. X-Ray Spectrometry, 24, 320-326 (1999). [7]. Bigolas J., Jaskóla M., Kiełsznia R., Kuliński S., Maciszewski W., Pachan M., Pławski E.: The history of development and applications of accelerators in the Institute of Nuclear Research and its "daughter" institutions. Nukleonika, 40, 29-92 (1995). [8]. Boruchowska M., Lankosz M., Adamek D., Korman A.: PIXE Analysis of Human Brain Tissue. X-Ray Spectrometry, 30, 174-179 (2001). [9]. Currie L.A.: Limits for Qualitative Detection and Quantitative Determination - Application to Radiochemistry. Anal. Chem., 40, 586-592 (1968). [10]. Frisell W.: Human Biochemistry. Collier Macmillan Publishers, London 1982, s. 470-495. 348