C Z N I K I. R O r oczniki

ISSN 1427-440X AnnAA N N A L les E S A AcA C A D demia E M I A E e M m E edica D I C A e E ss tetinensis T E T I N E N S I S A AnnA N N A L ls s of O F tt H e E PomerAP O M E R A N nia I A N n M me edica D I C A L l U University N I V E R S I T Y R O r oczniki C Z N I K I POMORSKIEJ Pomorskiej AKADEMII AkAdemii MEDYCZNEJ medycznej W w SZCZECINIE szczecinie TOM LII tom li PAM WYDAWNICTWO wydawnictwo POMORSKIEJ Pomorskiej AKADEMII AkAdemii MEDYCZNEJ medycznej W w szczecinie SZCZECINIE SZCZECIN szczecin NR nr 31 2005 2006

Annales Academiae Medicae Stetinensis Roczniki Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie ukazują się od 1951 roku. Są wydawnictwem naukowym, ciągłym, recenzowanym i cytowanym m.in. w Index Medicus (Medline), Biological Abstract, Chemical Abstract. Dostępne w ponad 150 bibliotekach krajowych i zagranicznych. Do druku przyjmowane są prace oryginalne i poglądowe oraz prezentujące ważną kazuistykę z zakresu nauk podstawowych, klinicznych oraz humanistyki medycznej autorów z Pomorskiej Akademii Medycznej oraz z innych ośrodków w kraju i za granicą. Zamieszczony materiał publikowany jest i będzie według przyjętego schematu wydawniczego, w języku polskim lub angielskim, z krótkimi streszczeniami odpowiednio dla języka polskiego po angielsku, a dla języka angielskiego po polsku. Każdy tom obejmuje 3 części stałe: oryginalne prace naukowe o objętości 1 1,5 arkusza wydawniczego, w tym skondensowane rozprawy doktorskie, doniesienia naukowe itp.; kronikę PAM za poprzedni rok wraz z przemówieniem rektora na inauguracji roku akademickiego i spis jednostek naukowo-dydaktycznych oraz bibliografię dorobku piśmienniczego uczelni. Od tomu 50 Roczników PAM zostały wprowadzone zmiany w edycji, które omówiono w regulaminie publikowania prac. REGULAMIN PUBLIKOWANIA PRAC* w Annales Academiae Medicae Stetinensis Roczniki Pomorskiej Akademii Medycznej Redakcja Annales Academiae Medicae Stetinensis Roczniki Pomorskiej Akademii Medycznej przyjmuje oryginalne prace naukowe, w trybie ciągłym. Można publikować materiały ze wszystkich dziedzin nauk medycznych, również te, które są zbyt obszerne na zamieszczenie w czasopismach specjalistycznych. Materiał powinien mieć nie więcej niż 20 25 stron maszynopisu formatu A-4, łącznie z rycinami, tabelami, podpisami i piśmiennictwem tylko cytowanym w tym dziele (ograniczonymi do minimum) oraz streszczeniami. Manuskrypt napisany w języku polskim i angielskim, na białym papierze, bez wyróżnień. Zadrukowana może być tylko pierwsza strona kartki, druga pozostaje niezadrukowana (czysta). Używać należy 12-punktowej czcionki, z zachowaniem podwójnego odstępu między wierszami. Strony numerować kolejno, zaczynając od tytułowej. Numery stron umieszczać w dolnym, prawym rogu każdej strony. Zachować kolejność układu: strona tytułowa, tekst podstawowy, materiał ilustracyjny, piśmiennictwo. Strona tytułowa Imię i nazwisko autora (autorów); tytuł pracy w dwóch językach; miejsce uzyskania stopnia naukowego (dotyczy doktoratów) lub pracy autora (nazwa i adres placówki naukowej, tytuł i stopień naukowy jej kierownika); słowa kluczowe w dwóch językach wymienianych w katalogu MeSH; miejsce i nazwa instytucji, gdzie wykonano pracę; szczegółowe dane dotyczące dysertacji (dotyczy prac doktorskich promotor, liczba: stron, rycin, tabel i piśmiennictwa). Tekst podstawowy S u m m a r y: streszczenie pracy w języku angielskim i/lub innym. Powinno się w nim znaleźć: cel badania lub próby, podstawowe procedury (wybór badanych w doświadczeniu, metody obserwacji lub analizy), główne wyniki (istotne dane i ich statystyczne znaczenie) oraz wnioski. Należy podkreślić nowe i istotne aspekty pracy. W s t ę p: podać cel artykułu i podsumować uzasadnienie wykonanego badania lub obserwacji z możliwością przywołania piśmiennictwa. M e t o d y: opisać w sposób łatwo zrozumiały dobór materiału badawczego oraz zastosowanych metod i statystyki. W y n i k i: przedstawić w tekście w logicznej kolejności. Nie powtarzać danych z tabel i rycin, podkreślić i podsumować tylko ważne obserwacje. D y s k u s j a: podkreślić należy nowe oraz ważne aspekty badania i wynikające z nich wnioski, nie powtarzać szczegółowo danych przedstawionych w rozdziałach Wstęp i Wyniki. Porównać własne obserwacje z innymi autorami, którzy wykonali zbliżone badania. W n i o s k i: powiązać z celami badania i przedstawić w sposób zwięzły. S t r e s z c z e n i e s t r u k t u r a l n e (wstęp, materiał i metody, wyniki, konkluzje): w języku podstawowym pracy, zawierające kwintesencję tego, co jest w tekście, od 200 do 250 słów. S k r ó t y użyte w tekście po raz pierwszy należy podać w pełnym brzmieniu. Nie należy rozpoczynać zdania od skrótu. L i c z b o w e w a r t o ś c i i s y m b o l e wszystkich wielkości winny być podane wg międzynarodowego układu jednostek SI. S ł o w a k l u c z o w e: 3 6 terminów, nie powinny powtarzać słów zawartych w tytule pracy, wymienianych w katalogu MeSH. Materiał ilustracyjny Obejmuje ryciny (kreski wykresy, diagramy oraz siatki zdjęcia), tabele, tablice, opatrzone tytułami (pod rycinami, nad tabelami). Powinny być dostarczone na oddzielnych kartkach, z oznaczeniem góra dół i kolejności numeracji wg cytowania w tekście. Osobną numerację posiadają ryciny i osobną tabele. Fotografie mikroskopowe powinny posiadać wewnętrzną skalę, a stosowane symbole, strzałki lub litery wyraźnie uwidocznione na tle. Kolorów używać tylko wtedy, jeśli barwa czarno-biała nie odda istoty przekazu. Tytuły oraz inne informacje wewnętrzne na rycinach i w tabelach należy podać w języku polskim i angielskim. Na marginesie maszynopisu zaznaczyć numery tabel i rycin w miejscu, gdzie mają być wstawione. Piśmiennictwo Numerując, należy podawać w kolejności cytowania. Każdy numer piśmiennictwa należy zapisywać od nowej linii. Pozycji nie należy dublować. Cytowane w tekście piśmiennictwo podać w nawiasach kwadratowych, ze spacją między numerami. Podajemy nazwisko autora/-ów z pierwszymi literami imion. Przytaczamy wszystkich autorów, jeśli jest ich sześciu. Powyżej tej liczby sześciu z dopiskiem et al. Tytuły periodyków powinny być skracane zgodnie ze sposobem przyjętym w Index Medicus (Medline). Redakcja wymaga przedłożenia pracy w dwóch egzemplarzach wraz z wersją elektroniczną (dyskietka lub CD-ROM) z zaznaczeniem programu zapisu. Tekst powinien być zapisany w programie Word. * Opracowany na podstawie wytycznych Międzynarodowego Komitetu Wydawców Czasopism Medycznych, opublikowanych w Problemach Medycyny Nuklearnej 1997, 11 (21), 67 87.

A N N A L E S A C A D E M I A E M E D I C A E S T E T I N E N S I S A N N A L S O F T H E P O M E R A N I A N M E D I C A L U N I V E R S I T Y R O C Z N I K I POMORSKIEJ AKADEMII MEDYCZNEJ W SZCZECINIE TOM LII WYDAWNICTWO POMORSKIEJ AKADEMII MEDYCZNEJ W SZCZECINIE SZCZECIN NR 3 2006

R e d a k t o r n a c z e l n y E d i t o r - i n - C h i e f prof. dr hab. n. med. IRENEUSZ KOJDER M i ę d z y n a r o d o w a R a d a N a u k o w a I n t e r n a t i o n a l S c i e n t i f i c C o u n c i l Prof. Dr. Raymond Ardaillou (Paryż, F), prof. dr hab. n. med. Andrzej Cretti, Prof. Dr. Antonio J.G. Ferreira (Lizbona, P), prof. dr hab. n. med. Janusz Fydryk, Prof. Dr. Alan Gewirtz (Filadelfia, USA), Prof. Dr. Yücel Kanpolat (Ankara, TR), prof. dr hab. n. med. Irena Karłowska, Prof. Dr. Koichi Kono (Osaka, J), prof. dr hab. n. med. Ireneusz Kojder, prof. dr hab. n. med. Tadeusz Marcinkowski, Prof. Dr. Falk Oppel (Bielefeld, D), Prof. Dr. Mary Osborn (Getynga, D), prof. dr hab. n. med. Andrzej Paradowski, Prof. Dr. Wolfgang Straube (Rostok, D), prof. dr hab. n. med. Eugeniusz Szmatłoch K o m i t e t r e d a k c y j n y E d i t o r i a l c o m m i t t e e prof. dr hab. n. med. Dariusz Chlubek, prof. dr hab. n. med. Maria Jastrzębska, prof. dr hab. n. med. Krystyna Pilarska, prof. dr hab. n. med. Maria Syryńska, prof. dr hab. n. med. Andrzej Żyluk, dr hab. n. med. Aleksandra Kładna, dr hab. n. med. Anna Machoy-Mokrzyńska, dr hab. n. med. Alicja Walczak, mgr Dagmara Budek, mgr Bożena Gottschling T ł u m a c z r e d a k c j i E d i t o r i a l t r a n s l a t o r dr n. med. Tomasz Dutkiewicz R e d a k c j a t e c h n i c z n a i k o r e k t a T e c h n i c a l e d i t o r a n d p r o o f r e a d e r Hubert Czekała Bożena Gottschling Wojciech Markowski Ryszard Sędkiewicz Copyright by Pomorska Akademia Medyczna, 2006 A d r e s r e d a k c j i E d i t o r i a l o f f i c e a d d r e s s Pomorska Akademia Medyczna 70-204 Szczecin, ul. Rybacka 1 www.ams.edu.pl wydawnictwo@pam.szczecin.pl Wydanie publikacji dofinansowane przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego This publication was partly financed by the Ministry of Science and Higher Education WYDAWNICTWO POMORSKIEJ AKADEMII MEDYCZNEJ W SZCZECINIE Wydanie I. Nakład 350 egz. Format A-4. Objętość: ark. druk. 18,8. Skład komputerowy, druk i oprawa: PPH ZAPOL, Dmochowski, Sobczyk, Spółka jawna, Szczecin, tel./fax 091 434 10 21, e-mail: zarzad@zapol.com.pl

SPIS TREŚCI 1. Monika Rać, Michał Rać Molekularne podstawy chorób prionowych......................................... 5 2. Iwona Poziomkowska-Gęsicka Reaktywność oskrzeli na zastosowany wziewnie salbutamol w odniesieniu do polimorfizmu genu kodującego receptor β 2 -adrenergiczny........................................................ 15 3. Barbara Dołęgowska, Wojciech Błogowski, Dariusz Chlubek Wpływ glukozy na zmiany odporności hemolitycznej erytrocytów badania in vitro.................. 25 4. Agnieszka Kempińska Fenotypy termiczne bliźniąt monozygotycznych próba oceny ich zróżnicowania..................... 29 5. Magdalena Jaborowska Badania nad ograniczeniem liczebności pasożytniczych geohelmintów za pomocą saprotroficznych grzybów glebowych i ich wydzielin........................................................ 37 6. Tomasz Janus Diagnostyka i opiniowanie wyników w sądowo-toksykologicznej analizie amfetamin................... 47 7. Małgorzata Mokrzycka, Andrzej Pawlik, Maria Kałdońska, Barbara Millo Ocena czynności wątroby u dzieci z ostrą białaczką limfiblastyczną w czasie remisji................... 61 8. Ewa Gajewska, Magdalena Sobieska, Włodzimierz Samborski Zależność między Monachijską Funkcjonalną Diagnostyką Rozwojową a oceną reaktywności posturalnej na podstawie 7 prowokowanych reakcji ułożeniowych według Vojty przeprowadzonej w pierwszym okresie życia dziecka...... 67 9. Anita Huryń, Stanisława Bielecka-Grzela, Adam Klimowicz Zastosowanie fototerapii w dermatologii.......................................... 71 10. Renata Guzicka-Kazimierczak Chłoniaki nieziarnicze z pierwotną lokalizacją w żołądku analiza kliniczna i czynniki rokownicze.......... 77 11. Leszek M. Sagan, Ireneusz Kojder, Łukasz Madany, Maria Giżewska Metoda endoskopowego umieszczania drenu komorowego zastawki technika i zastosowanie............. 85 12. Danuta Mikulska, Romuald Maleszka, Mirosław Parafiniuk Próba zastosowania termografii jako metody diagnostycznej w dermatologii na podstawie badań prowadzonych w latach 2001 2005..................................................... 91 13. Elżbieta Kuncewicz, Ewa Gajewska, Magdalena Sobieska, Włodzimierz Samborski Zespół mięśnia gruszkowatego............................................... 99 14. Joanna Ziółkowska Stan zdrowia jamy ustnej i potrzeb leczniczych chorych na cukrzycę............................ 103 15. Magdalena Sroczyk-Jaszczyńska, Jerzy P. Szumiłowicz Ocena w skaningowym mikroskopie elektronowym (SEM) ściany bruzdy zęba opracowanej metodą abrazyjną i wiertłem diamentowym................................................... 115 16. Eliza Górniak Fluorescencja szkliwa przed i po wytrawieniu szkliwa w badaniach in vivo i in vitro.................. 119 17. Małgorzata Tomasik Analiza czynników etiologicznych ubytków przyszyjkowych niepróchnicowego pochodzenia.............. 125 18. Andrzej Kierzek Podyplomowe szkolenia Alfreda Marcina Sokołowskiego (1849 1924) w Wiedniu i Heidelbergu............. 137 19. Monika Tyszkiewicz-Bandur, Maria J. Siemińska Dynamika nadziei w chorobie nowotworowej przegląd badań............................... 141 20. Józef Lipiec Nadzieja cele, szanse, granice................................................ 147

CONTENTS 1. Monika Rać, Michał Rać Molecular bases of prion diseases............................................... 5 2. Iwona Poziomkowska-Gęsicka Bronchi reaction to the inhaled salbutamol according to the polymorphisms of β 2 -adrenergic receptor......... 15 3. Barbara Dołęgowska, Wojciech Błogowski, Dariusz Chlubek The effect in vitro of glucose on erythrocyte resistance to hemolysis........................... 25 4. Agnieszka Kempińska An attempt to determine the variability of thermal phenotypes in monozygotic twins.................. 29 5. Magdalena Jaborowska Limitation in the population of parasitic geohelminths by saprotrophic soil fungi and their secretions.......... 37 6. Tomasz Janus Diagnostics and interpretation on results in forensic toxicology of amphetamines.................... 47 7. Małgorzata Mokrzycka, Andrzej Pawlik, Maria Kałdońska, Barbara Millo Assessment of liver function in children with acute lymphoblastic leukemia in remission................ 61 8. Ewa Gajewska, Magdalena Sobieska, Włodzimierz Samborski Correlates between munich functional development diagnostics and postural reactivity finding based on seven provovoked postural reactions modus Vojta during the first period of child s life...................... 67 9. Anita Huryń, Stanisława Bielecka-Grzela, Adam Klimowicz Application of phototherapy in dermatology........................................ 71 10. Renata Guzicka-Kazimierczak Primary gastric non-hodgkin s lymphoma: clinical findings and prognostic factors................... 77 11. Leszek M. Sagan, Ireneusz Kojder, Łukasz Madany, Maria Giżewska Endoscope-guided placement of the ventriculoperitoneal shunt: technique and applicatios................ 85 12. Danuta Mikulska, Romuald Maleszka, Mirosław Parafiniuk The usefulness of thermography as a diagnostic method in dermatology on the basis of clinical trials in 2001 2005... 91 13. Elżbieta Kuncewicz, Ewa Gajewska, Magdalena Sobieska, Włodzimierz Samborski Piriformis muscle syndrome.................................................. 99 14. Joanna Ziółkowska Oral health status and dental service needs of diabetic patients.............................. 103 15. Magdalena Sroczyk-Jaszczyńska, Jerzy P. Szumiłowicz Evaluation of the lateral dent wall of sulcus treated with air abrasion technique and with diamond drill seen in SEM.. 115 16. Eliza Górniak Fluorescence of enamel before and after etching: an in vivo and in vitro study...................... 119 17. Małgorzata Tomasik Analysis of etiological factors involved in noncarious cervical lesions........................... 125 18. Andrzej Kierzek Postgraduate studies of Alfred Marcin Sokołowski (1849 1924) in Vienna and Heidelberg............... 137 19. Monika Tyszkiewicz-Bandur, Maria J. Siemińska Dynamics of hope in neoplastic disease: a review...................................... 141 20. Józef Lipiec Hope: its goals, chances, and limits.............................................. 147

ANNALES ACADEMIAE MEDICAE STETINENSIS ROCZNIKI POMORSKIEJ AKADEMII MEDYCZNEJ W SZCZECINIE ANNALS OF THE POMERANIAN MEDICAL UNIVERSITY 2006, 52, 3, 5 13 Monika Rać, Michał Rać 1 Molekularne podstawy chorób prionowych Molecular bases of prion diseases Zakład Biochemii Pomorskiej Akademii Medycznej al. Powstańców Wielkopolskich 72, 70-111 Szczecin Kierownik: prof. dr hab. n. med. Dariusz Chlubek 1 Zakład Diagnostyki Obrazowej i Radiologii Interwencyjnej Pomorskiej Akademii Medycznej ul. Unii Lubelskiej 1, 71-252 Szczecin Kierownik: dr hab. n. med. Anna Walecka Summary Prion diseases are transmissible neurodegenerative conditions that include Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) in humans and bovine spongiform encephalopathy and scrapie in animals. The normal cellular prion protein (PrP c ) is a membrane sialoglycoprotein of unknown function having the unique property of adopting an abnormal tertiary conformation. The pathological conformer (PrP sc ) would be the agent of transmissible spongiform encephalopathies or prion diseases. Prion propagation involves recruitment of host cellular prion protein, primarily of alpha-helical structure, into a disease-specific isoform rich in betasheet structure. The existence of multiple prion strains has been difficult to explain in terms of a protein-only infectious agent, but recent studies suggest that strain specific phenotypes can be encoded by different prion protein conformations and glycosylation patterns. It is an intriguing proposition that the post-translational modifications alone, or in combination with amino acid changes, play dominant roles in the pathogenic transformation of PrP c to PrP sc. Prion diseases are unique in that they comprise sporadic, genetic (autosomal dominant inheritance), and iatrogenically or environmentally acquired forms. Point mutations in the prion protein gene lead to neurodegenerative disease. K e y w o r d s: PrP c and PrP sc proteins mutations prion diseases. Streszczenie Białko prionu o prawidłowej strukturze (PrP c ) wchodzi w skład błon komórkowych i jest sialoglikoproteiną. Choroba prionowa pojawia się, gdy obecne w komórce prawidłowe białko PrP c zmienia strukturę przestrzenną (α-helisy) na właściwą dla białka prionu o zmienionej strukturze PrP sc (β-struktury). Powstałe białko PrP sc łączy się z innym PrP c, wymuszając zmianę ich budowy przestrzennej. Białko PrP sc jest przyczyną wielu chorób zwyrodnieniowych ośrodkowego układu nerwowego określanych łącznie mianem encefalopatii gąbczastych. Do chorób tych u ludzi należą choroby: kuru, Creutzfelda Jacoba, Gerstmanna Sträussera Scheinkera, śmiertelna rodzinna bezsenność. Choroby prionowe mogą być wynikiem zarażenia, dziedziczenia (autosomalnie dominująco) lub pojawiać się spontanicznie. Białka PrP c i PrP sc są kodowane przez ten sam gen, zlokalizowany u człowieka na chromosomie 20. Gen ten składa się z dwóch eksonów. PrP sc różni się od PrP c najczęściej pojedynczą mutacją punktową. H a s ł a: białka PrP c i PrP sc mutacje choroby prionowe. Białko PrP sc jako czynnik infekcyjny Prion (proteinaceous infectious particle) jest czynnikiem infekcyjnym składającym się jedynie z patologicznego białka prionu o zmienionej strukturze PrP sc (nie zawiera kwasu nu-

6 Monika Rać, Michał Rać kleinowego) o odmiennej konformacji przestrzennej od białka komórkowego prionu o prawidłowej strukturze (PrP c ) [1, 2]. Dlatego też czynnik zakaźny choroby prionowej, wnikając do organizmu nie powoduje powstawania przeciwciał i stanów zapalnych, jest trudny do wykrycia, a zakażenie niełatwe do rozpoznania w postępowaniu diagnostycznym. Choroba prionowa pojawia się, gdy obecne w komórce prawidłowe białko PrP c zmienia strukturę przestrzenną (α-helisy) na właściwą dla PrP sc (β-struktury) rycina 1 [3]. W hodowlach komórkowych przekształcenie natywnego białka w białko typu PrP sc zachodzi wewnątrz neuronów. Białko o wadliwej strukturze gromadzi się w nadmiarze w lizosomach, co pobudza je do wydzielenia enzymów niszczących komórkę. W wyniku rozpadu komórki białko PrP sc dostaje się do przestrzeni międzykomórkowych i zakaża kolejne komórki (PrP sc łączy się z innym PrP c, wymuszając ich zmianę budowy przestrzennej) [4, 5, 6, 7]. Konwersja PrP c w PrP sc jest gatunkowo specyficzna [8]. Ilość czynnika patogennego narasta w postępie wykładniczym. Przyczyną choroby jest zmieniony kształt przestrzenny białka, a nie odpowiednia sekwencja DNA czy RNA. Następnie PrP sc odkłada się w mózgu w postaci blaszek amyloidowych lub tzw. synaptycznych depozytów PrP c (ryc. 2). Z kolei tkanka nerwowa może zanikać w wyniku uprzątania jej przez mikroglej, a powstające przestrzenie zapełnia płyn. Mają one nieregularne rozmieszczenie, przez co tkanka mózgowa przypomina wyglądem gąbkę [6, 9]. Amyloid jest substancją niejednorodną chemicznie i może być tworzony przez różne białka, między innymi: lekkie łańcuchy immunoglobulin, transtyretynę, apolipoproteinę A-I, gelsolinę, cystatynę C, białko prionowe. Białko amyloidu jest zwykle hydrofobowe, trudno rozpuszczalne w warunkach fizjologicznych, odporne na rozkład proteolityczny, a w procesie chorobowym zawiera mutację zazwyczaj w jednej pozycji aminokwasowej [10, 11]. Ryc. 2. Schemat rozwoju choroby prionowej Fig. 2. Progress of prion disease Struktura genu i białek PrP c i PrP sc Białka PrP c i PrP sc są kodowane przez ten sam gen zlokalizowany u człowieka na chromosomie 20 [12]. Gen kodujący białko prionu składa się z dwóch eksonów (tab. 1). Ekson pierwszy jest niekodujący i zawiera sekwencję 5`końcową, podczas gdy ekson drugi koduje 254 aminokwasy (ryc. 3) a) b) Ryc. 1. Proponowany przestrzenny model białka: a) PrP c, b) PrP sc Fig. 1. Spatial model of the prion protein: a) PrP c, b) PrP sc

Molekularne podstawy chorób prionowych 7 T a b e l a 1. Eksony, intron i mutacje w ludzkim genie prionu [13] T a b l e 1. Exons, intron and mutations in the human prion gene [13] Numer exonu Exon number Wielkość intronu Length of intron Nukleotydy w mrna mrna nucleotides Kodowane aninokwasy Amino acids encoded Zmiany w sekwencji nukleotydów Changes in nucleotide sequence Zmiany w sekwencji aminokwasowej Changes in amino acid sequence Piśm. Ref. 1 12 698-100 -11 żaden / none 2-10 +254 1 254 T204C C305T C313A C314T C350T A351G C372G A385G C414G T435G C478T G483A A512G C519T C531T G532A G538A A547G A560G A562G C563G C563A G564A G586A T593C G598A G604A C606T G607A G623A C624T G628A G631C A635G G636A A650G G655A A684G G690A T695G C712T C314T + A385G A385G + G532A G538A + T695G G598A + G655A Pro68Pro Pro102Leu Pro105Thr Pro105Leu Ala117Val Ala117Ala Gly124Gly Met129Val Ile138Met Tyr145stop Gln160stop Val161Val Asn171Ser Asn173Asn His177His Asp178Asn Val180Ile Thr183Ala His187Arg Thr188Ala Thr188Arg Thr188Lys Thr188Thr Glu196Lys Phe198Ser Glu200Lys Asp202Asn Asp202Asp Val203Ile Arg208His Arg208Arg Val210Ile Glu211Gln Gln212Arg Gln212Gln Gln217Arg Glu219Lys Arg228Arg Ser230Ser Met232Arg Pro238Ser Pro1/Leu + Met/Val Met/Val + Asp/Asn Val/Ile + Met/Arg Glu/Lys + Glu/Lys 14 15 16 17 18 15 19 18 20 21 22 19 23 20 24 25 17 26 27 28 14 22 20 29 30 31 32 20 29 33 20 34 29 32 14 30 35 14 14 17 14 36 37 38 39

8 Monika Rać, Michał Rać 1 ATG GCG AAC CTT GGC TGC TGG ATG CTG GTT CTC TTT GTG GCC ACA TGG 1 Met Ala Asn Leu Gly Cys Trp Met Leu Val Leu Phe Val Ala Thr Trp 49 AGT GAC CTG GGC CTC TGC AAG AAG CGC CCG AAG CCT GGA GGA TGG AAC 17 Ser Asp Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn 97 ACT GGG GGC AGC CGA TAC CCG GGG CAG GGC AGC CCT GGA GGC AAC CGC 33 Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg 145 TAC CCA CCT CAG GGC GGT GGT GGC TGG GGG CAG CCT CAT GGT GGT GGC 49 Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly 193 TGG GGG CAG CCT CAT GGT GGT GGC TGG GGG CAG CCC CAT GGT GGT GGC 65 Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly 241 TGG GGA CAG CCT CAT GGT GGT GGC TGG GGT CAA GGA GGT GGC ACC CAC 81 Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His 289 AGT CAG TGG AAC AAG CCG AGT AAG CCA AAA ACC AAC ATG AAG CAC ATG 97 Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met 337 GCT GGT GCT GCA GCA GCT GGG GCA GTG GTG GGG GGC CTT GGC GGC TAC 113 Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr 385 ATG CTG GGA AGT GCC ATG AGC AGG CCC ATC ATA CAT TTC GGC AGT GAC 129 Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Ile Ile His Phe Gly Ser Asp 433 TAT GAG GAC CGT TAC TAT CGT GAA AAC ATG CAC CGT TAC CCC AAC CAA 145 Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gln 481 GTG TAC TAC AGG CCC ATG GAT GAG TAC AGC AAC CAG AAC AAC TTT GTG 161 Val Tyr Tyr Arg Pro Met Asp Glu Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val 529 CAC GAC TGC GTC AAT ATC ACA ATC AAG CAG CAC ACG GTC ACC ACA ACC 177 His Asp Cys Val Asn Ile Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr 577 ACC AAG GGG GAG AAC TTC ACC GAG ACC GAC GTT AAG ATG ATG GAG CGC 193 Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Val Lys Met Met Glu Arg 625 GTG GTT GAG CAG ATG TGT ATC ACC CAG TAC GAG AGG GAA TCT CAG GCC 209 Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Glu Arg Glu Ser Gln Ala 673 TAT TAC CAG AGA GGA TCG AGC ATG GTC CTC TTC TCC TCT CCA CCT GTG 225 Tyr Tyr Gln Arg Gly Ser Ser Met Val Leu Phe Ser Ser Pro Pro Val 721 ATC CTC CTG ATC TCT TTC CTC ATC TTC CTG ATA GTG GGA TGA 241 Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly END Ryc. 3. Sekwencja aminokwasowa i cdna PrP c [45] Fig. 3. cdna nucleotides and AA sequence information of PrP c [45] kursorowego PrP 33 35 sc (33 35 kda, sc scarpie) [46, 47, 48]. W wyniku modyfikacji potranslacyjnych prawidłowe białka prionu o strukturze trzeciorzędowej, zawierającej trzy α-helisy, zmienia budowę na patogenne białko z przewagą β-struktur rycina 1 [49, 50, 51]. Beta-struktura (pofałdowanej kartki) powstaje przez glikozylacię w miejscu Asn181 i Asn197 [51]. Oba białka u człowieka składają się z tej samej ilości aminokwasów [41]. W konwersji PrP c -PrP sc bierze udział dodatkowy komponent białko X [52, 53]. Białko PrP sc jest jedynie trwalsze, nie wbudowuje się w błony i gromadzi się w pęcherzykach wewnątrzkomórkowych. Różnic tych nie rozpoznaje jednak układ odpornościowy, a pojawienie się w organizmie białka o zmienionej strukturze przestrzennej nie pobudza limfocytów do reakcji obronnej [54]. Badając czynnik zakaźny Prusiner [55], stwierdził, oraz region 3`końcowy [40]. Białka PrP c różnych zwierząt są podobnej wielkości i mają podobną sekwencję aminokwasową [41]. Taką stałość budowy obserwuje się zazwyczaj, gdy dane białko pełni istotną dla organizmu rolę, niezależnie od szczebla rozwoju tego organizmu. Nie wiadomo jednak jaką funkcję pełni w organizmie białko PrP c. Wchodzi ono w skład błon komórkowych, jest sialoglikoproteiną i stale podlega procesom syntezy i rozpadu [42, 43, 44]. Białko prionu o ciężarze 27 30 kda (PrP 27 30) jest produktem ograniczonej proteolizy większego białka preże jest on względnie trwały w obecności enzymów proteolitycznych, traci aktywność po kontakcie z niektórymi detergentami, fenolem oraz ługiem i jest odporny na enzymy rozkładające kwasy nukleinowe, a także na 70% alkohol etylowy, kwasy, wysoką temperaturę, promieniowanie ultrafioletowe. Wszystko to sugeruje, że jest on raczej białkiem niż kwasem nukleinowym [40, 55]. Mutacje genu PrP c i PrP sc i ich kliniczne konsekwencje Istnieją różne hipotezy na temat czynnika zakaźnego w chorobach prionowych. Uważa się [51], że konwersja PrP c w PrP sc wywołana jest przede wszystkim mutacją i: jest warunkiem koniecznym i wystarczającym do wystąpienia objawów choroby [9] lub zwiększa wrażliwość na zakażenie dotychczas niezidentyfikowanym wirusem [56, 57] lub jest indukowana przez dotychczas niewykryty wirus [58] lub tworzy chimerę molekularną wirusospecyficznego oligonukleotydu, w którym PrPsc jest częścią czynnika infekcyjnego [59]. Gen PrP sc różni się od PrP c najczęściej pojedynczą mutacją punktową, rzadziej dwoma sprzężonymi mutacjami punktowymi lub delecją krótkiego odcinka nukleotydów. Dotychczas opisano następujące mutacje w genie kodującym białko prionu: a) substytucje pojedynczego nukleotydu (tab. 1): substytucja T/C w kodonie 68 prowadząca do mutacji milczącej [14], substytucja C/T w kodonie 102 prowadząca do substytucji proliny przez leucynę [15], substytucja C/A w kodonie 105 prowadząca do substytucji proliny przez treoninę [16], substytucja C/T w kodonie 105 prowadząca do substytucji proliny przez leucynę [17], substytucja C/T w kodonie 117 prowadząca do substytucji alaniny przez walinę [18], substytucja A/G w kodonie 117 prowadząca do mutacji milczącej [15], substytucja C/G w kodonie 124 prowadząca do mutacji milczącej [19], substytucja A/G w kodonie 129 prowadząca do substytucji metioniny przez walinę [18], substytucja C/G w kodonie 138 prowadząca do substytucji izoleucyny przez metioninę [20], substytucja T/G w kodonie 145 prowadząca do skrócenia ramki odczytu [21], substytucja C/T w kodonie 160 prowadząca do skrócenia ramki odczytu [22], substytucja G/A w kodonie 161 prowadząca do mutacji milczącej [19], substytucja A/G w kodonie 171 prowadząca do substytucji asparaginy przez serynę [23],

Molekularne podstawy chorób prionowych 9 substytucja C/T w kodonie 173 prowadząca do mutacji milczącej [20], substytucja C/T w kodonie 177 prowadząca do mutacji milczącej [24], substytucja G/A w kodonie 178 prowadząca do substytucji aspraginianu przez asparaginę [25], substytucja G/A w kodonie 180 prowadząca do substytucji waliny przez izoleucynę [17], substytucja A/G w kodonie 183 prowadząca do substytucji treoniny przez alaninę [26], substytucja A/G w kodonie 187 prowadząca do substytucji histydyny przez argininę [27], substytucja A/G w kodonie 188 prowadząca do substytucji treoniny przez alaninę [46], substytucja C/G w kodonie 188 prowadząca do substytucji treoniny przez argininę [32], substytucja C/G w kodonie 188 prowadząca do substytucji treoniny przez lizynę [40], substytucja G/A w kodonie 188 prowadząca do mutacji milczącej [20], substytucja G/A w kodonie 196 prowadząca do substytucji glutaminianu przez lizynę [29], substytucja T/C w kodonie 198 prowadząca do substytucji fenyloalaniny przez serynę [30], substytucja G/A w kodonie 200 prowadząca do substytucji glutaminianu przez lizynę [31], substytucja G/A w kodonie 202 prowadząca do substytucji asparaginianu przez asparaginę [32], substytucja C/T w kodonie 202 prowadząca do mutacji milczącej [20], substytucja G/A w kodonie 203 prowadząca do substytucji waliny przez izoleucynę [29], substytucja G/A w kodonie 208 prowadząca do substytucji argininy przez histydynę [33], substytucja C/T w kodonie 208 prowadząca do mutacji milczącej [20], substytucja G/A w kodonie 210 prowadząca do substytucji waliny przez izoleucynę [34], substytucja G/C w kodonie 211 prowadząca do substytucji glutaminianu przez glutaminę [29], substytucja A/G w kodonie 212 prowadząca do substytucji glutaminy przez argininę [32], substytucja G/A w kodonie 212 prowadząca do mutacji milczącej [14], substytucja A/G w kodonie 217 prowadząca do substytucji glutaminy przez argininę [30], substytucja G/A w kodonie 219 prowadząca do substytucji glutaminianu przez lizynę [35], substytucja A/G w kodonie 228 prowadząca do mutacji milczącej [14], substytucja G/A w kodonie 230 prowadząca do mutacji milczącej [14], substytucja T/G w kodonie 232 prowadząca do substytucji metioniny przez argininę [17], substytucja C/T w kodonie 238 prowadząca do substytucji proliny przez serynę [14], substytucja C/T w kodonie 105 prowadząca do substytucji proliny przez leucynę sprzężona z substytucją A/G w kodonie 129 prowadzącą do substytucji metioniny przez walinę [36], substytucja A/G w kodonie 129 prowadząca do substytucji metioniny przez walinę sprzężona z substytucją G/A w kodonie 178 prowadzącą do substytucji asparaginianu przez asparaginę [37], substytucja G/A w kodonie 180 prowadząca do substytucji waliny przez izoleucynę sprzężona z substytucją T/G w kodonie 232 prowadzącą do substytucji metioniny przez argininę [38], substytucja G/A w kodonie 200 prowadząca do substytucji glutaminianu przez lizynę sprzężona z substytucją G/A w kodonie 219 prowadzącą do substytucji glutaminianu przez lizynę [39]; b) krótkie delecje delecja 24 nukleotydów w kodonach 54 61 lub 62 69 [34], delecja 20 nukleotydów rozpoczynająca się od kodonu 76 [60], delecja 24 nukleotydów zmiennie, w obszarze 246-269 nukleotydu [61, 62, 63]. Białko PrP sc jest przyczyną wielu chorób zwyrodnieniowych ośrodkowego układu nerwowego określanych łącznie mianem encefalopatii gąbczastych (tab. 2, ryc. 4) [64]. Do chorób tych u ludzi należą: choroba kuru, choroba Creutzfeldta Jakoba (CJD), nowa wersja CJD (variant CJD vcjd, iatrogenic CJD icjd, sporadic CJD scjd), choroba Gerstmanna Sträussera Scheinkera (Gerstmann Sträusser Scheinker disease GSS), śmiertelna rodzinna bezsenność (fatal familial insomnia FFI) [40]. W związku z podobną symptomatologią, odróżnienie jednej choroby wywołanej przez priony od drugiej jest bardzo trudne. Ich wspólną cechą jest to, że przebieg charakteryzuje się zarówno występowaniem ciężkich zespołów otępiennych, jak i silnie Ryc. 4. Przykładowe obrazy tomografii rezonansu magnetycznego mózgowia (sekwencja FLAIR) pacjenta z chorobą Creutzfelda-Jacoba prezentujące zaawansowane zaniki korowo-podkorowe mózgu oraz zmiany demielinizacyjne isototy białej (materiał z archiwum Zakładu Diagnostyki Obrazowej i Radiologii Interwencyjnej Pomorskiej Akademii Medycznej) Fig. 4. Example MR images of a brain in patient with Creutzfeld-Jacob disease presenting cortico-subcortical atrophy and periventricular demyelinisation of white matter (from the archive of Department of Diagnostic Imaging and Interventional Radiology of Pomeranian Medical University)

10 Monika Rać, Michał Rać T a b e l a 2. Choroby prionowe występujące u ludzi T a b l e 2. Human prion diseases Kuru Choroba Disease Choroba Creutzfeldta Jakoba Creutzfeldt-Jakob Disease CJD vcjd Źródło zarażenia Source of infection infekcja rytualny kanibalizm infection ritual cannibalism dziedziczna mutacja w obrębie genu PrP hereditary mutation in the PrP gene infekcja od krów infection from cows Występowanie Incidence wyłącznie w górzystych terenach Papua i Nowa Gwinea exclusively in mountainous areas of Papua New Guinea znanych jest ok. 100 rodzin, w których występuje szczególnie często / clusters of CJD in some 100 families Typowe objawy Symptoms utrata koordynacji ruchów, często z towarzyszącym otępieniem / loss of coordinated movements often accompanied by dementia otępienie z towarzyszącą utratą koordynacji ruchów dementia accompanied by loss of coordinated movements Czas trwania choroby (od objawów do zgonu) Disease duration (from first symptoms to death) od 3 miesięcy do roku 3 months to 1 year od 1 miesiąca do 10 lat, na ogół ok. roku 1 month to 10 years, usually 1 year icjd zakażenie będące następstwem działania lekarskiego (przeszczep narządu, podanie hormonu wzrostu, kosmetyki zanieczyszczone prionami) iatrogenic infection (organ grafting, growth hormone injection, cosmetics containing prions) znanych ok. 100 przypadków some 100 cases have been described scjd Choroba Gerstmanna Sträussera Scheinkera Gerstmann Sträusser Scheinker Disease Śmiertelna rodzinna bezsenność (FFI)v Fatal familial insomnia (FFI)v mutacja lub spontaniczna konwersja PrP c w PrP sc mutation or spontaneous conversion of PrP c to PrP sc dziedziczna mutacja w obrębie genu PrP hereditary mutation in the PrP gene dziedziczna mutacja w obrębie genu PrP hereditary mutation in the PrP gene 1/mln osób 1 mln persons znanych jest ok. 50 rodzin, w których występuje szczególnie często clusters of this disease in some 50 families znanych jest 9 rodzin, w których choroba ta występuje / 9 families with this disease have been identified utrata koordynacji ruchów oraz otępienie loss of coordinated movements and dementia zaburzenia snu, objawy ze strony autonomicznego układu nerwowego, bezsenność i otępienie / disorders of sleep, symptoms from the autonomous nervous system, insomnia and dementia na ogół od 2 do 6 lat usually 2 to 6 years około roku approx. 1 year wyrażonym upośledzeniem czynności ruchowych. Ponadto wszystkie te schorzenia cechuje długi czas inkubacji, niekiedy do trzydziestu lat [65]. U zwierząt priony powodują: chorobę szalonych krów (bovine spongiform encephalopathy BSE), scarpie u owiec i kóz oraz pasażowalne encefalopatie: kotów (feline spongiform encephalopathy FSE), norek (transmissible mink encephalopathy TME), łosi, wielouszych jeleni, antylop kudu, pum, strusi, gepardów, ocelotów, tygrysów, świń, myszy, chomików, małp [40]. Choroby prionowe mogą być wynikiem zarażenia, dziedziczenia (autosomalnie dominującego) lub pojawiać się spontanicznie [66, 67]. Scrapie choroba owiec, zaczęła przenosić się na przedstawicieli innych gatunków na skutek stosowania resztek zwierzęcych jako substratu do produkcji treściwej karmy dla zwierząt. Szczególnie podatne na zakażenia są następujące narządy wewnętrzne: rdzeń kręgowy, mózg,

Molekularne podstawy chorób prionowych 11 migdałki, trzustka, żołądek, śledziona, układ żółciowy, wątroba, jelita. Związek niektórych postaci CJD u ludzi z BSE wydaje się bardzo prawdopodobny [65, 66, 68]. Białko PrP sc może się dostać do organizmu różnymi drogami, na skutek zabiegów lekarskich: przez wstrzyknięcie wprost do mózgu, dootrzewnowo, dożylnie lub z pokarmem. Zaobserwowano, że potrzeba aż 100 tysięcy cząsteczek nierozpuszczalnej formy prionu (PrP sc ) by uzyskać dawkę zakaźną. Formę nierozpuszczalną można przekształcić poza komórką w rozpuszczalną, a następnie powrócić do formy wyjściowej. Tak uzyskany preparat nie jest już zakaźny [66, 67]. Rola proteinazy K w proteolizie PrP c i PrP sc Proteinaza K jest niespecyficzną endopeptydazą, o masie molekularnej 28,790 Da, składającą się z 279 reszt aminokwasowych, zawierającą w swoim centrum katalitycznym serynę, i bierze udział w wewnątrzkomórkowej degradacji białek. Optimum działania enzymu mieści się w ph 7,5 12,0 i jest on tremostabilny (przeprowadza proces hydratacji w zakresie temperatur 37 177 C). Jest enzymem sklasyfikowanym pod numerem: E.C. 3.4.21.14. oraz E.C. 3.4.21.64. (wersja bez jonów wapnia) [69]. Białka PrP c i PrP sc różnią się niektórymi własnościami fizykochemicznymi, między innymi w wyniku trawienia proteinazą K w obecności detergentu PrP c ulega całkowitej, a PrP sc jedynie częściowej proteolizie, uwalniając rdzeń PrP 27 30 [46, 70]. Zaobserwowana oporność białka prionu na trawienie proteinazą K koreluje ze zwiększającą się wraz z wiekiem zawartością proteolipidów w organizmie. Choroba vcjd spowodowana czynnikiem PrP sc, wykazuje charakterystyczny czas inkubacji, objaw kliniczny i obraz zmian patologicznych w mózgu oraz charakterystyczny obraz trawienia białka PrP sc proteinazą K z uwzględnieniem tzw. wzorca glikozylacji fragmentów po proteolizie. Opisując biochemiczny charakter białka PrP sc, podkreśla się jego oporność na hydrolizę proteinazą K [42, 71]. Jedną z możliwości wytłumaczenia takiego stanu jest to, że priony przybierają wiele rodzajów konfiguracji przestrzennej. Jeden typ przekształconego białka może wykazywać powinowactwo do pewnej populacji neuronów w mózgu, natomiast drugi do innej, w wyniku czego występują zupełnie inne objawy chorobowe. Ponieważ prion może rozwijać się na co najmniej dwa sposoby, nie będzie zaskoczeniem znalezienie form zwiniętych przestrzennie zupełnie inaczej. Stwierdzono in vitro, że białka prionowe wykazują różną oporność na trawienie proteinazą K w zależności od ich pochodzenia. Forma infekcyjna, nazwana scarpie PrP, jest oporna na proteazy, tak samo jest w przypadku CJD, PrP sc w GSS jest oporny tylko częściowo (tzn. tylko wariant z mutacją w 198 kodonie). Prion oporny na proteinazę K znaleziono także u pacjentów z FFI. Zaobserwowano również, że alkaliczne ph (> 10) oraz wysokie stężenie mocznika (> 3M) może znacznie obniżyć oporność PrP sc na działanie hydrolityczne proteinazy K. Również wzrastająca koncentracja 1, 1, 1, 3, 3, 3-heksafluoro-2-propanu powoduje obniżenie stężenia form opornych na działanie proteinazy K (PrP 27 30) [52, 72]. Badania prowadzone przez wiele ośrodków naukowych pozwolą określić czy priony odgrywają rolę w bardziej powszechnych chorobach neurologicznych, takich jak choroba Alzheimera, Huntingtona, Parkinsona czy stwardnienie rozsiane. Choroby te łączą znaczne podobieństwa: przybierają one formy sporadyczne, czasami atakują całe rodziny; są chorobami średniego lub późnego wieku; mają podobny obraz patologiczny następuje degeneracja neuronów, akumulacja białka w postaci płytek, powiększenie komórek glejowych; w żadnej z tych chorób nie występują nacieki leukocytarne w tkance mózgowej [64, 73, 74]. Niestety, pomimo coraz większej wiedzy na temat podstaw encefalopatii gąbczastych, w tym opisanych chorób prionowych, wciąż pozostają one nieuleczalnymi. Piśmiennictwo 1. Prusiner S.B.: Molecular biology and genetics of prion diseases. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 1994, 343, 447 463. 2. Prusiner S.B., Scott M.: Genetics of prions. Annu. Rev. Genet. 1997, 31, 139 175. 3. Ross E.D., Minton A., Wickner R.B.: Prion domains: sequences, structures and interactions. Nat. Cell Biol. 2005, 7, 1039 1044. 4. Prado M.A, Alves-Silva J., Magalhaes A.C., Prado V.F., Linden R., Martins V.R. et al.: PrP c on the road: trafficking of the cellular prion protein. J. Neurochem. 2004, 88, 769 781. 5. Martins V.R.: A receptor for infectious and cellular prion protein. Braz. J. Med. Biol. Res. 1999, 32, 853 859. 6. Caughey B.: Prion protein interconversions. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2001, 356, 197 200. 7. Chakraborty C., Nandi S., Jana S.: Prion disease: a deadly disease for protein misfolding. Curr. Pharm. Biotechnol. 2005, 6, 167 177. 8. Kocisko D.A., Come J.H., Priola S.A., Chesebro B., Raymond G.J., Lansbury P.T. et al.: Cell-free formation of protease-resistant prion protein. Nature, 1994, 370, 471 474. 9. Prusiner S.B.: Molecular biology of prion diseases. Science, 1991, 252, 1515 1522. 10. Makin O.S., Serpell L.C.: Structures for amyloid fibrils. FEBS J. 2005, 272, 5950 5961. 11. Zerovnik E.: Amyloid-fibril formation. Proposed mechanisms and relevance to conformational disease. Eur. J. Biochem. 2002, 269, 3362 3371. 12. Sparkes R.S., Simon M., Cohn V.H., Fournier R.E., Lem J., Klisak I. et al.: Assignment of the human and mouse prion protein genes to homologous chromosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 7358 7362. 13. Internetowa baza danych Human Prion Point Mutations. http://www. mad-cow.org/prion_point_mutations.html (15.03.2006). 14. Windl O., Giese A., Schulz-Schaeffer W., Zerr I., Skworc K., Arendt S. et al.: Molecular genetics of human prion diseases in Germany. Hum. Genet. 1999, 105, 244 252. 15. Hsiao K., Baker H.F., Crow T.J., Poulter M., Owen F., Terwilliger J.D. et al.: Linkage of a prion protein missense variant to Gerstmann Straussler syndrome. Nature, 1989, 338, 342 345. 16. Liberski P.P., Barcikowska M., Cervenakova L., Bratosiewicz J., Marczewska M., Brown P. et al.: A case of sporadic Creutzfeldt Jakob disease with a Gerstmann Straussler Scheinker phenotype but no alterations in the PRNP gene. Acta Neuropathol. (Berl), 1998, 96, 425 430.

12 Monika Rać, Michał Rać 17. Kitamoto T., Ohta M., Doh-ura K., Hitoshi S., Terao Y., Tateishi J.: Novel missense variants of prion protein in Creutzfeldt Jakob disease or Gerstmann Straussler syndrome. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993, 191, 709 714. 18. Doh-ura K., Tateishi J., Sasaki H., Kitamoto T., Sakaki Y.: Pro Leu change at position 102 of prion protein is the most common but not the sole mutation related to Gerstmann Straussler syndrome. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989, 163, 974 979. 19. Prusiner S.B.: Prion diseases and the BSE crisis. Science, 1997, 278, 245 251. 20. Laplanche J.L., Hachimi K.H., Durieux I., Thuillet P., Defebvre L., Delasnerie-Laupretre N. et al.: Prominent psychiatric features and early onset in an inherited prion disease with a new insertional mutation in the prion protein gene. Brain, 1999, 122, 2375 2386. 21. Ghetti B., Piccardo P., Spillantini M.G., Ichimiya Y., Porro M., Perini F. et al.: Vascular variant of prion protein cerebral amyloidosis with tau-positive neurofibrillary tangles: the phenotype of the stop codon 145 mutation in PRNP. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 744 748. 2 2. Finckh U., Muller-Thomsen T., Mann U., Eggers C., Marksteiner J., Meins W. et al.: High prevalence of pathogenic mutations in patients with early-onset dementia detected by sequence analyses of four different genes. Am. J. Hum. Genet. 2000, 66, 110 117. 2 3. Samaia H.B., Mari J.J., Vallada H.P., Moura R.P., Simpson A.J., Brentani R.R.: A prion-linked psychiatric disorder. Nature, 1997, 390, 241. 24. Ripoll L., Laplanche J.L., Salzmann M., Jouvet A., Planques B., Dussaucy M. et al.: A new point mutation in the prion protein gene at codon 210 in Creutzfeldt Jakob disease. Neurology, 1993, 43, 1934-1938. 25. Goldfarb L.G., Haltia M., Brown P., Nieto A., Kovanen J., McCombie W.R. et al.: New mutation in scrapie amyloid precursor gene (at codon 178) in finnish Creutzfeldt Jakob kindred. Lancet, 1991, 337, 425. 26. Nitrini R., Rosemberg S., Passos-Bueno M.R., da Silva L.S., Iughetti P., Papadopoulos M. et al.: Familial spongiform encephalopathy associated with a novel prion protein gene mutation. Ann. Neurol. 1997, 42, 138 146. 27. Cervenakova L., Buetefisch C., Lee H.S., Taller I., Stone G., Gibbs C.J. Jr. et al.: Novel PRNP sequence variant associated with familial encephalopathy. Am. J. Med. Genet. 1999, 88, 653 656. 2 8. Collins S., Boyd A., Fletcher A., Byron K., Harper C., McLean C.A. et al.: Novel prion protein gene mutation in an octogenarian with Creutzfeldt Jakob disease. Arch. Neurol. 2000, 57, 1058 1063. 29. Peoc h K., Manivet P., Beaudry P., Attane F., Besson G., Hannequin D. et al.: Identification of three novel mutations (E196K, V203I, E211Q) in the prion protein gene (PRNP) in inherited prion diseases with Creutzfeldt Jakob disease phenotype. Hum. Mutat. 2000, 15, 482. 30. Hsiao K., Dlouhy S.R., Farlow M.R., Cass C., Da Costa M., Conneally P.M. et al.: Mutant prion proteins in Gerstmann Straussler Scheinker disease with neurofibrillary tangles. Nat. Genet. 1992, 1, 68 71. 31. Goldgaber D., Goldfarb L.G., Brown P., Asher D.M., Brown W.T., Lin S. et al.: Mutations in familial Creutzfeldt Jakob disease and Gerstmann Straussler Scheinker s syndrome. Exp. Neurol. 1989, 106, 204 206. 32. Piccardo P., Dlouhy S.R., Lievens P.M., Young K., Bird T.D., Nochlin D. et al.: Phenotypic variability of Gerstmann Straussler Scheinker disease is associated with prion protein heterogeneity. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1998, 57, 979 988. 33. Mastrianni J.A., Iannicola C., Myers R.M., DeArmond S., Prusiner S.B.: Mutation of the prion protein gene at codon 208 in familial Creutzfeldt Jakob disease. Neurology, 1996, 47, 1305 1312. 3 4. Pocchiari M., Salvatore M., Cutruzzola F., Genuardi M., Allocatelli C.T., Masullo C. et al.: A new point mutation of the prion protein gene in Creutzfeldt Jakob disease. Ann. Neurol. 1993, 34, 802 807. 35. Barbanti P., Fabbrini G., Salvatore M., Petraroli R., Cardone F., Maras B. et al.: Polymorphism at codon 129 or codon 219 of PRNP and clinical heterogeneity in a previously unreported family with Gerstmann Straussler Scheinker disease (PrP P102L mutation). Neurology, 1996, 47, 734 741. 36. Yamada M., Itoh Y., Inaba A., Wada Y., Takashima M., Satoh S. et al.: An inherited prion disease with a PrP P105L mutation: clinicopathologic and PrP heterogeneity. Neurology, 1999, 53, 181 188. 37. Reder A.T., Mednick A.S., Brown P., Spire J.P., Van Cauter E., Wollmann R.L. et al.: Clinical and genetic studies of fatal familial insomnia. Neurology, 1995, 45, 1068 1075. 38. Hitoshi S., Nagura H., Yamanouchi H., Kitamoto T.: Double mutations at codon 180 and codon 232 of the PRNP gene in an apparently sporadic case of Creutzfeldt Jakob disease. J. Neurol. Sci. 1993, 120, 208 212. 39. Seno H., Tashiro H., Ishino H., Inagaki T., Nagasaki M., Morikawa S.: New haplotype of familial Creutzfeldt Jakob disease with a codon 200 mutation and a codon 219 polymorphism of the prion protein gene in a Japanese family. Acta Neuropathol. (Berl), 2000, 99, 125 130. 4 0. Prusiner S.B.: Prions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 13363-13383. 41. Westaway D., Carlson G.A., Prusiner S.B.: Unraveling prion diseases through molecular genetics. Trends. Neurosci. 1989, 12, 221 227. 42. Bennion B.J., Daggett V.: Protein conformation and diagnostic tests: the prion protein. Clin. Chem. 2002, 48, 2105 2114. 43. Fournier J.G.: Nonneuronal cellular prion protein. Int. Rev. Cytol. 2001, 208, 121 160. 4 4. Weissmann C.: The state of the prion. Nat. Rev. Microbiol. 2004, 2, 861 871. 45. Internetowa baza danych Chip Bioinformatics. http://snpper.chip.org (15.03.2006). 46. Stahl N., Prusiner S.B.: Prions and prion proteins. FASEB J. 1991, 5, 2799 2807. 47. Chesebro B., Race R., Wehrly K., Nishio J., Bloom M., Lechner D. et al.: Identification of scrapie prion protein-specific mrna in scrapie-infected and uninfected brain. Nature, 1985, 315, 331 333. 4 8. Basler K., Oesch B., Scott M., Westaway D., Walchli M., Groth D.F. et al.: Scrapie and cellular PrP isoforms are encoded by the same chromosomal gene. Cell, 1986, 46, 417 428. 49. Prusiner S.B.: Biology and genetics of prion diseases. Annu. Rev. Microbiol. 1994, 48, 655 686. 5 0. Pan K.M., Baldwin M., Nguyen J., Gasset M., Serban A., Groth D. et al.: Conversion of alpha-helices into beta-sheets features in the formation of the scrapie prion proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 10962 10966. 51. Otvos L. Jr., Cudic M.: Post-translational modifications in prion proteins. Curr. Protein. Pept. Sci. 2002, 3, 643 652. 52. Baldwin M.A., Cohen F.E., Prusiner S.B.: Prion protein isoforms, a convergence of biological and structural investigations. J. Biol. Chem. 1995, 270, 19197 19200. 53. Telling G.C., Scott M., Mastrianni J., Gabizon R., Torchia M., Cohen F.E. et al.: Prion propagation in mice expressing human and chimeric PrP transgenes implicates the interaction of cellular PrP with another protein. Cell, 1995, 83, 79 90. 54. Wisniewski T., Brown D.R., Sigurdsson E.M.: Therapeutics in Alzheimer s and prion diseases. Biochem. Soc. Trans. 2002, 30, 574 578. 55. Prusiner S.B.: Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science, 1982, 216, 136 144. 56. Ikeda T., Horiuchi M., Ishiguro N., Muramatsu Y., Kai-Uwe G.D., Shinagawa M.: Amino acid polymorphisms of PrP with reference to onset of scrapie in Suffolk and Corriedale sheep in Japan. J. Gen. Virol. 1995, 76, 2577 2581. 57. Hunter N., Dann J.C., Bennett A.D., Somerville R.A., McConnell I., Hope J.: Are Sinc and the PrP gene congruent? Evidence from PrP gene analysis in Sinc congenic mice. J. Gen. Virol. 1992, 73, 2751 2755. 58. Weissmann C.: A unified theory of prion propagation. Nature, 1991, 352, 679 683. 59. Liberski P.P., Bratosiewicz J.: Transmissible cerebral amyloidoses or prion diseases: is the structure of the infectious agent really understood? Post. Biochem. 1996, 42, 320 330. 6 0. Laplanche J.L., Chatelain J., Thomas S., Brown P., Cathala F.: Analysis of the PrP gene in a Tunisian family with Creutzfeldt Jakob disease. Rev. Neurol. (Paris), 1991, 147, 825 827.

Molekularne podstawy chorób prionowych 13 61. Bosque P.J., Vnencak-Jones C.L., Johnson M.D., Whitlock J.A., McLean M.J.: A PrP gene codon 178 base substitution and a 24-bp interstitial deletion in familial Creutzfeldt Jakob disease. Neurology, 1992, 42, 1864 1870. 62. Vnencak-Jones C.L., Phillips J.A. 3 rd.: Identification of heterogeneous PrP gene deletions in controls by detection of allele-specific heteroduplexes (DASH). Am. J. Hum. Genet. 1992, 50, 871 872. 63. Masullo C., Salvatore M., Macchi G., Genuardi M., Pocchiari M.: Progressive dementia in a young patient with a homozygous deletion of the PrP gene. Ann. NY Acad. Sci. 1994, 724, 358 360. 6 4. Foguel D., Silva J.L.: New insights into the mechanisms of protein misfolding and aggregation in amyloidogenic diseases derived from pressure studies. Biochemistry, 2004, 43, 11361 11370. 65. Hacker A.: BSE choroba szalonych krów. PZWL, Warszawa 1998. 6 6. Rossi G., Salmona M., Forloni G., Bugiani O., Tagliavini F.: Therapeutic approaches to prion diseases. Clin. Lab. Med. 2003, 23, 187 208. 67. Brown D.R.: Molecular advances in understanding inherited prion diseases. Mol. Neurobiol. 2002, 25, 287 302. 6 8. Aguzzi A., Klein M.A., Montrasio F., Pekarik V., Brandner S., Furukawa H. et al.: Prions: pathogenesis and reverse genetics. Ann. NY Acad. Sci. 2000, 920, 140 157. 69. Dolashka P., Dimov I., Genov N., Svendsen I., Wilson K.S., Betzel C.: Fluorescence properties of native and photooxidised proteinase K: the X-ray model in the region of the two tryptophans. Biochim. Biophys. Acta. 1992, 1118, 303 312. 70. Oesch B., Westaway D., Walchli M., McKinley M.P., Kent S.B., Aebersold R. et al.: A cellular gene encodes scrapie PrP 27 30 protein. Cell, 1985, 40, 735 746. 71. Fernandez Garcia A., Heindl P., Voigt H., Buttner M., Wienhold D., Butz P. et al.: Reduced proteinase K resistance and infectivity of prions after pressure treatment at 60 degrees C. J. Gen. Virol. 2004, 85, 261 264. 72. Yamakawa Y., Hagiwara K., Nohtomi K., Nakamura Y., Nishijima M., Higuchi Y.: Atypical proteinase K-resistant prion protein (PrPres) observed in an apparently healthy 23-month-old Holstein steer. Jpn. J. Infect. Dis. 2003, 56, 221 222. 73. Johansson J.: Molecular determinants for amyloid fibril formation: lessons from lung surfactant protein C. Swiss. Med. Wkly, 2003, 133, 275 282. 74. Ross C.A., Poirier M.A.: Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nat. Med. 2004, Suppl. 10, 10 17.

ANNALES ACADEMIAE MEDICAE STETINENSIS ROCZNIKI POMORSKIEJ AKADEMII MEDYCZNEJ W SZCZECINIE ANNALS OF THE POMERANIAN MEDICAL UNIVERSITY 2006, 52, 3, 15 23 IWONA POZIOMKOWSKA-GĘSICKA REAKTYWNOŚĆ OSKRZELI NA ZASTOSOWANY WZIEWNIE SALBUTAMOL W ODNIESIENIU DO POLIMORFIZMU GENU KODUJĄCEGO RECEPTOR β 2 -ADRENERGICZNY* BRONCHI REACTION TO THE INHALED SALBUTAMOL ACCORDING TO THE POLYMORPHISMS OF β 2 -ADRENERGIC RECEPTOR* Katedra i Zakład Fizjologii Pomorskiej Akademii Medycznej al. Powstańców Wlkp. 72, 70-111 Szczecin Kierownik: prof. dr hab. n. med. Andrzej Paradowski Summary Introduction: The functioning of β 2 -adrenergic receptor (β 2 ADR) depends on its isoforms. Polymorphism of the β 2 ADR gene has been described, the most frequent being g.46a G and g.79c G. The reaction of the bronchi to inhaled salbutamol has now been studied in relation to g.46a G and g.79c G polymorphisms. For this purpose, spirometry was done in healthy males aged 20 26 years. Material and methods: The study group comprised 170 young men who were allocated to six groups according to the β 2 ADR genotype determined with PCR: g.46a G polymorphism (g.46aa, g.46gg, g.46ag), g.79c G polymorphism (g.79cc, g.79gg, g.79gc). Spirometric parameters were measured before and after inhalation of salbutamol. The results of the test were compared in g.46a G groups and g.79c G groups. Results: Administration of 200 μg of salbutamol significantly increased spirometrc parameters during forced expiration. However, changes were not specific for any genotype. Increase in PEF was significantly higher in g.46aa than g.46gg and in g.79cc than g.79gc genotypes. The distribution of genotypes was typical for the Caucasian population. K e y w o r d s: β 2 -adrenergic receptor gene polymorphism spirometry bronchodliator responce. Streszczenie Wstęp: Celem badań było uzyskanie odpowiedzi na pytanie, czy u młodych mężczyzn charakteryzujących się prawidłowymi wartościami wskaźników spirometrycznych, można podając jednorazowo salbutamol w dawce 200 µg, uzyskać wzrost wartości wskaźników, wskazujący na zmianę napięcia mięśni gładkich oskrzeli oraz czy istnieje zróżnicowanie reakcji na zastosowany β 2 -mimetyk w zależności od polimorfizmu g.46a G i g.79c G genu kodującego receptor β 2 -adrenergiczny. Materiał i metody: W badaniach wzięło udział 170 młodych mężczyzn, których podzielono, w zależności od stwierdzonego metodą PCR polimorfizmu genu kodującego receptor β 2 adrenergiczny, na grupy g.46a G (g.46aa, g.46ag, g.46gg) i g.79c G (g.79cc i g.79cg, g.79gg). Wartości wskaźników spirometrycznych zmierzone przed i po podaniu wziewnym salbutamolu, porównywano w obrębie grup g.46a G oraz g.79c G. * Zwięzła wersja rozprawy doktorskiej przyjęta przez Radę Wydziału Lekarskiego Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie. Promotor: prof. dr hab. n. med. Andrzej Paradowski. Oryginalny maszynopis obejmuje: 95 stron, 19 rycin, 17 tabel, 114 pozycji piśmiennictwa. * Concise version of doctoral thesis approved by the Council of the Faculty of Medicine, Pomeranian Medical University in Szczecin. Promotor: Prof. Andrzej Paradowski M.D., D.M.Sc. Habil. Original typescript comprises: 95 pages, 19 figures, 17 tables, 114 references.

16 IWONA POZIOMKOWSKA-GĘSICKA Wyniki: Zmiany wartości ocenianych parametrów obrazujących warunki przepływu powietrza w drogach oddechowych poza wskaźnikiem PEF nie różnicowały w istotny sposób porównywanych grup wyodrębnionych na podstawie polimorfizmu g.46a G i g.79c G genu kodującego β 2 ADR. Stwierdzono, że wzrost PEF w grupie g.46aa był istotnie większy od odnotowanego w grupie g.46gg, podobnie jak w grupie g.79cc w porównaniu do osób z genotypem g.79gc. H a s ł a: receptor β 2 -adrenergiczny polimorfizm genetyczny spirometria próba rozkurczowa. Wstęp Receptor β 2 -adrenergiczny (β 2 ADR) pełni istotną rolę w regulacji czynności układu oddechowego [1] przy nikłym unerwieniu oskrzeli przez układ współczulny. Wykazanie działania rozszerzającego oskrzela amin katecholowych, wchodzących w interakcję z β 2 ADR, zwróciło uwagę na możliwość udziału tego receptora w kształtowaniu reaktywności oskrzeli. Gen kodujący β 2 ADR został sklonowany przez Lefkowitza i wsp. w 1987 roku [2]. Znajduje się on na ramieniu długim chromosomu 5 (5q31 32), jest polimorficzny, pozbawiony intronów [3, 4, 5, 6]. Do tej pory wykryto obecność 9 jego mutacji punktowych, 5 z nich to zmiany degeneratywne, natomiast pozostałe miejsca polimorficzne, zlokalizowane w nukleotydach: 46, 79, 100 i 491, powodują zamianę aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym receptora, odpowiednio w pozycjach: 16, 27, 34 i 164 [7, 8]. Polimorfizm 16 kodonu związany z zamianą adeniny na guaninę (g.46a G) skutkuje zastąpieniem argininy przez glicynę w pozycji 16 łańcucha polipeptydowego receptora. Polimorfizm 27 kodonu β 2 ADR, polegający na zamianie cytozyny na guaninę (g.79c G), prowadzi do zastąpienia glutaminy przez kwas glutaminowy w pozycji 27 łańcucha receptora. Polimorfizm 16 kodonu β 2 ADR ma istotne znaczenie w transdukcji sygnału przez ten receptor. Genotyp g.46gg wiąże się ze znacznym spadkiem ekspresji receptora w odpowiedzi na izoprenalinę [9]. Chorzy na astmę, posiadający g.46gg, są 6-krotnie bardziej narażeni na cierpienie z powodu nocnych objawów i wykazują większy stopień nadreaktywności dróg oddechowych na histaminę [10]. Martinez i wsp. [9] zaobserwowali u dzieci posiadających g.46aa około 5-krotnie częściej pozytywną reakcję oskrzeli na pojedynczą dawkę albuterolu (salbutamol) w porównaniu do homozygot g.46gg oraz 2-krotnie częściej pozytywną odpowiedź na ten lek w porównaniu z dziećmi heterozygotycznymi g.46ag. Zależność astmy od uwarunkowań genetycznych nie jest jednoznaczna. Hopes i wsp. [11] w 1998 roku stwierdzili istotną zależność między obecnością g.79cc i astmą dziecięcą, a Ohe i wsp. [12] zależność pomiędzy polimorfizmem 175 kodonu a astmą wśród ludności Japonii. Hancox i wsp. [13] u osób z g.46gg nie zaobserwowali różnic pomiędzy nasileniem objawów chorobowych w przebiegu astmy w porównaniu do osób posiadających g.46aa. Taylor i wsp. [14] nie stwierdzili istotnych różnic w reakcji na salbutamol pomiędzy osobami będącymi homozygotami g.46aa i g.46gg. Izoformy receptora β 2 ADR kształtują odpowiedź mięśni gładkich oskrzeli, modyfikując interakcję ligand receptor. Przy podobnych zmianach obturacyjnych pacjenci reagują w różnym stopniu po takiej samej dawce leków rozszerzających oskrzela, w tym salbutamolu. W światowej strategii rozpoznawania, leczenia i prewencji astmy (Global Initiative for Asthma) zwracana jest uwaga na istnienie chorych podatnych i opornych na β 2 -mimetyki oraz wskazana jest potrzeba prowadzenia badań farmakogenetycznych, służących opracowaniu metod leczenia astmy, dostosowanych do indywidualnych potrzeb chorego [15]. W pracy postawiono pytanie, czy podanie osobom zdrowym salbutamolu powoduje rozszerzenie oskrzeli w stopniu istotnie wpływającym na zwiększenie wartości wskaźników spirometrycznych, obrazujących warunki przepływu powietrza w drogach oddechowych, w trakcie natężonego wydechu oraz czy istnieje zróżnicowanie reakcji w zależności od stwierdzanej izoformy β 2 -ADR. Oceniano także częstość występowania polimorfizmu genu kodującego receptor β 2 ADR w pozycji nukleotydu 46 (g.46aa, g.46ag, g.46gg) i nukleotydu 79 (g.79cc, g.79gc, g.79gg) w badanej grupie mężczyzn. Materiał i metody Badaniami objęto 170 zdrowych mężczyzn w wieku 20 26 lat. Badania uzyskały akceptację Komisji Bioetycznej Pomorskiej Akademii Medycznej (PAM) w Szczecinie (nr BN-001/47/03). Wszystkie osoby zostały poinformowane o celach i sposobach przeprowadzenia badań oraz wyraziły pisemną zgodę na uczestniczenie w nich. U wszystkich zgłaszających się oceniano polimorfizm genu kodującego β 2 ADR w pozycji nukleotydu 46 i 79, na podstawie których podzielono ich na grupy: g.46aa homozygota, obecność adeniny i adeniny; GG homozygota, obecność guaniny i guaniny; AG heterozygota, obecność adeniny i guaniny; g.79cc homozygota, obecność cytozyny i cytozyny; GG homozygota, obecność guaniny i guaniny; GC heterozygota, obecność guaniny i cytozyny. Do badań genetycznych pobrano wymaz z błony śluzowej okolicy policzka i dna jamy ustnej. Genomowy DNA izolowano w Pracowni Izolacji DNA Zakładu Medycyny Sądowej PAM zestawem Sherlock AX firmy A&A Biotechnology, według opracowanej przez firmę metody przygotowanej do wykrywania śladowych ilości DNA. Polimorfizm w pozycji nukleotydu 46 i 79 genu kodującego β 2 ADR badano w Samodzielnej Pracowni Patobiochemii i Biologii Molekularnej PAM.

REAKTYWNOŚĆ OSKRZELI DO POLIMORFIZMU GENU KODUJĄCEGO RECEPTOR β 2 -ADRENERGICZNY 17 W metodzie łańcuchowej polimerazy (PCR), przy amplifikacji DNA genu kodującego β 2 ADR, zastosowano parę primerów ograniczających oba regiony polimorficzne, tj. g.46a G i g.79c G. Próbki DNA amplifikowano z odpowiednią parą primerów, datp, DTP, DTP, DTP, buforem do PCR, polimerazą Taq w termocyklerze Mastercycler. Produkty amplifikacji z parą primerów β 2 ADR rozdzielano, następnie inkubowano z 5 jednostkami enzymu restrykcyjnego NcoI (MBI Fermentas), a drugą w tych samych warunkach trawiono 2,5 jednostkami restryktazy SatI (MBI Fermentas). Otrzymane w wyniku trawienia fragmenty DNA i marker wielkości DNA rozdzielano poprzez elektroforezę w 3% żelu agarozowym. Dla celów dokumentacyjnych wykonano zdjęcia żeli w świetle UV aparatem DS-34 firmy Polaroid (ryc. 1 i 2). M puc 8 AA AG AA GG Ryc. 1. Polimorfizm genu receptora β 2 -adrenergicznego w pozycji g.46 (enzym NcoI-MBI Fermentas); M marker, AA homozygota, AG heterozygota, GG homozygota Fig. 1. Polymorphism of g.46a G (enzyme NcoI-MBI Fermentas); M molecular weight marker, AA homozygote, AG heterozygote, GG homozygote M puc 8 GG GC CC CC Ryc. 2. Polimorfizm genu receptora β 2 -adrenergicznego w pozycji g.79 (enzym SatI-MBI Fermentas); M marker, GG homozygota, GC heterozygota, CC homozygota Fig. 2. Polymorphism of g.79c G (enzyme NcoI-MBI Fermentas); M molecular weight marker, GG homozygote, GC heterozygote, CC homozygote Badanie spirometryczne przeprowadzono za pomocą aparatu Lungtest 1000 firmy MES, zgodnie z zaleceniami American Thoracic Society i European Respiratory Society, sprowadzając do standardowych warunków (Body Temperature and Pressure Saturated with water wapour) [16, 17]. Model badań przyjęty w materiale własnym obejmował dwukrotne wykonanie w czasie jednej wizyty badania spirometrycznego: wyjściowego i 20 min po podaniu 200 μg salbutamolu [3, 14, 18]. Wstępnie oceniano pojemność życiową płuc (VC), a w dalszej kolejności przeprowadzano badanie przepływ/ objętość; po 6 spokojnych oddechach badany wykonywał maksymalnie głęboki wydech, a po nim maksymalnie forsowny i głęboki wdech, przechodząc płynnie w maksymalnie natężony wydech trwający co najmniej 3 s. Manewr ten powtarzano 3 8-krotnie, do uzyskania trzech powtarzalnych pętli. Z otrzymanych wartości wskaźników spirometrycznych, do analizy ze zmierzonych wartości wybierano najwyższe. Z licznych wskaźników spirometrycznych, rejestrowanych lub wyliczanych przez spirometr wybrano: 1. Objętości powietrza wydychanego w trakcie natężonego wydechu FEV 0,5, FEV 1, FEV 2, FEV 3, FVC ex. 2. Prędkości przepływu powietrza w określonych fazach natężonego wydechu MEF 75, MEF 50, MEF 25, PEF, FEF 25/75, FEF 75/85. 3. Powierzchnię pola pod krzywą przepływ/objętość A ex = MEF 50 FVC ex. Próbę rozkurczową przeprowadzano, używając krótkodziałającego, selektywnego agonisty receptora β 2 salbutamolu [16, 18] firmy Norton (Salamol EB). Po wykonaniu wyjściowego badania spirometrycznego badany otrzymywał wziewnie 2 dawki leku, po 100 μg każda [1, 18, 19]. Ponowne badanie spirometryczne wykonywano po 20 min od zakończeniu drugiej aplikacji leku [18, 20, 21, 22]. Do oceny statystycznej uzyskanych wyników zastosowano program komputerowy Statistica 6.0. Testem χ 2 porównywano częstość występowania genotypów i alleli genu kodującego receptor β 2 -adrenergiczny. Wartości wskaźników spirometrycznych przed podaniem salbutamolu (oznaczane literą p) i po podaniu leku (oznaczane literą k) przedstawiono w postaci wartości średnich (x) i odchyleń standardowych (± SD) oraz rozstępu (minimum i maksimum). Normalność rozkładów określano za pomocą testu Shapiro Wilka. Przy rozkładach normalnych zastosowano test t-studenta, a przy niewykazujących takiego rozkładu test U Manna Whitneya. Istotność zależności między zmiennymi wyrażano współczynnikami korelacji rang Spearmana, równaniami regresji oraz wykorzystując wieloczynnikową analizę wariancji Anova. Jako istotne przyjęto wartości p < 0,05 [23]. Na podstawie regresji wielokrotnej oceniano wpływ: wysokości ciała, masy ciała, genotypu (g.46a G i g.79c G) na zmiany wartości wskaźników spirometrycznych. Wyniki oceniano także, posługując się współczynnikami obliczanymi

18 IWONA POZIOMKOWSKA-GĘSICKA na podstawie pomiarów dokonanych przed i po podaniu salbutamolu: FEV 1 = kfev 1 - pfev 1 [20, 24], Współczynnik odwracalności (w.o.): w.o. = [17, 20, 24] Współczynnik EF = FEV 1 - ZN gdzie ZN = FVC ex f f = 0,82 (stała obliczona z równania regresji) Współczynnik R = Wyniki W badanej grupie 170 osób rozkład genotypów był zgodny z równowagą Hardy Weinberga. Stwierdzono również, że oba oceniane polimorfizmy pozostają ze sobą w ścisłym sprzężeniu: D = 0,900655; p < 0,000. Rozkład procentowy występowania genotypów w obrębie nukleotydu 46 przedstawiał się następująco: osoby posiadające g.46aa stanowiły 13,5% (n = 23), g.46gg 43,5% (n = 74), a heterozygoty g.46ag 43,0% (n = 73). W obrębie nukleotydu 79 osoby posiadające g.79cc stanowiły 25,3% (n = 43), g.79gg 54,7% (n = 93), natomiast heterozygoty g.79gc 20% (n = 34). Spośród 170 osób, u których oznaczono polimorfizm genu kodującego β 2 ADR, badania spirometryczne wykonano u 148 osób charakteryzujących się średnią wieku 22,5 ± 1,5 (20 26 lat), średnią wysokością ciała 179,4 ± 6,2 (165 195 cm). Wartości ocenianych wskaźników spirometrycznych nie odbiegały od norm ustalonych w odniesieniu do wieku oraz wysokości ciała badanych; średnia wartość FVC ex wynosiła 108% wartości należnej, FEV 1 102% wartości należnej; wskaźnik Tiffeneau (FEV 1 %FVC ex ) 82%. We wszystkich sześciu wyodrębnionych grupach, wartości wyjściowe podstawowych wskaźników mieściły się w granicach normy; FVC ex 105 111% wartości należnej, FEV 1 97,8 104,5% wartości należnej. Wartości VC nie różnicowały istotnie żadnej z wymienionych grup. We wszystkich badanych grupach wartości VC były istotnie skorelowane z pfvc ex (r = 0,84349 0,94457), ale zgodnie z oczekiwaniami od nich wyższe. Wartości FEV 1 były zależne w znacznym stopniu od FVC ex, dla pfvc ex r = 0,8371 dla kfvc ex r = 0,8914. Średnia wartość FEV 1 przed podaniem leku stanowiła 82% FVC ex, natomiast po podaniu leku 85% FVC ex. Średnie wartości wszystkich parametrów istotnie zwiększyły się w odniesieniu do wartości przed podaniem leku, z wyjątkiem średniej wartości FVC ex. W poszczególnych przypadkach wartości FVC ex po podaniu leku w znaczący sposób różniły się od wartości wyjściowych. W związku z tym przeprowadzono analizę porównawczą wartości wyjściowej i po podaniu leku opartą na relacji zmian FEV 1 do zmian FVC ex ( FEV 1 / FVC ex ). Nie uwzględniono w dalszej analizie osób, u których wartości FEV 1 po podaniu salbutamolu zwiększały się, ale w stopniu nieadekwatnym do zmian FVC ex, czyli tych, gdzie zmniejszał się stosunek FEV 1 / FVC ex (6 osób); jak również osób, u których zmiany wartości FEV 1 0 ± 0,16 L wiązały się z równoczesnymi zmianami FVC ex 0 ± 0,2 L (63 osoby). Ze względu na powyższe, zróżnicowanie reakcji na salbutamol oceniono wśród pozostałych 79 osób. Wartości wyjściowe, jak i po podaniu leku, zebrano w tabeli 1 oraz obliczono istotność różnic dla obydwu wartości badanego wskaźnika w poszczególnych grupach nukleotydu 46 (tab. 2) i 79 (tab. 3). Reakcję oskrzeli na podany wziewnie salbutamol rozpatrywano na podstawie różnicy wartości wskaźnika po podaniu preparatu i jego wartości wyjściowej. Jedynie wartości PEF różniły się istotnie w grupach g.46aa i g.46gg oraz w grupach g.79cc i g.79gc (odpowiednio p = 0,03 oraz p = 0,02). Wyższe wartości odnotowano w grupie g.46aa oraz g.79cc. Reakcję na podanie salbutamolu oceniono także na podstawie tzw. współczynnika odwracalności. Współczynnik ten zastosowano nie tylko zgodnie z przy- T a b e l a 1. Wartości wskaźników spirometycznych (x ± SD) przed i po podaniu salbutamolu w wyselekcjonowanej grupie (n = 79) T a b l e 1. Spirometric parameters (x ± SD) before and after inhalation of salbutamol in selected group (n = 79) Wskaźnik spirometryczny Spirometric parameters FVC ex (L) FEV 0,5 (L) FEV 1 (L) FEV 2 (L) FEV 3 (L) PEF (L/s) MEF 75 (L/s) MEF 50 (L/s) MEF 25 (L/s) FEF 75/85 (L/s) FEF 25/75 (L/s) A ex (L 2 /s) Grupa po selekcji (n = 79) Selected groups (n = 79) x ± SD wyjściowe / before po leku / after 5,65 ± 0,72 5,65 ± 0,68 p = 0,936 3,24 ± 0,43 3,50 ± 0,42 p = 0,000 4,42 ± 0,56 4,69 ± 0,56 p = 0,000 5,19 ± 0,65 5,29 ± 0,65 p = 0,000 5,39 ± 0,69 5,43 ± 0,67 p = 0,019 10,08 ± 1,32 10,36 ± 1,31 p = 0,000 8,58 ± 1,42 9,12 ± 1,23 p = 0,000 5,31 ± 1,34 6,37 ± 1,34 p = 0,000 2,27 ± 0,64 2,8 ± 0,78 p = 0,000 1,76 ± 0,52 2,14 ± 0,67 p = 0,000 4,55 ± 1,02 5,43 ± 1,08 p = 0,002 27,69 ± 6,32 31,05 ± 6,45 p = 0,000