WYSTĘPOWANIE CLOSTRIDIUM DIFFICILE W PRZEWODZIE POKARMOWYM HOSPITALIZOWANYCH DZIECI DO DRUGIEGO ROKU ŻYCIA

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2010, 62: 77-84 Dorota Wultańska 1, Piotr Obuch-Woszczatyński 1, Aleksandra Banaszkiewicz 2, Andrzej Radzikowski 2, Hanna Pituch 1, Grażyna Młynarczyk 1. WYSTĘPOWANIE CLOSTRIDIUM DIFFICILE W PRZEWODZIE POKARMOWYM HOSPITALIZOWANYCH DZIECI DO DRUGIEGO ROKU ŻYCIA 1 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej WUM w Warszawie Kierownik: prof. dr hab. G. Młynarczyk 2 Klinika Gastroenterologii i Żywienia Dzieci WUM w Warszawie Kierownik: prof. dr hab. A. Radzikowski Badano występowanie C. difficile w przewodzie pokarmowym dzieci do drugiego roku życia oraz porównano fenotypowe i genotypowe właściwości wyhodowanych szczepów. Sto siedemdziesiąt osiem próbek kału pobranych od dzieci w wieku od 2 miesięcy do 2 lat, hospitalizowanych w latach 2003-2006, zbadano na obecność toksyn A/B C. difficile. Toksynotwórczość szczepów potwierdzono metodą PCR. Lekowrażliwość szczepów oznaczono stosując metodę E-test. Odsetek zakażonych dzieci laseczką C. difficile wyniósł 68,6%. Szczepy o profilu toksynotwórczości A + B + CDT - stanowiły 35%, o profilu toksynotwórczości A - B + CDT - 10%, natomiast 5% stanowiły szczepy A + B + CDT +. 50% wyhodowanych szczepów było nietoksynotwórczych. Odsetek szczepów opornych na erytromycynę i klindamycynę wyniósł odpowiednio 52% i 42%. Oporność na cyprofloksacynę była powszechna i dotyczyła 98% badanych szczepów, zaś na moksyfloksacynę i gatyfloksacynę wyniosła 8%. Odsetek szczepów opornych na imipenem wyniósł 50%. Wszystkie badane szczepy były wrażliwe na metronidazol i wankomycynę. Clostridium difficile (Bacillus difficilis) po raz pierwszy opisano w 1935 roku izolując ten drobnoustrój z próbek kału zdrowych noworodków (18). Drobnoustroje kolonizują człowieka już w czasie narodzin. W trakcie porodu oraz bezpośrednio po nim, noworodek zostaje szybko skolonizowany przez drobnoustroje pochodzące od matki, a także z otaczającego go środowiska (1, 2). Przewód pokarmowy noworodków i niemowląt jest niedojrzały i nie w pełni rozwinięty, a niedojrzała mikroflora w tym przypadku nie chroni przed kolonizacją C. difficile (9). Częstość występowania C. difficile zależna jest od wieku dziecka. Odsetek skolonizowanych dzieci poniżej 2 roku życia wynosi od 3% do 70%. W przypadku dzieci starszych i młodzieży (3-18 roku życia), nosicielstwo jest niskiego stopnia i podobnie jak u osób dorosłych może wynosić 5%-8% (11, 12, 16, 19). Do kolonizacji noworodków dochodzi

78 D. Wultańska i inni Nr 1 najczęściej w środowisku szpitalnym, które jest głównym źródłem szczepów C. difficile (3, 6, 13). Rola C. difficile w zakażeniach przewodu pokarmowego u dzieci do 2 roku życia nie jest do końca wyjaśniona (4, 5). Ferreira i wsp. zbadali dzieci z trzech grup wiekowych: noworodki i dzieci do 5 miesiąca życia, dzieci od 6 miesiąca do 11 miesiąca życia oraz od 1 roku do 5 roku życia. Stwierdzili, że u dzieci w tych grupach wiekowych może dojść do stanu zapalnego w przewodzie pokarmowym i wystąpienia ostrej biegunki o etiologii C. difficile (8). Lekami stosowanymi do leczenia biegunek o etiologii C. difficile są metronidazol i wankomycyna (15). Znacząca większość szczepów izolowanych na świecie jest wrażliwa na metronidazol i wankomycynę. Wrażliwość szczepów C. difficile na inne leki jest zróżnicowana. W Polsce występują szczepy C. difficile o wysokiej oporności na leki stosowane w lecznictwie szpitalnym, a mianowicie klindamycynę, erytromycynę oraz nowe fluorochinolony (14, 15, 20, 21). Ponieważ brak jest doniesień na temat zakażeń C. difficile u dzieci do 2 roku życia w Polsce, jak też charakterystyki izolowanych szczepów, postanowiono dokonać retrospektywnej analizy występowania tego drobnoustroju w tej grupie wiekowej. Celem podjętych przez nas badań było ustalenie częstości występowania C. difficile w przewodzie pokarmowym hospitalizowanych dzieci do drugiego roku życia, u których obserwowano biegunkę nieznanego pochodzenia, jak też po antybiotykoterapii oraz opracowanie charakterystyki wyhodowanych szczepów. MATERIAŁ I METODY W y k r y w a n i e t o k s y n C. d i f f i c i l e o r a z h o d o w l a i i d e n t y f i k a c j a s z c z e p ó w C. d i f f i c i l e. Materiał do badań stanowiło 178 próbek kału pobranych od dzieci do drugiego roku życia hospitalizowanych w latach 2003-2006, u których wystąpiła biegunka nieznanego pochodzenia jak też po antybiotykoterapii. Dzieci były leczone w różnych oddziałach Samodzielnego Publicznego Dziecięcego Szpitala Klinicznego w Warszawie: chirurgicznym (n=16), hematologicznym (n=10), nefrologicznym (n=35), onkologicznym (n=25), patologii noworodków (n=28) i gastroenterologicznym (n=64). Próbki kału badano w kierunku obecności toksyn C. difficile. Dla potrzeb szybkiej diagnostyki użyto testu opartego na reakcji immunoenzymatycznej (ELISA) do wykrywania obydwu toksyn A i B C. difficile Toxin A/B Test (Tech Lab, Inc., Stany Zjednoczone). Próbki kału posiewano jednocześnie na podłoże selektywne CCCA do izolacji C. difficile, zawierające Columbia agar z krwią baranią (5%) oraz mieszankę antybiotyków: cykloserynę, cefoksytynę i amfoterycynę B (bio Merieux, Francja). Posiewy inkubowano w warunkach beztlenowych w aparacie Gloves box w temperaturze 37 C przez 48 godz. Identyfikację C. difficile prowadzono na podstawie charakterystycznej morfologii kolonii, zielono-żółtej fluorescencji w świetle lampy Wood a (długość fali 365 nm), swoistego zapachu p-krezolu i barwienia preparatów metodą Grama. Identyfikacji dokonano badając właściwości biochemiczne wyhodowanych szczepów przy użyciu testów API 20A (bio Merieux, Francja) (22).

Nr 1 Występowanie C. difficile u hospitalizowanych dzieci 79 Określenie profilu toksynotwórczości szczepów C. difficile. Toksynotwórczość wyhodowanych szczepów C. difficile badano przy użyciu komercyjnych testów do wykrywania toksyny TcdA C. difficile Toxin A Test (Oxoid, Wielka Brytania) oraz testu do wykrywania obydwu toksyn TcdA i TcdB C. difficile Toxin A/B Test (EIA) (TechLab. Inc, Stany Zjednoczone). Testy wykonywano zgodnie z instrukcją podaną przez producenta. Toksynotwórczość szczepów potwierdzono metodą PCR ze starterami YT28/YT29 stosowanymi do wykrywania nie powtarzających się sekwencji genu toksyny TcdA (tcda) i starterami YT17/YT18 do wykrywania genu toksyny TcdB (tcdb) oraz starterów NK9/NKV011 do wykrywania powtarzających się sekwencji genu toksyny TcdA (22). Fragmenty genów toksyny binarnej (CDT) cdta i cdtb wykrywano z zastosowaniem dwóch par starterów cdta pos 5 -TGA ACC TGG AAA AGG TGA TG-3 (pozycja 507 do 526 w genie cdta) i cdta rev 5 -AGG ATT ATT TAC TGG ACC ATT TG-3 (pozycja 882 do 860 w genie cdta) i cdtb pos 5 -CTT AAT GCA AGT AAA TAC TGAG-3 (pozycja 368 do 389 w genie cdtb) i cdtb rev 5 -AAC GGA TCT CTT GCT TCA GTC-3 (pozycja 878 do 858 w genie cdtb) wg metody opisanej wcześniej (21). Do celów porównawczych użyto szczepów wzorcowych: toksynotwórczego VPI 10463 (A + B + ), nietoksynotwórczego NIHBRIGGS 8050 (A - B - ), szczepu kontrolnego do wykrywania delecji w genie toksyny A GAI 95601 (A - B + ) otrzymanego od dr Haru Kato (Institut of Anaerobic Bacteriology, Gifu University School of Medicine, Japonia) oraz szczepu C. difficile 8864 (CCUG 20 309) wytwarzającego tylko toksynę B i posiadającego geny toksyny binarnej (A - B + CDT - ) (22). O z n a c z e n i e w r a ż l i w o ś c i n a l e k i. Badanie wrażliwości na metronidazol (MZ), wankomycynę (VA), erytromycynę (EM), klindamycynę (CM), cyprofloksacynę (CM), moksyfloksacynę (MX), gatyfloksacynę (GA) i imipenem (IM) przeprowadzono oznaczając minimalne stężenie hamujące wzrost szczepów C. difficile (MIC) przy użyciu metody gradientowo-dyfuzyjnej E-test (AB BIODISK, Solna, Szwecja). Zawiesinę szczepów C. difficile o gęstości 1 w skali wg McFarlanda posiewano na podłoże Columbia agar. Na tak przygotowane podłoże nakładano paski nasycone lekami i inkubowano w warunkach beztlenowych w temperaturze 37 0 C przez 48 godzin. Odczytu dokonywano zgodnie z zaleceniami producenta. Oporność na antybiotyki ustalono na podstawie zaleceń CLSI (the Clinical and Laboratory Standards Institute). W y k r y w a n i e g e n u e r m B m e t o d ą P C R. Badania przeprowadzono przy użyciu starterów 2980/2981 swoistych dla genu ermb, metodą opisaną wcześniej (21). WYNIKI Odsetek próbek dodatnich wśród 178 próbek kału pobranych od dzieci w wieku od 2 miesięcy do 2 lat, hospitalizowanych w latach 2003-2006 w Samodzielnym Publicznym Dziecięcym Szpitalu Klinicznym w Warszawie, w których wykryto toksyny C. difficile i/lub wyhodowano szczepy toksynotwórcze C. difficile wyniósł 68,6% (n=122). Ze 178 próbek kału wyhodowano 40 szczepów Clostridium difficile. Przesiewowe badanie szczepów C. difficile z zastosowaniem testu immunoenzymatycznego do wykrywania obydwu toksyn A/B lub A lub B C. difficile wykazało, że 20 szczepów było toksynotwórczych, natomiast 20 szczepów było nietoksynotwórczych. Badanie obecności genów warunkujących toksynotwórczość z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) u 20

80 D. Wultańska i inni Nr 1 Tabela I. Charakterystyka toksynotwórczości i wrażliwości na leki szczepów C. difficile wyhodowanych z przewodu pokarmowego dzieci w wieku od 2 m-cy do 2 lat. L.p Nr szczepu Oddział Płeć/Wiek dziecka w mc A + B + CDT - (1) A - B + CDT - (2) A + B + CDT + (3) A - B - CDT - (4) ToxA (5) 1 P 194/04 Chir M/12 - - - + - - 0,75 0,75-0,25 1 3 >32 1,5 1 2 P 297/04 Chir K/7 + - - - + + 0,75 4-0,064 0,5 >32 6 0,5 0,5 3 P 207/06 Chir M/24 - - - + - - 0,5 0,38-0,032 0,25 4 >32 1 1 4 P 358/06 Chir M/6 - - - + - - 32 >256-0,064 0,38 >32 >32 1 1 5 P 366/06 Chir M/6 - - - + - - 12 >256-0,047 0,5 >32 >32 1 0,75 6 P 390/06 Chir M/2 - - - + - - >256 >256-0,064 1 >32 >32 1 1,5 7 P 408/06 Chir M/2 - - - + - - 8 >256-0,047 1 3 >32 1 1 8 P 435/06 Chir M/3 - - - + - - 8 >256-0,094 1 8 >32 0,75 1 9 P 348/06 Hem M/24 + - - - + + 0,25 0,38-0,032 0,75 6 >32 0,5 1 10 P 35/03 Nef K/24 - - + - + + 0,5 2-0,094 1 2 >32 >32 >32 11 P 71/03 Nef K/24 - - + - + + 0,5 4-0,094 0,75 2 >32 >32 >32 12 P 153/03 Nef K/24 - - - + - - 0,75 1-0,5 0,38 4 >32 >32 >32 13 P 33/05 Nef M/24 - - - + - - >256 4-0,064 1,5 >32 >32 1 1 14 P 298/05 Nef M/12 - - - + - - >256 >256-0,125 1 >32 >32 1,5 1 15 P 316/06 Nef K/12 - + - - - + 1 0,75 + 0,25 1 6 >32 1,5 1,5 16 P 367/06 Nef K/12 - + - - - + >256 >256 + 0,047 0,75 >32 >32 2 1,5 17 P 389/06 Nef K/12 - + - - - + >256 >256 + 0,094 1 >32 >32 2 2 18 P 74/03 Onk K/24 + - - - - + 1 2-0,064 0,75 3 >32 1,5 1,5 19 P 131/03 Onk M/24 + - - - + + 0,5 4-0,064 0,75 4 >32 1 1,5 20 P 45/04 P.now. K/12 + - - - + + >256 >256 - <0,016 1 >32 >32 1 0,125 21 P 89/04 P.now. M/24 - - - + - - >256 2-0,047 0,38 6 >32 1,5 1 22 P 287/04 P.now. M/12 - - - + - - >256 1,5-0,023 0,5 >32 >32 1 0,75 23 P 133/05 P. now. M/12 - - - + - - >256 >256-0,38 1,5 >32 >32 1,5 1 24 P 173/05 P. now. K/12 + - - - + + 1,5 2-0,19 0,75 4 >32 1 1 25 P 272/05 P. now. K/12 + - - - + + 1 4-0,094 0,125 >32 >32 0,5 0,5 26 P 287/05 P. now. K/13 - - - + - - >256 4-0,047 0,75 >32 >32 1 1 27 P 54/06 P. now. M/10 - - - + - - 0,25 1,5-0,094 0,5 >32 >32 0,75 0,75 ToxA/ B (6) EM (7) CM (8) ermb (9) MZ (10) VA (11) IP (12) CI (13) GA (14) MX (15)

Nr 1 Występowanie C. difficile u hospitalizowanych dzieci 81 28 P 203/06 P. now. K/17 + - - - + + 0,5 0,38-0,064 0,75 6 >32 1,5 1 29 P14/03 Gastr M/12 - + - - - + >256 >256 + 0,023 0,38 4 >32 1 1,5 30 P 51/03 Gastr K/24 + - - - + + >256 >256-0,016 0,75 12 >32 1 1,5 31 P 18/04 Gastr K/24 - - - + - - >256 >256 + 0,064 1 2 >32 1,5 0,75 32 P 225/04 Gastr K/12 + - - - + + 1 4-0,19 0,75 3 >32 1,5 1 33 P 334/04 Gastr K/12 - - - + - - >256 >256-0,25 0,19 >32 >32 1 1 34 P 300/05 Gastr M/17 - - - + - - 1 0,75-0,047 0,5 16 >32 1,5 1 35 P 358/05 Gastr M/7 - - - + - - >256 >256-0,19 0,5 >32 >32 1 1 36 P 13/06 Gastr K/12 + - - - + + 1,5 4-0,19 1 6 >32 1,5 0,75 37 P 227/06 Gastr K/5 + - - - + + >256 >256-0,125 0,75 >32 >32 0,75 1 38 P 236/06 Gastr M/12 - - - + - - >256 >256-0,125 0,5 >32 >32 2 1,5 39 P 334/06 Gastr M/12 + - - - + + 0,75 2-0,064 0,75 >32 >32 1 1 40 P 397/06 Gastr M/12 + - - - + + 1,5 1,5-0,094 0,75 6 >32 1 1 K płeć żeńska, M płeć męska, Chir oddział chirurgii, Hem oddział hematologii, Nef oddział nefrologii, Onk oddział onkologii, P. now oddział patologii noworodków, Gastr oddział gastroenterologiczny, (1) szczepy C. difficile wytwarzające toksynę A +, B + a nie wytwarzające toksyny binarnej CDT -, (2) szczepy C. difficile niewytwarzające toksyny A -, wytwarzające toksynę B + a nie wytwarzające toksyny binarnej CDT -, (3) szczepy C. difficile wytwarzające toksynę A +, B + i toksynę binarną CDT +, (4) szczepy C. difficile nietoksynotwórcze A - B - CDT -, (5) Test lateksowy C. difficile toxin A Test (Oxoid) do wykrywania toksyny A, (6) Test immunoenzymatyczny C. difficile Toxin A/B Test (Tech Lab. Inc, USA) do wykrywania toksyn A i B lub A lub B, (7) wartość MIC (mg/l) dla erytromycyny, (8) wartość MIC (mg/l) dla klindamycyny, (9) obecność genu oporności na klindamycynę (+) lub brak (-), (10) wartość MIC (mg/l) dla metronidazolu, (11) wartość MIC (mg/l) dla wankomycyny, (12) wartość MIC (mg/l) dla imipenemu, (13) wartość MIC (mg/l) dla cyprofloksacyny, (14) wartość MIC (mg/l) dla gatyfloksacyny, (15) wartość MIC (mg/l) dla moksyfloksacyny.

82 D. Wultańska i inni Nr 1 szczepów, które dawały pozytywną reakcję w teście EIA wykazało, że 14 (35%) szczepów posiadało geny dwóch toksyn tj. TcdA i TcdB (A + B + CDT - ), 4 (10%) szczepy posiadały gen toksyny TcdB oraz delecję w genie toksyny tcda, która uniemożliwia wytwarzanie biologicznie aktywnej toksyny TcdA (A - B + CDT - ) a 2 (5%) szczepy posiadały geny toksyny TcdA i TcdB oraz toksyny binarnej (CDT) (A + B + CDT + ). W 20 (50%) szczepach, które w teście EIA nie wykazały pozytywnej reakcji nie wykryto genów toksyn a zatem szczepy można było zakwalifikować do grupy A - B - CDT - (Tabela I). Zakres wartości najmniejszego stężenia hamującego (MIC) metronidazolu wobec badanych szczepów wynosił 0,016 mg/l - 0,38 mg/l, MIC wankomycyny 0,25 mg/l - 1,5 mg/l, MIC erytromycyny 0,25 mg/l - 256 mg/l, MIC klindamycyny 0,38 mg/l - 256 mg/l, MIC cyprofloksacyny 6,0 mg/l - 32 mg/l, MIC moksyfloksacyny 0,75 mg/l - 32,0 mg/l, MIC gatyfloksacyny 0,5 mg/l - 32 mg/l, MIC imipenemu 2,0 mg/l - 32 mg/l. Gen ermb warunkujący oporność typu MLS B wykryto w pięciu szczepach (Tabela I). W pozostałych 13 szczepach o wysokiej oporności na klindamycynę i erytomycynę nie wykryto genu ermb. DYSKUSJA Zakażenie C. difficile stanowi obecnie ważny problem kliniczny zarówno u pacjentów dorosłych jak i dzieci. Z jednej strony u dużego odsetka noworodków i niemowląt obserwuje się bezobjawowe zakażenie szczepami toksynotwórczymi (10, 16), z drugiej zaś strony coraz częściej pojawiają się doniesienia o udowodnionym objawowym zakażeniu C. difficile u tak małych dzieci (8). W przypadku naszych pacjentów z oddziałów pediatrycznych u których stwierdzono objawy biegunki zakażenie C. difficile wykazano u 68,6% dzieci. Na uwagę zasługuje fakt, że wśród wyhodowanych szczepów 50% było toksynotwórczych, natomiast zaobserwowano znaczny odsetek szczepów nietoksynotwórczych tj. 50%. Podobne wyniki uzyskali Enad i wsp., którzy przebadali 87 próbek kału od noworodków, z których wyhodowali 52% szczepów toksynotwórczych, zaś 48% szczepów nietoksynotwórczych (7). Z przewodu pokarmowego dzieci leczonych na oddziałach nefrologicznym i gastroenterologicznym wyhodowano szczepy C. difficile, które wytwarzały tylko toksynę B. Stanowiły one 10% badanych szczepów. Szczepy wytwarzające wszystkie trzy toksyny tj. A, B i toksynę binarną wyhodowano tylko od pacjentów oddziału nefrologicznego i stanowiły one 5% badanych szczepów. Należy podkreślić, iż w badanej populacji dzieci w wieku od 2 miesięcy do 2 lat, wyizolowano szczepy C. difficile o różnym profilu toksynotwórczości tj szczepy A + B + CDT -, A - B + CDT -, A + B + CDT +, A - B - CDT -, które również izoluje się od chorych dorosłych (14). Jednak różny jest odsetek szczepów należących do poszczególnych typów izolowanych w populacji ludzi dorosłych w porównaniu do dzieci i tak np. u dorosłych leczonych w szpitalach warszawskich 44,3% stanowiły szczepy wytwarzające toksynę A i B (A + B + CDT - ), 1,3% szczepy wytwarzające wszystkie trzy toksyny (A + B + CDT + ), 45,5% stanowiły szczepy nie wytwarzające toksyny A a wytwarzające toksynę B (A - B + CDT - ), zaś tylko 8% stanowiły szczepy nietoksynotwórcze (A - B - CDT - ) (15). Badane szczepy różniły się także wrażliwością na leki. Odsetek szczepów opornych na erytromycynę i klindamycynę wyniósł odpowiednio 52% i 42% szczepów. Szczepy oporne na klindamycynę były jednocześnie oporne na erytromycynę, ale tylko 13% z nich posiadała znaną genetyczną determinantę w postaci genu ermb. Wysoka oporność na cyprofloksacynę była powszechna i dotyczyła 98% badanych szczepów. Odsetek szczepów opornych na mok-

Nr 1 Występowanie C. difficile u hospitalizowanych dzieci 83 syfloksacynę i gatyfloksacynę wyniósł 8%. Stwierdzono również wysoki odsetek szczepów opornych na imipenem tj. 50% oraz 20% szczepów o obniżonej wrażliwości. Natomiast wszystkie kliniczne szczepy C. difficile były wrażliwe na metronidazol i wankomycynę, podobnie jak i szczepy izolowane od pacjentów dorosłych (15, 21). Rola C. difficile w powodowaniu zakażeń objawowych u małych dzieci poniżej drugiego roku życia podlega stale dyskusji. Z jednej strony obserwuje się bezobjawową kolonizację, z drugiej zaś strony obecność C. difficile w przypadku biegunek, w szczególności o nieustalonej etiologii, nasuwa podejrzenie udziału tego drobnoustroju w procesach patologicznych zachodzących w przewodzie pokarmowym u tak małych dzieci. Nasze spostrzeżenia nie dowodzą udziału C. difficile w powodowaniu biegunek u naszych małych pacjentów, gdyż posiadaliśmy zbyt małą wiedzę w zakresie aspektów klinicznych. Natomiast uzupełniają lukę w polskim współczesnym piśmiennictwie na temat występowania C. difficile w tej grupie wiekowej. Po raz pierwszy w Polsce opracowano szczepy C. difficile występujące u hospitalizowanych małych dzieci, zarówno pod względem toksynotwórczości jak i lekowrażliwości. Kolejnym naszym wyzwaniem jest ustalenie genotypów (PCR-rybotypów) szczepów izolowanych od małych dzieci i porównanie ich z pulą PCR-rybotypów występujących w Polsce u pacjentów dorosłych. D. Wultańska, P. Obuch-Woszczatyński, A. Banaszkiewicz, A. Radzikowski, H. Pituch, G. Młynarczyk PREVALENCE OF CLOSTRIDIUM DIFFICILE IN THE GASTROINTESTINAL TRACT OF HOSPITALIZED CHILDREN UNDER TWO YEARS OF AGE SUMMARY The aim of this study was to determine prevalence of C. difficile in the gastrointestinal tract of hospitalized children under two years of age and a comparison of phenotypic and genotypic features. Hundred and seventy-eight samples collected from the faecal samples of children aged 2 months to 2 years, hospitalized in 2003-2006 were examined for the presence of toxin A/B of C. difficile. Toxigenicity of strains was confirmed using PCR. Susceptibility to antimicrobials was determined using E-test. The percentage of children infected with C. difficile was 68.6%. Toxigenic of C. difficile strains A + B + CDT - accounted for 35%, A - B + CDT - 10%, and 5% were strains of A + B + CDT +. 50% of the cultivated strains were non-toxigenic. The percentage of strains resistant to erythromycin and clindamycin was respectively 52% and 42%. Resistance to ciprofloxacin was widespread concern 98% of strains, and the moxifloxacin and gatifloxacin was 8%. The percentage of resistant strains to imipenem was 50%. All tested strains were susceptible to metronidazole and vancomycin. PIŚMIENNICTWO 1. Borriello SP, Wilcox MH. Clostridium difficile infections of the gut: the unanswered questions. J Antimicrob Chemoth 1998; 41: 67-9. 2. Brook I. Pseudomembranous colitis in children. J. Gastroenterol Hepatol 2005; 20: 182-6. 3. Cartwright CP, Stock F, Beekmann SE. PCR amplification of rrna intergenic spacer regions as a method for epidemiologic typing of Clostridium difficile. J Clin Microbiol 1995; 33: 184-7.

84 D. Wultańska i inni Nr 1 4. Cerquetti M, Luzzi I, Caprioli A. Role of Clostridium difficile in childhood diarrhea. Pediatr Infect Dis J 1995; 14: 598-603. 5. Colomba C, De Grazia S, Giammanco GM i inni. Viral gastroenteritis in children hospitalised in Sicily, Italy. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2006; 25: 570-5. 6. Delmee M, Verellen G, Avesani V. Clostridium difficile in neonates: serogrouping and epidemiology. Eur J Pediatr 1988; 147: 36-40. 7. Enad D, Meislich D, Brodsky NL. Is Clostridium difficile a pathogen in the newborn intensive care unit? A prospective evaluation. J Perinatol 1997; 17: 355-9. 8. Ferreira CE, Nakano V, Avila-Campos MJ. Cytotoxicity and antimicrobial susceptibility of Clostridium difficile isolated from hospitalized children with acute diarrhea. Anaerobe 2004; 10: 171-7. 9. Kader A, O Hare B, Valappil MK. Non-antibiotic associated C. difficile diarrhea in a 7 week-old infant. Indian Pediatr 2004; 41: 1045-8. 10. Larson HE, Barclay FE, Honour P. Epidemiology of Clostridium difficile in infants. J Infect Dis 1982; 146: 727-33. 11. Matsuki S, Ozaki E, Shozu M i inni. Colonization by Clostridium difficile of neonates in a hospital, and infants andchildren in three day-care facilities of Kanazawa, Japan. Int. Microbiol. 2005; 8: 43-8. 12. McFarland LV, Brandmarker SA, Guandalini S. Pediatric Clostridium difficile: a phantom menace or clinical reality? J. Pediatr. Gastroentero.l Nutr. 2000; 31: 220-31. 13. McFarland LV, Surawicz CM, Greenberg RN. Possible role of cross-transmission between neonates and mothers with reccurrent Clostridium difficile infections. Am J Infect Control 1999; 27: 301-3. 14. Pituch H. Zakażenia Clostridium difficile w Polsce-nowa epidemiologia. Rozprawa habilitacyjna WUM 2008. 15. Pituch H, van Leeuwen W, Maquelin K i inni. Toxin profiles and resistances to macrolides and newer fluoroquinolones as epidemicity determinants of clinical isolates of Clostridium difficile from Warsaw, Poland. J Clin Microbiol 2007; 1607-10. 16. Rolfe RD. The role of probiotic cultures in the control of gastrointestinal health. J. Nutr. 2000; 130: 396-402. 17. Stubbe H, Berdoz J, Kraehenbuhl JP, Corthésy B. Polymeric IgA is superior to monomeric IgA and IgG carrying the same variable domain in preventing Clostridium difficile toxin A damaging of T84 monolayers. J Immunol 2000; 164: 1952-60. 18. Wilkins TD, Lyerly DM. Clostridium difficile testing: after 20 years, still challenging. J Clin Microbiol 2003; 41: 531-4. 19. Wilson ME. Clostridium difficile and childhood diarrhea: cause, consequence, or confounder. Clin Infect Dis 2006; 43: 814-6. 20. Wultańska D. Udział Clostridium difficile w zakażeniach przewodu pokarmowego dzieci. Praca doktorska WUM 2008. 21. Wultańska D, Obuch-Woszczatyński P, Pituch H, Łuczak M. Przegląd wrażliwości klinicznych szczepów Clostridium difficile izolowanych z przewodu pokarmowego dzieci hospitalizowanych w oddziałach pediatrycznych w Warszawie na leki stosowane w lecznictwie szpitalnym. Med Dośw Mikrobiol 2007; 59: 161-8. 22. Wultańska D, Pituch H, Obuch-Woszczatyński P i inni. Profil toksynotwórczości szczepów Clostridium difficile izolowanych z przewodu pokarmowego dzieci z klinicznym rozpoznaniem biegunki poantybiotykowej. Med Dośw Mikrobiol 2005; 57: 377-82. Otrzymano: 16 II 2010 r. Adres Autora: 02-004 Warszawa, ul. Chałubińskiego 5, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej WUM w Warszawie.