MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2012, 64: 73-78 Występowanie przeciwciał klasy IgG dla wirusa odry w surowicach osób w różnym wieku Presence of IgG class antibodies anti -measles virus in sera of subjects in different age Agnieszka Częścik, Milena Dunal, Agnieszka Trzcińska, Joanna Siennicka Zakład Wirusologii NIZP-PZH w Warszawie W pracy przedstawiono wyniki badań występowania przeciwciał klasy IgG swoistych dla wirusa odry w surowicach osób szczepionych i nieszczepionych przeciwko odrze, które miały na celu dokonanie doboru grupy do badań dotyczących pamięci immunologicznej. ABSTRACT Introduction: The increase of measles incidence in Poland was recently observed. Furthermore, the analysis of routine serological tests performed in the Department of Virology, NIPH-NIH revealed, that nearly half of young people (20-30 years old) have no antibodies against measles virus. The paper presents results of IgG specific for measles virus prevalence in the sera of vaccinated and unvaccinated subjects, which aimed to make the selection of groups for immunological memory research. Methods: Total of 100 persons were examined based on results of determination of the presence of IgG anti-mev: 26 people born before and 74 born after 1972 year. From this group, 55 participants were selected for further study and divided into 3 groups 1) subjects born before 1972, unvaccinated against measles and seropositive as a result of natural infection, 2) subjects born after 1972, vaccinated against measles but seronegative or with traces of anti-mev IgG presence, 3) subjects born after 1972 seropositive due to vaccination. Selected persons are subject to further examinations include determination the number of leukocytes and lymphocytes profile. Results: The level of anty-mev IgG antibodies in subjects after natural infection was significantly higher compared to levels obtained by vaccinations. No significant differences in the immunological parameters which could influence on immune response were observed. Conclusions: Obtained results lead to search other factors that may affect the weak postvaccinal humoral response.
74 A. Częścik i inni Nr 1 WSTĘP Odra jest wysoce zaraźliwą chorobą wieku dziecięcego, której etiologicznym czynnikiem jest wirus odry (MeV) należący do rodziny Paramyxoviridae (5). Odra posiada wszelkie cechy warunkujące możliwość jej eliminacji: rezerwuarem wirusa jest jedynie człowiek, nie występują zakażenia bezobjawowe i nosicielstwo wirusa, istnieje skuteczna szczepionka. Za możliwością eliminacji wirusa MeV przemawia również fakt zakończonej powodzeniem akcji eradykacji blisko z nim spokrewnionego wirusa księgosuszu bydła (9). W 2001 roku WHO podjęła plan eliminacji zachorowań na odrę w Regionie Europejskim, którego podstawą jest istnienie skutecznej szczepionki, a warunkiem koniecznym wysoka wyszczepialność (13). Opracowanie żywej atenuowanej szczepionki przeciwko odrze nastąpiło w 1963r., wkrótce po izolacji wirusa. Większość obecnie używanych na świecie szczepionek wywodzi się ze szczepu Edmonston. Oprócz szczepionki monowalentnej, w chwili obecnej, powszechnie stosuje się szczepionki skojarzone, szczególnie w krajach rozwiniętych, gdzie na stałe zostały one umieszczone w kalendarzu szczepień. Szczepionki skojarzone zawierają oprócz atenuowanego szczepu wirusa odry, atenuowane szczepy wirusa różyczki i świnki lub wirusa różyczki, świnki i ospy wietrznej. Schematy szczepień stosowane w poszczególnych krajach różnią się. Na szeroką skalę szczepienia w Polsce rozpoczęto w 1974 r., podając dzieciom w wieku 13-15 miesięcy jedną dawkę szczepionki monowalentnej. W 1991 r. wprowadzono drugą dawkę szczepionki przeciwko odrze podawaną dzieciom w wieku 7 lat. Od 2005 r. w ramach Programu Szczepień Ochronnych w Polsce stosowana jest wyłącznie szczepionka skojarzona podawana w dwóch dawkach: pierwsza w 13-14 miesiącu życia, a druga w 10 roku życia. Można przyjąć, że obecność przeciwciał przeciwko wirusowi odry u osób urodzonych przed wprowadzeniem szczepień jest wynikiem przebycia naturalnego zakażenia, podczas gdy u osób urodzonych później jest związana z odpowiedzią poszczepienną. Szczepionka atenuowana indukuje odpowiedź immunologiczną jakościowo podobną do tej uzyskiwanej w wyniku naturalnego zakażenia. Stwierdzono jednak, że odporność poszczepienna jest mniej trwała a poziomy wytworzonych przeciwciał są niższe (3, 6, 7, 10, 12). Wprowadzenie szczepień na masową skalę wpłynęło na spektakularną poprawę epidemiologicznej sytuacji odry w Europie, chociaż epidemie nadal mają miejsce (8). Większość przypadków zachorowań dotyczy osób nieszczepionych, ale odnotowywane są również wśród osób z udokumentowaną historią szczepień (1). Inspiracją do podjęcia prezentowanych badań był obserwowany w ostatnich latach w Polsce wzrost zachorowań na odrę. W 2006 r. na 120 zarejestrowanych przypadków, 44 dotyczyło osób szczepionych 26 jedną dawką i 18 dwiema dawkami (1). Poza tym, w ramach analizy wyników rutynowych badań serologicznych prowadzonych w Zakładzie Wirusologii NIZP-PZH zaobserwowano, że blisko u połowy ludzi młodych, w wieku 20-30 lat, nie wykrywa się obecności przeciwciał klasy IgG anty-mev. W pracy przedstawiono wyniki badań występowania przeciwciał klasy IgG swoistych dla wirusa odry w surowicach osób szczepionych i nieszczepionych przeciwko odrze, które miały na celu dokonanie doboru grupy do badań dotyczących pamięci immunologicznej.
Nr 1 Występowanie przeciwciał dla wirusa odry 75 MATERIAŁ I METODY Próbki do oznaczeń serologicznych. Materiał do badań stanowiły próbki surowic pobrane na zasadzie dobrowolnej zgody od pracowników NIZP-PZH i członków ich rodzin. Zbadano ogółem 100 osób, 71 kobiet i 29 mężczyzn. Wśród badanych było 26 osób urodzonych przed 1972 r. (zakres wieku 40-75 lat, średnia 54 +/- 7,5) i 74 osoby urodzone po 1972 r. (zakres wieku 18-38 lat, średnia 28 +/- 4,5). Przeciwciała dla wirusa odry. W surowicach badanych osób określano poziom przeciwciał klasy IgG dla wirusa odry (anty MeV-IgG). Oznaczeń dokonywano metodą ELISA przy użyciu testu Enzygnost Anti Measles-Virus/IgG (Siemens, Niemcy). Wynik oznaczenia kalkulowano na podstawie różnicy OD (ΔOD) mierzonej w dołkach badanych i referencyjnych pomnożonej przez współczynnik korekcji (iloraz ΔOD dla kontroli pozytywnej i wartości referencyjnej dla danej serii testu podanej przez producenta). Za wynik dodatni przyjmowano wartości ΔOD>0,2; za wynik ujemny gdy ΔOD<0,1; za wynik wątpliwy uznawano wartości mieszczące się w granicach 0,1-0,2. Poziom anty-mev IgG wyrażany w jednostkach międzynarodowych (miu/ml) obliczano wg procedury podanej przez producenta testu. Grupa badana. Na podstawie wyników oznaczeń obecności anty-mev IgG w opisanej powyżej grupie 100 osób, dokonano selekcji 55 osób. Przy doborze kierowano się: a) wyrażeniem zgody na udział w dalszych badaniach, b) wiekiem, c) obecnością anty-mev IgG u osób urodzonych przed 1972 r., d) możliwością udokumentowania szczepienia przeciwko odrze u osób urodzonych po 1972 r. Na podstawie tych kryteriów wyłoniono 3 grupy po 20 osób: 1) grupę pierwszą stanowiły osoby urodzone przed 1972 r., nieszczepione przeciwko odrze, seropozytywne w wyniku naturalnego zakażenia, 2) drugą grupę stanowiły osoby urodzone po 1972 r., szczepione przeciwko odrze, z brakiem przeciwciał dla wirusa odry, bądź ze śladową ich obecnością (wynik wątpliwy w badaniu metodą ELISA), 3) trzecią grupę stanowiły osoby urodzone po 1972 r., szczepione przeciwko odrze, seropozytywne w wyniku szczepienia. Rozkład wieku oraz poziomy przeciwciał anty-mev IgG w poszczególnych grupach przedstawiono w tabeli I. U osób tych przeprowadzono badania kontrolne Tabela I. Charakterystyka badanych grup. Grupa Liczebność grupy Płeć (K/M) Wiek Zakres Średni wiek Zakres Anty MeV IgG (miu) Średni poziom przeciwciał Grupa 1 20 19/1 40-62 52,6 +/- 6,3 591-19293 6909,8 +/- 5329,9 Grupa 2 (2a + 2b) 18 11/7 21-36 27,3 +/- 4,4 34-662 209,5 +/- 149,2 2a 7 4/3 21-35 26,4 +/- 4,3 34-127 80,9 +/- 40,9 2b 11 7/4 22-36 27,9 +/- 4,6 184-662 291,4 +/- 133,8 Grupa 3 17 14/3 18-36 27,3 +/- 5,3 382-3755 1361,7 +/- 1079,4 K kobieta, M mężczyzna Grupa 1 osoby urodzone przed 1972r, nieszczepione przeciwko odrze, seropozytywne w wyniku naturalnego zakażenia Grupa 2 osoby urodzone po 1972r, szczepione przeciwko odrze, z brakiem obecności przeciwciał przeciwko wirusowi odry (2a), bądź ze śladową ich obecnością (2b) Grupa 3 osoby urodzone po 1972r, szczepione przeciwko odrze, seropozytywne
76 A. Częścik i inni Nr 1 obejmujące określenie liczby leukocytów i profilu limfocytów mające na celu określenie parametrów immunologicznych mogących mieć wpływ na reakcje odpornościowe. Oznaczenie liczby krwinek białych (WBC). Do badania pobierano krew żylną na EDTA. Liczbę białych krwinek WBC (White Blod Cells) oznaczano w komorze Bürkera przy użyciu płynu Turka. W 480µl płynu Turka zawieszano 20µl krwi. Po 20 min. inkubacji w temperaturze pokojowej zawiesinę nanoszono do komory i liczono krwinki białe w mikroskopie świetlnym. Wartość WBC wyrażano jako liczbę białych krwinek w 1 litrze krwi obwodowej. Za zakres prawidłowy przyjęto wartości od 4-10 x 10 9 /l. Profil limfocytów. Oznaczeń dokonywano w krwi żylnej pobranej na EDTA metodą cytometrii przepływowej przy wykorzystaniu testu Simultest IMK-Lymphocyte (Beton Dickinson). Określano skład odsetkowy limfocytów T (CD3+), B (CD19+) i komórek NK (CD3-CD16/CD56+) oraz subpopulacji limfocytów T (CD3+CD4+ i CD3+CD8+). Barwienie wykonano zgodnie z procedurą podaną przez producenta testu. Zbioru komórek dokonywano przy użyciu cytometru przepływowego FascCalibur. Analizę wyników przeprowadzano przy użyciu programu SimulSET. Za zakresy prawidłowe przyjęto określone w programie do analizy danych. Przyjęte wartości prawidłowe to odsetek limfocytów T w zakresie 59,4-84,6; odsetek limfocytów B w zakresie 6,4-22,6; odsetek komórek NK w zakresie 5,6-30,9; stosunek komórek CD4/CD8 w zakresie 0,9-3,6. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Spośród wszystkich zbadanych osób (n=100), wszystkie osoby urodzone przed 1972r. (n=26) były seropozytywne i wykazywały wysokie poziomy przeciwciał anty-mev IgG w zakresie od 348 miu do 19 263 miu (5 958+/-5 054). W grupie osób urodzonych po 1972 r. (n=74) obecność anty-mev IgG stwierdzono u 41 (średnia wartość miu 1 582+/- 1 852, w zakresie od 371 do 10 913), natomiast u 20 osób badanie dało wynik wątpliwy (średnia wartość miu 255+/-105, w zakresie od 175 do 662), a u pozostałych 13 osób nie stwierdzono obecności przeciwciał anty-mev IgG (średnia wartość miu 75, w zakresie od 11 do 183). Uzyskane wyniki potwierdziły wcześniejsze obserwacje (dane niepublikowane) uzyskane na podstawie rutynowo prowadzonych badań serologicznych w Zakładzie Wirusologii NIZP-PZH, z których wynikało, że u blisko połowy osób młodych nie wykazuje się obecności przeciwciał anty-mev IgG. W prezentowanych badaniach stwierdzono, że u 44,6% osób w wieku 36 lat i młodszych nie wykrywa się obecności przeciwciał anty-mev IgG lub stwierdzano u nich śladową ich obecność. Na podkreślenie zasługuje przypadek jednej z osób urodzonych po 1972r., wykazującej ponad dwukrotnie wyższy poziom anty MeV IgG (10 931 miu) od najwyższego odnotowanego w grupie osób seropozytywnych w wyniku szczepienia (5 019 miu). Analiza dokumentacji medycznej pozwoliła ustalić, że osoba ta przechorowała odrę, a dopiero potem prawdopodobnie (nie wynika to jasno z dokumentacji) była zaszczepiona. Po wyeliminowaniu wyników dotyczących wyżej opisanego przypadku należy stwierdzić, że w grupie osób seropozytywnych w wyniku szczepienia (n=40) średni poziom przeciwciał anty MeV IgG wyniósł 1 348+/-1 108 miu, w zakresie od 371 do 5 019 miu. Na podstawie określonych powyżej warunków wyselekcjonowano grupę 60 osób do dalszych badań. Spośród 40 osób urodzonych po roku 1972, które wyraziły zgodę na udział
Nr 1 Występowanie przeciwciał dla wirusa odry 77 w dalszych badaniach, wgląd w dane dotyczące szczepienia przeciwko odrze był możliwy w przypadku 36 osób, z których jedną, seronegatywną, która nie była szczepiona, wykluczono z dalszych badań. Ostateczną charakterystykę grup badanych, które stanowiło łącznie 55 osób przedstawiono w tabeli I. Różnice wieku między grupą 1 (osoby seropozytywne w wyniku naturalnego zakażenia) a osobami urodzonymi po 1972 r. były statystycznie znamienne (test t-studenta, p<0,0001), podczas gdy w obrębie grupy osób urodzonych po 1972 r. (grupa 2 versus grupa 3) różnic takich nie stwierdzono (test t-studenta, p=0,98). Poziom przeciwciał anty-mev IgG u osób po naturalnym zakażeniu (grupa 1) był istotnie wyższy w stosunku do poziomu uzyskanego w wyniku szczepienia w grupie 3 (Anova, p=0,0002), co potwierdza dane, że atenuowana szczepionka indukuje odpowiedź jakościowo podobną do tej uzyskiwanej w wyniku naturalnego zakażenia, jednak poziomy wytworzonych przeciwciał są niższe (4, 11). Analiza zależności pomiędzy wiekiem osób szczepionych (grupa 2 i 3) a poziomem przeciwciał nie wykazała związku między tymi zmiennymi (regresja liniowa, p=0,7). Mogłoby to sugerować, że niski poziom odpowiedzi humoralnej zależy od cech osobniczych a nie jest związany z obniżaniem się poziomu przeciwciał w czasie. Wnioskowanie takie powinno być jednak ostrożne z powodu małej liczebności grupy (n=35). Wyniki badań kontrolnych mających na celu określenie immunologicznych parametrów mogących mieć wpływ na reakcje odpornościowe wykazały brak istotnych różnic w zakresie badanych parametrów pomiędzy grupami (Anova, p>0,05). Wartości badanych parametrów immunologicznych dla poszczególnych osób mieściły się w zakresach prawidłowych. Średnia liczba białych krwinek (WBC) w grupie pierwszej wynosiła 5,7+/-1,4; w grupie T komórki CD3+ B komórki CD19+ NK komórki CD3-CD16/CD56+ Ryc.1. Skład odsetkowy populacji limfocytów w badanych grupach.
78 A. Częścik i inni Nr 1 drugiej: 5,5+/-1,4; w grupie trzeciej: 5,5+/-1,3 x10 9 /l. Dane dla składu odsetkowego populacji limfocytów przedstawiono na rycinie 1. Stosunek komórek CD4/CD8 w poszczególnych grupach wynosił: 1,9 (grupa 1); 1,6 (grupa 2) i 1,8 (grupa 3). Brak istotnych różnic w zakresie podstawowych parametrów odpowiedzi immunologicznej u badanych osób skłania do poszukiwania czynników mogących mieć wpływ na słabą poszczepienną odpowiedź humoralną. PIŚMIENNICTWO 1. Czarkowski P, Cielebąk E, Dacka P i inni. Choroby zakaźne i zatrucia w Polsce w 2006 roku. Wydawnictwo NIZP-PZH. Warszawa 2007. 2. Enders JF. Measles virus: historical review, isolation and behavior in various systems. Am J Dis Child 1962; 103: 282-7. 3. Krugman S, Giles JP, Jacobs AM i inni. Studies with a further attenuated live measles-virus vaccine. Pediatrics 1963; 31: 919-28. 4. Krugman S. Present status of measles and rubella immunization in the United States: a medical progress report. J Pediatr 1971; 78: 1-16. 5. Lamb RA, Griffin DE. Paramyxoviridae: the viruses and their replication. W: Fields Virology. Red. D.M. Knip, P.M. Howley, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Baltimore, New York, London, Buenos Aires, Hong Kong, Sydney, Tokyo, 2007, 1449-96. 6. Moss WJ, Ryon JJ, Monze M i inni. Differential regulation of interleukin (IL)-4, IL-5, and IL-10 during measles in Zambian children. J Infect Dis 2002; 186: 879-87. 7. Mossong J, Nokes DJ, Edmunds WJ i inni. Modeling the impact of subclinical measles transmission in vaccinated populations with waning immunity. Am J Epidemiol 1999; 150: 1238-49. 8. Mossong J, O Callaghan CJ, Ratnam S. Modelling antibody response to measles vaccine and subsequent waning of immunity in a low exposure population. Vaccine 2000; 19: 523-9. 9. Naruszewicz-Lesiuk D. Odra. W: Choroby zakaźne i ich zwalczanie na ziemiach polskich w XX wieku. Red. J. Kostrzewski, W. Magdzik, D. Naruszewicz-Lesiuk, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2001, 281-7. 10. Okada H, Kobune F, Sato TA, i inni. Extensive lymphopenia due to apoptosis of uninfected lymphocytes in acute measles patients. Arch Virol 2000; 145: 905-20. 11. Ovsyannikova IG, Dhiman N, Jacobson RM i inni. Frequency of measles virus-specific CD4+ and CD8+ T cells in subjects seronegative or highly seropositive for measles vaccine. Clin Diagn Lab Immunol 2003; 10: 411-6. 12. Polack FP, Hoffman SJ, Crujeiras G i inni. A role for nonprotective complement-fixing antibodies with low avidity for measles virus in atypical measles. Nat Med 2003; 9: 1209-13. 13. Ramsay M. Strategic plan for the elimination of measles in the European region. WHO Expanded Programme on Immunization. Seventh Meeting of National Programme Managers. Berlin, Germany, November 1997. Otrzymano: 20 I 2012 r. Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Wirusologii NIZP-PZH