UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCŁAWIU WYDZIAŁ MEDYCYNY WETERYNARYJNEJ KATEDRA ROZRODU Z KLINIKĄ ZWIERZĄT GOSPODARSKICH Lek. wet. OCENA ENDOMETRIUM NIEPŁODNYCH KLACZY WYBRANYMI METODAMI DIAGNOSTYCZNYMI Rozprawa doktorska Promotor: dr hab. Roland Kozdrowski, prof. nadzw. Praca wykonana w ramach grantu finansowanego przez NCN, 2011/01/B/NZ5/04173. Wrocław 2015
9. STRESZCZENIE Endometritis jest główną przyczyną niepłodności u klaczy. Wiele klaczy, które chorują na subkliniczne stany zapalne endometrium jest mylnie uznawana za zdrowe. Celem badań było porównanie przydatności różnych metod diagnostycznych (szczoteczki cytologicznej i biopsji endometrium) w tym różnych testów diagnostycznych (badanie mikrobiologiczne i badanie cytologiczne) w diagnostyce endometritis subclinica u klaczy. Jako złoty standard służący do wykrycia subklinicznego endometritis zastosowano badanie histopatologiczne (obecność co najmniej 1 komórki PMN polymorphonuclear cells, w pięciu polach widzenia, w warstwie nabłonka i warstwie zbitej endometrium). Biopsja endometrium oraz wymaz z macicy pobrany przy pomocy szczoteczki cytologicznej zostały pobrane od klaczy w rui i diestrus. Analizie poddano próby uzyskane od 82 klaczy w wieku od 2 do 23 lat. W celu określenia przydatności poszczególnych metod i testów diagnostycznych użyto współczynnika zgodności Kappa. Aby ustalić optymalne kryterium oceny cytologicznej zastosowano współczynnik Kappa oraz krzywą ROC. W niniejszym badaniu 56 klaczy (68,3%) wykazywało obecność neutrofili w badaniu histopatologicznym wycinka endometrium. Zarówno dla rozmazów, do których wykonania użyto materiał biopsyjny jak i materiał pobrany przy pomocy szczoteczki cytologicznej najlepszym kryterium wyznaczania endometritis jest 2% udział neutrofili w stosunku do komórek endometrium. Kryterium to cechowało się najwyższym współczynnikiem zgodności (Kappa) oraz wysoką czułością i swoistością. β hemolityczne streptokoki były najczęściej izolowanymi patogenami z materiału pobranego przy pomocy szczoteczki cytologicznej i biopsji endometrium. Większość patogennych mikroorganizmów spowodowała napływ komórek PMN do macicy i dodatni wynik cytologii. Niemniej jednak gatunki niepatogenne dla klaczy również wywołały odpowiedź zapalną, co może świadczyć o ich możliwości wypływu na płodność klaczy. Zmiany w endometrium (kategoria IIA, IIB i III wg Kenney i Doig) odnotowano u 78% klaczy. Znaczny wzrost izolacji patogennych drobnoustrojów oraz infiltracji endometrium neutrofilami zaobserwowano u klaczy należących do kategorii IIB i III, w porównaniu do grupy z kategorii I i IIA. W związku z tym przypuszcza się, iż zmiany degeneracyjne w endometrium mogą przyczyniać się do rozwoju infekcji oraz stanu zapalanego w endometrium u klaczy. 120
Badanie mikrobiologiczne, zarówno materiału pobranego przy pomocy biopsji endometrium jak i szczoteczki cytologicznej cechuje się niskim współczynnikiem zgodności (Kappa). Badanie cytologiczne cechuje się wyższą czułością, swoistością, wartością predykcyjną dodatnią i ujemną oraz współczynnikiem zgodności (Kappa) aniżeli badanie mikrobiologiczne uzyskane zarówno z biopsji endometrium jak i szczoteczki cytologicznej. Najwyższy współczynnik Kappa osiągnęło badanie cytologiczne materiału pobranego od klaczy w rui przy pomocy biopsji endometrium. Łącząc wyniki badania cytologicznego i mikrobiologicznego w obu technikach pobierania prób z macicy (biopsji endometrium i szczoteczki cytologicznej) wzrosła czułość w diagnozowaniu subklinicznego endometritis u klaczy. Pobieranie materiału przy użyciu szczoteczki cytologicznej jest prostsze i szybsze aniżeli pobieranie biopsji endometrium, a wyniki są miarodajne. Dlatego może być ona z powodzeniem wykorzystywana w diagnostyce endometritis subclinica u klaczy. Jednakże należy pamiętać, iż aby ocenić zdolność rozrodczą danej klaczy konieczne jest pobranie biopsji endometrium w celu oszacowania zmian w endometrium. 121
10. SUMMARY Endometritis is a major cause of infertility in brood mares. Subclinical endometritis can be undiagnosed because clinical signs may be subtle. The objective of this study was to compare the usefulness of various diagnostic methods (cytobrush and endometrial biopsy), including a variety of diagnostic tests (microbiological and cytological examination) in diagnosis of subclinical endometritis in mares. Histopathological examination (presence of at least one polymorphonuclear cell PMN, per five fields in the endometrial luminal epithelium and the stratum compactum) was considered as a gold standard in diagnosis of subclinical endometritis. An endometrial biopsy and cytobrush samples were collected from mares in estrus and diestrus in the breeding season. Samples obtained from 82 mares aged 2 to 23 years were analysed. In order to determine usefulness of each method and diagnostic tests, the Cohen s Kappa coefficient was used. To determine the optimal cytological evaluation criteria a Kappa coefficient and Receiver Operating Characterictic (ROC) curve analysis were applied. In this study, 56 mares (68,3%) showed the presence of neutrophils in a histopathological examination of the endometrium. The best criterion for determining endometritis is 2% of PMNs in relation to endometrial cells, both for smears obtained from endometrial biopsy as well as from cytobrush. This criterion was characterized by the highest Kappa coefficient and a high sensitivity and specificity. β hemolytic streptococci were the most frequently isolated pathogens from the material collected by cytobrush and biopsy of the endometrium. Most pathogenic microorganisms caused the influx of PMN cells to the endometrium and a positive cytology. However, non-pathogenic species also caused an inflammatory response, which may indicate the possibility of an influence on fertility in mares. Changes in the endometrium (category IIA, IIB and III according to Kenney and Doig) were found in 78% cases. A significant increase in the isolation of pathogenic microorganisms and the infiltration of neutrophils were observed in mares with biopsy score IIB and III compared to I and II. Therefore, it is believed that the degenerative changes in the endometrium may contribute to the development of endometrial infection and inflammation. In the present study, microbiological examination is characterized by a low Kappa coefficient. Cytological examination is characterized by higher sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value and a Kappa coefficient when compare to microbiological examination, obtained both from both the endometrial biopsy and cytobrush. 122
The highest Kappa coefficient was achieved by cytological examination from biopsy taken in estrus. When we combined the results of cytological and microbiological examinations, in both techniques (endometrial biopsy and cytobrush), sensitivity of the methods in the diagnosis of subclinical endometritis increased. In conclusion, sampling using cytobrush is easier and faster than collection of endometrial biopsy and the results are reliable. Therefore, it can be successfully used in diagnosis of subclinical endometritis in mares. However, it should be noted, that a prognostic value of carrying a pregnancy to term, classification of mares with chronic endometritis and specific treatment plans for this category, cannot be given without the endometrial biopsy. 123