PRODUKCJA BIOMASY CZ. 3 Beztlenowy metabolizm sacharydów - fermentacja Fermentacja etanolowa (alkoholowa) stanowi szereg reakcji enzymatycznych polegających na przekształceniu sacharydów do etanolu, dwutlenku węgla oraz wytwarzaniu energii niezbędnej do procesów życiowych komórki drożdży. Przemiany składające się na fermentację tworzą szlak amfiboliczny (powstające metabolity pośrednie są wykorzystywane jako substraty do produkcji biomasy oraz donory i akceptory atomów wodoru i elektronów). Większość drożdży fermentujących może wykorzystywać glukozę, fruktozę, mannozę i galaktozę. Głównym szlakiem fermentacji jest ciąg przemian cukrów zwany szlakiem Embdena-Meyerhofa-Parnasa (EMP) (rys. 1). Fermentowany cukier po wniknięciu do komórki drożdży jest przekształcany do D-glukozy, która ulega fosforylacji do glukozo-6-fosforanu, a następnie w wyniku kolejnych przemian enzymatycznych szlaku EMP do 2 cząsteczek pirogronianu. Po ich dekarboksylacji (do aldehydu octowego i CO 2 ) aldehyd octowy jest redukowany, przy udziale dehydrogenazy alkoholowej, do etanolu. Wytworzona energia zostaje zmagazynowana w postaci 2 cząsteczek ATP. C 6 H 12 O 6 -» 2CO 2 + 2CH 3 CH 2 OH + 118,43 kj/mol Zaledwie 26% energii wytworzonej z 1 mola glukozy jest magazynowane w postaci ATP. 74% energii zostaje uwolnione w postaci ciepła. Ponieważ podczas fermentacji temperatura powinna być stale kontrolowana i utrzymywana na poziomie 24-28ºC, konieczne jest chłodzenie kadzi z brzeczką fermentacyjną. W rzeczywistości około 95% glukozy jest fermentowane na drodze EMP, a oprócz głównych produktów fermentacji powstają niewielkie ilości glicerolu, kwasów organicznych, alkoholi fuzlowych i mieszaniny wyższych alkoholi, głównie pentanolu, butanolu i propanolu. W warunkach limitowanego dostępu azotu, do etanolu i CO 2 przekształcane jest jedynie 70% glukozy, natomiast jej pozostała część jest magazynowana w postaci glikogenu. Glikoliza jest procesem amfibolicznym, gdyż wiele metabolitów pośrednich tego szlaku jest wykorzystywane do biosyntezy składników komórkowych: glukozo-6-fosforan w syntezie glukanu (sacharyd ściany komórkowej), triozofosforany w syntezie lipidów, pirogronian jako prekursor aminokwasów. Jednak rosnące komórki drożdży wymagają do procesów biosyntezy znacznie więcej związków niż szlak EMP jest w stanie dostarczyć. Są one tworzone w obecności tlenu, w cyklu Krebsa oraz na drodze tlenowych przemian glukozo-6-fosforanu w obecności NADP + w szlaku heksozomonofosforanowym (HMP), nazywanym też szlakiem pentozowym. W warunkach beztlenowych poziom enzymów cyklu Krebsa (gł. dehydrogenazy 2-oksoglutaranu) oraz szlaku pentozowego (dehydrogenazy glukozo-6-fosforanu) jest bardzo niski. Tlenowy metabolizm węglowodanów Drożdże fermentujące w obecności tlenu przekształcają sacharydy, wykorzystując tlen cząsteczkowy jako akceptor protonów. Drożdże niefermentujące metabolizują węglowodany tylko na drodze tlenowej. Podstawowymi szlakami metabolizmu tlenowego są cykl Krebsa (zwany też cyklem kwasów trójkarboksylowych lub cyklem TCA) oraz cykl glioksalowy, natomiast zmagazynowanie energii w postaci ATP zachodzi w cytochromach zlokalizowanych w mitochondriach (rys. 2). Powstały w procesie glikolizy pirogronian, na drodze dekarboksylacji oksydatywnej, przy udziale koenzymu A i w obecności dehydrogenazy pirogronianowej zostaje przekształcony do acetylokoenzymu A. Zaktywowany acetyl zostaje całkowicie utleniony do dwutlenku węgla w szeregu cyklu kwasów trójkarboksylowych. Cykl Krebsa jest szlakiem amfibolicznym, dostarczającym wielu substratów wykorzystywanych w procesach biosyntezy w komórce, np. w syntezie aminokwasów. W przypadku wyczerpania zasobów cukru w pożywce hodowlanej, cykl Krebsa zostaje zahamowany na poziomie izocytrynianu, a metabolizm sacharydów jest prowadzony na drodze cyklu glioksalowego. Wówczas, jako źródło węgla komórki wykorzystują inne metabolity np. aldehyd octowy, etanol, glicerol, które są przekształcane w acetylo-coa. Dalej w szlaku TCA do izotiocytrynianu, kwasu glioksalowego i jabłczanu. Końcowymi etapami metabolizmu tlenowego drożdży są reakcje zachodzące w łańcuchu oddechowym, polegające na przenoszeniu elektronów i protonów. Końcowym akceptorem elektronów jest tlen cząsteczkowy. W procesie utleniania biologicznego wytwarzana energia magazynowana jest w postaci ATP - podczas oddychania tlenowego cząsteczka glukozy utleniana jest do dwutlenku węgla i wody z wytworzeniem 38 cząsteczek ATP. C 6 H 12 O 6 + 6O 2 -» 6CO 2 + 2H 2 O + 2824 kj/mol
Rys. 1. Szlak EMP Rys. 2. Cykl Krebsa i cykl glioksalowy Oddychanie i fermentacja - efekty regulacyjne Procesy oddychania tlenowego i beztlenowego są w komórkach drożdży nierozerwalne. Rodzaj prowadzonego metabolizmu zależy nie tylko od dostępu tlenu, ale również wielu czynników. U niektórych gatunków drożdży oddychanie i fermentacja przebiegają prawie w tych samych proporcjach, u innych obserwuje się przewagę jednego z tych procesów. Browarnicze drożdże dolnej fermentacji Saccharomyces uvarum charakteryzują się najmniejszym udziałem oddychania w procesach metabolicznych, natomiast drożdże browarnicze górnej fermentacji Saccharomyces cerevisiae wykazują metabolizm tlenowy na poziomie zbliżonym do ras drożdży piekarskich S. cerevisiae. Na podstawie aktywności oddechowej drożdże mogą być podzielone na 3 grupy: -wykazujące metabolizm tlenowy - drożdże niefermentujące, u których zachodzi jedynie oddychanie -prowadzące procesy tlenowe i beztlenowe w proporcjach równowagowych -oddychanie stanowi 40-50% przemian metabolicznych, np. drożdże browarnicze górnej fermentacji, piekarskie, większość drożdży patogennych -wykazujące głównie metabolizm beztlenowy - (udział oddychania nie przekracza 10-15%), np. drożdże gorzelnicze, winiarskie oraz drożdże browarnicze dolnej fermentacji U niektórych gatunków drożdży można prawie całkowicie stłumić fermentację przez silne napowietrzanie, jak to ma miejsce w drożdżownictwie, gdzie chodzi o możliwie największe nagromadzenie ich masy komórkowej. Są też przypadki, gdy drożdże w warunkach beztlenowych prawie wcale się nie rozwijają gdyż nie mają zdolności fermentacyjnych, co wykorzystuje się w produkcji drożdży paszowych. Drożdże dzikie (w przemyśle piekarskim Candida, Torulopsis, Mycoderma) to typowe tlenowce. Szlachetne szczepy, jak S. cerevisiae, mają zdolność fermentacji lub oddychania tlenowego w zależności od warunków, co wykorzystuje się do oceny ich jakości - określania biologicznej aktywności, czyli zdolności wytwarzania CO 2 spulchniającego ciasto w czasie fermentacji. Zmiana warunków hodowli z beztlenowych na tlenowe u S. cerevisiae prowadzi do 5-do 10-krotnego zwiększenia wydajności biomasy, przy czym tlen musi być rozpuszczony w pożywce. Wzrost stężenia tlenu w pożywce: -nieznacznie hamuje aktywność glikolizy poprzez inhibicję aktywności fosfofruktokinazy -zwiększa aktywność liazy cytrynianowej i dehydrogenazy jabłczanowej - wzrost intensywności cyklu Krebsa -uruchamia proces fosforylacji oksydatywnej w mitochondriach -hamuje transport aktywny glukozy przez błony plazmatyczne -intensyfikuje cykl glioksalowy - wykorzystanie etanolu, wyprodukowanego w czasie fermentacji Hamowanie fermentacji w komórkach drożdży w obecności tlenu nosi nazwę efektu Pasteura. Obserwowany jest u wszystkich drożdży z wyjątkiem browarniczych, u których wystąpiło zjawisko adaptacji do anaerobiozy i różnica pomiędzy fermentacją w warunkach beztlenowych a metabolizmem tlenowym jest nieznaczna. Również u wielu ras drożdży winiarskich tlen tylko nieznacznie hamuje fermentację.
Wysokie stężenie glukozy lub innych fermentowanych cukrów powoduje zahamowanie syntezy mitochondriów i reprodukcji komórek drożdży w populacji, w której następuje zmiana metabolizmu tlenowego na fermentacyjny. Istota negatywnego efektu Pasteura polega na hamowaniu biosyntezy enzymów oddechowych. W obecności wysokich stężeń glukozy następuje obniżenie stężenia cytochromów, spadek ilości syntetyzowanych enzymów cyklu Krebsa, zahamowanie aktywności dehydrogenaz i ATP-azy. Katabolicznej represji glukozowej podlega także synteza podstawowych składników, takich jak: ubichinon, fosfolipidy i kwas palmitynowy. Najniższe stężenie glukozy, które hamuje syntezę enzymów oddechowych u drożdży S. cerevisiae wynosi 6mM. Stężenie 12mM hamuje syntezę oksydazy cytochromu c i dehydrogenazy jabłczanowej, a stężenie 30mM glukozy hamuje syntezę oksydoreduktazy NADPH-cytochromu c. Wpływ podstawowych czynników fizykochemicznych na rozmnażanie drożdży w warunkach produkcyjnych Drożdże, jak wszystkie organizmy żywe, podlegają nieustannym wpływom czynników fizycznych i chemicznych środowiska. Temperatura Jeden z najistotniejszych czynników wpływających na procesy życiowe komórek drożdży. Doświadczalnie wyznaczone optimum temperatur waha się w granicach 28-32 C. W takim przedziale drożdże rozmnażają się najszybciej. W miarę obniżania temperatury, drożdże wolniej pączkują aż do zahamowania procesów życiowych. Powyższe zjawisko zostało wykorzystane w praktyce przechowywania mleczka drożdżowego oraz drożdży pakowanych (handlowych). Podwyższenie temperatury powyżej optimum również hamuje wzrost drożdży i ich rozmnażanie. Dłuższe działanie wyższych temperatur prowadzi do degeneracji komórek. W warunkach produkcyjnych temperatury powyżej 33 C sprzyjają zakażeniom i rozwojowi drożdży dzikich, co znacznie obniża wydajność. Zmiany temperatury wpływają m.in. na zawartość wody wolnej w komórkach. W temperaturze optymalnej (30 C) wynosi ona 73%, w 35 C zawartość wody obniża się do 70%, w 40C do 60%. Obniżenie zawartości wody w komórkach powoduje zmniejszenie poboru składników odżywczych z brzeczki melasowej i zahamowanie rozmnażania się drożdży. Przy niższych temperaturach drożdże mają zdolność wchłaniania wody. ph (odczyn środowiska) Wpływ ph związany jest przede wszystkim z oddziaływaniem jonów wodorowych na ścianę komórkową drożdży i tym samym z pobieraniem przez nią substancji pokarmowych. Utrzymanie ph brzeczki na właściwym poziomie jest szczególnie ważne w praktyce. Optimum ph dla rozwoju drożdży wynosi 4,5 do 5,5. Odchylenia od tego przedziału znacznie upośledzają pobór pożywek, wzrost i rozmnażanie drożdży a tym samym obniżają wydajność drożdży z kadzi. Spadek ph poniżej wartości 3,0 lub wzrost powyżej 8,0 całkowicie hamują rozmnażanie drożdży. ph brzeczki powyżej 5,5 sprzyja dodatkowo zakażeniom bakteryjnym. Zmiany ph zachodzące podczas prowadzenia procesu produkcyjnego wywołane są produktami wydzielanymi przez drożdże i wykorzystywaniem składników podłoża, co prowadzi do zakwaszania pożywki. Stężenie roztworów melasowych Stopień rozcieńczenia melasy przeznaczonej do hodowli drożdży może w pewnych warunkach naruszyć funkcjonowanie ściany komórkowej, która staje się przepuszczalną dla wody wewnątrzkomórkowej. Zjawisko odwodnienia drożdży wstrzymuje lub zwalnia procesy życiowe i uniemożliwia rozmnażanie. W warunkach produkcyjnych w hodowlach prowadzonych w gęstych brzeczkach, czynnikiem chroniącym komórki przed działaniem ciśnienia osmotycznego jest zwiększona intensywność napowietrzania (ilość tlenu w pożywce). Ponadto w procesach prowadzonych przy małym rozcieńczeniu melasy wodą, stosowane są odpowiednie szczepy drożdży lub drożdże zaadaptowane do rozmnażania w gęstych brzeczkach.. Zanieczyszczenia pożywki melasowej Melas jako pożywka niejednorodna, zmienna i zależna od bardzo wielu parametrów, często nie spełnia wszystkich warunków i zawiera nadmiar składników hamujących wzrost drożdży lub zbyt małe ilości cukru. Do trujących związków chemicznych jakie mogą być w melasie zaliczamy sole metali ciężkich (arsenu, miedzi, kadmu, cynku). Metale te są łatwo przyswajalne przez drożdże, strącają zawarte w komórkach białko, blokują centra enzymatyczne i w związku z tym zatrzymują procesy życiowe. Z uwagi na zależność śmiertelnego działania soli metali od środowiska, w którym występują a szczególnie od ph, ogólnej zawartości drożdży i badanego szczepu, ogromnie trudno jest określić w praktyce jakie stężenie soli metali ciężkich wywołuje nieodwracalne zmiany u drożdży. W literaturze podaje się na przykład, że arsen działa toksycznie w stężeniu 0,0005%, a miedź - 0,005%. Dodatkowo, może zachodzić zjawisko wzajemnego neutralizowania lub wzmacniania szkodliwego wpływu poszczególnych jonów na komórki, na skutek reakcji zachodzących między solami. To samo dotyczy szkodliwego działania niektórych kwasów występujących w melasie, np. szczawiowego, octowego, masłowego, mrówkowego i SO 2. Zgodnie z danymi literaturowymi wzrost drożdży zostaje całkowicie zahamowany przy następujących stężeniach kwasów: szczawiowego - 0,001%, mrówkowego - 0,0085%, octowego - 0,02%, masłowego - 0,0005%, SO 2-0,0025%. Z innych związków obecnych w melasie niebezpieczne są także azotyny (hamują wzrost drożdży już w stężeniu 0,004%) i formalina (0,001%) stosowana niekiedy w cukrowniach. Składniki podłoża. Alkohole. Produkty fermentacji drożdży hamują ich rozmnażanie się. W zależności od gatunku i szczepu drożdży jedne mogą rozwijać się przy 12% alkoholu, ale są i takie co przestają się rozmnażać już przy 10%. U S. cerevisiae w procesie fermentacji z 1 g glukozy powstaje (teoretycznie) 0,51 g etanolu i 0,49 g CO 2. W praktyce, z względu na zużywanie glukozy do syntezy składników budulcowych komórki i produktów ubocznych, powstaje około 0,46 g etanolu i 0,44 g CO 2. Maksymalne stężenie końcowe etanolu zależy od oporności drożdży na ten alkohol, do najbardziej opornych należą drożdże z rodzaju Saccharomyces. S. cerevisiae mogą rosnąć jeszcze przy stężeniu etanolu 100, a nawet 120 g/dm 3, a fermentację prowadzą nawet przy stężeniu 200 g/dm 3 (drożdże używane do produkcji sake wytrzymują nawet 300 g etanolu na dm 3 ). Wysokie stężenia etanolu spowalniają procesy fermentacji. Mechanizm toksycznego działania alkoholu etylowego na metabolizm ma charakter kompleksowy, przy czy jest on silniejszy w fazie wzrostu i namnażania komórek, aniżeli produkcji
etanolu. Po całkowitym zahamowaniu wzrostu drożdży stosowanych przy wyrobie sake (stężenie etanolu 120 g/dm 3 ), ich aktywność fermentacyjna zostaje zachowana jeszcze w 25%. Etanol działa na białka enzymatyczne i strukturalne, błony komórkowe (komórkową jądrową mitochondrialną) oraz retikulum endoplazmatyczne, szczególnie silnie na enzymy błonowe wywołując m.in. rozprzęganie procesów energetycznych. Dwutlenek siarki W stosunku do siarkowania drożdże zachowują się rozmaicie. Można je przyzwyczaić do siarkowania. Dawki 50-100 mg SO 2 na 1 dm 3 podłoża działają szkodliwie na bakterie, ale nie hamują jeszcze pracy drożdży. Cechy nabyte pod wpływem SO 2 stopniowo zatracają się z ich wiekiem. Najbardziej oporne są drożdże Schizosaccharomyces liąuefaciens. Wykonanie ćwiczenia I. Analiza tlenowej hodowli drożdży - Opisać wygląd makroskopowy hodowli biomasy drożdżowej. - Oznaczyć masę kolby i poziom cieczy (porównać z masą wyjściową). - Określić liczbę komórek drożdży w komorze Thoma (przed pobraniem materiału hodowlę dokładnie wymieszać). Komórki liczymy pod mikroskopem w komorze Thoma. W razie konieczności wykonujemy 10-krotne rozcieńczenie hodowli w płynie fizjologicznym. Przy średniej liczbie komórek w jednym kwadraciku (a) i rozcieńczeniu (n), zawartość komórek (L) w 1ml wynosi: L = 4 x 10 6 x a x n [jtk/ml] - Oznaczyć zawartość sacharozy w płynie pohodowlanym. Pobrać 50 ml hodowli do kolbki miarowej o pojemności 100cm 3, dodać kolejno po 10ml płynów Herlesa I i II, mieszając próbę po każdej dawce, zawartość kolby dopełnić do kreski wodą destylowaną. Wymieszać starannie otrzymany roztwór i przesączyć (sączek z bibuły filtracyjnej). W przesączu oznaczyć stężenie sacharozy poniższymi metodami. pomiar metodą areometryczną Ok. 30/40ml przesączu wlać do cylindra szklanego i powoli włożyć cukromierz (areometr Ballinga). Po 1-2 minutach odczytać wskazania cukromierza. (roztworu nie wylewać zachować do kolejnych oznaczeń) pomiar w refraktometrze Pomiar wykonujemy refraktometrem lunetowym MASTER-TA z automatyczną kompensacją temperatury. W tym celu podnosimy osłonę pryzmatu, pipetą nanosimy ok. 1 ml przesączu tak, aby zamykając osłonę ciecz równomiernie, bez pęcherzyków powietrza pokryła cały pryzmat. Następnie patrząc przez lunetkę odczytujemy wynik. (skala po lewej stronie w 0 Brix, skala po prawej stronie 0 T.A.) Po wykonaniu pomiaru refraktometr dokładnie płuczemy pod bieżącą wodą i wycieramy delikatnie do sucha papierowym ręcznikiem. pomiar w polarymetrze (sacharymetrze) Rurkę polarymetryczną o długości 200mm przepłukać, a następnie dokładnie napełnić przesączem (pozbyć się pęcherzyków powietrza). Następnie umieszczamy rurkę w polarymetrze i odczytujemy wynik. Zawartość sacharozy (%) obliczyć ze wzoru: a - odczyt ze skali sacharymetru L długość rurki [dm] C a * 100 * 2 = 20 0 [ a ] * L [ ] 20 0 a = 66 0 - skręcalność właściwa sacharozy, tj. kąt o jaki następuje skręcenie płaszczyzny polaryzacji światła przez roztwór sacharozy o stężeniu 100g w 100 cm 3 roztworu, w rurce o długości 1 dm, przy użyciu światła żółtego, w temperaturze 20ºC. 5. Oznaczyć zawartości białka metodą Lovry ego Metoda ta wykorzystuje reakcję, jaką dają wiązania peptydowe i aminokwasy aromatyczne z odczynnikiem Folina- Ciocalteu a. Przebiega ona w dwóch etapach: (1) pierwszy polega na przyłączeniu jonów miedzi do wiązania peptydowego, co w konsekwencji prowadzi do reakcji biuretowej (utworzenie koordynacyjnych połączeń Cu 2+ z dwoma przyległymi wiązaniami peptydowymi); (2) w drugim etapie następuje redukcja kwasu fosforowolframowego i fosfomolibdenowego do odpowiedniego błękitu molibdenowego przez obecną w białku tyrozynę i tryptofan.
- Wykonanie: Hodowle drożdży dokładnie wymieszać i ok. 25 cm 3 przefiltrować przez sączek z bibuły filtracyjnej w zestawie do filtracji Sartorius. W tym celu należy zamontować zestaw. Filtrować używając sączka z bibuły filtracyjnej (w razie potrzeby sączek przyciąć do odpowiedniego rozmiaru). Zamontować lejek i podłączyć wężem kolbę filtracyjną z pompą próżniową. Przy otwartym przepływie wlać 25cm 3 hodowli i włączyć pompę. Po zakończeniu filtracji cały zestaw należy dokładnie umyć!!! Pobrać ok. 0,2g biomasy drożdży z sączka, rozetrzeć z niewielką ilością odtłuszczonego piasku w moździerzu, w celu rozerwania ścian komórkowych i uwolnienia cytoplazmy. Następnie moździerz dokładnie przepłukać 5ml wody destylowanej. Całość przenieść ilościowo do probówki wirówkowej i odwirować (3000 obr/min, 5 min.). W celu odwirowania próby należy: otworzyć pokrywę wirówki umieścić w niej probówkę z zawiesiną roztartych drożdży, jako przeciwwagi użyć drugiej probówki wypełnionej 5 ml wody destylowanej zamknąć pokrywę wirówki ustawić pokrętłem czas wirowania 5 minut ustawić pokrętłem obroty w granicach 3000 obr/min po upływie wyznaczonego czasu wirówka sama się wyłączy Po zakończeniu wirowania ostrożnie pobrać do probówki 1ml płynu znad odwirowanego osadu drożdży. Do drugiej probówki wprowadzić 1ml wody destylowanej próba kontrolna. Następnie do probówek dodać po: 0,3ml 1M NaOH, 3ml odczynnika miedziowego, Odczynnik miedziowy przygotować bezpośrednio przed oznaczeniem mieszając ze sobą w probówce: 10ml odczynnika A, 0,1ml odczynnika B 1 i 0,1ml odczynnika B 2 - po wymieszaniu odstawić na 15 min. 0,3ml odczynnika Folina Energicznie wymieszać probówki (vortex) i po 30 min. odczytać, przy długości fali 660 nm, wartość absorbancji próby badanej wobec próby kontrolnej, a następnie stężenie białka z krzywej wzorcowej albuminy. - Pomiar absorbancji przed rozpoczęciem pomiaru należy otworzyć pokrywę spektrofotometru urządzenie nagrzewa się 15 minut!!! po 15 minutach napełniamy szklaną kuwetę w 2/3 objętości próbą kontrolną trzymając kuwetę staramy się nie dotykać przeźroczystych ścianek naczynia!!! w celu dokonania pomiaru naciskamy 2-krotnie przycisk A potwierdzając kolejno: wybór kuwety (10mm), pomiar absorbancji, umieszczamy kuwetę w urządzeniu, wpisujemy długość fali 660 nm i naciskamy P rozpoczyna się pomiar, uzyskany wynik zapisujemy pomiar powtarzamy 3-ktornie (wyciągając i ponownie wkładając kuwetę) wynik końcowy podajemy jako średnią trzech pomiarów do drugiej kuwety wprowadzamy analogiczną ilość badanego roztworu i wykonujemy 3-krotny pomiar absorbancji po pomiarach kuwety dokładnie płuczemy wodą destylowaną i pozostawiamy do wyschnięcia na bibule urządzenie wyłączamy zamykając pokrywę spektrofotometru 6. Opracowanie wyników Opis wykonanych doświadczeń oraz uzyskane wyniki należy zamieścić w sprawozdaniu. Wyciągnąć wnioski. Można skorzystać z tabeli: Przed hodowlą Waga kolbek [g] Liczba komórek [w 1 cm 3 ] Zawartość sacharozy [%] Stężenie białka [mg/ml] - Po hodowli 7. Zagadnienia teoretyczne: - metabolizm drożdży (tlenowy i fermentacja) - efekty regulacyjne oddychania i fermentacji - wpływ czynników fizykochemicznych na rozmnażanie drożdży - metody analizy ilościowej drożdży 8. Literatura: 1. Chmiel A., Biotechnologia. Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne; Wyd. PWN, Warszawa; 1998. 2. Kunicki-Goldfinger W.; Życie bakterii; Wyd. PWN; Warszawa; 1998 3. Libudzisz Z. Kowal K.; Mikrobiologia techniczna; Wyd. Politechniki Łódzkiej; 2000
białka