4 Hodowla i genetyka ODPORNOŚĆ NA WIRUSY M I S W TETRAPLOIDALNYCH I DIPLOIDALNYCH MATERIAŁACH ZIEMNIAKA mgr Krystyna Michalak, mgr Iwona Wasilewicz-Flis IHAR-PIB, Zakład Genetyki i Materiałów Wyjściowych Ziemniaka (ZGiMW) w Młochowie ul. Platanowa 19, 05-831 Młochów, e-mail: k.michalak@ihar.edu.pl W irus M ziemniaka (Potato virus M, PVM) i wirus S ziemniaka (Potato virus S, PVS) są zaliczane do rodzaju Carlavirus rodziny Flexiviridae. W nasiennictwie i uprawie są określane mianem lekkich, ponieważ na ogół nie powodują na roślinach silnych objawów chorobowych. Czasem jednak takie objawy można zaobserwować, zależy to od reakcji odmiany na infekcję i szczególnie dotyczy wirusa M (Chrzanowska, Zagórska 1996). Oba wirusy są zaliczane do tzw. nietrwałych, przenoszonych niekrążeniowo na kłujce mszyc, co znacznie ułatwia ich rozprzestrzenianie. PVM występuje we wszystkich rejonach uprawy ziemniaka, ale problemem jest głównie we wschodniej i południowo-wschodniej Europie. Straty plonu powodowane przez PVM mogą sięgać 30%, a w skrajnych przypadkach nawet 75% (Kostiw 2011). PVS jest również szeroko rozpowszechniony w Polsce i na świecie (Chrzanowska 2000), jednak nie ma dużego znaczenia gospodarczego. Z badań prowadzonych w oddziale
5 IHAR-PIB w Młochowie wynika, że niektóre odmiany mogą być porażone PVS w 100%. Straty plonu odmian całkowicie zainfekowanych są oceniane na kilka do 20% (Brunt 2001). Na porażonych roślinach ziemniaka objawy wirusa S na ogół są słabe, ale bywają również bardzo wyraźne, szczególnie na liściach roślin zacienionych uprawianych w szklarni. Takie objawy (chlorotyczne rysunki, zielone plamki na żółknącym tle) zaobserwowano w szklarni w Młochowie na odmianach Jasia i Kuba (Chrzanowska i in. 2011). Wirus S stwarza problemy w produkcji zdrowych sadzeniaków, szczególnie w krajach, w których jest on normowany, np. w Szkocji. W Polsce nie ma takich wymogów. PVS może sprawiać trudności w pracach in vitro, gdyż jest wirusem, którego trudno pozbyć się z rośliny. Jego eliminacja jest procesem długotrwałym, ale w rezultacie dającym efekty w postaci kultur wolnych od PVS. Odmiany będące w krajowym rejestrze (KR) nie są standardowo badane przed rejestracją pod kątem odporności na PVM i PVS, a w konsekwencji nie przypisuje im się stopnia odporności. Odporność na PVM w diploidalnych klonach oraz tetraploidalnych odmianach ziemniaka W diploidalnych klonach, wywodzących się z syntezy form rodzicielskich prowadzonej od ponad 40 lat w oddziale IHAR-PIB w Młochowie, odporność na PVM pochodzi głównie z dzikiego diploidalnego gatunku Solanum gourlayi. Opracowano metodę oceny odporności, która pozwala na wyselekcjonowanie form bardzo wysoko odpornych na PVM (Wasilewicz-Flis 2001). Pierwszym etapem jest inokulacja mechaniczna roślin badanego genotypu, a w następnych dwóch latach inokulacja przez szczepienie, gdzie badana forma jest podkładką, a zrazem zainfekowany pęd pomidora. W obu wypadkach ocenia się porażenie pierwotne i wtórne za pomocą testu ELISA. Stosuje się silny izolat PVM z odmiany Uran, namnażany na roślinach pomidora. Wzorcem odpornym jest wysoko odporny diploidalny klon DW 84- -1457. Odporność wywodząca się z S. gourlayi, warunkowana występowaniem genu Gm, ma charakter tolerancji, która przejawia się wysoką odpornością na infekcję w połączeniu z powolnym namnażaniem, słabym przemieszczaniem się oraz niską koncentracją wirusa w porażonej roślinie (Waś i in. 1980). Odporność ta jest niezależna od szczepu PVM i przejawia się w szerokim zakresie temperatur. Jej źródłem dla materiałów diploidalnych, a dzięki tworzeniu męskich gamet o niezredukowanej liczbie chromosomów również dla tetraploidalnych, jest klon DW 84-1457 (Dziewońska, Wawrzyczek 1991). Klon ten, rozmnażany w polu przez prawie 30 lat, nie uległ porażeniu PVM. W 1993 r. po raz pierwszy przekazano hodowcom tetraploidalne materiały wyjściowe z odpornością na PVM determinowaną genem Gm (Chrzanowska i in. 2002). W materiałach diploidalnych istnieje niewielka grupa klonów z odpornością na PVM, która wywodzi się z dzikiego diploidalnego gatunku S. megistacrolobum i jest związana z reakcją nadwrażliwości warunkowaną genem Rm (Dziewońska i in. 1978). Odporność oparta na reakcji nadwrażliwości może występować równocześnie z odpornością na porażenie pochodzącą z odmian i rodów hodowlanych (Butkiewicz 1984). Rośliny posiadające ten typ odporności pozostają zdrowe nawet przy dużej presji wirusa. Poziom odporności form z genem Rm zależy od tła genetycznego (Dziewońska i in. 1978). Rośliny klonów z odpornością opartą na reakcji nadwrażliwości nie ulegają mechanicznemu zakażeniu PVM, a po szczepieniu wykazują reakcję nekrotyczną (Chrzanowska 1988). Waś i inne (1980) oceniły odporność pochodzącą od S. gourlayi jako silniejszą niż wywodząca się z S. megistacrolobum. Pierwsze materiały wyjściowe z genem Rm przekazano hodowcom w 1985 r. (Chrzanowska i in. 2002). Od 1997 w ofercie materiałów wyjściowych są tetraploidalne rody łączące odporność z dwóch źródeł: z S. gourlayi i S. megistacrolobum. Do oceny odporności na PVM determinowanej równocześnie genami Gm i Rm stosowana jest metoda inokulacji mechanicznej i przez szczepienie. Po szczepieniu badane rośliny powinny być prowadzone w stałej temperaturze 27 o C, która pozwala na ujaw-
6 nienie się reakcji nekrotycznej warunkowanej W aktualnym KR odporność odmian na genem Rm, hamowanej w niższych temperaturach przez obecność genu Gm (Miętkiewcji nadwrażliwości Rm. W latach 2008-2011 PVM jest związana z obecnością genu reakska 1997). W selekcji form odpornych na w oddziale IHAR-PIB w Młochowie przetestowano 37 odmian ziemniaka w celu okre- PVM będzie możliwe stosowanie markerów molekularnych, ponieważ lokalizacja genów ślenia ich reakcji na PVM po mechanicznym Rm i Gm w genomie ziemniaka jest znana. zakażeniu roślin w warunkach szklarniowych Prace molekularne są na etapie wdrażania (tab. 1). Ocena 102 odmian została przedstawiona w publikacji Chrzanowskiej i innych do syntezy materiałów wyjściowych. (2011). Tabela 1 Reakcja 37 odmian ziemniaka na infekcję silnym szczepem PVM Objawy chorobowe po inokulacji roślin silnym szczepem PVM słabe średnie średnie do silnych silne do bardzo silnych Aruba Bellarosa Bosman Etola* Jutrzenka* Miłek Tucan Zagłoba Zuzanna Cyprian Ewelina Flaming Gawin* Meridian Michalina* Owacja Tetyda Wiarus Carrera Pokusa Roko Soplica* Almera Altesse* Arielle Berber Danuta* Ingrid* Justa Kuras Promyk Nie uległy infekcji: Ametyst, Bursztyn*, Eugenia, Finezja, Gustaw*, Legenda* * nieujęte w publikacji Chrzanowskiej i innych (2011) Ocenę przeprowadzono zgodnie z metodyką opisaną przez Chrzanowską i inne (2011). Każdy genotyp reprezentowało 20 roślin, które w warunkach szklarniowych były zakażane mechanicznie silnym szczepem PVM z odmiany Uran. Po ok. 7 dniach rośliny wysadzano w polu w celu obserwacji objawów PVM. Jesienią pobierano po 2 bulwy z rośliny do próby oczkowej w warunkach szklarniowych. Opisano wtórne objawy chorobowe, a obecność wirusa w roślinach sprawdzono testem ELISA. W zależności od nasilenia objawów PVM na roślinach odmiany podzielono na reagujące słabo, średnio lub silnie. Odmiany, których rośliny nie uległy zakażeniu, w następnym roku szczepiono infekcyjnymi zrazami w celu uzyskania reakcji nekrotycznej na odrostach podszczepiennych. Odmiany, których rośliny wykazały brak porażenia po mechanicznej inokulacji oraz reakcję nekrotyczną, uważa się za odporne na PVM. Pierwszymi odmianami w Polsce, w których wykryto gen Rm, były: Triada zarejestrowana w 1996 r. i Korona zarejestrowana w 2002. W puli 37 ocenianych odmian u 6 Ametyst, Bursztyn, Eugenia, Finezja, Gustaw i Legenda stwierdzono reakcję nadwrażliwości na PVM związaną z obecnością genu Rm (tab. 2). Odmiany ziemniaka odporne na PVM z reakcją nadwrażliwości Tabela 2 Odmiana Formy rodzicielskie Rok rejestracji Hodowla Ametyst PW 353 x Bila 2009 PMHZ Strzekęcino Bursztyn M 62633 x Fianna 2010 PMHZ Strzekęcino Eugenia PW 368 x Pamir 2006 HZ Zamarte Finezja PS 1669 x Karlena 2007 HZ Zamarte Gustaw DS 2 x PS 647 2010 PMHZ Strzekęcino Legenda M 62633 x Fianna 2010 PMHZ Strzekęcino
7 Dotychczas nie wykorzystano w hodowli ziemniaka odporności na PVM pochodzącej z S. gourlayi, determinowanej genem Gm. Odporność na PVS w diploidalnych klonach i tetraploidalnych odmianach ziemniaka Stwierdzona w diploidach oraz niektórych odmianach odporność na PVS pochodzi z tetraploidalnego gatunku uprawnego S. tuberosum subsp. andigena i jest determinowana przez gen Ns (Baerecke 1967). Ekspresja tego genu wyraża się reakcją nadwrażliwości po inokulacji roślin przez szczepienie. Gen ten zapewnia wysoką odporność na zakażanie PVS w warunkach polowych, chociaż Butkiewicz i Dziewońska (dane niepublikowane) zaobserwowały, że rośliny rodów z genem Ns sporadycznie porażały się PVS w polu. Pierwszymi odmianami posiadającymi gen Ns były węgierska Szignal i niemiecka Fantasia (Ross 1986). Do tej pory odporność na PVS opartą na reakcji nadwrażliwości warunkowaną genem Ns stwierdzono u 5 odmian: Barycz, Klepa, Meduza i Omulew (Chrzanowska 2000) oraz Neptun, których obecnie nie ma w KR. Opracowano markery molekularne sprzężone z genem Ns, które mogą mieć zastosowanie w selekcji diploidalnych i tetraploidalnych form odpornych na PVS (Marczewski 2001). Spośród diploidalnych klonów ziemniaka wyróżniono genotypy odporne na PVS, które włączono do prac genetycznych. W oddziale IHAR-PIB w Młochowie od wielu lat testuje się rośliny z prób sadzeniaków pod względem porażenia wirusem S (Chrzanowska, Zagórska 2005). W latach 2007-2012 przetestowano 20-bulwowe próby sadzeniaków kwalifikowanych 100 odmian ziemniaka. Z tej grupy 71% prób okazało się wolnych od PVS, 19% wykazało porażenie 0-20%, a 10% było porażonych w 90-100% przynajmniej raz na 3-4 próby: z HZ Zamarte Gwiazda, Hubal, Stasia, z PMHZ Strzekęcino Ametyst i Michalina. Odmiany, u których stwierdzono najwyższe porażenie PVS, należą do nowszych i jeszcze nie przeszły procesu odwirusowania w kulturach in vitro. Spośród testowanych odmian wyróżniono 9, których rośliny okazały się wolne od wirusa S w kilku kolejnych latach. Do oceny odporności na PVS użyto metody mechanicznego zakażania 10 roślin każdej odmiany izolatem zwykłym z odmiany Leona. Po inokulacji rośliny były prowadzone w szklarni, ponieważ w tych warunkach objawy porażenia PVS są wyraźne. Na dolnych liściach pojawiają się drobne, zielone plamki na żółknącym tle. W czwartym tygodniu po inokulacji rośliny były badane na obecność wirusa testem ELISA. PVS nie wykryto w roślinach 7 odmian: Etola, Jutrzenka, Skawa, Ślęza, Sonda, Tajfun i Zenia. Odporność odmiany Tajfun na PVS pochodzi od form rodzicielskich wyhodowanych w Młochowie i jest warunkowana genem Ns. Źródła odporności pozostałych odmian nie są znane, dlatego też wymagają one dalszych badań. Podsumowując, należy zauważyć, że chociaż PVM i PVS są zaliczane do wirusów o mniejszym znaczeniu gospodarczym, trzeba je uwzględniać w hodowli odpornościowej. Nie ma postępu hodowlanego w zakresie odporności odmian na oba wirusy. W KR jedynie 6 odmian jest odpornych na PVM (z genem Rm), a odporności determinowanej genem Gm hodowcy dotychczas nie wykorzystali. Podobnie, tylko 7 odmian ma genetyczną odporność na PVS. Wykorzystanie diploidalnych klonów ziemniaka jako źródła odporności na PVM i PVS może być równoległą drogą, obok tradycyjnej hodowli, do podniesienia poziomu odporności na te wirusy w nowych odmianach. Literatura 1. Baerecke M. L. 1967. Überempfindlichkeit gegen das S-Virus der Kartoffel in einem bolivianischen Andigena-Klon. Züchter 37: 281-286; 2. Brunt A. 2001. Potato virus S (PVS; Genus Carlavirus). [W:] Loebenstein G., Berger P. H., Brunt A. A., Lawson R. H. (eds). Virus and virus like diseases of potatoes and production of seed-potatoes. Kluwer Acad. Publ.: 109-112; 3. Butkiewicz H. 1984. Synteza materiałów wyjściowych odpornych na wirusy. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 273: 135-148; 4. Chrzanowska M. 1988. Reakcja rodów ziemniaka polowo odpornych na wirus liściozwoju (PLRV) oraz wirusy Y (PVY) i M (PVM) po zakażeniu roślin metodą szczepienia. Biul. Inst. Ziemn. 38: 9-19; 5. Chrzanowska M., Zagórska H. 1996. Reakcja odmian ziemniaka na silny szczep wirusa M po sztucznej inokulacji roślin. Biul. Inst. Ziemn. 46: 17-27; 6. Chrzanowska M. 2000. Krańcowa odporność na wirusy Y i X ziemniaka oraz polowa odporność
8 na wirus S ziemniaka w polskich odmianach ziemniaka. Biul. IHAR 214: 231-238; 7. Chrzanowska M., Sieczka M. T., Zagórska H. 2002. Resistance to PVM in potato parental lines bred in Młochów Research Center. IHAR. Plant Breed. Seed Sci. 46, 2: 57-65; 8. Chrzanowska M., Zagórska H. 2005. Izolaty wirusa S w materiałach nasiennych odmian ziemniaka uprawianych w Polsce. Ziemn. Pol. 4: 7-10; 9. Chrzanowska M., Michalak K., Zagórska H., Szajko K. 2011. Reakcja na wirusy odmian ziemniaka znajdujących się w Krajowym Rejestrze w 2010 roku. Biul. IHAR 260/261: 309-324; 10. Dziewońska M. A., Czech B., Ostrowska K., Waś M. 1978. Reaction to potato virus M (PVM) of hybrids with gene Rm derived from Solanum megistacrolobum. [W:] 7th Trienn. Conf. EAPR, Warsaw. Abstr.: 155-156; 11. Dziewońska M. A., Wawrzyczek M. 1991. Synteza ziemniaków odpornych na wirusy dorobek i perspektywa. [W]: Synteza materiałów wyjściowych dla hodowli ziemniaka dorobek i perspektywa. Mater. konf. zorganizowanej przez ZGiSMW. Bonin, 20-21.02.1991. Inst. Ziemn. Bonin: 17-27; 12. Kostiw M. 2011. Ocena zagrożenia plantacji nasiennych ziemniaka przez choroby wirusowe. Wieś Jutra 150/151: 27-29; 13. Marczewski W. 2001. Inter-simple sequence repeat (ISSR) markers for the Ns resistance gene in potato (Solanum tuberosum L.). J. Appl. Genet. 42 (2): 139-144; 14. Miętkiewska E. 1997. Współdziałanie dwóch typów odporności na wirus M ziemniaka (PVM), pochodzących od Solanum gourlayi i S. megistacrolobum w ziemniakach tetraploidalnych. Rozpr. dokt. IHAR Oddz. Młochów: 73 s.; 15. Ross H. 1986. Potato breeding problems and perspectives. Advances in Plant Breeding. Suppl. J. Plant Breed.: 74 s.; 16. Wasilewicz-Flis I. 2001. Selekcja rodów hodowlanych odpornych na wirus M ziemniaka (PVM), w których odporność determinowana jest genami Gm i Rm. Monogr. i Rozp. Nauk. 10/2001: 49-51; 17. Waś M., Dziewońska M. A., Ostrowska K., Kowalska A. 1980. Reaction of Solanum gourlayi and its hybrids with Solanum tuberosum to potato virus M (PVM). Phytopath. Z. 97: 186- -191