Ocena wiarygodności diagnostyki mikrobiologicznej w Polsce na podstawie wyników POLMICRO 2018

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics Diagn Lab. 2019; 55(2): 99-106 ISSN 0867-4043 Praca oryginalna Original Article Ocena wiarygodności diagnostyki mikrobiologicznej w Polsce na podstawie wyników POLMICRO 2018 The assessment of microbiological diagnostics credibility in Poland on the basis of the POLMICRO 2018 Programme results Ewa Młodzińska, Karolina Bosacka, Anna Mikołajczyk, Joanna Rybicka, Waleria Hryniewicz Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej, Warszawa Streszczenie Program POLMICRO Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych organizowany jest przez Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej (COBJwDM). Celem Programu POLMICRO 2018 była ocena biegłości laboratoriów w interpretacji preparatów mikroskopowych barwionych metodą Grama, identyfikacji drobnoustrojów, oznaczaniu wrażliwości na antybiotyki, wykrywaniu mechanizmów oporności takich jak: ESBL, MBL, KPC, PRP oraz oporność gronkowców na metycylinę. Przesyłane w ramach Programu izolaty bakteryjne różniły się wrażliwością na antybiotyki oraz obecnością różnych mechanizmów oporności. Praca przedstawia wyniki XXV edycji POLMICRO 2018. Abstract POLMICRO programme the Polish National External Quality Assessment Scheme in Microbiology is organized by the Centre of Quality Control in Microbiology (CQCM). The aim of the POLMICRO 2018 Programme was to evaluate proficiency of laboratories in the interpretation of Gram slides, identification of microorganisms, determination of susceptibility to antibiotics, detection of resistance mechanisms like ESBL, MBL, KPC, PRP or resistance of staphylococci to methicillin. Bacterial isolates distributed within the Programme differed in their susceptibility to antibiotics and the presence of various resistance mechanisms. The paper presents the results of the XXV edition POLMICRO 2018. Słowa kluczowe: Key words: POLMICRO, zewnątrzlaboratoryjny sprawdzian wiarygodności, identyfikacja, lekowrażliwość, mechanizmy oporności POLMICRO, external quality assessment scheme, identification, susceptibility to antimicrobials, resistance mechanisms Wstęp Ogólnopolski Zewnątrzlaboratoryjny Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych POLMICRO umożliwia laboratoriom poddawanie kontroli różnych etapów diagnostyki mikrobiologicznej takich jak preparaty bezpośrednie, identyfikacja do poziomu gatunku i oznaczanie fenotypów wrażliwości na leki różnych gatunków bakterii, jak i wykrywanie mechanizmów oporności. Udział w kontroli zewnętrznej pozwala na ocenę jakości badań rutynowo wykonywanych w laboratorium oraz na stałe monitorowanie jego pracy. Program POLMICRO prowadzi Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej (COBJwDM). Celem Programu POLMICRO, oprócz oceny kompetencji laboratoriów mikrobiologicznych w zakresie identyfikacji, oznaczania wrażliwości i wykrywania mechanizmów oporności na leki czynników etiologicznych najczęstszych bakteryjnych zakażeń człowieka, jest szeroko pojęta edukacja. Z tego względu, w oparciu o sytuację epidemiologiczną w poszczególnych latach, edycje programu dedykowane są istotnym mechanizmom oporności na leki. Dominującym wśród pałeczek Gram-ujemnych mechanizmom takim jak obecność β-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym-esbl, cefalosporynaz- -AmpC, karbapenemaz klasy A (KPC, GES), klasy B (metalo-β laktamaz, VIM, IMP, NDM) i C (OXA-48) oraz mechanizmom oporności bakterii Gram dodatnich; tj. oporności pneumokoków na penicylinę i makrolidy, gronkowców na metycylinę czy enterokoków na wankomycynę, aminoglikozydy (HLAR) i linkozamidy. Szczepy o nowych mechanizmach oporności, które nie pojawiły się dotychczas w Programie POLMICRO, wysyłane są początkowo w celach edukacyjnych, co oznacza, że nie podlegają ocenie. W komentarzu do Programu mechanizm jest szczegółowo opisywany wraz z zaleceniami dotyczącymi wykrywania go w rutynowej diagnostyce. Ponowne wysłanie szczepów o danym mechanizmie oporności pozwala ocenić skuteczność podjętych działań edukacyjnych. W roku 2018 odbyła się XXV edycja Programu POLMICRO. Na podstawie ustalonego na początku roku harmonogramu badań 99

www.diagnostykalaboratoryjna.eu biegłości, COBJwDM zorganizował sześć rund sprawdzianów obejmujących różne obiekty badań, metody i techniki badawcze. Przedmiotem przeprowadzonych sprawdzianów była ocena preparatów mikroskopowych, identyfikacja izolatów do poziomu gatunku, oznaczenie różnych fenotypów wrażliwości i wykrywanie następujących mechanizmów oporności na leki: ESBL, KPC, MBL u pałeczek Gram-ujemnych oraz oporność pneumokoków na penicylinę i gronkowców koagulazo-ujemnych na metycylinę. Na zakończenie każdej rundy Programu POLMICRO laboratoria otrzymały ocenę wraz z komentarzem dotyczącym wyników badań oraz ze wskazówkami odnośnie stosowanych metod i technik diagnostycznych, które mogą być wykorzystane w procesie doskonalenia laboratoriów. Materiały i metody Wszystkie obiekty badań pochodziły z kolekcji COBJwDM i zostały przygotowane na potrzeby Programu badań biegłości POLMICRO. Wykorzystane izolaty bakteryjne należące do różnych gatunków, o różnych fenotypach wrażliwości na leki przeciwdrobnoustrojowe przedstawiono w tabeli I. Pierwsza runda była sprawdzianem praktycznym w wersji elektronicznej, a zadaniem laboratoriów było udzielenie odpowiedzi na piętnaście pytań testowych dotyczących interpretacji preparatów mikroskopowych, testów identyfikacyjnych, testów lekowrażliwosci oraz najnowszych rekomendacji EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing). Przygotowano dwa zestawy pytań testowych różniące się pytaniem dotyczącym interpretacji preparatu do kontroli jakości barwienia metodą Grama. Praktyczne rundy Programu, od II do V, zawierały różne obiekty badań i związane z nimi zadania. W II rundzie POLMICRO 2018 laboratoria otrzymały dwa szczepy bakteryjne do identyfikacji do poziomu gatunku, oznaczenia lekowrażliwości i wykrycia mechanizmów oporności. Szczep A wyizolowany z posiewu plwociny od pacjentki z zapaleniem płuc chorującej od wielu lat na mukowiscydozę, a szczep B wyizolowany od pacjenta z urosepsą z posiewu krwi i moczu. W III rundzie uczestnicy Programu otrzymali zestaw pięciu izolatów do identyfikacji, w tym czterech także do oznaczenia lekowrażliwości i wykrycia mechanizmów oporności. Przedmiotem badań były drobnoustroje wymagające do wzrostu wzbogaconych podłoży i odpowiednich warunków inkubacji (atmosfera 5-10% CO 2). IV rundę poświęcono wstępnej diagnostyce: laboratoria otrzymały pięć preparatów mikroskopowych. Preparaty A i B pochodziły z dodatniej hodowli krwi od pacjenta hospitalizowanego na Oddziale Intensywnej Terapii, preparat C pochodził z jednorodnej hodowli bakteryjnej uzyskanej z materiału od pacjenta z pooperacyjnym zapaleniem gałki ocznej, preparat D wykonano z hodowli bakteryjnej uzyskanej z materiału z rany oparzeniowej, a preparat E zawierał różne drobnoustroje do kontroli jakości barwienia metodą Grama. Zadaniem uczestników było utrwalenie, a następnie zabarwienie preparatów metodą Grama oraz ich ocena pod mikroskopem. W rundzie V laboratoria otrzymały zestaw zawierający dwa szczepy z rodzaju Staphylococcus do identyfikacji i oznaczenia lekowrażliwości właściwej dla przedstawionego przypadku klinicznego. Pierwszy izolat wyhodowano od pacjenta z zakażeniem skóry i tkanki podskórnej, a drugi od pacjenta z zakażeniem łożyska krwi. W rundzie VI POLMICRO 2018 zadaniem laboratoriów była odpowiedź na zawarte w ankiecie elektronicznej dziesięć pytań testowych dotyczących zasad wykonywania testów lekowrażliwości oraz ich interpretacji, oceny preparatów mikroskopowych barwionych metodą Grama oraz aktualnych rekomendacji EUCAST [1, 2, 3]. Runda ta miała charakter edukacyjny, a jej wyniki nie były brane pod uwagę przy przyznawaniu Świadectw. Po zakończeniu każdej rundy Sprawdzianu uczestnicy otrzymywali indywidualną ocenę oraz zbiorcze wyniki wszystkich Laboratoriów, które uczestniczyły w Programie. Do Sprawozdania kończącego każdą rundę dołączano szczegółowy komentarz zawierający opis obiektów badań danej rundy wraz z zaleceniami. Ocena wszystkich rund Programu POLMICRO przeprowadzona była zgodnie z normą PN-EN ISO/IEC 17043:2011 Ocena zgodności. Ogólne wymagania dotyczące badań biegłości [4] i procedurą Centralnego Ośrodka Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej PO-02 Program Badań Biegłości POLMICRO. Na podstawie wyników uzyskanych przez uczestników i wyliczonego wskaźnika z (z-score) przyznawano ocenę pozytywną lub negatywną. Laboratoriom, które uczestniczyły we wszystkich rundach Programu POLMICRO 2018 i otrzymały wyniki pozytywne przyznano Świadectwa uzyskania pozytywnych wyników w Ogólnopolskim Sprawdzianie Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych POLMI- CRO. Laboratoria, które nie przystąpiły do wszystkich rund Programu POLMICRO 2018 lub uzyskały co najmniej jedną ocenę negatywną, otrzymały zaświadczenia o uczestnictwie w Programie i uzyskanych wynikach. Rycina 1. Liczba laboratoriów oraz ich wyniki uzyskane w poszczególnych rundach sprawdzianu. Wyniki Liczba laboratoriów mikrobiologicznych biorących udział w Programie POLMICRO 2018 była różna w zależności od rundy. Na rycinie 1 przedstawiono liczbę laboratoriów oraz ich wyniki uzyskane w poszczególnych rundach Sprawdzianu. Zielonym kolorem zaznaczono wyniki pozytywne wskaźnik z 2. Wyniki warunkowo pozytywne zaznaczono kolorem żółtym ze wskaźnikiem z-score pomię- 100

Diagn Lab. 2019; 55(2): 99-106 Tabela I. Obiekty badań wykorzystane w poszczególnych rundach Programu POLMICRO 2018 (edycja XXV) Obiekty badań nr kolekcji POLMICRO Mechanizmy oporności / fenotyp wrażliwości / opis obiektów badań POLMICRO 2018 runda I Listeria monocytogenes PM 330 - Zdjęcie preparatu mikroskopowego z posiewu osadu PMR Moraxella catarrhalis PM 331 - Zdjęcie preparatu mikroskopowego do kontroli jakości barwienia metodą Grama Staphylococcus aureus PM 332 - Zdjęcie preparatu mikroskopowego do kontroli jakości barwienia metodą Grama Pseudomonas aeruginosa PM 333 - Zdjęcie preparatu mikroskopowego do kontroli jakości barwienia metodą Grama Enterococcus casseliflavus PM 334 - Zdjęcia testu na zdolność ruchu i testu na wytwarzanie barwnika Proteus mirabilis PM 335 ESBL (+) pozwalający wykryć β-laktamazę o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) + pytanie testowe Serratia marcescens PM 336 MBL (+) w kierunku mechanizmu MBL + pytanie testowe Klebsiella pneumoniae PM 337 KPC (+) w kierunku mechanizmu KPC + pytanie testowe Staphylococcus epidermidis PM 338 MLS B indukcyjny Zdjęcie płytki z podłożem agarowym Mueller-Hinton oznaczanie wrażliwości na makrolidy, linkozamidy i streptograminy + pytanie testowe Staphylococcus epidermidis PM 339 - Zdjęcie płytki z podłożem agarowym Mueller-Hinton oznaczanie wrażliwości na makrolidy, linkozamidy i streptograminy + pytanie testowe POLMICRO 2018 runda II Pseudomonas aeruginosa PM 340 - [TZP, CAZ, IMP, MEM, CIP, LEV, AK]=R Klebsiella pneumoniae PM 341 KPC (+) [AMC, CAZ, CRO, IMP, MEM, CIP, GM]=R, [AK] =I/R, [SXT]=S Klebsiella pneumoniae PM 342 MBL (+) [NDM] [AMC, CAZ, CRO, IMP, MEM, CIP, AK, GM, SXT]=R POLMICRO 2018 runda III Haemophilus influenzae PM 343 BLPACR [AMP, AMC]=R Haemophilus influenzae PM 344 BLPAR [AMP]=R, [AMC]=S Streptococcus pyogenes PM 345 - [E, CL]=S Streptococcus pneumoniae PM 346 - [P, CTX, CRO]=R, [E, CL]=S Eikenella corrodens PM 347 - Izolat tylko do identyfikacji Aggregatibacter aphrophilus PM 348 - Izolat tylko do identyfikacji POLMICRO 2018 runda IV Preparaty mikroskopowe z dodatniej hodowli krwi Preparaty mikroskopowe z hodowli na podłożu stałym A i B Pałeczki Gram-ujemne Z posiewu krwi wyhodowano Pseudomonas aeruginosa PM 349 A i B Ziarenkowce Gram- -dodatnie Z posiewu krwi wyhodowano Staphylococcus aureus PM-350 C Laseczki Gram-dodatnie Preparat z hodowli Bacillus cereus PM-351 D Pałeczki Gram-ujemne Preparat z hodowli Pseudomonas aeruginosa PM-352 Pałeczki Gram-ujemne Preparat z hodowli Pseudomonas aeruginosa PM-353 E Komórki grzybów drożdżoidalnych Preparat z hodowli Candida glabrata PM-354 POLMICRO 2018 runda V Staphylococcus epidermidis PM 355 L-fenotyp [FOX, CL, GM, CIP, LZD]=R, [E, VA]=S Staphylococcus haemolyticus PM 356 MLS B indukcyjny [FOX, CL, GM, CIP]=R, [VA]=S Staphylococcus haemolyticus PM 357 MLS B indukcyjny [FOX, CL, E, GM]=R, [CIP, VA]=S POLMICRO 2018 runda VI Proteus mirabilis PM-358 ESBL (+) pozwalający wykryć β-laktamazę o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) + pytanie testowe Pseudomonas aeruginosa PM-359 Zdjęcie preparatu mikroskopowego z dodatniego posiewu krwi Klebsiella pneumoniae PM-360 MBL (+) w kierunku mechanizmu MBL + pytanie testowe Klebsiella pneumoniae PM-361 w kierunku mechanizmu MBL + pytanie testowe BLPACR szczep wytwarzający β-laktamazę, oporny na amoksycylinę; BLPAR szczep wytwarzający β-laktamazę, oporny na ampicylinę; ESBL β-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym; KPC karbapenemazy klasy A; L-fenotyp wrażliwość na erytromycynę, wrażliwość/średnia wrażliwość/oporność na klindamycynę i oporność na linkomycynę in vitro; MBL karbapenemazy klasy B, tzw. metalo-β-laktamazy; MLS B (indukcyjny) oporność na makrolidy, linkozamidy i streptograminy B; NDM metalo-β-laktamazy typu New Delhi. AK-amikacyna, AMC-amoksycylina z kwasem klawulanowym, AMP-ampicylina, CAZ-ceftazydym, CIP-ciprofloksacyna, CL-klindamycyna, CRO-ceftriakson, CTX-cefotaksym, E-erytromycyna, FOX-cefoksytyna, GM-gentamycyna, IMP-imipenem, LEV-lewofloksacyna, LZD-linezolid, MEM-meropenem, P-penicylina, TZP-piperacylina z tazobaktamem, VA-wankomycyna S (susceptible) wrażliwy, I (intermediate) średniowrażliwy, R (resistant) -oporny 101

www.diagnostykalaboratoryjna.eu dzy 2 < z > 3. Oceny negatywne przyznane laboratoriom, które otrzymały z 3 oznaczono kolorem czerwonym. Identyfikacja Czterysta czterdzieści laboratoriów (99,5%) spośród czterystu czterdziestu dwóch poprawnie zidentyfikowało obydwa szczepy przesłane w ramach II rundy Sprawdzianu. Jedno laboratorium popełniło błąd w identyfikacji szczepu A, zamiast Pseudomonas aeruginosa PM-340 podano Pseudomonas putida, drugie laboratorium nieprawidłowo zidentyfikowało szczep B Klebsiella pneumoniae PM-342 jako Klebsiella oxytoca. W trzeciej rundzie czterysta trzydzieści sześć laboratoriów (99,5%) poprawnie zidentyfikowało szczepy A, B, C i D. Dwa laboratoria popełniły błąd w identyfikacji szczepu B zamiast Haemophilus influenzae PM-344 jedno oznaczyło go jako Haemophilus parainfluenzae, a drugie-haemophilus aphrophilus. Laboratoria dodatkowo otrzymały edukacyjny szczep E którego identyfikacja z założenia nie podlegała ocenie. Uczestnicy byli o tym poinformowani w Liście rozpoczynającym III Rundę POLMICRO 2018. Zadania podjęło się czterysta piętnaście laboratoriów (94,7%), a prawidłowej odpowiedzi udzieliło aż trzysta sześćdziesiąt siedem (83,8%) z nich. Zestaw pierwszy zawierający jako szczep E-Eikenella corrodens PM-347 otrzymało dwieście osiemnaście laboratoriów. Sto osiemdziesiąt siedem (85,8%) zidentyfikowało ten szczep prawidłowo. Zestaw drugi zawierający szczep Aggregatibacter aphrophilus PM-348 otrzymało dwieście dwadzieścia laboratoriów, sto osiemdziesiąt (81,8%) zidentyfikowało szczep E prawidłowo. Szczepy A i B przesłane do laboratoriów w V rundzie poprawnie zidentyfikowało czterysta trzydzieści pięć z nich (99,5%), w przypadku szczepu B z zestawu drugiego Staphylococcus haemolyticus PM-357 dwóch uczestników popełniło błąd identyfikując szczep jako Staphylococcus saprophyticus. Lekowrażliwość i mechanizmy oporności W II rundzie POLMICRO 2018 laboratoria (n=442) otrzymały zestaw dwóch szczepów (A i B). Zestawy różniły się między sobą szczepem B. Szczep A Pseudomonas aeruginosa PM-340 był oporny na wszystkie leki wymienione w Formularzu Odpowiedzi. Czterysta trzydzieści jeden (97,5%) laboratoriów prawidłowo oznaczyło lekowrażliwość szczepu na piperacylinę z tazobaktamem. Dziesięć laboratoriów (2,3%) nieprawidłowo podało, że szczep jest wrażliwy na ten antybiotyk, a jedno średniowrażliwy. Czterystu trzydziestu czterech (98,2%) uczestników prawidłowo oceniło oporność szczepu na imipenem. Dwa laboratoria błędnie zaznaczyły, że szczep jest wrażliwy na ten lek, a pięć, że średniowrażliwy. Trzysta pięćdziesiąt trzy (79,9%) laboratoria poprawnie podały, że szczep jest oporny na meropenem. Czterystu trzydziestu (97,3%) uczestników oznaczyło prawidłowo lekowrażliwość szczepu na fluorochinolony. Wszystkie laboratoria prawidłowo oznaczyły lekowrażliwość szczepu na ceftazydym i amikacynę. Klebsiella pneumoniae PM-341 szczep B (I zestaw) otrzymało dwieście dwadzieścia trzy laboratoria. Izolat był oporny na amoksycylinę z kwasem klawulanowym, cefotaksym, ceftriakson, karbapenemy, fluorochinolony, gentamycynę oraz wrażliwy na trimetoprim/sulfametoksazol. Szczep był ESBL-dodatni i produkował karbapenemazę klasy A (KPC). Z oceny wyłączono oznaczenie ESBL oraz OXA-48 ze względu na trudności związane z odczytem testów fenotypowych. Wszystkie laboratoria (100%) prawidłowo oznaczyły lekowrażliwość szczepu na amoksycylinę z kwasem klawulanowym, cefalosporynę III generacji, ciprofloksacynę, gentamycynę oraz amikacynę. Dwieście osiem (93,3%) laboratoriów na podstawie oznaczenia wrażliwości na imipenem poprawnie zakwalifikowało szczep do kategorii oporny. Podobnie sytuacja wyglądała w przypadku oznaczenia lekowrażliwości Klebsiella pneumoniae PM-341 na meropenem. Stu dziewięćdziesięciu siedmiu (88,3%) uczestników prawidłowo zaznaczyło, że szczep jest oporny. Oznaczenie wrażliwości na trimetoprim/sulfametoksazol nie przysporzyło laboratoriom większych problemów. Szczep Klebsiella pneumoniae PM-341 był producentem KPC (ang. Klebsiella pneumoniae carbapenemase), dwieście siedemnaście (97,3%) laboratoriów prawidłowo oznaczyło mechanizm oporności tego szczepu. Dwa laboratoria błędnie podały, że szczep jest MBL-dodatni a kolejne pięć nie wykryło produkcji karbapenemaz. Szczep B Klebsiella pneumoniae PM-342 (II zestaw) wykazywał oporność na wszystkie antybiotyki umieszczone w Formularzu Odpowiedzi i był producentem metalo-β-laktamazy (NDM). Stu dziewięćdziesięciu czterech (88,6%) uczestników prawidłowo wykryło mechanizm oporności szczepu. Trzech uczestników błędnie podało, że szczep jest producentem KPC, natomiast aż dwudziestu dwóch uczestników, że Klebsiella pneumoniae PM-342 produkuje zarówno karbapenemazę klasy A (KPC) jak i klasy B (MBL). Wszystkie laboratoria prawidłowo podały, że szczep PM-342 jest oporny na amoksycylinę z kwasem klawulanowym, cefotaksym lub ceftriakson i ciprofloksacynę. Sto dziewięćdziesiąt jeden (87,2%) laboratoriów prawidłowo podało, że szczep jest oporny na imipenem, natomiast dwadzieścia osiem (12,8%) popełniło błąd zaznaczając odpowiedź średniowrażliwy. Zdecydowana większość laboratoriów prawidłowo oceniła także oporność szczepu na meropenem (n=217, 99%). Prawie wszystkie laboratoria bezbłędnie zakwalifikowały szczep jako oporny na aminoglikozydy (amikacyna n=218-99,5%; gentamycyna n=214 97,7%). Jedno laboratorium błędnie określiło szczep jako wrażliwy na trimetoprim/sulfametoksazol. W III rundzie Programu POLMICRO zadaniem laboratoriów (n=438) była identyfikacja i ocena lekowrażliwości tzw. wymagających drobnoustrojów. Szczep Haemophilus influenzae PM-343 produkuje β-laktamazę i jest oporny na ampicylinę i amoksycylinę z kwasem klawulanowym fenotyp BLPACR (ang. Beta-Lactamase Positive, Amoxicillin-Clavulanate Resistant). Ten mechanizm oporności związany jest zarówno z obecnością β-laktamazy, jak i mutacjami w genie kodującym białko PBP3. Czterysta trzydzieści jeden laboratoriów (98,4%) prawidłowo określiło mechanizm jako BLPACR. Cztery laboratoria błędnie zaznaczyły fenotyp BLPAR, czyli nieprawidłowo oznaczyły wrażliwość na amoksycylinę z kwasem klawulanowym, a dwa BLNAR co związane było z nieprawidłową interpretacją testu cefinazowego. 102

Diagn Lab. 2019; 55(2): 99-106 Szczep Haemophilus influenzae PM-344 β-laktamazo-dodatni jest oporny na ampicylinę BLPAR (ang. Beta-Lactamase Positive, Ampicillin Resistant) i wrażliwy na amoksycylinę z kwasem klawulanowym. Czterysta trzydzieści dwa laboratoria (98,6%) prawidłowo określiły jego fenotyp. Mechanizm oporności BLPAR jest związany z produkcją β-laktamazy przez drobnoustrój. Oznaczenie wrażliwości szczepu na ampicylinę przeprowadzono bezbłędnie, natomiast w oznaczaniu wrażliwości szczepu na amoksycylinę z kw. klawulanowym dwanaście laboratoriów popełniło błąd, oznaczając szczep jako oporny zamiast wrażliwy. Laboratoria nie miały trudności z uzyskaniem prawidłowych wyników oznaczeń (99,5%) na leki zawarte w Formularzu Odpowiedzi szczepu C-Streptococcus pyogenes PM-345 tj. wrażliwy na erytromycynę (n=436/438) i klindamycynę (n=436/438). Szczep D Streptococcus pneumoniae PM-346 jest oporny na penicylinę (referencyjna wartość MIC 4 mg/l) i cefalosporyny MIC cefotaksymu 4 mg/l, MIC ceftriaksonu 4 mg/l. Zgodnie z przypadkiem klinicznym (zakażenie inne niż zapalenie opon mózgowo- -rdzeniowych) należało zinterpretować szczep jako oporny i taką interpretację dla penicyliny podało 397 laboratoriów (90,6%). Interpretację kliniczną średniowrażliwy podało trzydzieści osiem laboratoriów. Wynik oznaczenia szczepu na penicylinę wrażliwy zamiast oporny uzyskały trzy laboratoria (0,7%). Rozkład wartości MIC penicyliny dla S. pneumoniae PM-346 uzyskanych przez laboratoria przedstawiono na rycinie 2.Oznaczenie wrażliwości szczepu PM-346 na cefotaksym przeprowadziło trzystu trzydzieści jeden uczestników Programu (n=331/438; 75,6 %) i trzysta piętnaście (95,2%) z nich uzyskało prawidłowy wynik tj oporny. Wrażliwość szczepu na ceftriakson przetestowało sto sześć laboratoriów (n=106/438; 24,2%) i osiemdziesiąt trzy (78,3%) z nich uzyskało poprawny wynik tj. oporny. Interpretacja S. pneumoniae PM-346 średniowrażliwy na penicylinę i cefalosporyny została uznana jako poprawną, z uwagi na możliwość uzyskania takiego wyniku dla tego szczepu w zależności od zastosowanej kombinacji dostępnych na rynku pasków z gradientem antybiotyku i podłoży antybiogramowych. Wyniki przeprowadzonej w Centralnym Ośrodku kontroli jakości ze szczepem S. pneumoniae ATCC 49619 różnych połączeń pasek z gradientem stężeń antybiotyku/podłoże Mueller-Hinton dla drobnoustrojów wymagających, różnych producentów, były prawidłowe i mieściły się w zakresach wyznaczonych w tabelach kontroli jakości EUCAST v. 8.0 [2]. W rundzie V poświęconej gronkowcom koagulazo-ujemnym wyniki oznaczeń lekowrażliwości przedstawiają się następująco: Staphylococcus epidermidis PM-355 szczep metycylinooporny, oporny na gentamycynę, ciprofloksacynę, linezolid i klindamycynę, wrażliwy na erytromycynę oraz wankomycynę (MIC=1,5mg/L). Szczep charakteryzował się obecnością L-fenotypu, co oznacza, że w jego leczeniu nie powinno się stosować linkomycyny i klindamycyny. Izolat otrzymały wszystkie laboratoria (n=437). Czterystu dwudziestu siedmiu (97,7%) uczestników prawidłowo oznaczyło fenotyp oporności na makrolidy, linkozamidy i streptograminy B. Ocena wrażliwości na pozostałe leki nie sprawiła uczestnikom trudności. Staphylococcus haemolyticus PM-356 szczep metycylinooporny, oporny na klindamycynę, erytromycynę, gentamycynę i ciprofloksacynę, wrażliwy na wankomycynę, charakteryzował się obecnością indukcyjnego fenotypu oporności na makrolidy, linkozamidy i streptograminy B, co oznacza, że należało raportować jako klinicznie oporny na klindamycynę. Izolat ten otrzymało 218 laboratoriów. Wszystkie prawidłowo oznaczyły wrażliwość na gentamycynę i wankomycynę. Laboratoria nie miały problemu z określeniem indukcyjnego fenotypu oporności MLS B (100% prawidłowych odpowiedzi). Ocena wrażliwości na pozostałe leki nie sprawiła uczestnikom trudności, a odsetek poprawnych interpretacji klinicznych cefoksytyny i ciprofloksacyny wynosił 99,5%. Szczep Staphylococcus haemolyticus PM-357 metycylinooporny, oporny na klindamycynę, erytromycynę, gentamycynę, wrażliwy na ciprofloksacynę i wankomycynę, charakteryzował się obecnością indukcyjnego fenotypu oporności na makrolidy, linkozamidy i streptograminy B. Izolat otrzymało 219 laboratoriów i 99,5% z nich prawidłowo określiło indukcyjny fenotyp oporności MLSB. Jedno popełniło błąd określając fenotyp oporności jako konstytutywny i podało błędną interpretację kliniczną wrażliwości szczepu na klindamycynę: szczep wrażliwy. Ocena wrażliwości na pozostałe leki nie sprawiła uczestnikom trudności odsetek poprawnych interpretacji klinicznych cefoksytyny, gentamycyny, ciprofloksacyny i wankomycyny wynosił 99,5%. Rycina 2. Rozkład wartości MIC penicyliny uzyskanych przez laboratoria dla szczepu PM-346 Ocena preparatów mikroskopowych IV runda była poświęcona ocenie preparatów mikroskopowych. Laboratoria otrzymały pięć preparatów mikroskopowych A, B, C, D i E. Przygotowano dwa zestawy różniące się kolejnością preparatów A i B. Zestaw pierwszy zawierał w preparacie A Pseudomonas aeruginosa PM-349, a w preparacie B Staphylococcus aureus PM-350. Zestaw ten otrzymało 224 uczestników. Zestaw drugi który zawierał odpowiednio Staphylococcus aureus PM-350 w preparacie A i Pseudomonas aeruginosa PM-349 w preparacie B, był rozesłany do 223 103

www.diagnostykalaboratoryjna.eu laboratoriów. Preparaty pochodziły z dodatniej hodowli krwi i otrzymali je wszyscy uczestnicy. Preparat bezpośredni zawierający zawiesinę P. aeruginosa PM-349 prawidłowo oceniło ponad 96,4% (n=423) uczestników. Preparat przygotowany z zawiesiny S. aureus PM-350 poprawnie oceniło czterysta trzydzieści jeden (98,2%) laboratoriów. Preparat C pochodził z jednorodnej hodowli bakteryjnej uzyskanej z materiału od pacjenta z pooperacyjnym zapaleniem gałki ocznej i zawierał Bacillus cereus PM-351. W preparacie widoczne były Gram-dodatnie laseczki. Czterysta trzydzieści pięć (99,1%) laboratoriów prawidłowo oceniło preparat. Preparat D został przygotowany z zawiesiny szczepu P. aeruginosa PM-352 wyizolowanego z materiału pobranego z rany oparzeniowej. Czterysta trzydzieści cztery (98,9%) laboratoria podały prawidłową odpowiedź. Preparat E służył do kontroli jakości barwienia metodą Grama. Laboratoria otrzymały informację, że jeden z drobnoustrojów obecnych w preparacie barwi się Gram-dodatnio, a drugi Gram- -ujemnie. Preparat zawierał pałeczki Pseudomonas aeruginosa PM-353 oraz grzyby Candida glabrata PM-354.Czterysta trzydzieści sześć (99,3%) laboratoriów prawidłowo oceniło preparat E. Sprawdziany teoretyczne w wersji elektronicznej W pierwszej rundzie programu POLMICRO 2018 zadaniem laboratoriów było udzielenie odpowiedzi na pytania dotyczące interpretacji preparatów mikroskopowych barwionych metodą Grama, testów identyfikacyjnych i lekowrażliwości oraz aktualnych rekomendacji EUCAST. Poniżej przedstawiono pytania, z którymi uczestnicy programu mieli największe trudności. W zadaniu 3. przedstawiono dwa różne preparaty mikroskopowe zawierające bakterie Gram-dodatnie i Gram-ujemne po jednym dla każdego zestawu pytań, służące do kontroli jakości barwienia metodą Grama. Zdecydowanie trudniejszy w ocenie okazał się preparat z zestawu I Gram-ujemne i Gram-dodatnie ziarenkowce, aż sześćdziesiąt osiem laboratoriów popełniło błąd. Preparat z zestawu II zawierający Gram-ujemne pałeczki oraz Gram-dodatnie ziarenkowce nieprawidłowo oceniło tylko siedem laboratoriów. Wyniki uczestników wskazują na niejednakowy poziom trudności preparatów wybranych do tego zadania, a różnica w liczbie prawidłowych odpowiedzi między zestawami była znamienna statystycznie (p-value <0,05), dlatego Koordynator Programu zdecydował się o wyłączeniu tego zadania z oceny końcowej. Zadanie 5. dotyczyło wyboru szczepu wzorcowego do kontroli jakości krążków antybiogramowych w oznaczaniu lekowrażliwości szczepu Haemophilus influenzae. Zgodnie z wytycznymi EUCAST należy zastosować szczep H. influenzae ATCC 49766, natomiast dla amoksycyliny z kwasem klawulanowym należy skontrolować jakość inhibitora β-laktamaz, przy pomocy szczepu Staphylococcus aureus ATCC 29213 [2]. Ze względu na bardzo wysoki odsetek błędnych odpowiedzi pytanie to zostało wyłączone z oceny. Zadanie 7. polegało na ocenie testu fenotypowego pozwalającego wykryć β-laktamazę o rozszerzonym spektrum substratowym ESBL. Na podstawie zdjęcia można było wnioskować, że szczep Proteus mirabilis jest ESBL-dodatni. Charakterystyczne poszerzenie stref było widoczne przy krążkach z ceftazydymem 30µg i cefotaksymem 30 µg od strony krążka z amoksycyliną z kwasem klawulanowym 30µg. Dwadzieścia trzy (5,2%) laboratoria popełniły błąd i podały, że szczep nie wytwarza ESBL. W zadaniu 8. przedstawiono test fenotypowy pozwalający wykryć mechanizm MBL dla szczepu A Serratia marcescens oraz szczepu B Morganella morganii. Oba szczepy wytwarzały metalo-βlaktamazę. Tylko czterech uczestników (0,9%) wybrało błędną odpowiedź. W zadaniu 9. przedstawiono test fenotypowy pozwalający wykryć mechanizm KPC dla szczepu Klebsiella pneumoniae. Różnica wielkości stref zahamowania wzrostu wokół krążków z meropenemem i meropenemu z kwasem boronowym wynosiła 15 mm. Zgodnie z zaleceniami KORLD Wykrywanie karbapenemaz zalecenia 2017 test należy odczytać jako dodatni [5]. Dwa laboratoria nieprawidłowo zinterpretowały test. W zadaniu 10. przedstawiono zdjęcia antybiogramów dla dwóch szczepów Staphylococcus epidermidis. Oba szczepy były oporne na metycylinę, a szczep A dodatkowo prezentował fenotyp MLS B indukcyjny. Błędną odpowiedź wybrało tylko dwóch uczestników. Na zdjęciach w zadaniu 11. przedstawiono antybiogram dla szczepu Staphylococcus epidermidis opornego na metycylinę, wankomycynę, makrolidy, linkozamidy i streptograminy. Dziesięć laboratoriów (2,3%) nieprawidłowo wykonało to zadanie. Szósta runda Programu pełniła rolę edukacyjną, a jej wyniki nie były brane pod uwagę przy przyznawaniu Świadectw. W VI rundzie Sprawdzianu najwięcej błędnych odpowiedzi odnotowano w pytaniu dotyczącym rekomendowanej przez EUCAST zasady 15-15-15 związanej z podstawowymi zasadami wykonywania testów lekowrażliwości metodą dyfuzyjno-krążkową [3]. Biorąc pod uwagę, że część z prezentowanych pytań w niezmienionej treści pojawiła się w I rundzie 2018 roku należałoby oczekiwać, że odsetek prawidłowych odpowiedzi w tych pytaniach będzie wyższy. W pytaniu dotyczącym szczepów wzorcowych do kontroli jakości testów lekowrażliwości dla H. influenzae, w I rundzie POLMICRO 2018 aż 15,2% (n=67) uczestników popełniło błąd, natomiast w rundzie VI liczba błędów była znacznie niższa i wynosiła 6,2% (n=27). Ocena testu fenotypowego pozwalającego wykryć ESBL w szczepie Proteus mirabilis sprawiła trudność tylko pięciu laboratoriom (1,1%), podczas gdy w I rundzie odnotowano dwadzieścia trzy błędne odpowiedzi (n=5,2%). Po podsumowaniu wyników Programu POLMICRO 2018 zostały przyznane Świadectwa. Otrzymało je trzysta osiemdziesiąt osiem laboratoriów (87,1%). Pięćdziesiąt siedem laboratoriów (12,8%), które nie przystąpiły do wszystkich rund programu POLMICRO w cyklu rocznym lub uzyskały co najmniej jedną ocenę negatywną w danym roku, otrzymały zaświadczenia o uczestnictwie i uzyskanych wynikach. Dyskusja i podsumowanie Identyfikacja do poziomu gatunku, oznaczanie lekowrażliwości i wykrywanie mechanizmów oporności na leki czynników etiologicznych zakażeń to kluczowe elementy diagnostyki mikrobiologicznej zakażeń wywoływanych przez patogeny bakteryjne. Laboratorium mikrobiologiczne uczestnicząc w Ogólnopolskim Zewnątrzlaboratoryjnym Sprawdzianie Wiarygodności Badań 104

Diagn Lab. 2019; 55(2): 99-106 Mikrobiologicznych POLMICRO ma możliwość kontroli jakości oznaczeń wykonywanych rutynowo i sprawdzenia skuteczności kontroli wewnętrznej prowadzonej w laboratorium. Wiarygodność oceny preparatów mikroskopowych oraz wyników identyfikacji do poziomu gatunku uzyskiwane przez uczestniczące w Programie POLMICRO laboratoria pozostaje na stałym, wysokim poziomie. Liczba poprawnych wyników wynosi średnio: dla oceny preparatów mikroskopowych 95% (2015-2018) [6, 7, 8]; a dla identyfikacji drobnoustrojów 96% (1997-2017) [10], natomiast 99,5% w roku 2018. Oznaczenie wrażliwości na leki oraz wykrywanie i interpretacja mechanizmów oporności na antybiotyki, umożliwia podejmowanie odpowiednich decyzji terapeutycznych i działań związanych z kontrolą i profilaktyką zakażeń. Obecnie najbardziej istotne epidemiologicznie jest wykrywanie enzymów wytwarzanych przez pałeczki Gram-ujemne; zarówno z rzędu Enterobacterales w którego skład wchodzi rodzina Enterobacteriaceae jak i przez pałeczki niefermentujące; takich jak β-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) czy karbapenemazy. Jednym z najważniejszych w tej chwili mechanizmem oporności, który zaadresowano do laboratoriów uczestniczących w programie POLMICRO 2018 były karbapenemazy KPC i MBL (NDM). Trudności w oznaczaniu oporności na karbapenemy u Gram-ujemnych pałeczek mogą wynikać z różnych podstaw takiej oporności: wytwarzania β-laktamaz hydrolizujących karbapenemy (karbapenemazy klasy A, B i D), których ekspresja może być na różnym poziomie, nadprodukcja ESBL, zmniejszenia przepuszczalności osłon komórkowych, wypompowywania leku z komórki lub współwystępowania powyższych mechanizmów. W 2011 laboratoria po raz pierwszy w Sprawdzianie otrzymały szczep KPC dodatni Escherichia coli PM-190 i 20,1% uczestników nie wykryło produkcji karbapenemazy [9, 11]. W 2018 roku obecność mechanizmu KPC w szczepie K. pneumoniae PM-341 wykryło już 97,3% laboratoriów. Pierwszy raz w ramach kontroli POLMICRO szczepy MBL dodatnie zostały wysłane w 2008 roku i były to pałeczki niefermentujące: Acinetobacter baumannii PM-142, P. aeruginosa PM-144 i Pseudomonas putida PM-145. Błędy popełniło wtedy 7% laboratoriów w szczepie A. baumannii, 5,5% w szczepie P. aeruginosa, a 2,1 % u P. putida określając je jako MBL ujemne. W kolejnych latach odsetek prawidłowych wyników wykrywania mechanizmu MBL był zmienny najniższy w roku 2010 (82,7%), a najwyższy w 2016 (90%). W roku 2018 wytwarzanie karbapenemazy klasy B NDM wykryło 88,6% laboratoriów. Karbapenemaza KPC hydrolizuje wszystkie antybiotyki β -laktamowe, natomiast MBL nie hydrolizuje aztreonamu, ale ze względu na współwystępowanie innych mechanizmów, często szczepy je wytwarzające są oporne na wszystkie β-laktamy. Karbapenemazy MBL pozostają niewrażliwe na inhibitory β-laktamowe, natomiast wobec KPC mogą być skuteczne nowe inhibitory takie jak awibaktam i waborbaktam. Szczepy pałeczek jelitowych Enterobacterales produkujące karbapenemazy CPE (CPE ang. Carbapenemase Producing Enterobacterales) rozprzestrzeniają się w wielu krajach na świecie, również w Polsce. Uważane są obecnie za jedno z największych zagrożeń dla zdrowia publicznego w zakresie medycyny zakażeń, dlatego ogromnie istotne jest ich prawidłowe wykrywanie. Laboratoria powinny zweryfikować swoje procedury badawcze ze szczególnym uwzględnieniem metod fenotypowych wykrywania karbapenemaz, zwłaszcza, że zgodnie z Zasadami postępowania w przypadku identyfikacji szczepów Enterobacteriaceae produkujących karbapenemazy (www.antybiotyki.edu.pl), każdy szpital musi mieć zapewnioną możliwość szybkiej diagnostyki badań przesiewowych w kierunku CPE i weryfikacji obecności szczepów CPE u hospitalizowanych pacjentów [5,12,13]. Wyniki Programu POLMICRO w roku 2018 wykazały, że laboratoria mają także trudności w ocenie testów fenotypowych pozwalających wykryć mechanizm ESBL, który znany jest już od 1983 roku. Wykrywanie ESBL jest rutynowym testem wykonywanym w laboratorium mikrobiologicznym dla wszystkich pałeczek Enterobacterales. Istnieje więc potrzeba regularnego przesyłania w programie szczepów z takim mechanizmem, jak również prowadzenia szkoleń praktycznych w laboratoriach obejmujących wykrywanie także starych fenotypów oporności. Trudności z wykrywaniem ESBL wynikają z ich ogromnej różnorodności, istotnych między nimi różnic w preferencjach substratowych, poziomu ekspresji a także współistnienia w komórce innych β-laktamaz. Wśród bakterii Gram-dodatnich wytwarzających szczególnie niebezpieczne mechanizmy oporności są szczepy gronkowców oporne na metycylinę, wankomycynę czy linezolid, enterokoki oporne na wankomycynę, teikoplaninę, aminoglikozydy i linezolid oraz izolaty Streptococcus pneumoniae oporne na penicylinę, makrolidy i cefalosporyny III generacji. W omawianej edycji Sprawdzianu POLMICRO 2018 laboratoria nie miały problemów z określeniem fenotypów oporności gronkowców, natomiast wykrywanie oporności u szczepów S. pneumoniae nadal stanowi wyzwanie dla ok. 10% laboratoriów uczestniczących w programie. Jest to wysoki procent, zwłaszcza że pneumokoki stanowią wiodący czynnik etiologiczny zakażeń inwazyjnych i zapalenia płuc. Ocena lekowrażliwości i jej interpretacja oraz wykrywanie mechanizmów oporności szczególnie u pałeczek Gram-ujemnych wymagają w laboratoriach mikrobiologicznych ciągłego doskonalenia. Szkolenia merytoryczne dla pracowników laboratorium dotyczące wykrywania mechanizmów oporności pałeczek Gram-ujemnych skupiają się przede wszystkim na aktualnej sytuacji epidemiologicznej i najgroźniejszych obecnie fenotypach oporności jakimi są karbapenemazy. Umiejętności laboratoriów muszą nadążać za ogromną zmiennością drobnoustrojów, aby móc ją skutecznie i odpowiednio szybko wykrywać. W przeciwnym razie nie będą mogły pełnić roli, do której zostały powołane. Piśmiennictwo: 1. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing EUCAST, Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 8.1, 2018, www.eucast.org 2. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Routine and extended internal quality control for MIC determination and disk diffusion as recommended by EUCAST, Version 8.0, 2018, www. eucast.org 3. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, EUCAST, Antimicrobial susceptibility testing EUCAST disk diffusion method, Version 6.0, 2017, www.eucast.org 105

www.diagnostykalaboratoryjna.eu 4. Norma PN-EN ISO/IEC 17043:2011 Ocena zgodności Ogólne wymagania dotyczące badania biegłości. 5. Żabicka D, Baraniak A, Literacka E, Gniadkowski G, Hryniewicz W. Wykrywanie karbapenemaz zalecenia 2017. Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów, Narodowy Instytut Leków. 6. Stefaniuk E, Bosacka K, Młodzińska E, et al. POLMICRO 2015 Ogólnopolski Zewnątrzlaboratoryjny Sprawdzian Wiarygodności Badań w Diagnostyce Mikrobiologicznej. Diagn Lab. 2016; 52 (1): 29-38. 7. Stefaniuk E, Bosacka K, Młodzińska E, et al. Program Badań Biegłości POLMICRO 2016 Ogólnopolski Zewnątrzlaboratoryjny Sprawdzian Wiarygodności Badań w Diagnostyce Mikrobiologicznej. Diagn Lab. 2017; 53 (1): 23-32. 8. Młodzińska E, Bosacka K, Mikołajczyk A, et al. Ogólnopolski Zewnątrzlaboratoryjny Sprawdzian Wiarygodności Badań w Diagnostyce Mikrobiologicznej POLMICRO 2017. Diagn Lab.2018; 54 (3): 159-166. 9. Stefaniuk E, Młodzińska E, Chmylak B, et al. Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych POLMICRO 2011 zmiana rekomendacji oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów z amerykańskich na europejskie problemy i sukcesy. Diagn Lab. 2012; 48 (1): 7-17. 10. Młodzińska E, Mikołajczyk A, Bosacka K, et al. Polish National External Quality Assessment Scheme in Microbiology Diagnostics (POLMI- CRO) 20 years of experience. Poster nr EV0222, 27th ECCMID 2017, 22-25.04.2017, Wiedeń, Austria 11. Młodzińska E, Stefaniuk E, Baraniak A., et al. Mechanizmy oporności ESBL, MBL i KPC szczepów Klebsiella pneumoniae Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych POLMICRO 2010. XIV Sympozjum Naukowe Postępy w Medycynie Zakażeń. 03-04.12.2010 12. Zasady postępowania w przypadku identyfikacji szczepów Enterobacteriaceae produkujących karbapenemazy (CPE ang. Carbapenemase Producing Enterobacteriaceae), www.antybiotyki.edu.pl 13. Wielokierunkowa strategia zapobiegania rozprzestrzeniania się pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzających karbapenemazy (CPE) w podmiotach leczniczych m.st. Warszawy, 2018, www.antybiotyki.edu.pl Autor do korespondencji: mgr Ewa Młodzińska Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej 01-793 Warszawa, ul. Rydygiera 8 tel. +48 22 8415834 e-mail: emlodzinska@polmicro.edu.pl Otrzymano: 03.06.2019 Akceptacja do druku: 05.07.2019 Nie zgłoszono konfliktu interesów 106