Część teoretyczna: Ćwiczenie 5 I. Enterobacteriaceae PAŁECZKI JELITOWE Do tej rodziny należy wiele drobnoustrojów mających znaczenie w mikrobiologii i analizie produktów żywnościowych. Wiele ich rodzajów powoduje u człowieka zaburzenia przewodu pokarmowego i dlatego znajomość ich jest bardzo ważna z punktu widzenia higieny żywności. Są to zdecydowanie chorobotwórcze pałeczki durowe i duru rzekomego (Salmonella) oraz czerwonki (Shigella), a ponadto względnie chorobotwórcze pałeczki okrężnicy (Escherichia coli) i odmieńca (Proteus vulgaris), inne stanowią normalną mikroflorę przewodu pokarmowego, mogą być chorobotwórcze. Zasady podziału tej grupy opierają się na zdolnościach wytwarzania indolu i H 2 S, rozkładania cukrów i alkoholi, rozrzedzania żelatyny i zużywania cytrynianu jako źródła węgla. Cechy charakterystyczne: - morfologicznie są to pałeczki średniej wielkości (0,3-1,0 x 1,0-6,0μm), - gramujemne, - ruchliwe, okołorzęse lub nieruchliwe (Klebsiella, Shigella), - nieprzetrwalnikujace, - tlenowce względne (lub względne beztlenowce), - mezofile, niehalofilne - fermentują glukozę z wytworzeniem kwasu pirogronowego i gazu lub tylko kwasu, - redukują azotany do azotynów, niektóre do azotu. Wyróżnia się kilka rodzajów: Escherichia, Salmonella, Proteus, Shigella, Yersinia, Serratia, Klebsiella, Enterobacter. II. Acetobacteraceae BAKTERIE OCTOWE Fermentacja octowa jest to tzw. pseudofermentacja, ponieważ zachodzi w warunkach tlenowych. CH 3 CH 2 OH + O CH 3 COOH + H 2 O + Q Cechy charakterystyczne: - krótkie pałeczki, - występują pojedynczo, po dwie lub w łańcuszkach, - mają skłonność do przechodzenia w postacie nieprawidłowe (inwolucyjne) pod wpływem silnego zakwaszenia środowiska lub w wyniku hodowli w temp. wyższej niż optymalna, - wiele gatunków wytwarza otoczki śluzowe, - nie wytwarzają przetrwalników, - są gramujemne, - są typowymi tlenowcami, - są mezofilami o optymalnej temperaturze wzrostu 25-35 C, - najkorzystniejsze ph dla ich rozwoju to 4-6,5, - giną w temp. 55 C w ciągu 15 minut. 1
3 rodzaje: Acetobacter, Gluconacetobacter, Gluconobacter Przedstawiciele: Acetobacter aceti, A. pasteurianus, A. orleanensis, Gluconacetobacter xylinus (szkodnik), Ga. hansenii, Gluconobacter oxydans. Produkcja octu Do produkcji octu stosowane są trzy metody: - orleańska W metodzie tej bakterie Acetobacter aceti (również Gluconacetobater xylinus, A. orleanensis, A. pasteurianus, A. vini acetati, A. ascendens,) rozwijają się w postaci kożuszka na powierzchni wina rozlanego do płaskich naczyń lub kadzi fermentacyjnych. W tym przypadku proces zakwaszania przebiega bardzo wolno. Substratem jest alkohol zawarty w psującym się winie lub nieudanych piwach, produkcje octu prowadzi się w dużych otwartych kadziach, do których co tydzień dodaje się znaczna partię wina i równocześnie od spodu odciąga kwas octowy (ok. 7%), - ociekowa W tej metodzie bakterie są związane z materiałem nośnym (np. wytłoczyny z winogron, wióry bukowe, szypułki gron) w naczyniach napowietrzanych przez ich wytrząsanie. Do tego typu metod zalicza się też metodę szybkiego wytwarzania kwasu octowego, w której zalewa alkoholowa przepływa wielokrotnie przez naczynia wypełnione wiórami bukowymi, na których osiadły bakterie octowe (najczęściej A. schűtzenbachii, A. curvum). Moc uzyskanego kwasu octowego wynosi ok. 12%. - wgłębna Jest coraz częściej stosowana na skalę przemysłową metodą, gdyż daje znaczne oszczędności i łatwo ją zautomatyzować, w szczególności przy przejściu na proces ciągły. Przebiega w bioreaktorach (acetator Fringsa, cavitator, vinegator), w których zapewnione jest ciągłe mieszanie, napowietrzanie i kontrola temperatury. III. PROMIENIOWCE (Actinomycetales) Cechy charakterystyczne: - pod względem budowy cytologicznej są podobne do bakterii, a budowy morfologicznej do grzybów, 2
- wytwarzają strzępki, tworzące grzybnie (pseudomycelium), strzępki mogą rozdzielać się na pojedyncze komórki, - nie wytwarzają przetrwalników, - są gramdodatnie, niektóre kwasooporne, - występują głównie w glebie, stanowiąc od 10 do 70%, a w torfach 95% mikroflory. Rysunek i zdjęcie spod mikroskopu promieniowca Cechy promieniowców glebowych: - czynnik próchnicotwórczy, - mogą dalej rozkładać próchnicę, - korzystają z wielu źródeł węgla, - uruchamiają w glebie fosfor staje się przyswajalny dla roślin, - zmieniają strukturę gleby czyniąc ją bardziej przewiewną, - wytwarzają liczne metabolity - witaminy, enzymy, geosmina ( zapach wiosny ), antybiotyki. VI. ANTYBIOTYKI Antybiotyk substancja organiczna wytwarzana przez drobnoustroje będąca produktem ich wtórnego metabolizmu, wykazująca wysoką i wybiórczą aktywność przeciwbakteryjną, będącą jednocześnie mało szkodliwa dla makroorganizmów. Po raz pierwszy odkryte przez Flemminga w 1926 (1928) roku penicylina Penicillium notatum. Obecnie istnieje ponad 3000 antybiotyków wytwarzanych przez: - 67% promieniowce - 20% grzyby, - 12% bakterie właściwe np. bacytracyna i polimyksyna tworzone przez Bacillus, - 1% porosty. Wśród promieniowców 80-90% antybiotyków wytwarzanych jest przez rodzaj Streptomyces. 3
BARWIENIE METODĄ ZIEHL-NIELSENA (BARWIENIE BAKTERII KWASOODPORNYCH) 1. Wykonać rozmaz, wysuszyć na wolnym powietrzu i utrwalić termicznie 2. Na utrwalony preparat działać fuksyną fenolowa do tzw. trzeciej pary, 3. Ostudzić szkiełko 4. Spłukać wodą 5. Odbarwić alkoholem z dodatkiem HCl (10-30 s), 6. Spłukać wodą 7. Podbarwić błękitem metylenowym przez okres 1-2 minuty, 8. Spłukać wodą 9. wysuszyć i oglądać pod immersją. Prątki (w skupiskach) będą wybarwione na kolor bladoróżowy od fuksyny (B na rysunku poniżej), a wszystkie pozostałe mikroorganizmy na kolor niebieski (A). 4
Część praktyczna: Wszystkie doświadczenia wykonywać w warunkach sterylnych! 1. Odczyt zdolności Bacillus do redukcji azotanów (hodowla płynna) a) odszukać hodowle i przenieść ją do statywu pod komorę laminarną b) dodać 0,5 ml odczynnika Griessa i wstrząsnąć probówką UWAGA odczynnik ma bardzo ostry kwaśny zapach, ponadto proszę nie odkładać pipety na blat i/lub z przymocowaną pompką tylko odstawić do statywu! c) obserwować zmiany w probówce, zjawisko omówić (sprawozdanie 1) 2. Barwienie bakterii Escherichia coli metodą Grama a) preparaty wykonać z przygotowanej hodowli E. coli (probówka, skos) b) przygotować dwa rozmazy i barwić zgodnie z protokołem barwienia c) preparaty oglądać pod immersją wykonać rysunki itd. (sprawozdanie 1) 3. Barwienie bakterii octowych metodą Grama a) preparaty wykonać z przygotowanej hodowli bakterii octowych (szalka Petriego lub kolbka) b) przygotować dwa rozmazy i barwić zgodnie z protokołem barwienia c) preparaty oglądać pod immersją wykonać rysunki itd. (sprawozdanie 1) 4. Barwienie promieniowców metodą Grama a) preparaty wykonać z przygotowanej hodowli promieniowców (szalka Petriego) b) dokonać oceny morfologicznej wyrosłej kolonii c) przygotować dwa rozmazy i barwić zgodnie z protokołem barwienia d) preparaty oglądać pod immersją wykonać rysunki itd. (sprawozdanie 1) 5
5. Barwienie promieniowców metodą Ziehl-Nielsena a) preparaty wykonać z przygotowanej hodowli promieniowców (szalka Petriego) b) przygotować dwa rozmazy i barwić zgodnie z protokołem barwienia c) preparaty oglądać pod immersją wykonać rysunki itd. (sprawozdanie 1) 6