Ewelina Strąk, Maria Balcerek

Acta Sci. Pol., Biotechnologia 14 (1) 2015, 33-44 ISSN 1644 065X (print) ISSN 2083 8654 (on-line) WYBRANE TECHNOLOGIE WYKORZYSTYWANE W PRZEMYŚLE GORZELNICZYM1 Ewelina Strąk, Maria Balcerek Politechnika Łódzka Streszczenie: W niniejszym artykule zostały przedstawione technologie stosowane w przemyśle gorzelniczym produkującym etanol na cele spożywcze i przemysłowe. W celu oceny potencjalnych korzyści technologicznych i ekonomicznych dokonano charakterystyki oraz oceny metod przygotowania surowców skrobiowych do fermentacji etanolowej, powszechnie wykorzystywanych w polskich gorzelniach, takich jak: metoda ciśnieniowo-termiczna (parowanie), technologia bezciśnieniowego uwalniania skrobi (BUS). Ponadto omówione zostały technologie: jednoczesnego scukrzania i fermentacji (ang. SSF) wraz modyfikacjami (z zastosowaniem preparatów STARGEN, VHG) oraz Biostil. Zwrócono uwagę m.in. na parametry procesowe, stosowane enzymy oraz aspekty związane z ochroną środowiska. W podsumowaniu wskazano potencjalne korzyści płynące z dalszego rozwoju technologicznego dla przemysłu gorzelniczego. Słowa kluczowe: gorzelnictwo, etanol, technologie, zacieranie WSTĘP Polskie gorzelnictwo rolnicze ukierunkowane jest głównie na produkcję destylatu rolniczego charakteryzującego się wysoką jakością. Istotnymi aspektami są rodzaj oraz jakość przerabianych surowców. Badania wydajności etanolu z różnych surowców wykazują jej znaczną zmienność (brak ścisłej korelacji między zawartością skrobi a końcową wydajnością etanolu) [Słomińska i Garbaciak 2002, Dien i in. 2002]. Prawdopodobną przyczyną tego jest fakt, iż wielkość i kształt ziaren skrobi zależą od ich pochodzenia, co warunkuje zróżnicowaną podatność na rozkład enzymatyczny [Gantelet i Duchiron 1999]. Jednak w dobie dzisiejszego rozwoju biotechnologii umiejętne zastosowanie nowoczesnych preparatów amylolitycznych i pomocniczych w połączeniu z odpowiednimi Copyright by Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Adres do korespondencji Corresponding author: Ewelina Strąk, Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii, Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności, Politechnika Łódzka, ul. Wólczańska 171/173, 90-924 Łódź, e-mail: ewelina.strak@dokt.p.lodz.pl

34 E. Strąk i M. Balcerek parametrami procesowymi i/lub modyfikacjami technologicznymi sprawia, że różnice wynikające z pochodzenia skrobi mogą zostać zminimalizowane. METODY PRZYGOTOWANIA SUROWCÓW SKROBIOWYCH DO FERMENTACJI Obróbka ciśnieniowo-termiczna Metodą uwalniania skrobi, najczęściej wykorzystywaną w tradycyjnych polskich gorzelniach, jest ciśnieniowo-termiczna obróbka surowców skrobiowych określana jako parowanie. Proces odbywa się w parniku Henzego, pod ciśnieniem 0,3 0,4 MPa, w czasie 45 60 minut [Jarosz i Jarociński 1994] i polega na działaniu podwyższonej temperatury na struktury międzykomórkowe surowca w celu uwolnienia ziaren skrobi. W czasie parowania następuje utrata semikrystalicznej struktury skrobi, czego następstwem jest jej kleikowanie. Proces ten wiąże się ze zjawiskiem silnego pęcznienia ziaren skrobi w wyniku dyfundowania wody do wnętrza jej struktury (zwiększenie objętości 60 100 razy). Konieczne jest więc przeprowadzanie go w warunkach silnego uwodnienia. W wyniku działania odpowiednio wysokiej temperatury następuje degradacja części składników ściany komórkowej, co sprzyja głębszemu uwolnieniu skrobi. Całkowita dezintegracja komórek surowca następuje dopiero w chwili uwolnienia uparowanej masy z parnika, gdyż woda zaabsorbowana przez komórki w kontakcie z ciśnieniem atmosferycznym przechodzi w stan pary, powodując rozerwanie komórki [Łączyński 1992]. Warunki procesu zapewniają dodatkową sterylizację surowca dzięki wyeliminowaniu form wegetatywnych oraz przetrwalnikowych niepożądanych drobnoustrojów. Ponadto, pod wpływem obróbki wysokotemperaturowej niektóre mikotoksyny mogą ulegać transformacji do form pochodnych, np. DON do mniej toksycznego DOM-1 [Kłosowski i in. 2011, Pronyk i in. 2006, Samar i in. 2007]. Mankamentem barotermicznej obróbki surowca skrobiowego w parniku jest wysoka energochłonność. W przypadku braku kontroli parametrów decydujących o prawidłowym jej przebiegu może skutkować utratą części węglowodanów zawartych w surowców lub powstałych podczas hydrolizy, m.in. w wyniku odziaływań z produktami hydrolizy białek. Efektem tego jest powstawanie barwnych związków (reakcje Maillarda). Podwyższona temperatura w trakcie parowania sprzyja również odwadnianiu cukrów prostych, czego następstwem jest przekształcanie ich w związki karmelowe o ciemnej barwie i specyficznej woni [Kłosowski i in. 2010]. Z technologicznego punktu widzenia zarówno reakcje Maillarda, jak i karmelizacja powodują, iż część węglowodanów staje się niedostępna dla drożdży. Związki powstałe w wyniku tych reakcji mają negatywny wpływ na rozwój i aktywność fermentacyjną drożdży. Niektórzy autorzy wskazują również, iż obecność produktów reakcji ubocznych może skutkować blokowaniem przyswajalności niektórych aminokwasów, np. lizyny następuje blokowanie grup aminowych innymi składnikami organicznymi [Matyka 2006]. Powyższe, negatywne zjawiska mogą spowodować obniżenie wydajności spirytusu, od 0,5 do 1,0 litra destylatu ze 100 kg zboża [Hahnefeld i Pritzbuer 1981]. W zależności od surowca należy zoptymalizować parametry procesu, takie jak: temperatura, ciśnienie oraz czas oddziaływania. Korzystne jest także wprowadzenie systemu umożliwiającego monitorowanie zmienności Acta Sci. Pol.

Wybrane technologie wykorzystywane w przemyśle... 35 tych parametrów w celu usunięcia ewentualnych nieprawidłowości [Kaczmarek 2003]. Warto też zwrócić uwagę na system cyrkulacji zawartości parnika w odniesieniu do wartości ciśnienia. Zastosowanie systemu trzech cyrkulacji (ciśnienie: 1,5; 2,5; 3,5 atm), poprzez otwieranie zaworu odpowietrzającego na czas 2 3 minut, przy zamkniętym zaworze doprowadzającym parę skutkuje przemieszczeniem pary w rozpławionym surowcu, co wywołuje mieszanie zawartości, dzięki czemu poprawia się rozkład masy i temperatury w parniku. Zabieg ten powoduje również obniżanie ciśnienia w zbiorniku od 0,2 do 0,5 atm [Kłosowski i in. 2010]. Uparowana masa jest wytłaczana do kadzi zaciernej. W wyniku drastycznego obniżenia ciśnienia dochodzi do zniszczenia struktury surowca i następuje pełne uwolnienie rozpuszczonej skrobi z komórek roślinnych. Kolejnym etapem postępowania technologicznego jest zacieranie, czyli enzymatyczna hydroliza skrobi z udziałem preparatów enzymów amylolitycznych. Proces prowadzony jest w kadzi zaciernej wyposażonej m.in. w mieszadło oraz chłodnicę, co umożliwia ustalenie temperatur zacieru właściwych dla użytych preparatów enzymatycznych i uniknięcie ich inaktywacji termicznej. Wstępna obróbka surowca metodą ciśnieniowo-termiczną jest najbardziej energochłonnym etapem w całym procesie. Tak przygotowana masa określana jest zacierem słodkim, po skorygowaniu ph, zadaniu drożdżami i dodaniu pożywki poddawana jest fermentacji w kadziach fermentacyjnych. Obróbka mechaniczna Odpowiednie przygotowanie surowca ma istotny wpływ na efektywność kolejnych etapów postępowania technologicznego w procesie produkcji etanolu. Mechaniczna obróbka surowca wykorzystywana jest głównie w technologii bezciśnieniowego uwalniania skrobi. Z racji mniejszych nakładów energetycznych na przygotowanie zacieru wpływa na obniżenie kosztów produkcji etanolu [Kapela i Solarek 2004]. W przypadku tzw. mielenia na sucho (ang. dry milling) stosuje się urządzenia mielące (m.in. młyny młotkowe) wyposażone w sita o odpowiedniej średnicy, najczęściej nie większej niż 1,7 mm. Dokładne rozdrobnienie materiału ułatwia enzymom dostęp do skrobi. W Stanach Zjednoczonych opracowano metodę mielenia na mokro (ang. wet milling). Opiera się ona na przeprowadzeniu takich procesów jak: moczenie ziarna, mielenie, odwłóknianie, odwirowywanie oraz suszenie. Obróbka ta pozwala uzyskać z ziarna wiele cennych składników, takich jak: skrobia, gluten, błonnik, cukry (glukoza, fruktoza), skrobia modyfikowana, zarodki do produkcji oleju oraz różne inne specyficzne produkty [Jacques i in. 1999]. Ziarno przed mieleniem poddawane jest namaczaniu (24 48 godz.) w temperaturze 52 C oraz w obecności niewielkiej ilości SO 2. Zastosowanie tego zabiegu pozwala na rozłożenie białek i uwolnienie skrobi obecnej w kukurydzy, a ponadto zmiękcza ziarno. Wyniki badań Rendlemana i Shapouri [2007] wykazały, iż wstępna obróbka surowca z udziałem amoniaku, stosowanego przy separacji produktów za pomocą mielenia mokrego surowca, ułatwia usuwanie owocni i pozwala skrócić czas wygrzewania. Należy pamiętać, iż ziarna różnych surowców różnią się budową, dlatego też wykorzystuje się odpowiednio do tego przystosowaną aparaturę [Michalski 2005]. Namaczanie, kiszenie, a także mielenie ziarna odbywa się w silosach. Na tym etapie surowiec wykazuje wilgotność na poziomie 30 40%. Kolejne etapy przebiegają już podobnie jak w technologii bezciśnieniowego uwalniania skrobi (BUS). Biotechnologia 14 (1) 2015

36 E. Strąk i M. Balcerek TECHNOLOGIA BEZCIŚNIENIOWEGO UWALNIANIA SKROBI (BUS) W celu zmiejszenia kosztów produkcji oraz oszczędności energii [Kawa-Rygielska 2006] metodę ciśnieniowo-termiczną zastępuje się technologią bezciśnieniowego uwalniania skrobi (BUS) [Golisz i Wójcik 2013]. Surowiec jest rozdrabniany, a następnie z dodatkiem wody oraz enzymów ogrzewany do temperatury 80 90 C. Wyeliminowanie wysokiej temperatury przynosi wymierne korzyści w postaci oszczędności energii cieplnej do 50% (całkowity zysk energetyczny kształtuje się na poziomie 19 34%). Technologia BUS umożliwia przygotowanie zacierów o podwyższonej gęstości [Balcerek i in. 2011]. Przygotowywanie zacierów o wyższej zawartości ekstraktu stwarza możliwość uzyskania wyższej produktywności kadzi fermentacyjnych oraz mniejszej ilości ścieków, jednakże należy mieć na względzie osmofilność stosowanych drożdży. Dzięki wprowadzeniu do praktyki przemysłowej preparatów enzymów amylolitycznych pochodzenia mikrobiologicznego możliwe stało się oddzielne prowadzenie procesu upłynniania i scukrzania skrobi odmiennie niż w przypadku zacierania z udziałem słodu zbożowego. W technologii BUS, szczególnie ważne okazało się zastosowanie termostabilnych α-amylaz (EC 3.2.1.1) pochodzenia bakteryjnego, których optimum aktywności przypada na zakres temperatury 80 90 C. Po schłodzeniu upłynnionego zacieru do temperatury 55 60 C dodaje się preparat zawierający enzym scukrzający, czyli amyloglukozydazę (EC 3.2.1.3.). Wykorzystanie enzymów pochodzenia mikrobiologicznego przy optymalnych dla ich aktywności parametrach pozwala na zmniejszenie ich dawek (w przeliczeniu na jednostki aktywności) w porównaniu z enzymami słodu, które były wprowadzane do zacieru jednocześnie. Stosowane parametry zacierania z udziałem enzymów słodowych, z uwagi na znaczące różnice dotyczące optymalnych warunków ich działania (temperatura, ph środowiska), określane były na postawie ich wartości pośrednich [Kapela i Solarek 2004]. Głównymi czynnikami ograniczającymi efektywne wykorzystanie potencjału stosowanych enzymów są: temperatura, ph środowiska oraz specyfika samych enzymów. Na przykład α-amylaza katalizująca hydrolizę wiązań α-1,4-glikozydowych w frakcjach skrobi, tj. amylozie i amylopektynie, charakteryzuje się właściwą dla endohydrolaz zdolnością do rozkładu wiązań wewnątrzstrukturalnych, powodując spadek lepkości zacieru. Enzym ten nie wykazuje jednak zdolności hydrolizy wiązań α-1,6- występujących w amylopektynie. Natomiast α-amylaza pochodzenia bakteryjnego (Bacillus licheniformis), wykazuje odporność na niskie ph środowiska, optymalna temperatura jej działania to 90. Aktywność tego enzymu w niewielkim stopniu jest zależna od jonów wapnia [Olempska- -Beer i in. 2006]. Zadaniem amyloglukozydazy jest katalizowanie hydrolizy wiązań α-1,4-glikozydowych od strony nieredukującego końca łańcucha skrobi, co prowadzi do uwalniania glukozy, oligosacharydów i dekstryn. Ponadto hydrolizowane są również wiązania α-1,6-, jednakże jest to proces mniej wydajny. Optymalne parametry dla aktywności tego enzymu to: temperatura 40 65 C i ph 4,0 5,6. Nadmierna lepkość jest jednym z problemów występujących podczas przygotowywania zacierów zbożowych, w szczególności w przypadku bezciśnieniowego uwalniania skrobi (BUS) [Grzybowski i Stecka 1998, Miecznikowski i in. 1996, Oliveira i in. 1999]. Przyczyną tego jest występowanie w zbożach innych wielocukrów polisacharydów nieskrobiowych (PNS), do których należą: pentozany (ksylany), β-glukany, celuloza oraz hemicelulozy. Podczas prowadzenia procesu zacierania wyłącznie z udziałem enzymów Acta Sci. Pol.

Wybrane technologie wykorzystywane w przemyśle... 37 amylolitycznych związki te nie ulegają hydrolizie do cukrów fermentujących. Przeciwdziałać temu można, wykorzystując aktywność hydrolaz polisacharydów nieskrobiowych (ksylanaza, celulaza oraz celobiaza) katalizujących hydrolizę wiązań β-1,4 oraz β-1,3 w PNS [Kłosowski 2006, Kłosowski i in. 2009, Mathlouthi 2002]. Zastosowanie tych enzymów w procesie gorzelniczym pozwala na uwolnienie cukrów podlegających fermentacji, dając tym samym szansę na wyższą wydajność spirytusu z jednostki surowca [Kapela i Solarek 2004]. Do enzymów wspomagających proces zacierania surowców skrobiowych należy zaliczyć również pullulanazę katalizującą hydrolizę wiązań α-1,6-glikozydowych w cząsteczkach amylopektyny skrobi. W wyniku aktywności tego enzymu powstają liniowe dekstryny, co poprawia dynamikę scukrzania oraz skraca czas fermentacji [Gantelet i Duchiron 1999]. Ponadto, stwarza to możliwość fermentacji zacierów o wyższych ekstraktach początkowych, a tym samym pozwala na zwiększenie produktywności kadzi fermentacyjnych [Srichuwonga i in. 2009, Wang i in. 1999]. W celu redukcji kosztów procesu BUS oraz w trosce o środowisko możliwe jest dodawanie otrzymywanego wywaru podestylacyjnego do śruty zbożowej w zastępstwie wody, jest to tak zwana recyrkulacja wywaru. Dodatkowo, zawracany wywar jest również źródłem aminokwasów uwolnionych podczas destylacji w wyniku plazmolizy komórek drożdży. Rys. 1. Schemat technologii bezciśnieniowego uwalniania skrobi http://www.enzymes.com. pl/?page_id=41 (data dostępu: 04.05.2015 r.) Fig. 1. Schema of the pressureless liberation of starch technology (access to 04.05.2015) Mankamentem technologii bezciśnieniowego uwalniania skrobi jest brak sterylności zacieru. Obecność bakterii m.in. pochodzenia surowcowego może prowadzić do tworzenia związków kancerogennych (akroleiny). Obca mikroflora może także wydzielać metabolity mające niekorzystny wpływ na aktywność fermentacyjną drożdży [Grzybowski i Stecka 1998]. Ponadto, formy wegetatywne obcej mikroflory opanowują środowisko szybciej niż drożdże szlachetne, efektem czego jest większy ubytek źródeł węgla. W celu ograniczenia ryzyka zanieczyszczenia mikrobiologicznego w technologii BUS jednym z rozwiązań jest zastosowanie przed zbiornikiem upłynniania reaktora przepływu laminarnego lub tłokowego, popularnie nazywanego jako tzw. strefa. Zacier wstępnie podgrzany w urządzeniu określanym jako jet-cooker przetłaczany jest do reaktora prze- Biotechnologia 14 (1) 2015

38 E. Strąk i M. Balcerek pływu laminarnego, w którym zostaje podgrzany do temperatury w zakresie 105 120ºC i utrzymany w tych warunkach przez czas od 2 do 20 minut. Mimo iż etap podgrzania powyżej 100 C uzyskiwany jest przez krótki czas, to skutkuje inaktywacją niepożądanych mikroorganizmów [Jacques i in. 2003]. Następnie tak przygotowaną masę przetłacza się poprzez rozprężacz do zbiornika upłynniania, w którym ochładza się ją do temperatury optymalnej do działania termostabilnej α-amylazy. Proces upłynniania powinien trwać około 90 minut. Stopień wstępnej hydrolizy skrobi jest decydujący w dalszym przebiegu procesu. Po upłynnianiu zacier schładza się do temperatury około 65ºC w celu poddania go osobnemu etapowi scukrzania, lub też studzi się od razu do temperatury nastawienia fermentacji. Druga metoda jest podstawą procesów noszących nazwę jednoczesnego scukrzania i fermentacji (charakterystyka w dalszej części artykułu). Jedną z modyfikacji technologii bezciśnieniowego uwalniania skrobi jest zimne zacieranie enzymatyczna hydroliza skrobi natywnej, prowadzona w temperaturze 30 C. Wysoka temperatura w tym procesie została wyeliminowana na rzecz specjalnie skonstruowanych α-amylaz upłynniających skrobię. Proces otrzymywania zacierów z wykorzystaniem wyłącznie preparatów enzymatycznych określany jest jako proces BPX (z ang. Broin Project X ) [Novozymes 2006]. Wraz z enzymami upłynniającymi i scukrzającymi do bioreaktora, w którym prowadzony jest proces, dodawane są drożdże odpowiedzialne za fermentację cukrów do etanolu. Obecnie proponowane zabiegi ulepszające tę technologię, mające na celu poprawę czystości mikrobiologicznej i efektywności zimnego zacierania, to: dodatek amoniaku i innych substancji chemicznych do zacieru, stosowanie środków dezynfekcyjnych w postaci preparatów kwasów chmielowych [Maye 2006, Rückle 2006], stosowanie odpowiednich bakterii (np. Zymomonas mobilis) [Bai i in. 2008], wykorzystywanie biologii molekularnej w celu doskonalenia drobnoustrojów, zbliżenie dawkowania enzymów do ilości stosowanych w metodach konwencjonalnych. TECHNOLOGIA JEDNOCZESNEGO SCUKRZANIA I FERMENTACJI (SSF) Jedną z innowacji wprowadzonych do praktyki gorzelniczej jest jednoczesne scukrzanie i fermentacja (ang. Simultaneous Saccharification and Fermentation SSF). Istota metody polega na schłodzeniu upłynnionego zacieru do temperatury zaszczepienia drożdżami i dodawaniu enzymu scukrzającego. Hydroliza dekstryn do cukrów podlegających fermentacji prowadzona jest stopniowo podczas trwania procesu. Głównymi zaletami tej metody jest zmniejszenie zapotrzebowania na energię, niższe zużycie wody oraz w konsekwencji niższe koszty związane z odprowadzaniem ścieków. Jednoczesne prowadzenie procesu scukrzania oraz fermentacji powoduje, iż drożdże mogą szybciej opanować środowisko oraz zacząć produkować etanol, który swoją obecnością działa hamująco na rozwój bakterii. Jest to rozwiązanie, które pozwala na obniżenie kosztów inwestycyjnych, uproszczenie operacji technologicznej, skrócenie czasu fermentacji, jak również daje możliwość prowadzenia fermentacji zacierów o podwyższonej zawartości ekstraktu [Kawa-Rygielska 2009, Kroumov i in. 2005, Nikolic i in. 2009, Roy i in. 2001, Suresk i in. 1999, Srichuwonga i in. 2009, Mukojimab i Tokuyasua 2009]. Rozwiązanie polegające na fermentacji zacierów, których gęstość przekracza 27 g składników rozpuszczalnych w 100 g zacieru, określane jest jako technologia VHG (ang. Very High Gravity) [Kawa- -Rygielska 2012]. Głównym problem utrudniającym prawidłowy przebieg fermentacji Acta Sci. Pol.

Wybrane technologie wykorzystywane w przemyśle... 39 zacierów gęstych jest wysokie ciśnienie osmotyczne wywołane koncentracją węglowodanów oraz duże stężenie alkoholu powstającego podczas procesu. Rozwiązaniem tych trudności jest zastosowanie technologii jednoczesnego scukrzania i fermentacji (ang. SSF). Utrzymanie stosunkowo niskiego stężenia glukozy uwalnianej podczas procesu jest możliwe dzięki bieżącemu metabolizowaniu jej przez komórki drożdży, co z kolei chroni je przed stresem osmotycznym. Produkcja etanolu tą metodą pozwala zredukować koszty inwestycyjne z racji przeprowadzania hydrolizy jak i fermentacji w jednym bioreaktorze, wyposażonym w układ regulacji temperatury oraz mieszadło [Kobayashi i in. 1998]. W tym przypadku preparat scukrzający zadaje się za wymiennikiem chłodzącym do temperatury nastawienia fermentacji. Pomimo braku optymalnej temperatury do działania glukoamylazy aktywność tego enzymu utrzymuje się na poziomie wystarczającym do przeprowadzenie pełnej hydrolizy [Öhgren i in. 2007]. Temperatura prowadzenia fermentacji oscyluje zwykle w granicach od 30 do 35 C. (optymalna do wzrostu drożdży). Według Warda i in. [1995] ulepszanie tej technologii powinno dążyć do wykorzystania nowych ras drożdży oraz szczepów bakterii odpornych na podwyższoną temperaturę procesu poprzez zastosowanie mieszanej kultury, np. termotolerancyjnych drożdży Kluveromyces marxianus oraz termofilnych grzybów strzępkowych Taloromyces emersonii (temperatura prowadzenia procesu około 45 C). Pozwoliłoby to na zwiększenie szybkości hydrolizy, która ma decydujący wpływ na ostateczną szybkość wytwarzania etanolu [Philippidis i Smith 1995, Ward i in. 1995]. W Stanach Zjednoczonych (1990 r.) dokonano udoskonalenia technologii SSF poprzez połączenie jej z propagacją drożdży. Rozwiązanie to nazwano SSYPF (z ang. Simultaneous Saccharification, Yeast Propagation and Fermentation), czyli technologia jednoczesnego scukrzania, namnażania drożdży i fermentacji. Proces ten warunkuje dłuższy kontakt drożdży z substratem oraz możliwość zwiększenia redukcji wzrostu obcej mikroflory. Efektem tego jest uzyskanie większej wydajności produktu dzięki wczesnemu zaszczepieniu zacieru drożdżami. Namnożenie drożdży eliminuje potrzebę zakupu oraz zaopatrywania zakładu w zapasy, co upraszcza proces [Novozymes i BBI International 2005]. Proces jednoczesnej hydrolizy i fermentacji jest stosunkowo dobrze poznany i opisany w literaturze przedmiotu, czego dowodem są liczne prace naukowe na ten temat [Öhgren i in. 2006, Verma i in. 2000], jednakże istnieje potrzeba optymalizacji parametrów przeprowadzanego procesu w zależności od rodzaju przerabianego surowca. Cechy skrobi natywnej i czynniki, które wpływają na kinetykę hydrolizy, stają się bardzo ważne dla energooszczędnej biokonwersji. Jednym z efektów badań jest technologia jednoczesnego scukrzania i fermentacji etanolowej natywnej skrobi z zastosowaniem preparatu o nazwie STARGEN, opracowana przez amerykańską firmę Genencor. Zastosowanie kompleksowego preparatu zawierającego enzymy amylolityczne wykazujące uzdolnienia do hydrolizy skrobi natywnej pozwala na pominięcie etapu jej kleikowania i upłynniania [Kumar 2008]. Innowacyjność rozwiązania polega na wykorzystaniu amylaz hydrolizujących ziarnistą skrobię oraz produkcji glukozy, podczas procesu fermentacji, ze skrobi niepoddanej uprzednio obróbce termicznej. Niezbędną aktywność amylolityczną warunkuje obecność dwóch enzymów, tj.: α-amylazy pochodzącej z Aspergillus kawachi, produkowanej przez Trichoderma reesei, oraz glukoamylazy pozyskiwanej z transgenicznych szczepów Aspergillus niger. Enzymy te charakteryzują się synergistycznym działaniem poniżej temperatury kleikowania skrobi. Mechanizm tej współpracy opiera się na tzw. Biotechnologia 14 (1) 2015

40 E. Strąk i M. Balcerek wydrążaniu przez glukoamylazę pojedynczych otworów w ziarenku skrobi, a następnie poszerzaniu ich przez α-amylazę [Shariffa i in. 2009]. Dostępne są dwa warianty preparatu stosowane w zależności od przerabianego surowca (STARGEN 001 kukurydza, STARGEN 002 pszenica, pszenżyto i jęczmień). Dodatkową zaletą tych kompleksów enzymatycznych jest optimum ph i temperatury odpowiednie do warunków prowadzenia fermentacji, co umożliwia przeprowadzenie wszystkich operacji technologicznych w temperaturze dla niej właściwej. Cały proces ująć można w trzech etapach: mieleniu, mieszaniu z wodą oraz równoczesnym scukrzaniu i fermentacji. Temperatura w jakiej odbywa się mieszanie zmielonego surowca z wodą, zawróconym wywarem lub kondensatem z destylacji wynosi: w przypadku zbóż (np. żyto, pszenica) 56 57 C, zaś kukurydzy 62 63 C. Na tym etapie dodaje się do mieszaniny kwaśną α-amylazę i enzym redukujący lepkość. Nieznaczne podwyższenie temperatury do wartości poniżej temperatury kleikowania, zwiększa ich podatność na działanie enzymów, jest to tzw. etap aktywacji. Takie przygotowanie surowca odbywa się w czasie od 30 do 60 min. Preparat Stargen dodawany jest do zacieru, gdy schłodzony zostanie do temperatury fermentacji. Z uwagi na swój charakter technologia ta nie uwzględnia etapu sterylizacji, co stwarza możliwości wystąpienia infekcji mikrobiologicznych, zwłaszcza w warunkach przemysłowych. Szczególnie niebezpieczne dla fermentacji są bakterie kwaszące, w związku z czym stosuje się zabiegi mające na celu zmniejszenie ich aktywności, takie jak: dodatek substancji antybakteryjnych (np. nadtlenek wodoru) [Skinner i Leathers 2004], osłona antybiotykowa (penicylina G lub virginiamycyna w Polsce niedozwolona), obniżone ph (3,3 3,6) podczas aktywacji skrobi i fermentacji, użycie ditlenku chloru jako dezynfektanta [Li i in. 2012]. Przy ph 5 bakterie mogą szybciej opanować środowisko fermentacji [Kàdàr i in. 2007], obniżenie ph zacieru hamuje rozwój obcej mikroflory. Charakterystyczną cechą bakterii z rodzaju Clostridium jest wrażliwość na niskie ph podłoża, ich wzrost hamowany jest przy ph 4,2, dlatego zalecana jest regulacja ph zacieru [Wasiak-Gromek 2002]. Najnowsze badania wskazują na możliwość stosowania w procesie gorzelniczym środków dezynfekcyjnych, w postaci preparatów kwasów chmielowych, których dodatek do zacieru powoduje hamowanie rozwoju bakterii. Kwasy chmielowe obniżają ph komórek bakterii, co eliminuje zużywanie glukozy przez te drobnoustroje [Rückle 2006]. Dodanie preparatów kwasów chmielowych jako środków antyseptycznych stanowi alternatywę do stosowania antybiotyków, daje możliwość usunięcia zanieczyszczeń pochodzenia bakteryjnego, nie obniżając żywotności komórek drożdży [Muthaiyan i in. 2011, Rückle i in. 2006]. TECHNOLOGIA BIOSTIL Technologia Biostil została opracowana przez szwedzką firmę Alfa-Laval. Jest to metoda opierająca się na ciągłym odprowadzaniu etanolu z fermentorów. Zabieg ten jest możliwy dzięki ciągłej fermentacji cukrów w środowisku o niskiej zawartości alkoholu (4,5% obj.), którą można uzyskać dzięki jednoczesnej jego destylacji. Kadź fermentacyjna jest zasilana z odpowiednią prędkością w sposób ciągły brzeczką melasową lub innym medium fermentacyjnym, z taką szybkością, by stężenia cukru w kadzi nie przekraczało 0,5 g/l glukozy [Chematur 2000 a]. Zawartość fermentora jest częściowo napowietrzana w celu regeneracji ścian komórkowych drożdży. W procesie Biostil wykorzystuje się Acta Sci. Pol.

Wybrane technologie wykorzystywane w przemyśle... 41 drożdże osmofilne. Zacier odfermentowany trafia na wirówki w celu separacji drożdży, które są zawracane ponownie do kadzi fermentacyjnej. Zawracanie drożdży skutkuje dużym ich stężeniem w fermentorze (ok. 5 x 10 8 komórek x cm -3 ) w odniesieniu do metody klasycznej, ilość ta warunkuje zachowanie sterylności procesu. Zacier pozbawiony drożdży kierowany jest do aparatu destylacyjnego sprzężonego z wyparką (aparat dwudzielny w górnej części znajduje się aparata destylacyjny, natomiast w dolnej wyparka). Z pierwszej kolumny odpędowej odzyskuje się około 90% etanolu zawartego w zacierze odfermentowanym [Chematur 2000 b]. Po pierwszej destylacji jedną część wywaru z etanolem zawraca się ponownie do kadzi fermentacyjnej, gdzie uzupełniana jest świeżą dawką podłoża, a drugą kieruje się do dolnej kolumny odpędowej wyparki, w której następuje całkowite oddestylowanie etanolu. Technologia ta opiera się na zasadzie zagospodarowania ciepła odpadowego. Opary z wyparki służą do ogrzewania zacieru w górnej kolumnie. Powstały w dolnej kolumnie wywar charakteryzuje się ekstraktem na poziomie 30 45%. Możliwa jest jego utylizacja poprzez spalenie, w wyniku czego otrzymuje się popiół zawierający składniki mineralne, takie jak: sole potasu i magnezu. Popiół ten, po uzupełnieniu w związki fosforu, może być więc wykorzystany jako wartościowy płynny nawóz bądź pasza [Chematur 2000 b]. W procesie BIOSTIL na jeden litr wyprodukowanego spirytusu powstaje około 0,8 l wywaru w porównaniu z tradycyjną metodą, w której powstaje 11 litrów wywaru. Po zagęszczeniu go do 55% suchej masy na 1 litr wyprodukowanego spirytusu przypadać będzie ok. 0,4 l wywaru. Kolejną zaletą tego procesu jest możliwość pracy z podłożami stężonymi. Ciśnienie osmotyczne nie ogranicza fermentacji, wspomaga jedynie tworzenie etanolu, po oddestylowaniu którego możliwa jest fermentacja zacierów nawet o 60% zawartości cukrów. Metodą tą można uzyskać wydajność fermentacji na poziomie 94,5% wydajności teoretycznej [Chematur 2000 b]. Jednak wprowadzenie tego procesu wiąże się z dodatkowymi kosztami inwestycyjnymi, związanymi z wyposażeniem oraz kontrolą systemu. PODSUMOWANIE Przemysł gorzelniczy zaopatruje, oprócz przemysłu spożywczego, wiele gałęzi przemysłu, w tym przemysł paliwowy. Wywiera to nacisk na producentów destylatu rolniczego dotyczący osiągania jak najlepszych wydajności przy wykorzystaniu odpowiednich szczepów mikroorganizmów, wraz z właściwie dobranymi preparatami enzymatycznymi, niższych kosztów produkcji, stosowania coraz bardziej różnorodnych surowców, przy zachowaniu dbałości o środowisko. Nowoczesne rozwiązania technologiczne w aktualnej pozycji przemysłu gorzelniczego na świecie nabierają szczególnego znaczenia w celu poprawienia opłacalności produkcji etanolu dla sektorów przemysłu oraz w perspektywie wykorzystania etanolu do produkcji biopaliw, a co za tym idzie, w sektorze energetycznym. Wszelkie usprawnienia obniżające koszty produkcji zwiększają konkurencyjność alkoholu etylowego w stosunku do innych źródeł energii odnawialnej. Omówione technologie oraz ich modyfikacje pozwalają na osiąganie powyższych wymagań. Jednak wskazane są dalsze badania ukierunkowane na optymalizację parametrów procesowych, dobór drożdży zdolnych do pełnego wykorzystywania substratów cukrowych oraz modernizację aparatury technologicznej w celu uzyskania nie tylko jak najlepszej wydajności procesowej, ale także wysokojakościowego destylatu. Biotechnologia 14 (1) 2015

42 E. Strąk i M. Balcerek PIŚMIENNICTWO Balcerek M., Sapińska E., Stanisz M., 2011. Fermentacja alkoholowa gęstych zacierów kukurydzianych. Acta Agrophysica, 18 (2), 431 441. Chematur Engineering AB, BIOSTIL 2000. a) High Performence Ethanol Production, internet: 20.11.2014., http://www.chematur.se/sok/download/biostil_starch_rev_0904.pdf, b) The New Recycling Concept, internet: 20.11.2014, http://www.chematur.se/sok/download/biostil_2000_ rev_sugar_0904.pdf Dien, B.S., R.J. Bothast, L.B. Iten, L.Barrios, S.R. Eckhoff, 2002. Fate of Bt Protein and Influence of Corn Hybrid on Ethanol Production. Cereal Chemistry 79 (4), 582 85. Gantelet H., Duchiron F., 1999. A new pullulanase from a hyperthermophilic archaeon for starch hydrolysis. Biotechnol. Lett., 21, 71 75. Golisz E., Wójcik G., 2013. Problemy gorzelni rolniczych i przemysłu bioetanolowego w Polsce. Inżyniera Rolnicza Z 2 (143) T. 1, 69 78. Grzybowski R.A., Stecka M.K., 1998. Zadania dla polskiego gorzelnictwa w obliczu perspektywy zjednoczenia z UE. Przem. Ferm. i Owoc.-Warz., 3, 5 7. Hahnefeld G., Pritzbuer K., 1981. Die Branntweinwirtschaft, 121 (16), 1 2. Jacques J.A., Lyons T.P., Kelsall D.R., 2003. The Alcohol Textbook- Grain dry milling and cooking procedures: extracting sugars in preparation for fermentation. Alltech Inc., Nottingham, 17. Jacques K., Kelsall D.R., Lyos T.P., 1999. Thinking outside the box, Ethanol production in the next millenium: processors of raw materials, not just ethanol producers. The Alcohol Textbook, 3rd Ed, Univ. Press, Nottingham, UK. Jarosz K., Jarociński J., 1994. Gorzelnictwo i drożdżownictwo. Wydawnictwo Szkolne i Pedagogiczne, Warszawa, wyd. 4, 44. Kaczmarek S., 2003. Nowe techniczne metody prowadzenia procesu parowania surowca w gorzelniach stosujących technologię ciśnieniowego uwalniania skrobi. Bydgoszcz IBPRS-SPG, Materiały IX Seminarium Aktualne problemy gorzelnictwa rolniczego, 55 63. Kapela T., Solarek L., 2004. Enzymy Novozymes dla gorzelnictwa nowoczesne preparaty scukrzające z grupy SAN oraz enzymy pomocnicze. Przem. Ferm. i Owoc.-Warz., 5, 26 28. Kawa-Rygielska J., 2006. Produkcja bioetanolu a kierunki obniżania kosztów w gorzelni rolniczej. Agro Przem., 4,45 46. Kawa-Rygielska J., 2009. Intensyfikacja produkcji etanolu. Nowe energooszczędne wydajne technologie. Agro Przem., 2, 32 33. Kawa-Rygielska J., 2012. Oddziaływanie jonów Cr(III) na dynamikę i efekty fermentacji zacierów kukurydzianych VHG. Wyd. Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu, 8 9. Kłosowski G., 2006. Technologie produkcji w polskim gorzelnictwie i stosowane w nich preparaty enzymatyczne. Rynki Alkohol., 10, 47 48. Kłosowski G., Błajet-Kosicka A., Mikulski D., Grajewski J., 2011. Ocena możliwości redukcji stężenia mikotoksyn w procesie produkcji etanolu z ziarna kukurydzy technologią BUS i klasyczną. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość. 2 (75), 89 105. Kłosowski G., Mikulski D., Czupryński B., Kotarska K., 2009. Characterisation of fermentation of high-gravity maize mashes with the application of pullulanase, proteolytic enzymes and enzymes degrading non-starch polysaccharides. J. Biosci. Bioeng., 109, 5, 466 471. Kłosowski G., Mikulski D., Grajewski J., Błajet-Kosicka A., 2010. The influence of raw material contamination with mycotoxins on alcoholic fermentation indicators. Biores. Technol. 101, 3147 3152. Kobayashi F., Sawada T., Nakamura Y., Ohnaga M., Godliving M., Ushiyama T., 1998. Saccharification and alcohol fermentation in starch solution of steam-exploded potato. Appl. Biochem. Biotechnol., 69, 177 189. Acta Sci. Pol.

Wybrane technologie wykorzystywane w przemyśle... 43 Kroumov A.D., M Odenes A.N., de Araujo Tait M.C., 2005. Development of new unstructured model for simultaneous saccharification and fermentation of starch to ethanol by recombinant strain. Biochem. Eng. J. 28, 243. Kumar M., 2008. Native grain amylases in enzyme combinations for granular starch hydrolysis. Patent US 2007/017485 (WO208021050). Li J., Vasanthan T., Bressler D.C., 2012. Improved cold starch hydrolysis with urea addition and heat treatment at subgelatinization temperature. Carbohydr. Polym., 87, 2, 1649 1656. Łączyński B., 1992. Skrócony kurs gorzelnictwa rolniczego. Wyd. Sigma-NOT, Warszawa. Mathlouthi N., Saulnier L., Quemener B., Larbier M., 2002. Xylanase, β-glucanase, and other side enzymatic activities have greater effects on the viscosity of several feedstuffs than xylanase and β- glucanase used alone or in combination. J. Agric. Food Chem., 50, 5121 5127. Matyka S., 2006. Lizyna dostępna (przyswajalna) a jakość przemysłowych mieszanek paszowych. Materiały XXII Konferencji Naukowo-Technicznej: Jakość i bezpieczeństwo pasz stan, wymagania i potrzeby. Jachranka, 9 12. Maye J.P., 2006. Use of hop acids in fuel ethanol production. US patent. Patent US2006263484. Michalski T., 2005. Z pola dla przemysłu. Kukurydza rośliną przyszłości. Agro Serwis, Perspektywy, 7 13. Miecznikowski A., Milewski J., Stecka K., 1996. Energooszczędna technologia produkcji spirytusu surowego. Przem. Ferm. Owoc.-Warz., 10, 15 18. Muthaiyan A., Limayem A., Ricke S., 2011. Antimicrobial strategies for limiting bacterial contaminants in fuel bioethanol fermentations. Progress in Energy and Combustion Science, 37, 351 370. Nikolic S., Mojovic L., Rakin M., Pejin D., 2009. Bioethanol production from corn meal by simultaneous enzymatic saccharification and fermentation with immobilized cells of Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus. Fuel 88, 1602. Novozymes & BBI International: Fuel ethanol. A technological evolution. 6.06.2005. Internet: http:// www.energiasrenovables.ciemat.es/adjuntos_documentos/fuelethanol-lr-05.pdf (11.12.2014). Novozymes, 2006. Broin and Novozymes to collaborate on development of ethanol from cellulosic biomass Companies build further on strong partnership to develop second generation process for ethanol from biomass, internet: http://www.novozymes.com/en/news/news-archive/pages/42477.aspx (10.12.2014) Öhgren K., Bura R., Lesnicki G., Saddler J., Zacchi G., 2007. A comparison between simultaneous saccharification and fermentation and separate hydrolysis and fermentation using steam-pretreated corn stover. Proc. Biochemistry, 42, 834 839. Öhgren K., Rudolf A., Galbe M., Zacchi G., 2006. Fuel ethanol production from steam-pretreated corn stover using SSF at higher dry matter content. Biomass and Bioenergy, 30, 863 869. Olempska-Beer Z., Merker R., Ditto M., DiNovi M., 2006. Food-processing enzymes from recombinant microorganisms a review. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 45(2), 144 158. Oliveira S.C., De-Castro H.F., Visconti A.E.S, Giudici R., 1999. Continuous ethanol process performance, kinetics parameters and model predictions. Bioprocess Eng., 20, 6, 525 530. Philippidis G.P., Smith T.K., 1995. Limiting factors in the simultaneous saccharification and fermentation process for conversion of cellulosic biomass to fuel ethanol. Appl. Biochem. Biotechnol., 51/52, 117 124. Pronyk C., Cenkowski S., Abramson D., 2006. Superheated steam reduction of eoxynivalenol in naturally contaminated wheat kernels. Food Contr. 17, 789 796. Rendleman C.M., Shapouri H., 2007. New Technologies in Ethanol Production, Agricultural Economic Report Number 842. Roy S., Gudi R.D., Venkatesh K.V., Shah S.S., 2001. Optimal control strategies for simultaneous saccharification and fermentation of starch. Process Biochem. 36, 713. Rückle L., 2006. Optimising Bioethanol Production: How to minimise infection risk naturally. 2nd European Bioethanol Technology Meeting, internet: 11.12.2014r., http://www.agfdt.de/loads/ bi06/rueckleabb.pdf Biotechnologia 14 (1) 2015

44 E. Strąk i M. Balcerek Rückle L., Senn T., 2006. Hop acids can efficiently replace antibiotics in ethanol production, Int. Sugar J., 108, 139 147. Samar M., Resnik S.L., Gonzalez H.H.L., Pacin A.M., Castillo M.D., 2007. Deoxynivalenol reduction during the frying process of turnover pie covers. Food Contr., 18, 1295 1299. Shariffa Y.N., Karim A.A., Fazilah A., Zaidul I.S.M., 2009. Enzymatic hydrolysis of granular native and mildly heat-treated tapioca and sweet potato starches at sub-gelatinization temperature. Food Hydrocoll. 23, 434. Skinner K.A., Leathers T.D., 2004. Bacterial contaminants of fuel ethanol production. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 31, 401 408. Słomińska L., Garbaciak M., 2002. Porównanie właściwości hydrolitycznych dwóch termostabilnych preparatów enzymatycznych; Technol. Aliment. 1 (2), 21 30. Srichuwonga S., Fujiwaraa M., Wanga X., Seyamaa T., Shiromaa R., Arakanea M., Mukojimab N., Tokuyasua K., 2009. Simultaneous saccharification and fermentation (SSF) of very high gravity (VHG) potato mash for the production of ethanol. Biomass Bioenerg., 33, 890 898. Szymanowska D., Grajek W., 2009. Fed-batch simultaneous saccharification and ethanol fermentation of native corn starch, Acta Sci.Pol., Technol. Aliment., 8 (4), 5 16. Verma G., Nigam P., Singh D., Chaudhary K., 2000. Bioconversion of starch to ethanol in a single-step process by coculture of amylolytic yeasts and Saccharomyces cerevisiae 21 Biores. Technol., 72, 261 266. Wang S., Thomas K.C., Sosulski K., Ingledew W.M., Sosulski F.W., 1999. Grain pearling and very high gravity (VHG) fermentation technologies for fuel alcohol production from rye and triticale. Proc. Biochem. 34, 421 428. Ward C., Nolan A. M., O`Hanlon K., McAree T., Barron N., McHale L., McHale A. P., 1995. Production of ethanol at 45 C on starch-containing media by mixed cultures of the thermotolerant, ethanol-producing yeast Kluyveromyces marxianus IMB3 and the thermophilic filamentous fungus Talaromyces emersonii CBS 814.70Appl. Microbiol. Biotechnol., 43, 408 411. Wasiak- Gromek M., 2002. Zakażenia mikrobiologiczne i ich źródła w produkcji spirytusu. Przem. Ferm. Owoc.Warz., 46, 6, 29 30. INDUSTRIAL TECHNOLOGIES USED FOR THE PRODUCTION OF ETHANOL Abstract. The article presents technology used in alcohol-distilling industry producing ethanol for industrial and food purposes. The introduction presents the fermentation process and the factors affecting the technological process, its efficiency and quality of the obtained distillate. In order to evaluate the potential of technological and economic benefits, in the following sections there were made comparative characteristics of the methods for the preparation of starch raw materials to ethanol fermentation, commonly used in Polish distilleries, such as pressure cooking, pressureless starch liberation method and the technologies used in global production plants of ethanol such as: Stargen, Biostil, SSF. Emphasis was placed on i.e. process parameters, used enzymes and care of environment. Summary points out potential benefits of further technological development for the alcohol-distilling industry. Key words: alcohol-distilling technology, ethanol, starch, mashing Zaakceptowano do druku Accepted for print: 30.03.2015 Do cytowania For citation: Strąk E., Balcerek M., 2015. Wybrane technologie wykorzystywane w przemyśle gorzelniczym, Acta Sci. Pol. Biotechnol., 14 (1), 33 44. Acta Sci. Pol.