Dr hab. Michał Kwiatek Katedra Genetyki i Hodowli Roślin Wydział Rolnictwa i Bioinżynierii Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu ul. Dojazd 11, 60-637 Poznań Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Arity Kuś pt.: Cytomolekularna ocena stabilności genomu jądrowego Brachypodium distachyon poddanego działaniu wybranych czynników mutagennych Przedstawiona mi do recenzji rozprawa doktorska przygotowana przez Panią mgr Aritę Kuś została zrealizowana w Katedrze Anatomii i Cytologii Roślin, na Wydziale Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach, a jej promotorem jest Pani dr hab. Jolanta Kwaśniewska. Praca ta ma postać komentarza do trzech artykułów naukowych, opublikowanych w prestiżowych czasopismach z listy filadelfijskiej, które są spójne tematycznie i stanowią podstawę dysertacji, co dopuszcza art. 13 Ustawy o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. z 2017 r. poz. 1789). Prezentowane badania finansowane były przez Narodowe Centrum Nauki, w ramach projektu badawczego typu MAESTRO-2 nr 2012/04/A/NZ3/00572, pt.: Struktura, dynamika i ewolucja roślinnego genomu jądrowego z perspektywy badań cytomolekularnych, którego kierownikiem był prof. zw. dr hab. Robert Hasterok. Prace naukowe będące przedmiotem niniejszej rozprawy doktorskiej: Brachypodium distachyon - A Useful Model in the Qualification of Mutagen-Induced Micronuclei Using Multicolor FISH. 2017. Kus A, Kwasniewska J. Hasterok R. PloS One 12: e0170618; Dissecting the chromosomal composition of mutagen-induced micronuclei in Brachypodium distachyon using multicolour FISH. 2018. Kus A, Kwasniewska J, Szymanowska-Pulka J, Hasterok R. Annals of Botany 122: 1161 1171; Detecting Brachypodium distachyon Chromosomes Bd4 and Bd5 in MH- and X-Ray- Induced Micronuclei Using mcfish. 2019. Kus A, Kwasniewska J, Szymanowska-Pulka J, Hasterok R. International Journal of Molecular Sciences 20(11), 2848; zostały opublikowane w latach 2017-2019 a ich sumaryczny wskaźnik wpływu Impact Factor wg Journal of Citation Reports wynosi 10,403 punktów a suma punktów wg punktacji Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego to 105 punktów lub też 300 punktów wg Komunikatu Ministra Nauki i Szkolnictwa Wyższego z dnia 31 lipca 2019 r. w sprawie wykazu czasopism naukowych 1
i recenzowanych materiałów z konferencji międzynarodowych wraz z przypisaną liczbą punktów. Według oświadczenia zamieszczonego na 86 stronie manuskryptu, wkład Pani mgr Arita Kuś w powstanie przedstawionych prac naukowych wynosi 68-70%. Artykuły naukowe wchodzące w skład niniejszej rozprawy doktorskiej zostały już zrecenzowane na etapie zatwierdzania publikacji do druku. Moja rola jako recenzenta niniejszej rozprawy doktorskiej sprowadza się do oceny formalnej rozprawy doktorskiej a także oceny merytorycznej badań zawartych w rozprawie oraz ich spójności a także oceny tekstu rozprawy doktorskiej, który został przygotowany samodzielnie przez Autorkę. Praca doktorska Pani mgr Arity Kuś zawiera 89 stron i jest uporządkowana według następującego podziału: Autoreferat rozprawy, w którego skład wchodzą następujące podrozdziały: Wprowadzenie, Cel pracy doktorskiej, Materiał i metody, Wyniki i dyskusja oraz Literatura; Publikacje wchodzące w skład rozprawy; Podsumowanie i wnioski; Streszczenie w języku polskim i angielskim; Oświadczenia autorów. Rozdział Wprowadzenie zawarty na trzech stronach tekstu prezentuje stan wiedzy dotyczący badań nad wpływem czynników mutagennych na stabilność genomu roślinnego. Ta część pracy napisana jest zwięźle i poprawnie, choć moim zdaniem niektóre wątki we wprowadzeniu są opisane zbyt powierzchownie. O ile w artykułach, będących przedmiotem pracy doktorskiej, należało rozsądnie gospodarować liczbą słów, tak wstęp w tym manuskrypcie powinien szczegółowo i dokładnie opisywać najważniejsze zagadnienia poruszone w pracy. Mam na myśli chociażby przedstawienie i krótki opis najważniejszych mutagenów egzogennych, które stanowią przecież przedmiot rozległych badań od wielu lat. Oprócz mutagenów wymienionych przez Panią mgr Aritę Kuś we Wprowadzeniu, warto byłoby wspomnieć o takich mutagenach, jak temperatura, a dokładniej jej nagłe zmiany, które mogą prowadzić do hydrolizy wiązania β- N-glikozydowego, łączącego zasadę azotową z cukrem w cząsteczce kwasu deoksyrybonukleinowego. Wartymi wspomnienia są także mutageny biologiczne, tj. niektóre wirusy lub pierwotniaki. Osobną kwestią, którą warto byłoby poruszyć, w odniesieniu do czynników mających wpływ na stabilność genomu, są geny powodujące nieprawidłowości w podziale komórkowym (m. in. powstawanie mikrojąder), szerzej znane jako segregation disorters, lub też wspomnieć o elementach ruchomych w genomie, które mają duże znaczenie patrząc przez pryzmat zmienności genetycznej, jak i funkcjonowania organizmu. Idąc dalej, w kolejnym fragmencie Wprowadzenia Autorka opisała badania nad efektami działania mutagenów w genomie roślinnym przy użyciu metod cytogenetycznych. Pani mgr Arita Kuś skoncentrowała się na głównie stosowanej w tego typu badaniach metodzie oceny mutagennego działania czynników chemicznych i fizycznych, określanej mianem testu 2
mikrojąder. Wywiązując się z roli recenzenta jestem zmuszony nadmienić, że również tym razem brakuje w mojej opinii krótkiego komentarza, o który chciałbym zapytać Autorkę, i który odpowiedziałby na naturalnie w tym miejscu pojawiające się pytania: czym są mikrojądra, kiedy powstają, jakie są mechanizmy ich formowania oraz jakie są następstwa tych procesów? W dalszej kolejności Autorka bardzo przejrzyście opisała techniki cytogenetyki molekularnej, które dają możliwość detekcji rearanżacji chromosomowych będących wynikiem działania mutagenów. Końcowy fragment dotyczy opisu badań gatunków modelowych, wykorzystywanych w badaniach nad oceną stabilności genomu roślinnego poddanego działaniu czynników mutagennych. Ta część Wprowadzenia w pełni uzasadnia wykorzystanie gatunku modelowego, jakim jest Brachypodium distachyon (Brachypodium) w tego typu badaniach, które mają szczególne znaczenie dla genetyki i hodowli traw i zbóż. Podsumowując pierwszą część rozprawy doktorskiej muszę stwierdzić, że Autorka kompleksowo i zwarcie przybliżyła czytelnikowi podjęty przez siebie temat badawczy, choć rozdział ten mógłby być szerzej opisany oraz wzbogacony o informacje ogólne, dzięki którym lektura niniejszej pracy mogłaby być zrozumiała także dla osób mniej zorientowanych w tematyce badawczej poruszonej w rozprawie. Cel pracy został określony przejrzyście w postaci czterech punktów: ocena wrażliwości genomu Brachypodium na działanie wybranych modelowych mutagenów chemicznych i fizycznych, poznanie mechanizmów powstawania mikrojąder indukowanych działaniem wybranych mutagenów poprzez jakościową i ilościową analizę ich składu, porównanie lokalizacji pęknięć DNA, prowadzających do powstania aberracji chromosomowych w genomie Brachypodium, powstałych w wyniku zastosowania mutagenów o różnych mechanizmach działania, opracowanie nowoczesnego roślinnego testu genotoksyczności opartego na jakościowej i ilościowej analizie mikrojąder w komórkach Brachypodium z wykorzystaniem metody BAC-FISH. O ile nie mam komentarza do trzech ostatnich punktów, tak po przeczytaniu treści pierwszego mam pewne zapytania: Czy można mówić o modelowych mutagenach chemicznych i fizycznych? Jeśli tak, to które mutageny można do nich zaliczyć? Jakie było kryterium doboru mutagenów tj. hydrazydu kwasu maleinowego (MH) oraz promieniowania X, które zostały zastosowane w pracy badawczej Autorki? Rozdział Materiały i metody liczy dwie i pół strony i w moim odczuciu nie jest opisany w sposób wyczerpujący. Podobnie, jak w przypadku przeglądu literatury opisanego we Wprowadzeniu, uważam, że w autoreferacie rozprawy doktorskiej zastosowane metody 3
badawcze powinny być opisane szerzej, niż w artykułach naukowych, w których często stosowane są odniesienia do innych źródeł. Moje uwagi są następujące: w sekcji Materiał roślinny i traktowanie mutageniczne brakuje informacji na temat sposobu akumulacji chromosomów w interfazie i metafazie; w sekcji Przygotowanie sond oraz FISH brakuje opisu metody/metod znakowania sekwencji DNA użytych do fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ; brakuje opisu metod statystycznych, użytych do analizy częstości występowania mikrojąder w różnych konfiguracjach. W pracach II i III były to analiza wariancji oraz testowanie typu post hoc przy użyciu testu NIR [najmniejszych istotnych różnic (ang. last significant differences - LSD)]. Znalazłem też dwie nieścisłości metodyczne. Pierwsza z nich dotyczy stosowanej sondy 25S rdna. W tekście Autoreferatu, na stronie 9, Autorka podała, iż w badaniach jako sondy DNA do FISH wykorzystano, między innymi, sekwencje 35S rdna. Natomiast we wszystkich trzech publikacjach, i moim zdaniem poprawnie, wykazano, że użyto sekwencji 25S rdna celem wizualizacji loci 35S rdna, które składa się z kilku podjednostek przedzielonych wewnętrzne transkrybowane sekwencjami (ang. internal transcribed spacer - ITS). Druga uwaga dotyczy filtrów wzbudzających i emisyjnych, wykorzystanych do obserwacji mikroskopowych. Autorka w autoreferacie wykazała użycie filtrów: 350/50 w przypadku DAPI, 490/20 w przypadku FITC oraz 640/30 w przypadku fluorochromu Alexa Fluor 647. W opublikowanych pracach Autorzy wykazują dodatkowo użycie znacznika tetramethylrhodamine-5-dutp, który do detekcji wymaga filtru 550/20. Wyniki i dyskusja zostały połączone przez Autorkę w jeden podrozdział liczący trzy i pół strony. Jego treść zasadzie w pełni oddaje istotę opublikowanych badań, które przedstawiają ocenę niestabilności genomu jądrowego Brachypodium distachyon, poddanego działaniu dwóch mutagenów: MH i promieniowania X. Analizy indukowanych w ten sposób zmian przeprowadzono wykorzystując metody fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ z sekwencjami powtarzalnymi DNA oraz malującymi chromosomy unikatowymi sekwencjami specyficznymi chromosomowo w charakterze sond molekularnych. Przedstawione wyniki wykazały obecność miejsc wrażliwych na działanie czynników mutagennych, odpowiadającym potencjalnym miejscom pęknięć DNA prowadzącym do powstawania aberracji w chromosomach Brachypodium. Co więcej, opublikowane rezultaty analiz genomu modelowego gatunku Brachypodium, uzyskane dzięki wykorzystaniu dobrze scharakteryzowanych, specyficznych chromosomowo markerów cytogenetycznych, mogą być z powodzeniem wykorzystane w analogicznych badaniach stabilności genomów zbóż i traw użytkowych w odpowiedzi na działanie czynników mutagennych. Ciekawym spostrzeżeniem jest fakt, iż mikrojądra bez sygnałów FISH obserwowano z o połowę niższą częstotliwością po traktowaniu MH (5%), niż po promieniowaniu X (10%). Autorka wnioskuje, że promieniowanie X indukuje pęknięcia w interstycjalnych fragmentach chromosomów częściej niż MH. Jestem ciekawy, czy ta zależność nie jest pochodną momentu, w którym dany mutagen działa w tym przypadku na 4
komórkę merystemu wierzchołkowego korzenia? Wszak MH działa podczas fazy S oraz zaburza tworzenie wrzeciona podziałowego, podczas gdy promieniowanie X powoduje pęknięcia DNA w trakcie całego cyklu komórkowego. Ponadto analiza tekstu autoreferatu oraz trzech publikacji naukowych, stanowiących niniejszą rozprawę doktorską pozwoliła mi sformułować następujące pytania: Dlaczego, dla porównania, nie wykonano analiz kariotypów (tj. analiz chromosomów metafazalnych) roślin poddanych działaniu mutagenu przy użyciu tych samych zestawów sond molekularnych? Takie badania mogłyby zweryfikować wyniki analiz jąder interfazowych. To podejście, między innymi mogłoby wypełnić lukę, wskazaną przez Autorkę na str. 15 manuskryptu, związaną z brakiem danych opisujących szczegółowy udział poszczególnych chromosomów, ich ramion oraz obszarów chromosomowych w formowaniu mikrojąder po traktowaniu mutagenicznym w komórkach roślinnych. Co więcej, miejsca ewentualnych pęknięć chromosomów mogłyby być porównane z rozmieszczeniem obszarów homologicznych chromosomów ryżu (Oryza sativa L.). Z kolei takie badania mogłyby potwierdzić, że miejsca występowania pęknięć DNA nie są przypadkowe, co może być związane z różnymi aspektami organizacji chromatyny np. rozmieszczeniem i stosunkiem heterochromatyny do euchromatyny czy gęstością genów. Druga kwestia to stabilność mutacji. Czy są plany przeprowadzenia analiz potomstwa roślin poddanych mutagenezie? Z kolei te wyniki byłyby przydatne także z punktu widzenia aplikacyjnego. W pracach nr 2 i 3 użyto sekwencji powtarzalnych oraz klonów specyficznych dla chromosomów Bd1, Bd4 i Bd5. Czy są plany aby przeanalizować częstość udziału pozostałych chromosomów w tworzeniu mikrojąder o podłożu mutagennym? Wnioski z pracy zostały w postaci 8 punktów i w moim odczuciu nie zostały dostatecznie przemyślane. Mam pewne zastrzeżenia do kilku z nich. We wniosku pierwszym proponuję użyć pełnej nazwy gatunkowej - Brachypodium distachyon. W mojej opinii wniosek nr 3 jest zbyt daleko idący i wymaga przeredagowania. Wszak nie zidentyfikowano sekwencji wrażliwych na działanie użytych mutagenów. Ponadto drugie zdanie w piątym wniosku nie ma charakteru konkluzji. Jest wynikiem uzyskanych badań. Podobnie zdanie drugie i trzecie we wniosku nr 6 oraz cały wniosek nr 7. Od strony językowej praca nie budzi moich zastrzeżeń poza sformułowaniem infrastruktura metodyczna (strony: 7; 12; 14; 78 i 80), które zostało użyte przez Autorkę w odniesieniu do zbioru metod i sposobów analizy genomu Brachypodium, a które można, zgodnie z definicją Słownika Języka Polskiego nazwać metodyką ; a dla podkreślenia faktu złożoności stosowanych metod zaawansowaną metodyką. Ponadto w tytule sekcji Materiał roślinny i traktowanie mutageniczne w podrozdziale Materiał i metody (strona 9) 5
zamieniłbym sformułowanie traktowanie mutageniczne na określenie mutageneza lub też traktowanie mutagenne. Oceniana rozprawa spełnia według mnie wymagania ustawowe wobec prac doktorskich [art. 179 ustawy z dnia 3 lipca 2018 r. Przepisy wprowadzające ustawę Prawo o szkolnictwie wyższym i nauce (Dz. U. z 30 sierpnia 2018 r. poz. 1669)]. Pragnę zaznaczyć, iż wymienione przeze mnie w niniejszej recenzji uwagi oraz komentarze mają charakter dyskusyjny i w żadnym stopniu nie obniżają wartości pracy, którą oceniam bardzo wysoko. Wnioskuję do Rady Wydziału Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach o dopuszczenie mgr Arity Kuś do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Biorąc pod uwagę rangę czasopism (dwa z nich plasują się w pierwszym kwartylu, trzecie w Q2), w których opublikowane zostały prace naukowe wchodzące w skład niniejszej pracy, zwracam się z wnioskiem o wyróżnienie przedłożonej mi do recenzji rozprawy doktorskiej. Poznań, dnia 12 sierpnia 2019 roku 6