PROT. STOM., 2005, LV, 4 Ocena wpływu nowej błony zaporowej dla sterowanej regeneracji tkanek na aktywność płytek krwi w osoczu bogato płytkowym* Evaluation of novel GBR barrier membrane influence to platelet rich plasma trombocyte activity Marcin Kozakiewicz 2, Henryka Bodek 1 Od kilku lat intensywnie promuje się użycie osocza bogato płytkowego (ang. platelet rich plasma PRP) w sterowanej regeneracji tkanek. Z tego względu zdecydowano się ocenić aktywność nowo stworzonej błony barierowej w kierunku stymulacji płytek krwi zawartych w PRP. Z płytek krwi spośród licznych czynników wzrostu w najwyższych stężeniach wydzielane są po aktywacji PDGF-AB i TGF-beta1. Pobrano krew od 12 zdrowych ochotników. Przeprowadzono separację osocza bogato płytkowego (PRP) według procedury proponowanej przez Curasan. Do PRP wprowadzano trójwarstwową błonę alginianowo-chitozanowo-alginianową o wymiarach 2 mm 2 mm, zamykano hermetycznie próbówki i inkubowano przez 60 minut w temperaturze 37 o C. Te 24 próbki stanowiły grupę doświadczalną. Drugą referencyjną serię 24 probówek z PRP inkubowano w tych samych warunkach, ale bez kontaktu z błoną. Po inkubacji stwierdzono zmniejszenie stężenia TGF-beta1 i brak zmian zawartości PDGF-AB w PRP. Nowa trójwarstwowa błona dla sterowanej regeneracji tkanek stabilizuje aktywność osteoindukcyjną PRP poprzez protekcyjny wpływ w stosunku do uwalniania PDGF- -AB i TGF-beta1 z płytek krwi. HASŁA INDEKSOWE: błona barierowa, osocze bogato płytkowe, czynniki wzrostu For a few years PRP is intensively investigated in oral implantologic procedures, and that is why we decided to evaluate the novel GBR barrier membrane in field of PRP platelet activity. After trombocyte activation, PDGF-AB and TGF-beta1 are released in the highest concentration among the number of other growth factors. Fourty eight blood samples from 12 healthy volunteers were included into this study. PRP was obtained according to Curasan s procedure. In one series PRP samples were incubated (60 min. 37 o C) with trilayer alginate-chitosan-alginate membrane (2 mm 2 mm). These samples established experimental group. Reference group was composed of remained series of 24 PRP samples which were incubated without contact to the membrane in the same conditions. After the incubation, concentrations of investigated growth factors were performed. TGF-beta1 level was decreased and concentration PDGF-AB was not altered in PRP. Concluding, the novel GBR membrane stabilized the osteogenic activity of PRP by the protective influence to the concentration of PDGF-AB and TGF-beta1. KEY WORDS: barrier membrane, platelet rich plasma, growth factors Z Zakładu Farmacji Aptecznej, UM w Łodzi 1 Kierownik dr hab. n. farm. H. Bodek Z Kliniki Chirurgii Czaszkowo-Szczękowo-Twarzowej ICh, UM w Łodzi 2 Kierownik: prof. dr hab. n. med. P. Arkuszewski Wieloletnia współpraca autorów pracy zaowocowała opatentowaniem licznych błon przeznaczonych dla implantologii stomatologicznej (9-17). Jednym z aspektów oceny przydatności stworzo- Adres autorów: 90-153 Łódź, ul. Kopcińskiego 22 *Praca finansowana z tematu badań własnych: 502-12-180 279
M. Kozakiewicz, H. Bodek nych produktów medycznych jest ich walidacja w typowych zastosowaniach klinicznych. Od kilku lat intensywnie promuje się użycie osocza bogato płytkowego (ang. platelet rich plasma PRP) w sterowanej regeneracji tkanek (8, 24, 25, 29, 31). Z tego względu zdecydowano się ocenić aktywność nowo stworzonej błony barierowej w kierunku stymulacji płytek krwi zawartych w PRP. Z badań Weibric i wsp. wynika, że z płytek krwi spośród licznych czynników wzrostu w najwyższych stężeniach wydzielane są po aktywacji płytko-pochodny czynnik wzrostu PDGF-AB i transformujący czynnik wzrostu TGF-beta1 (30). Dla tego też zdecydowano się na badanie tych właśnie peptydów. Cel pracy Ocena wpływu trójwarstwowej błony barierowej alginianowo-chitozanowo-alginianowej na zmiany stężenia PDGF-AB i TGF-beta1 we własnopochodnym osoczu bogato płytkowym. Materiał i metoda Pobrano krew od 12 zdrowych ochotników. Przeprowadzono separację osocza bogato płytkowego według schematu: I wirowanie 8 ml krwi z przyspieszeniem 900 g (2400 obr./min. przez 10 min.), II wirowanie supernatantu z przyspieszeniem 2000 g (3600 obr./min. przez 15 min.) usuwano supernatant pozostawiając na dnie próbówki 0,5 ml osocza bogato płytkowego. Do tej objętości PRP wprowadzano trójwarstwową błonę alginianowo-chitozanowo-alginianową (Alg-MkCh-Alg) o wymiarach 2 mm 2 mm, zamykano hermetycznie próbówki i inkubowano przez 60 minut w temperaturze 37 o C. Te 24 próbki stanowiły grupę doświadczalną (12 oznaczono M_PDGF-AB i 12 oznaczono M_TGF-beta1). Drugą referencyjną serię 24 probówek z PRP, po 0,5 ml każda, inkubowano w tych samych warunkach, ale bez kontaktu z błoną. Te próbki oznaczono C_PDGF-AB (12 szt.) i C_TGF-beta1 (12 szt.). Próbki PRP po inkubacji wirowano z przyspieszeniem 1000g przez 10 minut, nadsącz zbierano i zamrażano w temperaturze -75 o C do czasu wykonania oznaczeń. Po zebraniu wszystkich próbek rozmrażano je i oznaczano stężenie czynników wzrostu metodą Elisa korzystając z zestawów firmy R&D. Ze względu na brak rozkładów normalnych w porównywanych grupach zastosowano test W Mann-Whitney (Wilcoxon) dla porównania median oraz test K-S Kołmogorowa-Smirnowa dla porównania rozkładów stężenia badanych czynników wzrostu. Wyniki Obie zastosowane metody oceny statystycznej wyników przyniosły potwierdzenie braku różnic pomiędzy stężeniami PDGF-AB po 60 minutach inkubacji z błoną i bez niej (W=75, p=0,3012; K-S=0,7559, p=0,6172). Porównanie stężenia TGF-beta1 w PRP po oddziaływaniu błony zaporowej wskazało na znaczne obniżenie jego stężenia po 60 minutach w stosunku do grupy referencyjnej. Obie zastosowane metody statystyczne z bardzo wysoką znamiennością potwierdziły to działanie (W=2, p=0,0001; K-S=2,1320, p=0,0002). Wyniki przedstawiono w tabeli I na wykresach 1 i 2. T a b e l a I. Wpływ błony barierowej Alg-MkCh-Alg na stężenie badanych czynników wzrostu w osoczu bogato płytkowym (PRP). C_PDGF-AB pg/ml M_PDGF-AB pg/ml C_TGF-beta1 pg/ml M_TGF-beta1 pg/ml Średnia± s.d. 300,30±253,96 179,57±112,27 389,01±81,72 167,55±48,97 Mediana 204,83 199,25 389,01 158,90 Użyte skróty: C_PDGF-AB stężenie PDGF-AB w grupie referencyjnej, M_PDGF-AB stężenie PDGF-AB po kontakcie z błoną alginianowo-chitozanowo-alginianową, C_TGF-beta1 stężenie TGF-beta1 w grupie referencyjnej, M_TGF-beta1 stężenie TGF-beta1 po kontakcie z błoną alginianowo-chitozanowo-alginianową. * różnica statystycznie znacząca dla p<0,001 280
Regeneracja tkanek Ryc. 1. Rozkład oznaczonego stężenia PDGF-AB w badanych grupach po 60 minutach inkubacji w temperaturze 37 o C. C linia niebieska oznacza grupę referencyjną, M linia czerwona oznacza grupę doświadczalną. Na osi poziomej oznaczono stężenie czynnika wzrostu w pg/ml PRP. Ryc. 2. Rozkład oznaczonego stężenia TGF-beta1 w badanych grupach po 60 minutach inkubacji w temperaturze 37 o C. C linia niebieska oznacza grupę referencyjną, M linia czerwona oznacza grupę doświadczalną. Na osi poziomej oznaczono stężenie czynnika wzrostu w pg/ml PRP. Dyskusja Użycie własnopochodnego osocza bogato płytkowego (PRP) jest obecnie szeroko badane w zastosowaniach dla implantologii stomatologicznej jako metoda przyspieszająca dojrzewanie tkanki kostnej w szczęce i żuchwie (3, 5). Na pewno PRP jest źródłem czynników wzrostu, w którym w największym stężeniu występują PDGF-AB i TGF-beta1 (30). Poza wysokim stężeniem, ich pozytywna rola w dojrzewaniu tkanek miękkich i twardych jest udokumentowana (5). Ponadto wiadomo, że PDGF wpływa na przyspieszenie migracji i proliferacji mezenchymalnych osteogennych komórek prekursorowych pochodzenia szpikowego, a mediatorem jest kinaza białkowa (6). W badanym materiale zaobserwowano dużą zmienność poziomów PDGF-AB, czego skutkiem było zatarcie różnic pomiędzy grupą referencyjną, a doświadczalną. Taka zmienność może być wynikiem aktywnych procesów biologicznych zmieniających stężenie badanego czynnika wzrostu. Peptydy z rodziny TGF-β są najsilniejszymi czynnikami inicjującymi osteogenezę i regulującymi proces regeneracji kości (20, 28). Odgrywają one ważną rolę w kształtowaniu szkieletu, gojeniu złamań kości oraz remodelingu kości (7, 18, 19, 21). TGF-β jest obecny we wszystkich tkankach, ale jego najwyższe stężenie występuje w kości i płytkach krwi. Podobne receptory dla tego czynnika wzrostu ujawniono na prawie każdym rodzaju komórek, jednak najwyższe jego stężenie jest na osteoblastach (1, 2). Te dwa fakty nakreślają jak bardzo istotny jest to czynnik wzrostu dla metabolizmu i regeneracji kości (23, 26). Podobnie jak PDGF, TGF-β jest najwcześniej uwalniany z płytek krwi do ubytku kostnego po wypełnieniu go krwią. Pewna jego część jest aktywowana przez działanie plazminy na ściany ubytku kostnego w czasie tworzenia skrzepu (32). Cząstki uwolnionego wcześniej TGF-β są wiązane w przestrzeni międzykomórkowej z siarczanem heparanu tworząc formę latentną (4). Uwolnienie tego czynnika wzrostu z tego magazynu umożliwia istnienie długofalowego procesu regeneracji i remodelingu kości (27). Być może zastosowana błona staje się też rezerwuarem latentnego TGF-beta1. Ze względu na nie w pełni poznany mechanizm działania PRP (6) trudne jest do wyjaśnienia to działanie badanej błony i przewidzenie biologicznych skutków tej cechy. W ciągu pierwszej godziny po kontakcie PRP z błoną zaobserwowano niską aktywność płytek krwi. Niezbędna jest dalsza ocena tej błony zarówno w innym horyzoncie czasowym, jak i w porównaniu z wpływem jej na pełną krew. 281
M. Kozakiewicz, H. Bodek Wnioski Nowa trójwarstwowa błona dla sterowanej regeneracji tkanek stabilizuje aktywność osteoindukcyjną PRP poprzez protekcyjny wpływ w stosunku do uwalniania PDGF-AB i TGF-beta1 z płytek krwi. Piśmiennictwo 1. Beck L. S., Amento E. P., Xu Y., Deguzman L., Lee W. P., Nguyen T., Gillet N. A.: TGF-β induces bone closure of skull defects: temporal dynamics of bone formation in defects exposed to rh-tgf-β. J. Bone Min. Res., 1993, 8, 753-758. 2. Beck L. S., Ammann A. J., Aufdemorte T. B., Deguzman L., Xu Y., Lee W. P., McFatrige L. A., Chen T. L.: In vivo induction of bone recombinant human transforming growth factor beta. J. Bone Min. Res., 1991, 6, 961-965. 3. Carlson N. E., Roach R. B. Jr: Platelet-rich plasma: clinical applications in dentistry. J. Am. Dent. Assoc., 2002, 133, 1383-1386. 4. Centrella M., McCarthy T. L., Canalis E.: Skeletal tissue and transforming growth factor-β. FASEB J., 1988, 2, 3066-3072. 5. Gonshor A.: Technique for producing platelet-rich plasma and platelet concentrate: background and process. Int. J. Periodontics Restorative Dent., 2002, 22, 547-557. 6. Gruber R., Karreth F., Kandler B., Fuerst G., Rot A., Fischer M. B., Watzek G.: Platelet-released supernatants increase migration and proliferation, and decrease osteogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells under in vitro conditions. Platelets 2004, 15, 29-35. 7. Iwasaki M., Nakahara H., Nakata K., Nakaże T., Kiura T., Ono K.: Regulation of proliferation and osteochondrogenic differentiation of periosteum-derived cells by transforming growth factor-beta and basic fibroblast growth factor. J. Bone J. Surg., 1995, 77-A, 543-554. 8. Kovacs K., Velich N., Huszar T., Szabo G., Semjen G., Reiczigel J., Suba Z.: Comparative study of beta-tricalcium phosphate mixed with platelet-rich plasma versus beta-tricalcium phosphate, a bone substitute material in dentistry. Acta Vet. Hung., 2003, 51, 4, 475-484. 9. Kozakiewicz M., Bodek K. H.: Fizykochemiczne właściwości membran do sterowanej regeneracji tkanek opartych na bazie chitozanu. Czas. Stomat., 2003, 56, 332-337. 10. Kozakiewicz M., Bodek K. H.: Membrana chitozanowa z dodatkiem niesteroidowych leków przeciwzapalnych. Mag. Stomat., 2000, 109, 68-71. 11. Kozakiewicz M., Bodek K. H.: Membrana polimleczanowo-chitozanowa do sterowanej regeneracji tkanek. Mag. Stomat., 2000, 111, 10-12. 12. Kozakiewicz M., Bodek K. H.: Sposób wykonywania membran barierowych i membrana wykonana tym sposobem, Biuletyn Urzędu Patentowego, 2002, 11, 741, 350948. 13. Kozakiewicz M., Bodek K. H.: Sposób wykonywania trójwarstwowych złożonych membran barierowych i trójwarstwowa membrana barierowa wykonana tym sposobem, Biuletyn Urzędu Patentowego, 2002, 11, 741, 350950. 14. Kozakiewicz M., Bodek K. H.: Sposób wykonywania wielowarstwowych złożonych membran barierowych i wielowarstwowa membrana barierowa wykonana tym sposobem, Biuletyn Urzędu Patentowego, 2002, 11, 741, 350951. 15. Kozakiewicz M., Bodek K. H.: Sposób wykonywania rozpuszczalnych membran barierowych modyfikowanych lekami, Biuletyn Urzędu Patentowego, 2002, 11, 741, 350952. 16. Kozakiewicz M., Bodek K. H.: Sposób wykonywania złożonych membran barierowych i membrana barierowa wykonana tym sposobem, Biuletyn Urzędu Patentowego, 2002, 11, 741, 350949. 17. Kozakiewicz M., Bodek K. H.: Własna membrana chitozanowo-metylocelulozowa do sterowanej regeneracji kości. Ocena zastosowania u szczurów. Czas. Stomat., 2004 w druku. 18. Lind M.: Growth factors: possible new clinical tool. Acta Orthop. Scand., 1996, 67, 407-417. 19. Long M. W., Robinson J. A., Ashcraft E. A., Mann K. G.: Regulation of human bone-derived osteoprogenitor cells by osteogenic growth factors. J. Clin. Invest., 1995, 95, 881-887. 20. Morrisey W. M., Cipolle M. D., Pasquale M. D., Cline J., Gottlund K., Simon N., Arangio G. A.: Effects of systemic administration of TGF-β2 on callus area in rat tibia fracture model. Surg. Forum, 1997, 48, 561-562. 21. Massaque J.: The transforming growth factor-β family. Ann. Rev. Cell. Biol., 1990, 6, 597-641. 22. Ross R., Raines E. W., Bowen-Pope D. F.: The biology of platelet-derived growth factor. Cell, 1986, 46, 155-169. 23. Rowe N. M., Steibrech D. S., Mehrara B. J., Saadeh P. B., Dudziak M. E., Paccione M. F., Gittes G. K., Longaker M. T.: Gene expression of VEGF, TGF- 3, collagen II, and TIMP-1: molecules important to rat membranous bone repair. Surg. Forum, 1999, 50, 584-586. 24. Schlegel K. A., Kloss F. R., Schultze-Mosgau S., Neukam F. W., Wiltfang J.: Tierexperimentelle Untersuchung zum Einfluss verschiedener Thrombozytenkonzentrate auf die Defektregeneration mit autogenem Knochen und Kombinationen von autogenem Knochen und Knochenersatzmaterialien (Biogran und Algipore). Mund. Kiefer Gesichtschir. 2003, 7, 2, 112-118. 25. Sonnleitner,-D; Huemer,- 282
Regeneracja tkanek P; Sullivan D. Y: A simplified technique for producing platelet-rich plasma and platelet concentrate for intraoral bone grafting techniques: a technical note. Int. J. Oral Maxillofac. Implants., 2000, 15, 6, 879-882. 26. Sporn M. B., Roberts A. B.: Handbook of Experimental Pharmacology: Peptide growth factors. 1. The multifunctional nature of growth factors. New York, Springer Verlag 1990. 27. Steibrech D. S., Mehrara B. J., Rowe N. M., Dudziak M. E., Luchs J. S., Saadeh P. B., Gittes G. K., Longaker M. T.: gene expression of TGFbeta, TGF-beta receptor, and extracellular matrix proteins during membranous bone healing in rats. Plast. Reconstr. Surg., 2000, 105, 2028-2038. 28. Sumner D. R., Turner T. M., Gombotz W. R., Urban R. M., Galante J. O.: Enchancement of bone ingrowth by transforming growth factor-β. J. Bone J. Surg., 1995, 77-A, 1135-1147. 29. Velich N., Kovacs K., Huszar T., Semjen G., Reiczigel J., Szabo G., Suba Z.: Platelet-rich plasma (thrombocyta-koncentratum) hatasa a csontkepzodesre oszteokonduktiv csontpotloval (beta-trikalcium-foszfat) torteno egyuttes alkalmazaskor Beagle kutyakon. Fogorv. Sz. 2004, 97, 1, 23-27. 30. Weibric G., Buch R. S., Kleis W. K., Hafner G., Hitzler W. E., Wagner W.: Quantification of thrombocyte growth factors in platelet concentrates produced by discontinuous cell separation. Growth Factors, 2002, 20, 2, 93-97. 31. Wiltfang J., Schlegel K. A., Schultze-Mosgau S., Nkenke E., Zimmermann R., Kessler P.: Sinus floor augmentation with beta-tricalciumphosphate (beta- TCP): does platelet-rich plasma promote its osseous integration and degradation? Clin. Oral Implants Res., 2003, 14, 2, 213-218. 32. Yehualaeshet T., O Connor R., Green-Johnson J., Mai S., Silverstein R., Murphy- Urlich J. E., Khalil B.: Activation of rat alveolar macrophage-derived latent transforming growth factor beta- 1 by plasmin requires interaction with trombospondin- 1 and its cell surface receptor, CD36. Am. J. Pathol., 1999, 155, 841-851. Otrzymano: 21.X.2004 r. 283