MIKROORGANIZMY W PRODUKCJI KOSMETYKÓW I WYBRANYCH FARMACEUTYKÓW wykłady 1
PRODUKCJA BIOMASY 2
RYS HISTORYCZNY Ludwik Pasteur, I połowa XIX wieku proces fizjologiczny bakterii i drożdży pojęcie aseptyki, pożywki minimalnej wymagania odżywcze i tlenowe wielu drobnoustrojów Jacques Monod, I połowa XX wieku model wzrostu drobnoustrojów pojęcia szybkości wzrostu, stężenia stubstratów limitujących wzrost 3
RYS HISTORYCZNY I wojna światowa pierwsze kultury drobnoustrojów o znaczeniu spożywczym kontynuacja badao - lata międzywojenne, II wojna światowa: Niemcy, USA, Wielka Brytania lata pięddziesiąte intensywny rozwój prac badawczych nad wykorzystaniem mikroorganizmów jako źródła żywności bądź do celów paszowych 1966 wprowadzenie pojęcia SCP, single cell protein (białko jednokomórkowców, białko mikrobiologiczne) Obecnie SCP dotyczy produkcji biomasy, oraz izolatów białek z komórek drobnoustrojów 4
WYMAGANIA STAWIANE DROBNOUSTROJOM zdolnośd wszechstronnego i maksymalnego wykorzystania substratu odpowiedni skład chemiczny biomasy wydajny kompleks enzymów oddechowych, warunkujący szybki wzrost zdolnośd syntetyzowania substancji o działaniu oligodynamicznym odpornośd na niekorzystne zmiany składu podłoża i warunków hodowli korzystne cechy technologiczne brak zdolności syntezy substancji toksycznych brak zdolności adsorpcji substratów toksycznych z pożywki 5
KORZYŚCI WYNIKAJĄCE Z ZASTOSOWANIA MIKROORGANIZMÓW bardzo szybki wzrost w optymalnych warunkach duża efektywnośd biosyntezy białka łatwośd modyfikacji genetycznej duża zawartośd białka odpowiedniej jakości duża wydajnośd prowadzonych hodowli ciągłych wykorzystywanie jako substratów surowców odpadowych łatwa modyfikacja składu syntetyzowanego białka 6
METODY PROWADZENIA HODOWLI Hodowla okresowa Hodowla okresowa z zasilaniem Hodowla okresowa z powtórnym zasilaniem Hodowla półciągła Hodowla ciągła 9
HODOWLA W FERMENTORZE 10
PARAMETRY CHARAKTERYZUJĄCE WZROST BIOMASY PRZYROST BIOMASY (X) jest plonem rozwoju populacji we wszystkich fazach wzrostu hodowli okresowej 11
PARAMETRY CHARAKTERYZUJĄCE WZROST BIOMASY WŁAŚCIWA SZYBKOŚD WZROSTU (μ) stosunek szybkości przyrostu liczby komórek (dn)/biomasy komórek (dx) do liczby komórek (N)/biomasy (X) już istniejącej. 12
PARAMETRY CHARAKTERYZUJĄCE WZROST BIOMASY WSPÓŁCZYNNIK WZROSTU (μ) K s takie stężenie substratu przy którym uzyskuje się połowę maksymalnego współczynnika wzrostu tj., gdy μ = 0,5 μ maks μ maks - zależy od rodzaju organizmu i warunków procesu 13
PARAMETRY CHARAKTERYZUJĄCE WZROST BIOMASY CZAS GENERACJI (t g ) czas potrzebny do podwojenia liczby komórek 14
CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA WYDAJNOŚD BIOMASY Natlenienie EFEKT PASTEURA w obecności tlenu wydajnośd biomasy z cukru jest znacznie wyższa EFEKT CRABTREE w tlenowych hodowlach obserwuje się obniżanie wydajności biomasy w warunkach wzrastającego stężenia cukru (powyżej 1-2 g/l) Temperatura optymalna ok. 30 0 C ph ok. 4,5-5,0 Szybkośd dopływu melasy do fermentora Zanieczyszczenia melasy Czystośd mikrobiologiczna procesu technologicznego 15
16
DROŻDŻE WYKORZYSTYWANE W PRODUKCJI BIOMASY Z rodzaju Candida: C. lipolytica, C. tropicalis, C. guillermondii, C. maltosa, C. parafinica, C. oleophila, C. utilis, C. enthanothermophilum, C. kruzei, C. rugosa, C. curvata, C. blankii, C. deformans, C. parapsilosis Yarrowia lipolytica Saccharomyces cerevisiae Hanseniaspora sp. Pichia pastoris Hansenula sp. Kloeckera sp. Schwanniomyces alluvius Lipomyces kononenkoe Torulopsis utilis Rhodotorula sp. 17
CECHY CHARAKTERYSTYCZNE DROŻDŻY zawartośd białka 40-50% duża zawartośd aminokwasów: (egzogennych) lizyna, tryptofan, treonina, metionina; (endogennych) cysteina - (aminokwasy siarkowe składnik keratyny włosy, paznokcie, skóra) wskaźnik NPU 27-50 (białko roślinne 16-35; białko zwierzęce 75-78) bogate w witaminy, szczególnie grupy B: tiamina-b1, ryboflawina-b2, witamina PP-B3, biotyna-b7, kwas foliowy-b9/b11 bogate w substancje mineralne: fosfor, cynk, magnez, żelazo, potas, selen, chrom zawartośd kwasów nukleinowych 4-10% czas generacji 2-5 godzin łatwośd wydzielenia z pożywki 18
PREPARATY KOMÓREK DROŻDŻY suplement diety w przypadku problemów ze skórą i włosami suplement diety podczas odchudzania zalecane podawanie w przypadku cukrzycy i hipoglikemii łagodzą stany migrenowe pomocne w leczeniu chorób układu krążenia stymulują działanie układu odpornościowego polecane osobom nadpobudliwym, nerwowym pomagają w leczeniu bezsenności poprawiają koncentrację 19
ULEPSZANIE DROŻDŻY SACCHAROMYCES CEREVISIAE korzystanie z rafinozy jako źródła węgla wprowadzenie genu kodującego enzym a-galaktozydazę wydajniejszy wzrost na melasie melibioza hydroliza fruktoza rafinoza wykorzystanie serwatki hydroliza laktozy (glukoza, galaktoza) wprowadzenie genów kodujących: enzym β-galaktozydazę i białko permeazę laktozową 20
ULEPSZANIE DROŻDŻY SACCHAROMYCES CEREVISIAE wykorzystanie skrobi jako źródła węgla wprowadzenie do komórki enzymów: α-amylazy hydroliza do maltozy i dekstryn glukoamylazy hydroliza do postaci glukozy pullulanaza enzym rozcinający rozgałęzienia łaocucha 21
ULEPSZANIE DROŻDŻY SACCHAROMYCES CEREVISIAE korzystanie z ligninocelulozy jako substratu do produkcji biomasy wprowadzenie enzymów: rozkładających celulozę, hydrolizujących ksylany, umożliwiających asymilację przez drożdże ksylozy 22
23
PRÓŻNIOWY FILTR BĘBNOWY 24
PRODUKCJA BIAŁKA (SCP) W KOMÓRKACH DROŻDŻY biomasa komórek dezintegracja ekstrakcja białko Charakterystyka drożdży jako gospodarzy ekspresyjnych: dobrze scharakteryzowane łatwośd przeprowadzenia manipulacji genetycznych szybki wzrost i produkcja dużej ilości biomasy możliwośd produkcji białek wewnątrz- i zewnątrzkomórkowo (induktorem syntezy białka może byd substrat np. metanol) trwałe rekombinanty integracja plazmidów ekspresyjnych z genomem gospodarza modyfikacje posttranslacyjne białek tworzenie mostków disiarczkowych glikozylacja przyłączanie kwasów tłuszczowych stosunkowo proste oczyszczanie produktu peptyd sygnalny warunkujący wydzielanie białka na zewnątrz komórki 25
PRODUKCJA BIAŁKA (SCP) W KOMÓRKACH DROŻDŻY Gatunki drożdży stosowane do produkcji heterologicznych białek: Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris Pichia methanolica Hansenula polymorpha Kluyveromyces lactis Yarrowia lipolytica 27
HODOWLA PICHIA PASTORIS Glicerol wzrost biomasy Metanol induktor syntezy białka 28
PRODUKCJA BIAŁKA (SCP) W KOMÓRKACH DROŻDŻY Laktaza (b-galaktozydaza) enzym rozkładający laktozę Chrymozyna enzym rozkładający kazeinę w mleku Interleukina1-b białko z grupy cytokin (wydzielana przez organizm jako odpowiedź układu immunologicznego na antygen) Interferon aa białko produkowane przez leukocyty w odpowiedzi na zakażenia wirusowe i bakteryjne Β-laktoglobulina białko serwatkowe Lizozym białko stymulujące wzrost makrofagów Albumina surowicza białko osocza krwi 29
BAKTERIE WYKORZYSTYWANE DO PRODUKCJI BIOMASY Najwyższa właściwa szybkośd wzrostu (czas generacji 0,5-1 h) Zawartośd białka do 80% Zbilansowany skład aminokwasów Wysoki udział aminokwasów siarkowych i lizyny Zawartośd kwasów nukleinowych 10-16% Potencjalna patogennośd Trudnośd w separacji komórek (małe rozmiary) 30
BAKTERIE METYLOTROFICZNE Heterotroficzne metylotrofy Arthobacter sp. Methylobacterium organophylum Hyphomicrobium sp., Bacillus sp. Pseudomonas methanica Obligatoryjne metylotrofy Methylococcus sp., Methylomonas sp. Methylocystis sp., Methylophilus methylotrophus 31
PRZYKŁADY ZASTOSOWAO METYLOTROFÓW Produkcja biomasy Pseudomonas methanica produkcja 1 tony biomasy (40-50% zawartości białka) wymaga zużycia 4 ton metanu Pseudomonas methylotrophus produkcja 1 tony biomasy wymaga zużycia 1,9 ton metanolu Methylomonas methanol produkcja 1 tony biomasy wymaga zużycia 2 ton metanolu Produkcja białka (SCP): Bacillus methanolicus produkcja L-lizyny Methylobacillus glycogenes produkcja kwasu L-glutaminowego, L-treoniny i L-lizyny Methylophilus methylotrophus produkcja L-lizyny 32
GRZYBY JAKO PRODUCENCI BIOMASY czas generacji 5-12 godzin zawartośd białka do 50% białko ubogie w aminokwasy siarkowe trudne do strawienia ściany komórkowe niski udział kwasów nukleinowych ok. 3% łatwośd separacji komórek ogromna różnorodnośd metabolizowanych substratów Celuloza Chaetomium cellulolyticum, Trichoderma viride Ługi siarczynowe Paecilomyces variotii Skrobia Aspergillus niger, Fusarium graminearum 33