GinPolMedProject 1 (43) 2017: 087-093 ARTYKUŁ POGLĄDOWY Płyn pęcherzykowy Magdalena Lemm (ABE), Władysław Skałba (AEF), Mirosława Mackiewicz (DE), Andrzej Witek (DE) Medical University of Silesia, Department of Gynecology and Obstetrics, Katowice, Poland STRESZCZENIE WKŁAD AUTORÓW: (A) Projekt badania (B) Zbieranie Danych (C) Analiza Statystyczna (D ) Interpretacja Danych (E ) Przygotowanie Rękopisu (F ) Gromadzenie Piśmiennictwa (G ) Gromadzenie Funduszy Płyn pęcherzykowy jest bezpośrednim otoczeniem rozwijającej się komórki jajowej. W związku z tym określenie składu zapewnia dobre narzędzie do oceny jakości oocytów i jego zdolności do zapłodnienia, a także do oceny przebiegu wczesnych stadiów ciąży. Przegląd dostępnej literatury dotyczącej tematu dowodzi, że istnieje potrzeba dalszych badań dotyczących składu i roli płynu pęcherzykowego, który pozwoli poznać nieznane mechanizmy odpowiedzialne za niepowodzenia rozrodu i patologię wczesnego rozwoju zarodka. Słowa kluczowe: płyn pęcherzykowy; dojrzewanie pęcherzyka; oocyt Adres do korespondencji: Magdalena Lemm UCK SUM w Katowicach, Medyków 14, 40-752 Katowice Tel. +48 696460716, e-mail: magdalena.lemm@gmail.com Liczb słów: 3131 Tabele: 0 Ryciny: 0 Piśmiennictwo: 46 Received: 09.11.2016 Accepted: 09.01.2017 Published: 29.03.2017 WSTĘP Folikulogeneza jest procesem, w którym pierwotny pęcherzyk jajnikowy dojrzewa i różnicuje się w pęcherzyk antralny, a następnie przedowulacyjny, który po osiągnięciu całkowitej dojrzałości zdolny jest w momencie owulacji do wydalenia gotowej do zapłodnienia komórki jajowej. U kobiety proces wzrastania i dojrzewania pęcherzyków jajnikowych od stadium pęcherzyków primordialnych do dojrzałych zdolnych do owulacji trzeciorzędowych pęcherzyków Graafa trwa około jednego roku. Los pęcherzyków jest kontrolowany zarówno przez hormony o budowie białkowej oraz steroidowej, jak i przez wewnątrzjajnikowe czynniki wzrostu. Rekrutacja pęcherzyków odbywa się w pierwszych dniach cyklu miesiączkowego, jednak cały okres przygotowania pęcherzyków do owulacji trwa około 85 dni i nie podlega regulacji hormonalnej [1]. SKŁAD I ROLA PŁYNU PĘCHERZY- KOWEGO Pierwszą oznaką początku powstawania stadium pęcherzyka trzeciorzędowego jest pojawienie się jamki wśród komórek ziarnistych. Jamka wypełnia się płynem pęcherzykowym, którego źródłem jest zarówno transfer osocza, jak i wydzielnicza aktywność komórek ziarnistych i otoczki pęcherzyka. Nieznany jest dokładny mechanizm kontrolujący wczesną fazę powstawania jamki. Wydaje się, że polega on na działaniu autokrynno/parakrynnym, w tym takich czynników jak: aktywina, ligand KIT czy proteina złączy szczelinowych Cx 37. Podstawowa hipoteza dotycząca powstawania płynu pęcherzykowego sugeruje, że komórki ziarniste produkują kwas hialuronowy i siarczan chondroityny, proteoglikany, które generują gradient osmotyczny, powodujący przenikanie płynu z naczyń krwionośnych otoczki pęcherzyka. W płynie pęcherzykowym obecny jest ponadto inhibitor inter-alfa-trypsyny i versican (Vcan), które tworzą kompleksy z kwasem hia- 87
GinPolMedProject 1 (43) 2017: 087-093 luronowym i dodatkowo zwiększają retencję tych cząsteczek do wnętrza jamki. Płyn pęcherzykowy tworzy środowisko w którym komórki ziarniste i komórka jajowa znajdują cząsteczki regulacyjne niezbędne dla ich dalszego rozwoju [2]. Począwszy od stadium jamki (stadium pęcherzyka antralnego) dalszy jego rozwój zależy od hormonów przysadkowych: LH i FSH, które kontrolują końcowe etapy folikulogenezy, chociaż powstające lokalnie czynniki wzrostu mogą modulować ich działanie. Biochemiczna analiza składu płynu pęcherzykowego może dostarczyć istotnych informacji na temat jakości i dojrzałości oocytu. Zadanie powyższe spełniają analizy pojedynczych parametrów, uznanych za predyktory jakości oocytu, jak też metabolomika badania procesów chemicznych związanych z dojrzewaniem oocytu i proteomiczną analizą ujawniającą produkty genowe związane z tym procesem. Proteomiczna analiza płynu pęcherzykowego ujawnia obecność w nim białek z różnych grup czynnościowych np. insulinopodobny czynnik wzrostu, receptory, białka antyapoptyczne, czy mataloproteinazy. Zidentyfikowano 17 białek, których ekspresja w płynie pęcherzykowym zmieniała się po podaniu HCG, co pozwala uznać je za biomarkery, które pokazują, w jaki sposób mikrośrodowisko pęcherzyka zmienia się w zależności od warunków niepłodności [3]. Chemiczne składniki płynu pęcherzykowego mające istotne znaczenie dla rozwoju pęcherzyka i oocytu można pogrupować w następujące kategorie: a) hormony, b) czynniki wzrostu, c) reaktywne formy tlenu będące wolnymi rodnikami, e) czynniki anty-apoptotyczne, f) białka, peptydy i aminokwasy, g) cukry, h) prostanoidy. Gonadotropiny przysadkowe: FSH i LH są obecne w płynie pęcherzykowym, a na ich zawartość wpływa ich stężenie w surowicy krwi. Występuje korelacja stężeń gonadotropin przysadkowych w obu środowiskach; surowicy krwi i płynie pęcherzykowym [4,5]. Średnie stężenie FSH w płynie pęcherzykowym jest małe i zaczyna wzrastać w około 10 godzin po piku LH, osiągając 50% wartości występującej w surowicy krwi [6]. Podobnie, jak w przypadku FSH, stężenie LH jest małe na początku cyklu i zwiększa się między 10. a 20. godziną po piku LH, osiągając najwyższe wartości między 20. a 30. godziną, które odpowiadają 40% wartości występujących w surowicy krwi [6]. Interesującą jest obserwacja ujawniająca, że 20. godzin po piku LH pogarsza się stan błony podstawowej pęcherzyka i rozpoczyna morfologiczny i czynnościowy proces luteinizacji. W tym samym czasie stężenie estradiolu w płynie pęcherzykowym gwałtownie maleje [6]. Podanie gonadotropin w kontrolowanej hiperstymulacji jajników stosowane w metodzie in vitro jest interwencją zmieniającą środowisko wewnątrzpęcherzykowe. Ostatnio publikowane badania wykazały, że hiperstymulacja z użyciem gonadotropin zmienia wewnątrzpęcherzykową zawartość cytokin, co może zaburzać dojrzewanie oocytów i kompetencje zarodków. Powyższe negatywne zjawiska nie występują w modyfikowanych cyklach naturalnych [7]. Gonadotropiny podobnie, jak hormon wzrostu wpływają na produkcję przez komórki ziarniste szeregu substancji, ważnych dla dojrzewania oocytu, np. kwasu hialuronowego. Działając synergistycznie z estradiolem poprzez wydzielanie cyklicznego AMP zwiększają cytoplazmatyczne dojrzewanie oocytu i kontrolują mejozę [5]. Płyn pęcherzykowy pochodzący z pęcherzyków zawierających oocyty, które z sukcesem zostały zapłodnione zawiera większe stężenie HCG i FSH w porównaniu do otoczenia oocytów, których nie udało się zapłodnić, co dowodzi istotnej roli gonadotropin w tym procesie [8]. Hormon wzrostu (GH) wzmacnia zależną od FSH produkcję estradiolu przez komórki ziarniste podobnie, jak powstawanie w tych komórkach receptorów dla LH i FSH. Obecność GH w płynie pęcherzykowym została udowodniona, chociaż nie ustalono jej związku z potencjalną ciążą i jej rozwojem [5]. Prolaktyna jest obecna w płynie pęcherzykowym i w przeciwieństwie do gonadotropin przysadkowych i hormonów steroidowych jej stężenie w tym środowisku nie koreluje z stężeniem we krwi [4]. Stężenie prolaktyny w płynie pęcherzykowym jest znamiennie mniejsze w późnej fazie pomiesiączkowej w porównaniu do innych faz cyklu miesiączkowego i jest relatywnie stałe w okresie piku LH [6]. Należy jednak wykluczyć występowania wewnątrz pęcherzykowego źródła hormonu, ponieważ w płynie pęcherzykowym pacjentek leczonych bromokryptyną prolaktyna jest niewykrywalna [6]. Stężenie prolaktyny w płynie pęcherzykowym, podobnie jak stężenia: estradiolu, progesteronu i androstendionu wykazują związek z różnicami w dojrzałości komórki jajowej oraz jej zdolności do zapłodnienia i podziałów po zapłodnieniu pozaustrojowym [9]. Wysoki poziom prolaktyny w płynie pęcherzykowym jest związany z sukcesem rozwoju ciąży, co sugeru- 88
M. Lemm et al. Płyn pęcherzykowy je istotną rolę tego hormonu w dojrzewaniu oocytu [8]. Estradiol i progesteron są obecne w płynie pęcherzykowym w pęcherzykach o różnych wielkościach, na etapie po spontanicznym piku LH, a także po podaniu HCG w cyklach niestymulowanych i stymulowanych. W fazie pomiesiączkowej cyklu stężenie estradiolu w płynie w dużych pęcherzykach (powyżej 8 mm) jest duże, natomiast w fazie przedmiesiączkowej stężenie estradiolu zmniejsza się, a progesteronu jest duże [4]. W pęcherzykach przedowulacyjnych, przed i około szczytu LH stężenie estradiolu w płynie pęcherzykowym jest nieznacznie większe, niż w pozostałych pęcherzykach, a następnie maleje. Stężenie progesteronu na krótko przed pikiem LH gwałtownie wzrasta i kontynuuje ten wzrost przez następne 25 godzin po czym wolno maleje. Zmiany stężenia progesteronu świadczą o przebytej owulacji. Poziomy stężeń obu hormonów i ich wzajemne proporcje pozwalają ocenić zdolność komórek jajowych do zapłodnienia [6]. W piśmiennictwie występują różne oceny znaczenia progesteronu w płynie pęcherzykowym. Część autorów twierdzi, że duże stężenia progesteronu, lub mała proporcja między stężeniami estradiolu i progesteronu są predykcyjne dla implantacji i ciąży, inni uważają, że wiążą się z nieprawidłowym zapłodnieniem skutkującym wzrostem powstawania multipronuklearnych zarodków. Wydaje się, że optymalna ekspozycja komórki jajowej na progesteron, czyli ustalenie progu, którego przekroczenie powoduje uszkodzenie komórki jajowej jest obecnie jeszcze niemożliwe [5]. W płynie pęcherzykowym obecne są również androgeny. Stężenia androstendionu i testosteronu w tym środowisku są wyższe w fazie przedowulacyjnej, chociaż są znacznie mniejsze, niż stężenie estradiolu. Większe stężenia androgenów w płynie pęcherzykowym notuje się przed pikiem LH. Potwierdza to, że wymienione hormony są istotnym elementem na drodze biosyntezy estradiolu [10]. Większe stężenie androgenów w płynie pęcherzykowym wiąże się z obniżeniem jakości oocytów i liczby podziałów zygoty po zapłodnieniu. Niski wskaźnik estradiol/testosteron wiąże się z wczesną atrezją pęcherzyków i ograniczeniem możliwości zapłodnienia oraz rozwoju ciąży. Powszechnie akceptuje się pogląd, że mimo iż androgeny są odpowiedzialne za atrezję pęcherzyków, pewne ich ilości w płynie pęcherzykowym są niezbędne dla właściwego ich wzrostu. Przypuszcza się, że kortykosteroidy wpływają pozytywnie na końcowe etapy dojrzewania pęcherzyków i implantacje zarodków. Kortyzol hamuje sterydogenezę w jajniku, ale pozytywnie wpływa na dojrzewanie oocytów. W czasie piku LH zwiększa się stężenie kortyzolu w płynie pęcherzykowym. Stężenie to jest większe w dojrzałych pęcherzykach w porównaniu z niedojrzałymi. Dehydrogenaza 11ß-hydroksysteroidowa, enzym ktory katalizuje przemianę kortyzonu w kortyzol, występuje w ludzkich jajnikach. Pomiar aktywności enzymu stanowi pośrednią ocenę stężenia kortyzolu i kortyzonu w płynie pęcherzykowym. Aktywność enzymu w aspiratach płynu pęcherzykowego po trzydniowej inkubacji pozostaje w odwrotnej proporcji do sukcesu zapłodnienia oocytu w procedurze in vitro i dlatego proponuje się uznać jego aktywność za potencjalny predyktor udanego zapłodnienia [11]. Poziomy 21-hydroksy- pochodnych steroidów (11-deoksykortyzol i 11-deoksykortykosteron) prekursorów 17-hydroksyprogesteronu w płynie pęcherzykowym pozytywnie korelują z zawartością lipidów w luteinowych komórkach ziarnistych. Związki te działając poprzez receptor mineralokortykoidów promują luteinizację komórek ziarnistych. Fizjologiczne znaczenie powyższej korelacji dla procesów folikulogenezy i dojrzewania oocytów nie zostało jeszcze w pełni poznane [12]. Hormon anty-müllerowski (AMH) jest produkowany przez komórki ziarniste pęcherzyków przedjamkowych oraz małych pęcherzyków jamkowych i jest uznawany za czynnik hamujący rozwój pęcherzyków primordialnych oraz odpowiedzialny za rekrutację i selekcję pęcherzyków podczas dalszych etapów folikulogenezy. Hormon jest obecny również w płynie pęcherzykowym, a jego stężenie w tym środowisku pozwala na ocenę jakości zarodka. Uważa się, że powyższe oznaczenie jest wiarygodnym markerem żywotności oocytu [13]. Cykliczny adenozyno-3',5'-monofosforan (camp) jest elementem transdukcji sygnału wykorzystywanym, jako jeden z przekaźników II rzędu, między innymi w działaniu LH na receptory błonowe komórek docelowych. U wielu gatunków nukleotyd ten pełni istotną rolę w dojrzewaniu komórki jajowej. camp jest obecny w płynie pęcherzykowym człowieka, gdzie notuje się jego duże stężenie przed pikiem LH, które maleje po 20. godzinach. Przyczyna raptownego spadku stężenia nukleotydu w płynie pęcherzykowy w starszych pęcherzykach nie 89
GinPolMedProject 1 (43) 2017: 087-093 jest znana, chociaż być może jest wynikiem wzrostu aktywności fosfodiesterazy [6]. Inhibiny są produkowane przez komórki ziarniste pęcherzyków i ich poziom w płynie pęcherzykowym odzwierciedla aktywność komórek ziarnistych pojedynczych pęcherzyków. Prawdopodobnie wysoki poziom inhibin A i B jest związany z liczbą uzyskiwanych oocytów podczas procedury in vitro, lecz nie z ich jakością i zdolnością do zapłodnienia [14]. Lau stwierdził pozytywną korelację między jakością oocytów i stężeniem aktywiny A w płynie pęcherzykowym, przy braku podobnej korelacji w przypadkach inhibin A i B [15]. Białko morfogenetyczne kości 15 (BMP-15) wpływa na dojrzewanie oocytów. Jego stężenie w płynie pęcherzykowym pozytywnie koreluje ze stężeniem estradiolu, a większe stężenia tego białka występują w przypadkach udanego zapłodnienia i podziałów oocytu, niż w przypadkach braku zapłodnienia [16]. Stwierdzono, że insulinopodobne czynniki wzrostu I i II (IGF-I i IGF-II), polipeptydy promujące proliferacje i różnicowanie tkanek są obecne w płynie pęcherzykowym. Liczne badania dowodzą, jak ważny jest ich udział w prawidłowym funkcjonowaniu jajników, dojrzewaniu pęcherzyków, a tym samym jak wielka jest ich rola w płodności [17]. Niektóre badania dowodzą, że IGF 1 ma podstawowe znaczenie dla rozwoju pęcherzyka, aż do fazy zależnej od gonadotropin. Badania przeprowadzone na zwierzętach dowodzą, że inaktywacja IGF 1 powoduje zablokowanie wzrostu pęcherzyka, bez możliwości naprawczego wpływu gonadotropin. Należy jednak podkreśli, że prawidłowe poziomy GH i IGF 1 nie są warunkiem koniecznym do zachowania płodności [18]. Przykładem jest zespół Larona, w którym pomimo niskich wartości IGF 1 owulacje mogą występować prawidłowo [19]. Pod wpływem androgenów dochodzi do znaczącego wzrostu liczby pęcherzyków podstawowych czemu towarzyszy trzykrotny wzrost stężenia IGF 1 i 5. krotny wzrost produkcji receptora IGF w pęcherzykach pierwotnych [20]. Wykazano również, że w warunkach in vitro stymulowanie IGF 1 skutkuje wzrostem średnicy pęcherzyków preantralnych oraz produkcję estradiolu [21]. IGF 1 wpływa zarówno na komórki ziarniste, jak i tekalne, powodując, co wykazano w badaniach in vitro, wzrost proliferacji komórek ziarnistych i produkcji estradiolu, zwiększoną wrażliwość komórek ziarnistych na FSH, wzrost sekrecji inhibiny A, aktywiny A i folistatyny przez komórki ziarniste oraz wspomaganie syntezy androgenów w komórkach tekalnych [22]. U człowieka IGF 1 stymuluje produkcję VEGF przez komórki ziarniste, ale główny wpływ na funkcje autokrynne w komórkach tekalnych i parakrynne w komórkach ziarnistych ma IGF 2. Dobrze znany jest fakt synergistycznego działania IGF 1 i FSH na wzmacnianie proliferacji i sterydogenezy zwierząt [23]. W obecności FSH, IGF 1 powoduje wzrost syntezy receptorów dla LH w komórkach tekalnych i ziarnistych [24]. Białka wiążące IGF odgrywają kluczową rolę w regulacji biodostępności IGF przez selektywne wiązanie IGF i niedopuszczanie ich do związania się ze swoimi receptorami. IGFBP są inhibitorami indukowanego przez gonadotropiny wzrostu i różnicowania się pęcherzyków, co skutkuje hamowaniem działania na poziomie komórek docelowych. Tak więc zmiany w stężeniach wewnątrzpęcherzykowych IGFBP prowadzą do zmian w biodostępności IGF i w regulacji działania gonadotropin na pęcherzyki. Niektóre badania pokazują, że sama biodostępność IGF bardziej niż ich stężenie zmienia się podczas wzrostu i atrezji pęcherzyków jajnikowych. Jest to związane ze zmianami w ekspresji mrna dla IGFBP oraz ze zmianami w ich proteolitycznej degradacji [25]. Duże wewnątrzpęcherzykowe stężenie insulinopodobnych czynników wzrostu, podobnie jak stężenie białek wiążących insulinopodobne czynniki wzrostu znamiennie korelują z wskaźnikami zapłodnień oocytów i skalą oceniającą morfologię zarodków. Wykazano ponadto, że kombinacja wysokiego stężenia w płynie pęcherzykowym IGFBP-3 i IGFBP-4 z niskim stężeniem ciążowego białka osoczowego A (PAPP-A) wykazuje podobne korelacje [26]. PAPP A ciążowe białko osoczowe, czyli glikoproteina syntezowana w trofoblaście wykorzystywana między innymi do oceny wydolności łożyska i ryzyka wystąpienia zespołu Downa również wydaje się odgrywać kluczową rolę w dojrzewaniu pęcherzyków [27]. Wykazano, że ta występująca w płynie pęcherzykowym glikoproteina (ze wzrastającym stężeniem aż do porodu), działa jako proteaza, likwidując jedno z białek wiążących IGF, a tym samym wpływając na rozwój pęcherzyków. PAPP A może brać, także udział w ustalaniu pęcherzyka dominującego, a być może też w samej owulacji [28]. Amfiregulina jest cytokiną będącą członkiem rodziny naskórkowych czynników wzrostu (EGF). Prawdopodobnie mediuje efekt działa- 90
M. Lemm et al. Płyn pęcherzykowy nia HCG na dojrzewanie oocytów. Wykryto jej obecność w płynie pęcherzykowym i stwierdzono, że jej poziom odwrotnie koreluje z wskaźnikiem zapłodnienia, chociaż nie wpływa na jakość zarodków [29]. Źródłem obecnych w płynie pęcherzykowym prozapalnych cytokin jest osocze oraz miejscowa synteza w jajniku. Do tej grupy cytokin należą interleukiny (IL). Uważa się, że IL-1 beta płynu pęcherzykowego wpływa na dojrzewanie oocytów i zapłodnienie, lecz po zapłodnieniu nie odgrywa żadnej roli w rozwoju zarodka. Poziomy IF-2 i IF-10 korelują ze specyficznymi stężeniami hormonów w płynie pęcherzykowym, lecz nie stwierdzono ich związku z wynikami uzyskanymi przy stosowaniu metod rozrodu wspomaganego [5]. Zaobserwowano wysokie stężenie IF-12 i czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów (GM-CSF) w płynie pęcherzykowym w przypadkach zarodków o wysokim potencjale implantacyjnym. Nie stwierdzono natomiast istotnego związku między stężeniami: IF-2, TNF-alfa i leukotrienem B4 w płynie pęcherzykowym, a dojrzewaniem oocytów, zapłodnieniem i rozwojem ciąży. Natomiast proporcje między IL-1 alfa/ TNF alfa oraz IL-1 alfa/ltb4 (leukotrina B4) różnią się istotnie między grupami pacjentek, które zaszły i które nie zaszły w ciąże [30]. Między pacjentkami dobrze i słabo odpowiadającymi na metodę mikroiniekcji plemnika do komórki nie stwierdzono istotnych różnic w stężeniu w płynie pęcherzykowym: IGF-1, IL-6, IL-8, EGF i GM-CSF. Natomiast stężenie PDGF (płytkopochodny czynnik wzrostu) w tym środowisku jest wysokie u pacjentek dobrze odpowiadających [31]. Unaczynienie pęcherzyka, wewnątrzpęcherzykowa zawartość tlenu i aktywność mitochondriów to czynniki gwarantujące prawidłowy rozwój oocytów [5]. Reaktywne formy tlenu (ROS) spełniają ważną rolę w sygnalizacji komórkowej i homeostazie. Jednakże w okresie stresu oksydacyjnego poziom ROS może znacznie wzrosnąć i okazać się szkodliwym dla oocytów. Dokładny wpływ reaktywnych form tlenu na dojrzewanie oocytów wymaga jednak doprecyzowania. Wykazano bowiem pozytywną korelację pomiędzy poziomem ROS w płynie pęcherzykowym a parametrami dojrzałości oocytów, z drugiej strony ponad fizjologiczne poziomy ROS powodują uszkodzenie zarodków i negatywnie rzutują na rozrodczość. Należy przyjąć, że optymalny balans między dostępem oocytu do tlenu i antyoksydantami jest podstawą dla powstania prawidłowego wrzeciona mejotycznego i odpowiedniej liczby chromosomów. Szkodliwym działaniom ROS mogą przeciwstawić się zmiatacze wolnych rodników lub endogenne antyoksydanty. W płynie pęcherzykowym występują dysmutaza ponadtlenkowa i zależna od selenu peroksydaza glutationu. Duże stężenie dysmutazy ponadtlenkowej wiąże się z zaburzeniem zapłodnienia oocytów, natomiast duże stężenie peroksydazy glutationu ze zdolnością oocytów do zapłodnienia, przy czym małe stężenie tego enzymu z defektem zapłodnienia [32]. Całkowita zdolność antyoksydacyjna płynu pęcherzykowego jest istotnie większa w pęcherzykach zawierających oocyt zdolny do zapłodnienia i wykazuje pozytywną korelację z jakością zarodków i liczbą ciąż uzyskanych w wyniku stosowania technik rozrodu wspomaganego [33]. Płyn pęcherzykowy pęcherzyków zawierających dojrzałe oocyty, które są zdolne do zapłodnienia i tworzenia prawidłowych zarodków zawiera mniejsze ilości azotanów i azotynów, niż w przypadku zarodków o małej potencji do zagnieżdżenia. Poza tym stężenie tlenku azotu (NO) jest istotnie większe u pacjentek z endometriozą i wodniakiem jajowodu, schorzeniach związanych z obniżeniem zdolności do zapłodnienia [9]. Wydaje się zatem, że intensywna produkcja NO w mikrośrodowisku oocytu, jest niekorzystna i powadzi do zaburzenia rozwoju zarodka [34]. Negatywnym markerem jakości oocytu jest poziom czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) w płynie pęcherzykowym, ponieważ jego synteza jest związana z niedotlenieniem kompleksu wzgórek jajonośny oocyt. Marker ten jednak nie znalazł dotychczas zastosowania w praktyce [5]. Zmiany apoptotyczne w środowisku pęcherzyków wiążą się z niską jakością oocytów. Uważa się, że antygen apoptozy czynnik Fas rozpuszczalny w surowicy (sfas) reguluje atrezję pęcherzyków i dojrzewanie oocytów. Czynnik występuje w płynie pęcherzykowym [35]. Niski poziom sfas i wysoki sfas-l (ligandu sfas) wskazuje na wysoki poziom apoptozy i niską jakość oocytów [36]. Kompleksowa analiza danych dotyczących stężenia sfas w płynie pęcherzykowym wykazała, że nie jest on jednak wiarygodnym markerem jakości oocytów i uzyskanych z nich zarodków [5]. Płyn pęcherzykowy zawiera wiele białek, pochodzących z filtratu surowicy krwi oraz produkcji przez komórki ziarniste i tekalne pęcherzyka. Identyfikacja białek, które mogłyby być uznane za markery dobrego rozwoju pęcherzyka jest technicznie skomplikowana, dlatego zrozumienie roli poszczególnych białek 91
GinPolMedProject 1 (43) 2017: 087-093 w procesie wzrostu pęcherzyków i dojrzewania oocytu jest nadal ograniczone [37]. Zmiany stężeń alfa-fetoproteiny, antygenów CEA i CA- 125 w płynie pęcherzykowym wydają się nie mieć znaczenia dla oceny jakości oocytów [37]. W płynie pęcherzykowym obecny jest antygen CD44, glikoproteina zaangażowana w interakcjach międzykomórkowych. Stężenie tego białka jest mniejsze w pęcherzykach zawierających oocyt zdolny do zapłodnienia i wytworzenia prawidłowego zarodka. Nie wiadomo jednak, czy zwiększone stężenie CD44 wywiera, czy też nie wywiera niekorzystnego wpływu na oocyt [38]. Stwierdzono, że stężenie leptyny w płynie pęcherzykowym pozytywnie koreluje z wskaźnikiem zapłodnień i słabo z morfologiczną skalą rozwoju zarodków. Ocenia się, że poziom leptyny w tym środowisku nie odzwierciedla precyzyjnie jakości oocytu i nie może być użyty do ich selekcji [39]. Endotelina jest peptydem złożonym z 21 aminokwasów wydzielanym przez komórki śródbłonka naczyń krwionośnych. Peptyd odgrywa kluczową rolę w homeostazie naczyniowej. Endoteliny składają się z trzech izoform: endoteliny-1, endotelinę-2 i endotelinę-3. Stężenie endoteliny-2 jest istotnie większe w pęcherzykach zawierających oocyt zdolny do zapłodnienia i podziałów [40]. Pęcherzykowe stężenie peptydu koreluje z IGF-1, co wskazuje na możliwość synergistycznego działania promującego aktywność FSH wewnątrz pęcherzyka [40]. Obserwuje się zmniejszenie stężenia inhibitora dojrzewania pęcherzyków (OMI) w płynie pęcherzykowym przed uzyskaniem dojrzałości oocytu i jego zapłodnieniem. Pęcherzyki z wysoką aktywnością OMI zawierają niedojrzały oocyt, co pozwala twierdzić, że OMI jest negatywnym markerem jakości oocytu [41]. Uważa się, że stężenie niektórych aminokwasów obecnych w płynie pęcherzykowym może mieć wartość predykcyjną. Wymienia się kwas D-asparaginowy, którego zawartość koreluje z odsetkiem oocytów o dobrej morfologii [42]. Kwas hialuronowy, główny składnik macierzy zewnątrzkomórkowej jest obecny w płynie pęcherzykowym, a jego stężenie pozytywnie koreluje z apoptozą komórek ziarnistych i jest większe w przypadkach pęcherzyków zawierających oocyty niezdolne do zapłodnienia [43]. Stężenie kwasu hialuronowego w płynie pęcherzykowym jest małe w przypadkach nieskutecznej implantacji i w zaburzeniach hormonalnych, co pozwala zakłada, że produkcja tego związku wpływa na potencjał implantacyjny embrionów [44]. Mio - inozytol, cykliczny sześciowęglowy alkohol polihydroksylowy występuje w płynie pęcherzykowym. Jego stężenie pozytywnie koreluje z stężeniem estradiolu oraz jakością oocytów i powstających z nich zarodków [45]. Suplementacja tym związkiem poprawia jakość oocytów uzyskanych po stymulacji jajników w metodzie zapłodnienia pozaustrojowego [46]. PODSUMOWANIE Płyn pęcherzykowy stanowi bezpośrednie środowisko rozwijającego się oocytu, dlatego ustalenie jego składu stwarza dobre narzędzie dla oceny jakości oocytu, jego zdolności do zapłodnienia i dla dalszego przebiegu wczesnych etapów ciąży. Poznanie czynników związanych z najwyższą jakością oocytów pozwoli na racjonalizację metod stosowanych w rozrodzie wspomaganym oraz zrozumienie przyczyn wczesnych strat ciąż, występujących po naturalnym zapłodnieniu. Przegląd dostępnego piśmiennictwa dowodzi, iż istnieje konieczność dalszych badań nad składem i rolą płynu pęcherzykowego, które pozwolą poznać nieznane dotychczas mechanizmy odpowiedzialne za niepowodzenia rozrodczości i patologię wczesnego rozwoju zarodka i płodu. 1. Fortune JE. Ovarian follicular growth and development in mammals. Biol Reprod 1994;50:225-232. 2. Rodgers RJ, Irving-Rodgers HF. Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid. Biol Reprod 2010;82:1021-9. 3. Zamah AM, Hassis ME, Albertolle ME, Williams KE. Proteomic analysis of human follicular fluid from fertile women. Clin Proteomics 2015;12:5. 4. McNatty KP, Reader K, Smith P et al. Control of ovarian follicular development to the gonadotrophin-dependent phase: a 2006 perspective. Soc Reprod Fertil Suppl 2007;64:55-68. 5. Revelli A, Piane L, Casano S et al. Follicular fluid content and oocyte quality: from single biochemical markers to metabolomics. Reprod Biol Endocrinol 2009;7:40. 6. Lenton EA, King H, Thomas EJ et al. The endocrine environment of the human oocyte. J Reprod Fertil 1988; 82:827 841. 7. Baskind NE, Orsi NM, Sharma V. Follicular-phase ovarian follicular fluid and plasma cytokine profiling of natural cycle in vitro fertilization patients. Fertil Steril 2014; 102:410-8. 8. Laufer N, Botero-Ruiz W, DeCherney AH et al. Gonadotropin and prolactin levels in follicular fluid of human ova successfully fertilized in vitro. J Clin Endocrinol Metab 1984;58:430-434. 9. Lee TH, Wu MY, Chen MJ et al. Nitric oxide is associated with poor embryo quality and pregnancy outcome in in vitro fertilization cycles. Fertil Steril 2004;82:126-131. 10. Hiller SG, Reichert LE, Van Hall EV. Control of preovulatory follicular estrogen biosyntesis in human ovary. J Clin Endocr Metab 1981;52:847-856. PIŚMIENNICTWO 92
M. Lemm et al. Płyn pęcherzykowy 11. Lewicka S, Van Hagens C, Hettinger U at al. Cortisol and cortisone in human follicular fluid and serum and the outcome of IVF treatmen. Human Reproduction 2003; 18:1613-1617. 12. Amin M, Simerman A, Cho M et al. 21-Hydroxylasederived steroids in follicles of nonobese women undergoing ovarian stimulation for in vitro fertilization (IVF) positively correlate with lipid content of luteinized granulosa cells (LGCs) as a source of cholesterol for steroid synthesis. J Clin Endocrinol Metab 2014; 99:1299-306. 13. Kim JH, Lee JR, Chang HJ et al. Anti-Müllerian Hormone Levels in the Follicular Fluid of the Preovulatory Follicle: A Predictor for Oocyte Fertilization and Quality of Embryo. J Korean Med Sci 2014;29:1266 1270. 14. Wen X, Tozer AJ, Butler SA et al. Follicular fluid levels of inhibin A, inhibin B, and activin A levels reflect changes in follicle size but are not independent markers of the oocyte s ability to fertilize. Fertil Steril 2006;85:1723 1729. 15. Lau CP, Ledger WL, Groome NP et al. Dimeric inhibins and activin A in human follicular fluid and oocyte-cumulus culture medium. Hum Reprod 1999;14:2525 2530. 16. Wu YT, Tang L, Cai J et al. High bone morphogenetic protein-15 level in follicular fluid is associated with high quality oocyte and subsequent embryonic development. Hum Reprod 2007;22:1526 1531. 17. Adashi EY, Thorner MO, Jaffe RB. The somatotrophic axis and the reproductive process in health and disease. Fertil Steril 1994; 61:1014-5. 18. de Boer JA, Schoemaker J, van der Veen EA. Impaired reproductive function in women treated for growth hormone deficiency during childhood. Clin Endocrinol (Oxf) 1997;46:681-9. 19. Klinger B, Anin S, Silbergeld A et al. Development of hyperandrogenism during treatment with insulin-like growth factor-i (IGF-I) in female patients with Laron syndrome. Clin Endocrinol (Oxf) 1998 Jan;48(1):81-7. 20. Vendola K, Zhou J, Wang J et al. Androgens promote oocyte insulin-like growth factor I expression and initiation of follicle development in the primate ovary. Biol Reprod 1999; 61:353-7. 21. Zhou R, Yu SM, Ge W. Expression and functional characterization of intrafollicular GH-IGF system in the zebrafish ovary. Gen Comp Endocrinol 2015 pii: S0016-6480: 30033-2. 22. Spicer LJ, Chamberlain CS, Maciel SM. Influence of gonadotropins on insulin- and insulin-like growth factor- I (IGF-I)-induced steroid production by bovine granulosa cells. Domest Anim Endocrinol 2002;22:237-54. 23. Giudice LC. Insulin-like growth factor family in Graafian follicle development and function. J Soc Gynecol Investig 2001;8 (1 Suppl Proceedings):26-9. 24. Magoffin DA, Weitsman SR. Insulin-like growth factor- I regulation of luteinizing hormone (LH) receptor messenger ribonucleic acid expression and LH-stimulated signal transduction in rat ovarian theca-interstitial cells. Biol Reprod 1994; 51:766-75. 25. Monget P, Mazerbourg S, Delpuech T et al. Pregnancy-associated plasma protein-a is involved in insulinlike growth factor binding protein-2 (IGFBP-2) proteolytic degradation in bovine and porcine preovulatory follicles: identification of cleavage site and characterization of IGFBP-2 degradation. Biol Reprod 2003;68(1):77-86. 26. Wang TH, Chang CL, Wu HM et al. Insulin-like growth factor-ii (IGF-II), IGF-binding protein-3 (IGFBP-3), and IGFBP-4 in follicular fluid are associated with oocyte maturation and embryo development. Fertil Steril 2006;86:1392 1401. 27. Mazerbourg S, Overgaard MT, Oxvig C et al. Pregnancy-associated plasma protein-a (PAPP-A) in ovine, bovine, porcine, and equine ovarian follicles: involvement in IGF binding protein-4 proteolytic degradation and mrna expression during follicular development. Endocrinology 2001;142(12):5243-53. 28. Rivera GM, Fortune JE. Selection of the dominant follicle and insulin-like growth factor (IGF)-binding proteins: evidence that pregnancy-associated plasma protein A contributes to proteolysis of IGF-binding protein 5 in bovine follicular fluid. Endocrinology 2003; 144(2):437-46. 29. Asimakopoulos B, Abu-Hassan D, Metzen E et al. The levels of steroid hormones and cytokines in individual follicles are not associated with the fertilization outcome after intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril 2008;90:60 64. 30. Bili H, Tarlatzis BC, Daniilidis M et al. Cytokines in the human ovary: presence in follicular fluid and correlation with leukotriene B4. J Assist Reprod Genet 1998;15:93 98. 31. Hammadeh ME, Fischer-Hammadeh C, Hoffmeister H et al. Fibroblast growth factor (FGF), intracellular adhesion molecule (sicam-1) level in serum and follicular fluid of infertile women with polycystic ovarian syndrome, endometriosis and tubal damage, and their effect on ICSI outcome. Am J Reprod Immunol 2003;50:124-30. 32. Paszkowski T, Traub AI, Robinson SY, McMaster D. Selenium dependent glutathione peroxidase activity in human follicular fluid. Clin Chim Acta 1995,236:173-180. 33. Pasqualotto EB, Agarwal A, Sharma RK et al. Effect of oxidative stress in follicular fluid on the outcome of assisted reproductive procedures. Fertil Steril 2004, 81: 973-976. 34. Manau D, Balasch J, Jiménez W et al. Follicular fluid concentrations of adrenomedullin, vascular endothelial growth factor and nitric oxide in IVF cycles: relationship to ovarian response. Hum Reprod 2000,15:1295-1299. 35. Onalan G, Selam B, Onalan R et al. Serum and follicular fluid levels of soluble Fas and soluble Fas ligand in IVF cycles. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2006; 125: 85-91. 36. José de los Santos M, Anderson DJ, Racowsky C, Hill JA. Presence of Fas-Fas ligand system and Bcl-2 gene products in cells and fluids from gonadotropin-stimulated human ovaries. Biol Reprod 2000, 63:1811-1816. 37. Schweigert FJ, Gericke B, Wolfram W et al.. Peptide and protein profiles in serum and follicular fluid of women undergoing IVF. Hum Reprod 2006,21:2960-2968. 38. Ohta N, Saito H, Kaneko T et al. Soluble CD44 in human ovarian follicular fluid. J Assist Reprod Genet 2001,18:21-25. 39. De Placido G, Alviggi C, Clarizia R et al. Intra-follicular leptin concentration as a predictive factor for in vitro oocyte fertilization in assisted reproductive techniques. J Endocrinol Invest 2006;29:719-726. 40. Sudik R, Chari S, Pascher E, Sturm G. Human follicular fluid levels of endothelins in relation to oocyte maturity status. Exp Clin Endocrinol Diabetes 1996;104:78-84. 41. Channing CP, Liu CQ, Jones GS, Jones H. Decline of follicular oocyte maturation inhibitor coincident with maturation and achievement of fertilizability of oocytes recovered at midcycle of gonadotropin-treated women. Proc Nat Acad Sci USA 1983; 80:4184-4188. 42. Sinclair KD, Lunn LA, Kwong WY et al. Amino acid and fatty acid composition of follicular fluid as predictors of in-vitro embryo development. Reprod Biomed Online 2008;16:859-868. 43. Saito H, Kaneko T, Takahashi T et al. Hyaluronan in follicular fluids and fertilization of oocytes. Fertil Steril 2000; 74:1148-1152. 44. Babayan A, Neuer A, Dieterle S et al. Hyaluronan in follicular fluid and embryo implantation following in vitro fertilization and embryo transfer. J Assist Reprod Genet 2008;25:473 476. 45. Tony TY Chiu, Rogers MS, Eric LK et al. Follicular fluid and serum concentrations of myo-inositol in patients undergoing IVF: relationship with oocyte quality Hum Reprod 2002;17:1591-1596. 46. Ciotta L, Stracquadanio M, Pagano I et al. Effects of myo-inositol supplementation on oocyte s quality in PCOS patients: a double blind trial. Eur Rev Med Pharmacol Sci 2011;15: 509-14. 93