Węgorz, rozród w warunkach kontrolowanych - poradnik hodowcy Autorzy: Dariusz Kucharczyk Joanna Nowosad Recenzja: prof. dr hab. inż. Roman Kujawa Projekt okładki: Szymon Czarnowski Fotografie na okładce Roman J. Kujawa ISBN: 978-83-63503-56-7 Pozycja powstała w ramach projektu Innowacje w akwakulturze ryb ze szczególnym uwzględnieniem biotechniki rozrodu ryb Program Operacyjny RYBY 2007-2013 (OR14-61724-OR1400003/09/10/11). Korekta: Agnieszka Szamreta Skład: Sławomir Karetko Druk i oprawa: Białystok, ul. Zwycięstwa 10 tel. 85 653-78-04 e-mail: biuro@partnerpoligrafia.pl
Spis treści INFORMACJE O GATUNKU.... 4 CYKL ŻYCIOWY.... 7 WĘDRÓWKI TARŁOWE.... 9 DYMORFIZM PŁCIOWY.... 11 POZYSKIWANIE RYB.... 14 TRANSPORT RYB................................................. 15 PRZETRZYMYWANIE TARLAKÓW.... 17 Warunki środowiskowe.... 17 Temperatura wody.... 18 Zasolenie... 19 Światło/fotoperiod.... 20 Agresywne zachowanie węgorzy w niewoli.... 21 ANESTEZJA... 22 ROZRÓD W WARUNKACH KONTROLOWANYCH.... 23 Zachowanie godowe.... 23 Iniekcje hormonalne.... 23 Ilość iniekcji... 25 Środki hormonalne... 25 ZABIEGI LECZNICZE.... 27 Antybiotyki.... 27 WYWOŁYWANIE OWULACJI I SPERMACJI.... 28 Tarło... 29 Zapłodnienie.... 31 Inkubacja ikry.... 34 Rozwój embrionalny.... 35 NOTATKI.... 37 LITERATURA.... 39 3
INFORMACJE O GATUNKU Węgorz europejski, Anguilla anguilla L., jest jednym z najmniej poznanych gatunków ryb. Wciąż wiele aspektów jego życia, poczynając od biologii i migracji, a kończąc na biotechnologii rozrodu i podchowu larw, pozostaje niewyjaśnionych (Dekker 2003; van Ginneken i Maes 2005, Nowosad i in. 2014b). Gatunek ten cieszy się nie tylko zainteresowaniem wśród naukowców, lecz także jest bardzo ważny pod względem gospodarczym, ekonomicznym, rekreacyjnym i akwakulturowym (Ide i in. 2011). Węgorz jest gatunkiem euryhalinowym, szeroko rozpowszechnionym w Europie. Obszar jego dystrybucji sięga od subarktycznego środowiska na Półwyspie Kola (północny zachód Rosji) i Przylądka Północnego (Norwegia) w Europie północnej, do południowych wybrzeży Maroka, basenu Morza Śródziemnego i wschodnich wybrzeży Morza Czarnego. Rys. 1. Występowanie węgorza europejskiego, Anguilla anguilla (za Roland 2013) Populacja węgorza europejskiego (Anguilla anguilla) w ciągu czterech ostatnich dekad uległa dramatycznemu spadkowi. Szacuje się, iż liczebność tego gatunku stanowi obecnie zaledwie 1% jego zasobów z 1970 roku (Dekker 2003; Bevacqua i in. 2011). Obecnie gatunek ten znajduje się poza biologicznymi granicami bezpieczeństwa, w związku z czym od czerwca 2007 roku został objęty ochroną wynikającą z konwencji waszyngtońskiej i wpisano go do Czerwonej Księgi gatunków zagrożonych w całej Europie (CITES 2007; Belpaire i in. 2009; Prigge i in. 2012). 4
Status prawny, zagrożenie węgorza europejskiego Konwencja o Międzynarodowym Handlu 1. Prawo międzynarodowe Dzikimi Zwierzętami i Roślinami Gatunków Zagrożonych Wyginięciem (2007) CITES 2. Wymiar ochronny (wody słodkie i morskie) 50 cm 3. Okres ochronny 15.VI 15.VII 4. Limit połowu 2 sztuki na dobę 5. Czerwona lista (CKGZ*) CR (krytycznie zagrożony) * Czerwona Księga Gatunków Zagrożonych W Polsce, zgodnie z rozporządzeniem Rady Europy nr 1100/2007, zaczęto wdrażać Plan gospodarowania zasobami węgorza w Polsce (PGZWP). Według Rozporządzenia Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 11.06.2010 r. wprowadzono limit połowu węgorza do dwóch sztuk w ciągu doby, ustanowiono jego wymiar ochronny na 50 cm oraz wprowadzono zakaz połowów w okresie od 15 czerwca do 15 lipca. Od stycznia 2013 r. wszedł w życie przepis określający minimalną wielkość oczek sieci rybackich służących do połowu węgorza na 2 cm (Sieński 2011). Tak drastyczne zmiany w populacji węgorza tłumaczy się m.in.: nadmierną eksploatacją tego gatunku, pogarszającym się stanem środowiska, zmianami klimatycznymi czy występowaniem w pęcherzu pławnym pasożytniczego nicienia Anguillicoloides crassus (Freidland i in. 2007; Belpaire i in. 2009; Clevestam i in. 2011). Palstra i in. (2007) oszacowali, że wydatek energetyczny u ryb zapasożyconych przez Anguillicoloides crassus wzrasta nawet o mniej więcej 20%. Jest to o tyle UWAGA! Krew węgorzy zawiera niebezpieczną truciznę: ichtiotoksynę, która w kontakcie z krwią ssaków powoduje rozpad ich erytrocytów, zaburzenia czynności pracy serca i płuc, zmniejszenie krzepliwości krwi, skurcze mięśni (podobny efekt jak po wniknięciu jadu żmii!). Toksyna ta traci swoje niebezpieczne właściwości w temperaturze ok. 60 o C. istotne, iż badania nad wędrówką tarłową węgorza europejskiego wykazały, że ryby te nie płyną najkrótszą drogą na tarliska, ale najpierw w stronę zachodnich wybrzeży Afryki, a potem dopiero kierują się w stronę Morza Sargassowego (Aarestrup i in. 2009). By ratować węgorza europejskiego przed całkowitym wyginięciem, prowadzone są zarówno intensywne prace badawcze związane z opracowaniem techniki sztucznego rozrodu tego gatunku (Palstra i in. 2005; Nowosad i in. 2014a, 2014b), jak i intensywne akcje zarybieniowe mające na celu zwiększenie jego liczebności w wodach Europy (Vogel 2010). Również w Polsce takie akcje są prowadzone na szeroką skalę. 5
CYKL ŻYCIOWY Węgorz jest gatunkiem o interesującej historii życia większość czasu spędza w europejskich wodach słodkich, lecz na tarło wędruje w rejony Morza Sargassowego, pokonując przy tym tysiące kilometrów. W czasie procesu dojrzewania w ciele węgorza zachodzi szereg intensywnych zmian fizjologicznych i morfologicznych (van Ginneken i in. 2005a; Clevestam i in. 2011; Nowosad i in. 2014b). Mimo iż węgorz europejski jest często uważany za wielkiego oportunistę troficznego (Prigge i in. 2012), to w czasie migracji nie pobiera pokarmu, a energię na pokonanie odległości na tarliska (wędrówkę) i na budowę (dojrzewanie) gonad czerpie, jak zakładano, z zasobów tłuszczów skumulowanych w swoim ciele (Clevestam i in. 2011). Ostatnie badania wskazują jednak, że w trakcie dojrzewania gamet węgorze głównie korzystają z energii zawartej w mięśniach do wędrówki w znacznie większym stopniu niż z tłuszczu, który z kolei jest wbudowywany głównie w gonady (Nowosad i in. 2014b). W czasie migracji następuje prawidłowe dojrzewanie płciowe witellogeneza i rozwój jajników wywołane przez czynniki środowiskowe (Duriff i in. 2006). Obserwowane w ostatnim okresie zmniejszające się pokłady tkanki tłuszczowej wśród młodocianych osobników z wód śródlądowych, a także tych rozpoczynających wędrówkę tarłową mogą mieć swoje konsekwencje dla dorosłych osobników, uniemożliwiając tym samym samicom w stadium srebrnym docieranie do tarlisk i prawidłowe dojrzewanie ich gamet. W niektórych sytuacjach zgromadzonej energii może nawet nie wystarczyć na dopłynięcie na tarliska (Clevestam i in. 2011), co dodatkowo pogarsza i tak trudną sytuację tego gatunku. Węgorz należy do ryb katadromicznych, większość życia spędza w wodach słodkich, zaś na tarło wędruje w okolice Morza Sargassowego, pokonując tysiące kilometrów (Durif i in. 2005; van Ginneken i Maes 2005; Clevestam i in. 2011; Burgerhout i in. 2013). W wyniku zmian zachodzących w związku z przygotowaniem się do tarła, a tym samym do zmiany środowiska słodkowodnego na słonowodne, węgorze przechodzą metamorfozę (tzw. proces srebrzenia ), podczas której następuje szereg zmian fizjologicznych i morfologicznych (Durif i in. 2005; Clevestam i in. 2011). Zmiany te dotyczą m.in. barwy i wagi ciała, kształtu głowy czy też powiększania rozmiarów oka. 6
Rys. 2. Cykl życiowy węgorza (za Henkel i in. 2012) Rys. 3. Oko u samca węgorza na początku (A) i na koniec (B) stymulacji hormonalnej. 7
WĘDRÓWKI TARŁOWE Węgorz europejski jest jednym z gatunków, które są podatne na degradację wskutek zmian klimatycznych. Według Bonhommeau i in. (2008) szczególnie ważny jest efekt spadku rekrutacji w populacjach węgorza (nie tylko europejskiego, lecz także Anguilla rostrata i Anguilla japonica) wynikający ze zmian w produkcji pierwotnej oceanów, związanych ze zmianami klimatycznymi (wzrost średnich temperatur wody w obszarach, na których odbywa się tarło). Problemem dla węgorzy mogą stać się także zmiany temperatur wody na północnym Atlantyku oraz możliwe osłabienie Prądu Zatokowego w wyniku topnienia lodowców UWAGA! Tarliska węgorza nie są znane do dnia dzisiejszego. Istnieją dwie teorie dotyczące tarlisk: Morze Sargassowe lub okolice przed Morzem Sargassowym od strony Europy są przypuszczalnymi miejscami tarła. Dotychczas jednak nie złowiono tarlaków węgorza przed tarłem lub tuż po tarle ani nie pozyskano ikry ze środowiska naturalnego. Arktyki. Jednakże, jak opisują to Aarestrup i in. (2009), węgorz europejski w czasie wędrówki na tarliska potrafi korzystać z wody o różnej temperaturze, co związane jest z pionowymi wędrówkami dobowymi, gdy w nocy przebywa w cieplejszej wodzie (średnio około 11,7 C) bliżej powierzchni, natomiast w ciągu dnia schodzi zdecydowanie niżej, gdzie woda jest chłodniejsza (średnio około 10,1 C). Jak wynika z rozważań wyżej cytowanych autorów, korzystanie przez wędrujące węgorze z głębszych, chłodniejszych partii oceanu ma na celu nie tylko zabezpieczenie się przed drapieżnikami, lecz także świadome opóźnienie rozwoju gonad do czasu dopłynięcia w okolice cieplejszych wód w rejonie Morza Sargassowego. 8
Rys. 4. Szlak migracyjny węgorza europejskiego UWAGA! Podczas wędrówek tarłowych węgorze płyną wraz z prądami morskimi w stronę tarlisk. Larwy węgorza płyną do wybrzeży Europy również z prądami morskimi. Tarlaki w ciągu nocy płyną na głębokości 100 150 m, a w dzień nawet na głębokości 700 m. 9
DYMORFIZM PŁCIOWY U węgorza europejskiego występuje wyraźny dymorfizm płciowy. Jest do dobrze widoczne dojrzewające samce węgorza są zdecydowanie mniejsze od samic. Samice mogą osiągać rozmiary ciała do 2 m i masę ciała nawet do 9 kg, a samce uzyskują najczęściej długość 0,4 0,6 m i ciężar 0,06 0,15 kg. Jednocześnie w wodach słodkich bytują tylko samice, podczas gdy samce przebywają w wodach słonawych. Rys. 5. Samica (u góry) i samiec (u dołu) węgorza europejskiego tuż przed tarłem Płeć u węgorza jest rozpoznawana czasami przy użyciu biopsji, choć samice z reguły osiągają znacznie większe rozmiary niż samce. Podczas połowów ryb, które rozpoczęły wędrówkę tarłową, wykazano jednak, że samice zarażone nicieniem Anguillicola crassus są małe i mogą nie różnić się wielkościowo od samców (Clavestam i in. 2011). Jednocześnie ryby z silną inwazją nicienia są słabsze i często sną podczas przetrzymywania w warunkach kontrolowanych. To wszystko powoduje, że próby sztucznego rozrodu węgorza europejskiego kończyły się niską efektywnością oraz wysoką śmiertelnością tarlaków (Pedersen 2003; Palstra i in. 2005; Horvath i in. 2011; Perez i in. 2011). Dlatego, podejmując próbę udoskonalenia sztucznego rozrodu, w pierwszej kolejności należy opracować metodę pozwalającą na przyżyciowe określenie płci ryb, stopnia zapasożycenia oraz wykonywanie biopsji gonad w sposób możliwie jak najmniej inwazyjny. Badając tarlaki węgorza przy użyciu USG, nie stwierdzono różnic w lokalizacji gonad w ciele pomiędzy samcami i samicami. W obu przypadkach gonady ciągną się od głowy poza położenie otworu odbytowego. Jednak znacząca różnica występuje w stanie rozwoju wielkości gonad u ryb rozpoczynających wędrówkę tarłową. U samic indeks gonadosomatyczny (masa gonad * 100 / masa ciała) wynosi od 1,2 do 1,8, podczas gdy u samców zaledwie 0,1. Zatem jajniki są doskonale widoczne zarówno makroskopowo 10
(Rys. 6), jak i w USG (Rys. 7A, B). W przypadku samców gonady są praktycznie niewidoczne w USG, a makroskopowo są grubości włosa (Rys. 9). Ta zależność pozwala na praktycznie bezbłędne określenie płci bez konieczności stosowania bardzo inwazyjnej metody biopsji. Analiza pobranych próbek tkanek z gonad potwierdziła 100-procentową skuteczność oceny płci u węgorza. Nie było także potrzeby stosowania biopsji więcej niż jeden raz w celu pobrania próbek tkanek. Na podstawie analizy za pomocą USG do przeprowadzenia biopsji wytypowano tylny odcinek gonady (tuż przed otworem odbytowym), gdzie miąższość tkanki była największa, a inne organy, takie jak wątroba czy żołądek, były oddalone. Przeprowadzenie w tym miejscu biopsji z użyciem USG jest znacznie bardziej ułatwione aniżeli w innych. Korzystając z podglądu na ekranie, można za pomocą tylko jednego wkłucia wprowadzić igłę biopsyjną dokładnie w gonadę (Rys. 8), a następnie pobrać jej próbkę. Wysoka skuteczność jednorazowego wkłucia może w bardzo istotny sposób zmniejszyć inwazyjność metody określania stopnia dojrzałości gonad (Kucharczyk i in. 2015). Rys. 6. Makroskopowo widoczne gonady na początku dojrzenia (A) i w trakcie stymulacji hormonalnej (B) samca i samicy na początku dojrzewania (C) i tuż przed tarłem (D) 11
Rys. 7. Zdjęcia USG gonad samicy (A), samca (B) Rys. 8. USG gonad węgorza. Na rysunku widać wbitą igłę biobsyjną Rys. 9. Wypreparowywanie gonady samca węgorza 12
POZYSKIWANIE RYB Pozyskiwanie ryb do przeprowadzenia rozrodu powinno odbywać się z uwzględnieniem kilku poniżej opisanych zasad: 1. W przypadku samic należy wybierać osobniki, które już rozpoczęły wędrówkę tarłową. Jedną z oznak dojrzałości, bardzo łatwą do oznaczenia, jest indeks oczny (Nowosad i in. 2014a), który powinien wynosić minimum 7. Samice te powinny mieć wyraźnie (w rzucie z góry) zwężoną, wręcz spiczastą głowę. 2. Samce powinny mieć indeks oczny minimum 10 i najlepiej, gdy są pozyskane z wód naturalnych (przybrzeżnych). Możliwe jest również użycie samców pochodzących z hodowli, jednak przydatność do rozrodu takich ryb jest nieco mniejsza. 3. Ryby obu płci powinny być wolne od pasożytów zewnętrznych i od widocznych uszkodzeń ciała. 4. W wielu przypadkach przed stymulacją dojrzewania gonad, ryby powinny być przetrzymane w niskiej temperaturze wody (poniżej 10 C), co rozpoczyna spontaniczny proces rozwoju gonad. 5. Początkowo (a według niektórych autorów cały czas) samce i samice powinny być stymulowane osobno i przetrzymywane w nieco odmiennych warunkach. Dotyczy to także szybkości osiągania pełnej dojrzałości gonad. 13
TRANSPORT RYB Transport ryb powinien odbywać się w warunkach jak najmniej stresowych. Obecnie tarlaki węgorza są najczęściej przewożone w workach z tlenem. Maksymalne zagęszczenie oblicza się według wzoru: gdzie: M L maksymalne zagęszczenie ryb w [g/dm 3 ] W masa 1 ryby w [g] Maksymalne zagęszczenie podczas transportu dla ryb o masie 100 g wynosi 5 osobników na dm 3 wody, a dla ryb o masie 1000 g 1,5 osobnika w dm 3. Przy innym rodzaju transportu można skorzystać z zapisów tak zwanej normy branżowej BN-73/9147-16, jednak należy pamiętać, że są to tylko wytyczne i obecnie normy branżowe nie są obowiązującym aktem prawnym. Niemniej jednak, szczególnie podczas transportu samców, zestawione poniżej dane dla materiału obsadowego mogą być użyteczne. Tabela 1. Zapotrzebowanie wody w litrach na 1 kg materiału zarybieniowego węgorza przy przewozie w zbiornikach z napowietrzaniem (wg BN-73/9147-16) Rodzaj materiału zarybieniowego węgorza Narybek wstępujący Narybek obsadowy Obsada ryb do 12 godzin powyżej 12 godzin Temperatura wody 2 5 C 6 10 C 11 15 C 2 5 C 6 10 C 11 15 C 200 150 70 140 100 60 400 320 200 300 210 140 Tabela 2. Zapotrzebowanie wody w litrach na 1 kg materiału zarybieniowego węgorza przy przewozie w zbiornikach bez napowietrzania (wg BN-73/9147-16) Rodzaj materiału zarybieniowego węgorza Narybek wstępujący Narybek obsadowy Obsada ryb do 6 godzin do 12 godzin Temperatura wody 2 5 C 6 10 C 11 15 C 2 5 C 6 10 C 11 15 C 50 33 17 40 28 14 60 45 32 47 31 26 14
Tabela 3. Zapotrzebowanie wody w litrach na 1 kg materiału zarybieniowego węgorza przy przewozie w rękawach foliowych (wg BN-73/9147-16) Rodzaj materiału zarybieniowego węgorza Narybek wstępujący Narybek obsadowy Temperatura wody Czas trwania przewozu (godziny) do 12 godzin do 24 godzin Ilość wody i tlenu (litry) woda tlen woda tlen do 5 C 2 2 3 3 6 10 C 3 3 4 4 10 15 C 5 5 7 7 do 5 C 2 2 2,5 2,5 6 10 C 2,5 2,5 3,5 3,5 10 15 C 4 4 5 5 15
PRZETRZYMYWANIE TARLAKÓW Spośród wielu czynników środowiskowych do najważniejszych podczas przetrzymywania węgorza w warunkach kontrolowanych należą temperatura, zasolenie i warunki świetlne. Warunki środowiskowe Wzrost, rozród oraz funkcjonowanie ryb są optymalne w ramach określonych temperatur (Elliot 1981). Każdy gatunek ma ściśle zdefiniowany zakres temperatur optymalnych, w których procesy życiowe przebiegają najefektywniej, a poza którymi ulegają zakłóceniu (mogą działać jako stresor, zaburzając aktywność fizjologiczną i behawioralną), w ekstremalnych przypadkach (temperatury letalne) prowadząc także do śmierci (Fry i in. 1942; Kamler 1992; Kucharczyk i in. 1997, 1998; Kujawa i in. 1997; Kupren i in. 2011). W przypadku węgorza zdefiniowanie optimum temperatur w okresie rozrodu może nie być proste, gdyż gatunek ten oprócz tego, że większość życia spędza w wodach o znacznej rocznej amplitudzie temperatur, to przed tarłem odbywa wielotysięczną wędrówkę i wiele wskazuje na to, iż w jej trakcie wykorzystuje wody o różnych temperaturach (Aarestrup i in. 2009). Mianowicie oprócz pokonywania odległości wędrówkę węgorzy charakteryzuje dobowe przemieszczanie się w pionie pomiędzy wodami o różnej temperaturze. Węgorze nocą przebywają tuż przy powierzchni, w wodach o temperaturze wyższej (około 11,7ºC), a za dnia przemieszczają się w głąb zbiornika, ku warstwie o temperaturze około 10,1ºC, co prawdopodobnie ma na celu opóźnienie tempa rozwoju gonad tak, aby w pełni rozwinęły się dopiero po przybyciu do celu/na miejsce tarła, czyli ciepłych wód Morza Sargassowego. Stymulowanie ryb w warunkach kontrolowanych przy pomocy tak niskich temperatur (aby oddać naturalne warunki panujące podczas wędrówki) wiązałoby się z bardzo długim czasem dochodzenia przez ryby do dojrzałości, co zapewne skutkowałoby wyższymi kosztami manipulacji i przetrzymywania ryb. Ponieważ podczas rozmnażania w warunkach kontrolowanych niejednokrotnie z powodzeniem stosowane są temperatury wyższe niż podczas rozrodu ryb w środowisku naturalnym, przetestowano 3 różne temperatury (wyższe niż określone w literaturze 11,7 C), tak aby określić najkorzystniejszy wariant, który powinien stanowić kompromisowe rozwiązanie pomiędzy bardzo długą stymulacją w niskich temperaturach a najkrótszą w wysokich, mogących negatywnie wpłynąć na jakość pozyskiwanych gamet (przez zakłócenie 16
witellogenezy, finalnego dojrzewania gamet, owulacji). Dotychczas podczas procesu dojrzewania samic węgorza stosowano temperatury w przedziale około 20 C (Pedersen 2003, 2004; Palstra i in. 2005; van Ginneken i in. 2005), podobnie jak w przypadku węgorza japońskiego (Ohta i in. 1995; Kagawa i in. 2003; Abe i in. 2010). Badania przeprowadzone przez Perez i in. (2011), Mordenti i in. (2013) oraz Nowosad i in. (2014) sugerują, że przynajmniej w początkowym okresie stymulacji dojrzałości samic powinno się stosować odmienny protokół termiczny. Temperatura wody Temperatura to jeden z czynników środowiskowych mających znaczący wpływ na proces dojrzewania wielu ryb. W przeprowadzonych badaniach wykazano, że w przypadku węgorza najbardziej odpowiednią temperaturą wody spośród testowanych 15, 18 i 21 C jest temperatura 15 C. Rozwój gonad w tej temperaturze przebiega stosunkowo szybko, jednak na tyle wolno, że oszczędza energię na ich rozwój. Potwierdzono silny wpływ temperatury na proces dojrzewania gamet żeńskich węgorza europejskiego. Pomimo iż najszybciej dojrzewały samice, które przetrzymywano w temperaturze 21ºC, to jednak obraz pozyskanych od nich gamet wskazywał, iż proces dojrzewania w wodzie o tej temperaturze był zbyt szybki pozyskane oocyty o bardzo dużej średnicy (przekraczającej 2 mm) były wyraźnie przejrzałe. Pojedyncze samice oddawały spontanicznie niewielkie ilości ikry o bardzo dużej niejednokrotnie średnicy, jakby napęczniałe. W trakcie eksperymentu obserwowano spadek masy ciała ryb z grupy kontrolnej. Zależał on od temperatury i był wprost proporcjonalny do zwiększania się tempa metabolizmu przebiegał najszybciej w temperaturze 21ºC i w grupie tej samice na koniec eksperymentu (po 25 tygodniach) straciły około 15% wyjściowej masy ciała. Spadek ten był wyraźnie wolniejszy w grupie ryb przetrzymywanych w 15ºC w tym samym czasie samice straciły trochę powyżej 5% wyjściowej masy ciała. Z kolei tempo przyrostu masy ciała samic stymulowanych hormonalnie było wprost proporcjonalne do temperatury najszybciej zwiększała się masa samic z grupy przetrzymywanej w 21ºC, jednakże masa osiągnięta przez ryby z tej grupy na koniec eksperymentu była najniższa. Najwolniej przyrastały ryby z grupy przetrzymywanej w wodzie o temperaturze 15ºC, ale finalnie osiągnęły one najwyższy przyrost wagi. Jeśli chodzi o ryby z grupy przetrzymywanej w wodzie o temperaturze wynoszącej 18ºC, to wyniki przyjmowały pośrednie wartości tempo przyrostów było pośrednie i masy osiągnięte po ostatniej iniekcji również przyjęły pośrednią wartość. Należy to wiązać z niższymi wydatkami energetyczny- 17
mi na inne elementy metabolizmu niż budowa gonad w niższych temperaturach. Zaoszczędzona energia może być wydatkowana na budowę gonad, które osiągają większe rozmiary. Różnice w przyrostach masy ciała także wskazują na ich zależność od temperatury. UWAGA! Ponieważ nie są znane tarliska węgorza oraz głębokości, na jakich węgorz się trze, nie wiadomo także, jakie są warunki termiczne podczas tarła. Dlatego optymalne warunki są wyznaczane podczas badań naukowych. Rys. 10. Salimetr Zasolenie Pomimo iż węgorze rozmnażają się w wodzie słonej (morskiej), ze względów ekonomicznych (produkcja sztucznej wody morskiej jest bardzo kosztowna) prowadzono badania nad rozmnażaniem i dojrzewaniem węgorzy w wodzie słodkiej. Pomimo iż szczególnie samce mogą dojrzewać także w wodzie słodkiej, jest to proces znacznie mniej wydajny niż dojrzewanie ryb w wodzie słonej. Po drugie, dość często w środowisku wody słodkiej zdarzają się infekcje, które dziesiątkują stado rozrodcze. Badania własne wskazują, że w porównaniu do wody morskiej w wodzie słodkiej samice węgorza nie tylko wolniej dojrzewają, ale i zewnętrzne oznaki ich dojrzałości i dojrzewania są mniej widoczne (zaawansowane) niż w wodzie morskiej. Dotyczy to zarówno przyrostów masy ciała, jak i na przykład indeksu ocznego (wielkości oka), który jest jednym z wyznaczników postępującego dojrzewania samic (Nowosad i in. 2014a). 18
Światło/fotoperiod W trakcie naturalnej wędrówki tarłowej węgorze płyną w całkowitej ciemności (na głębokości 100 700 m). Dlatego też jest bardzo ważne, aby w trakcie dojrzewania ryb utrzymać podobne warunki świetlne. Z tego też powodu zbiorniki z tarlakami powinny być dodatkowo przykryte, a natężenie oświetlenia nie powinno przekraczać kilku luxów. UWAGA! Węgorz jest wyjątkowym gatunkiem pod względem odporności na zmiany zasolenia. Możliwa jest zmiana warunków zasolenia o 0 do 35 w ciągu jednej doby. Należy pamiętać, że sól morska (składnik wody morskiej) różni się składem od soli kuchennej i kuchennej soli morskiej. Rys. 11. Mierzenie natężenia światła przy pomocą luxomierza Agresywne zachowanie węgorzy w niewoli Tarlaki węgorza, zwłaszcza na początku okresu dojrzewania, wykazują czasami zachowania agresywne. Dotyczy to szczególnie najmniej dojrzałych osobników, na przykład niedojrzałe jeszcze samce atakują inne osobniki. Efektem takiego zachowania są ślady ugryzień na ciałach innych osobników (Rys. 12). Ponieważ takich śladów nie obserwuje się u ryb szybciej dojrze- 19
wających, należy sądzić, że osobniki wolniej dojrzewające wykazują agresję względem siebie. Rys. 12. Samiec węgorza pogryziony przez inne osobniki (strzałki wskazują miejsca ugryzień) 20
ANESTEZJA Wszystkie manipulacje z rybami, tak jak na przykład przeprowadzanie iniekcji hormonalnych, muszą być wykonane w stanie pełnej anestezji (wprowadzenia ryb w stan sedacji). Niestety nie wszystkie anestetyki mogą być zastosowane. Do stosowania u ryb jest dozwolony MS-222. W przypadku węgorza stosuje się dawkę tego anestetyku w ilości 150 300 mg/l wody (Roland 2013). Jednym z zalecanych dla węgorza w badaniach naukowych anestetyków jest propofol (0,65 ml/l). Aby go jednak stosować w praktyce, należy mieć pozwolenie lekarza weterynarii. Większość stosowanych w akwakulturze anestetyków działa na węgorza wyjątkowo drażniąco, nawet do tego stopnia, że ryby próbują wyskoczyć ze zbiornika z anestetykiem. Preparaty zawierające anestetyki stosowane u ryb nie są zarejestrowane na terenie Unii Europejskiej, jednak zawarte w nich substancje czynne nie są zabronione do stosowania u zwierząt, a stosuje się je w medycynie ludzkiej w przypadku człowieka lub weterynaryjnej w przypadku zwierząt hodowlanych. W związku z powyższym mogą być one wykorzystywane w akwakulturze pod kontrolą i nadzorem lekarza weterynarii. Ponieważ w akwakulturze anestetyki najczęściej stosuje się u tarlaków, które nie są przeznaczone do konsumpcji dla ludzi, problemem nie jest okres karencji po ich zastosowaniu. W karcie stosowania konkretnego preparatu powinien jednak widnieć wpis dotyczący długości okresu karencji. U zwierząt stałocieplnych taki okres wynosi maksymalnie 28 dni. U ryb, tj. organizmów zmiennocieplnych, jest on zależny od temperatury im niższa temperatura wody, tym dłuższy okres karencji. 21
ROZRÓD W WARUNKACH KONTROLOWANYCH Zachowanie godowe W okresie godowym samce wykazują zainteresowanie samicami. Pływają za nimi i niejednokrotnie oplatają samice swoim ciałem (Rys. 13). Iniekcje hormonalne Iniekcji należy dokonywać dootrzewnowo. W przypadku iniekcji domięśniowych w miejscach dokonywania zastrzyków bardzo często pojawiają się lokalnie stany Rys. 13. Rytuał godowy tarlaków węgorzy zapalne, które mogą doprowadzić nawet do śmierci tarlaków. Wówczas przydatność chorych i osłabionych ryb do rozrodu jest bardzo niska. Iniekcje dootrzewnowe najlepiej jest przeprowadzać w niewielkiej odległości od otworu odbytowego (Rys. 14). Igłę należy wprowadzić na głębokość około 7 mm w głąb jamy ciała i wstrzyknąć odmierzoną ilość środka hormonalnego. Rys. 14. Podawanie iniekcji hormonalnej samcowi (A) i samicy (B) węgorza 22
W celu przeprowadzenia iniekcji należy: Wprowadzić tarlaki w stan anestezji Zważyć rybę UWAGA: całą procedurę należy wykonać w półmroku Położyć rybę na stole manipulacyjnym na wilgotnym podłożu (np. ręczniku tetrowym) Jeżeli ryba jest znakowana, należy odczytać jej numer znaczka PIT Przełożyć rybę na powrót do basenu Wykonać iniekcję dootrzewnową Przełożyć delikatnie rybę do odpijalnika Ewentualnie wykonać kąpiel antybiotykową 23
Ilość iniekcji By wywołać dojrzewanie gonad, aż do finalnego dojrzewania gamet należy przeprowadzić szereg iniekcji. W zależności od płci, temperatury wody i początkowej dojrzałości ryb, ilość planowych iniekcji powinna wynieść od 7 do 15 w przypadku samców i od 15 do 30 w przypadku samic. Okres pomiędzy iniekcjami powinien wynosić od 3 do 7 dni. Środki hormonalne Nie jest możliwe przeprowadzenie stymulacji dojrzewania tarlaków węgorza bez zastosowania stymulacji hormonalnej. Dotychczas opracowane technologie stymulacji węgorzy w warunkach kontrolowanych przewidują dwa osobne protokoły dla samców i samic. Podczas stymulacji samców stosuje się najczęściej preparaty zawierające jako aktywny biologicznie składnik ludzką gonadotropinę kosmówkową (hcg). Zalecane jednorazowe dawki to 1000 2000 IU na kg masy ciała. Również inne preparaty, zawierające jako aktywny biologicznie składnik mieszaninę FSH + LH (zawarte np. w homogenacie lub ekstrakcie z przysadek mózgowych) lub analog GnRH i inhibitor dopaminy (zawarty np. w preparacie Ovopel) powodują dojrzewanie samców, jednak znacznie wolniejsze niż po zastosowaniu hcg. Stymulację samic wykonuje się z użyciem mieszaniny FSH + LH (zawartej np. w homogenacie lub ekstrakcie z przysadek mózgowych karpia lub łososia), czasami ze wspomaganiem w postaci użycia ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hcg). Pojedyncza dawka przysadki mózgowej dla samic wynosi od 15 do ponad 40 mg w przeliczenia na kg aktualnej masy ciała tarlaka. Na terenie Unii Europejskiej nie ma zarejestrowanych (podobnie jak w przypadku anestetyków) preparatów hormonalnych lub niehormonalnych stosowanych w rozrodzie ryb do wywoływania owulacji i spermiacji. Jednak wiele informacji na temat możliwości stosowania takich preparatów zawierają zapisy rozporządzenia Komisji (UE) nr 37/2010 z dnia 22 grudnia 2009 r. (Dz.U.UE.L.10.15.1). Zapisano w nich, że dozwolone jest stosowanie następujących substancji czynnych: 24
Substancja czynna Gonadotropina ludzka kosmówkowa (naturalny HCG i jego syntetyczne odpowiedniki) Hormon folikulostymulina (naturalny FSH pozyskiwany ze wszystkich gatunków i jego syntetyczne odpowiedniki) Hormon luteinizujący (naturalny LH pozyskiwany ze wszystkich gatunków i jego syntetyczne odpowiedniki) Hormon uwalniający gonadotropinę Przykładowe preparaty, które je zawierają hch, Pregnyl Przysadka mózgowa karpia, amura, jesiotra, łososia, leszcza itd. Przysadka mózgowa karpia, amura, jesiotra, łososia, leszcza itd. Ovoplant, Ova- -RH, Ovopel*, Ovaprim* Gatunki zwierząt, u których można je stosować Wszystkie gatunki zwierząt, od których lub z których pozyskuje się żywność Wszystkie gatunki zwierząt, od których lub z których pozyskuje się żywność Wszystkie gatunki zwierząt, od których lub z których pozyskuje się żywność Wszystkie gatunki zwierząt, od których lub z których pozyskuje się żywność Inne przepisy (na podstawie art. 14 ust. 7 rozporządzenia (WE) nr 470/2009 Brak wpisu Brak wpisu Brak wpisu Brak wpisu * Preparaty zawierają także inhibitory dopaminy stosowane w medycynie ludzkiej lub weterynaryjnej. W związku z powyższym mogą być one stosowane w akwakulturze pod kontrolą i nadzorem lekarza weterynarii. 25
ZABIEGI LECZNICZE Antybiotyki Bardzo długie przetrzymywanie ryb w niewoli oraz wielokrotne manipulacje (okresowe usypianie ryb oraz iniekcje dootrzewnowe) sprzyjają rozwojowi infekcji, szczególnie bakteryjnych. Dotyczy to przetrzymywania ryb zarówno w wodzie słodkiej, jak i morskiej. W obu środowiskach stwierdzono występowanie wielu rodzajów bakterii, w tym potencjalnie patogennych (Korzekwa i in. 2015). W miejscu iniekcji oraz wcześniejszych uszkodzeń ciała mogą się rozwijać infekcje bakteryjne (Rys. 15). W celu zapobieżenia infekcjom lub też leczenia ryb należy stosować kuracje antybiotykowe prowadzone pod kontrolą i zgodnie z zaleceniami lekarza weterynarii. Rys. 15. Infekcje bakteryjne u węgorza 26
WYWOŁYWANIE OWULACJI I SPERMACJI U samców finalnej spermacji nie wywołuje się przez jakieś specjalne działania. Najlepiej jest pobrać nasienie w 24 godziny po kolejnej standardowej iniekcji. U samic owulację wywołuje się najczęściej przez podanie iniekcji z DHP (17α,20β-Dihydroxy-4-pregnen-3-one) poprzedzonej dodatkową iniekcją z CPH. Moment rozpoczęcia wywołania owulacji jest trudny do określenia. Przez wiele lat proponowano, aby próbkę oocytów pobrać przy pomocy biopsji. Metoda jest jednak bardzo inwazyjna i bardzo często powoduje powstanie krwiaka w jajniku. Znacznie bardziej polecaną metodą jest pobranie próbki oocytów przy pomocy cewnika (Rys. 16). Następnie należy określić dojrzałość oocytów. Do dzisiaj metoda oceny jakości oocytów węgorza nie została opracowana, zaleca się jednak, aby średnica oocytów wynosiła powyżej 0,75 mm, krople tłuszczu były w trakcie koagulacji, a jądro w trakcie migracji. W celu określenia wielkości i zaawansowania w rozwoju oocytów węgorza należy: wprowadzić tarlaka węgorza w stan sedacji; zważyć rybę i ewentualnie określić jej numer znaczka PIT; położyć rybę na stole manipulacyjnym na wilgotnym podłożu (np. na ręczniku tetrowym); wprowadzić podłączony do strzykawki kateter na głębokość nie większą niż 5 7cm; odciągnąć tłoczek strzykawki i zassać niewielką próbkę oocytów, (około 50 100 szt.), przełożyć delikatnie rybę do odpijalnika; wykonać w razie potrzeby kąpiel antybiotykową; przełożyć rybę na powrót do basenu; jeśli samica posiada oocyty w stadium dojrzałości umożliwiającym wywołanie finalnego dojrzewania gamet, przygotować roztwór DHP; po otworzeniu fiolki z DHP (10 mg) wlać do niej 3 ml alkoholu etylowego o stężeniu minimum 70%; następnie dodać 2 ml płynu fizjologicznego; tak przygotowaną miksturę w ilości 1 cm 3 na 1 kg masy ciała samicy (dawka DHP 2 mg/kg) wstrzyknąć w minimum 8 10 różnych miejsc w jajniki (podczas manipulacji i iniekcji ryba musi być w sedacji); przełożyć delikatnie rybę do odpijalnika; przełożyć rybę na powrót do basenu. Ważne: DHP przed sporządzeniem roztworu musi być przetrzymywane w zamrażarce. 27
Rys. 16. Pobranie próbki oocytów węgorza przy pomocy cewnika Pozyskaną próbkę ikry należy obejrzeć pod lupą (mikroskopem), aby określić jej stopień zaawansowania w rozwoju. Najwyższą jakość mają oocyty z jedną kulą tłuszczu. Tarło W 16 24 godziny po podaniu DHP należy sprawdzić, czy wystąpiła już owulacja: wprowadzić tarlaka węgorza w stan sedacji; zważyć rybę i ewentualnie określić jej numer znaczka PIT; położyć rybę na stole manipulacyjnym na wilgotnym podłożu (np. na ręczniku tetrowym); osuszyć powłoki brzuszne zwilżonym (wilgotnym) ręcznikiem tetrowym; delikatnie nacisnąć okolice otworu płciowego, by sprawdzić, czy ikra wypływa na zewnątrz; jeśli tak, należy pobrać delikatnie oocyty do suchego naczynia; po pobraniu oocytów należy naczynie z ikrą szczelnie przykryć; przełożyć delikatnie rybę do odpijalnika; wykonać ewentualnie kąpiel antybiotykową; przełożyć rybę na powrót do basenu. 28
Próbkę ikry należy umieścić pod lupą. Ikra powinna zawierać jedną kulę tłuszczu widoczną wewnątrz oocytu (Rys. 17). Jeśli liczba kul tłuszczu jest większa, można przypuszczać, że jakość ikry jest obniżona. Następnie należy dodać niewielką ilość wody morskiej i ponownie je obejrzeć po około 5 minutach. Jeśli oocyty pływają (na powierzchni lub w toni wodnej), oznacza to, że są one dobrej jakości. Jeśli opadły na dno, to ikry nie należy poddawać procedurze zaplemnienia. Rys. 17. Oocyty węgorza Gdy ikra będzie dobrej jakości, można pobrać nasienie od samców. W tym celu należy: wprowadzić tarlaka węgorza w stan sedacji; zważyć rybę i ewentualnie określić jej numer znaczka PIT; położyć rybę na stole manipulacyjnym na wilgotnym podłożu (np. na ręczniku tetrowym); osuszyć powłoki brzuszne zwilżonym (wilgotnym) ręcznikiem tetrowym; delikatnie nacisnąć okolice otworu płciowego, by sprawdzić, czy nasienie wypływa; jeśli tak, należy pobrać delikatnie nasienie do strzykawek; przełożyć delikatnie rybę do odpijalnika; 29
wykonać ewentualnie kąpiel antybiotykową; przełożyć rybę na powrót do basenu. Ważne: ikra węgorza bardzo łatwo wypływa z jamy ciała. Gonady węgorza ciągną się poza otwór odbytowy, dlatego należy masować powłoki brzuszne zarówno od głowy w kierunku odbytu, jak i od ogona w stronę odbytu. Rys. 18. Pobieranie nasienia od węgorza Zapłodnienie Do pozyskanej ikry należy dodać nasienie. Po delikatnym wymieszaniu gamet trzeba wykonać proces ich aktywacji. Proces ten można wykonać na dwa sposoby. W pierwszym do mieszaniny gamet dodaje się wodę morską o temperaturze, w jakiej ma być inkubowana. Ilość wody powinna być minimum 2 do 4 razy większa niż objętość mieszaniny gamet. Po kilkukrotnym wymieszaniu gamet należy odstawić zaplemnioną ikrę na kilkanaście minut. W tym czasie ikra dobrej jakości utrzymuje się na powierzchni wody lub w toni wodnej. Ikra złej jakości opada na dno i nie powinna być przenoszona do dalszej inkubacji. W drugiej metodzie (zalecanej) niewielkie ilości mieszaniny gamet przekłada się do pojemników z wodą morską. Tam następuje delikatne mieszanie. Następnie czynności należy powtórzyć aż do całkowitego zaplemnienia całej porcji ikry. 30
Rys. 19. Samica węgorza przed pobraniem ikry, z wyraźnie widoczną brodawką płciową Rys. 20. Cieknąca samica węgorza po owulacji 31
Rys. 21. Pobór ikry Rys. 21. Zapłodnienie ikry węgorza 32
Inkubacja ikry Ikra węgorza jest pelagiczna w czasie inkubacji utrzymuje się w toni wodnej lub na jej powierzchni. Przepływ wody musi być tak ustalony, by ikra delikatnie cały czas krążyła w aparacie inkubacyjnym. W trakcie inkubacji ikra z rozwijającymi się zarodkami staje się coraz cięższa. Należy mieć to na uwadze i tak regulować wielkość przepływu, by ikra cały czas utrzymywała się w toni wodnej. Tradycyjne aparaty inkubacyjne używane do inkubacji ikry ryb słodkowodnych nie nadają się do inkubacji ikry węgorza. Rys. 22. Inkubacja ikry węgorza w eksperymentalnym aparacie 33
Rys. 23. Ikra węgorza w trakcie inkubacji Rozwój embrionalny Po zapłodnieniu ikra węgorza rozwija się. Początkowo widoczne są pierwsze podziały, później blastula wielko- i drobnokomórkowa, zaczyna się tworzyć zarodek. Poniżej przedstawiamy przykładowe zdjęcia związane z rozwojem embrionalnym węgorza (Rys. 24). Czas i tempo rozwoju embrionalnego są silnie zależne od temperatury wody. Zasadniczo im wyższa temperatura wody, tym rozwój embrionalny trwa krócej, a larwy wykluwają się mniej zaawansowane. 34
Rys. 24. Rozwój embrionalny węgorza i pusta osłonka jajowa po wykluciu 35
NOTATKI 36
37
LITERATURA Aarestrup K., Økland F., Hansen M.M., Righton D., Gargan P., Castonguay M., Bernatchez L., Howey P., Sparholt H., Pedersen M.I., McKinley RS., 2009. Oceanic spawning migration of the European eel (Anguilla anguilla). Science 325 (5948), pp 1660. Abe T., Ijiri S., Adachi S., Yamauchi K., 2010. Development of an in vitro culture system for producting eel larvae from immature ovarian follicles in Japanese eel Anguilla japonica. Fish Sci, 76: 257 265. Belpaire C.G.J., Goemans G., Geeraerts C., Quataert P., Parmentier K., Hagel P., De Boer J., 2009. Decreasing eel stocks: survival of the fattest? Ecol. Freshwater Fish. 18: 197 214. Bevacqua D., Melia P., De Leo G.A., Gatto M., 2011. Intra-specific scaling of natural mortality in fish: the paradigmaticcase of the European eel. Oecologia 165: 333 339. Christie W.W., 1973. The isolation of lipids from tissues. Recommended Procedures. Chloroform-methanol (2:1, v/v) extraction and Folch wash. W: Lipid Analysis. Isolation, separation, identification and structural analysis of lipids. Pergamon Press Oxford New York Toronto Sydney Braunschweig. S: 39 40. CITES, 2007. Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora. Consideration of Proposals for Amendment of Appendices I and II. Fourteenth Meeting of the Conference of the Parties. Netherlands: The Hague, 3 15 June 2007, pp. 39. Clevestam P.D., Ogonowski M., Sjoberg N.B., Wickstrom H., 2011. Too short to spawn? Implications of small body size and swimming distance on successful migration and maturation of the European eel Anguilla anguilla. Journal of Fish Biology. 78: 1073 1089. Dekker W., 2003. On the distribution of the European eel (Anguilla anguilla) and its Wsheries. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences (Can J Fish AquatSci) 60: 787 799. Duriff C., Dufour S., Elie1 P., 2006. Impact of silvering stage, age, body size and condition on reproductive potential of the European eel. Marine Ecology Progress Series. 327: 171 181. Elliott J.M., 1981. Some aspects of thermal stress on freshwater teleosts. In Stress and Fish (ed. A. D. Pickering), pp. 209 245. Academic Press, London. Friedland K.D., Miller M.I., Knights B., 2007. Oceanic changes in the Sargasso Sea and declines in recruitment of the European eel. ICES J. Mar. Sci. 64, 519 530. Fry F.E.J., Brett J.R., Clawson G.H., 1942. Lethal limits of temperature for young goldfish. Rev. Can. Biol. 1, 50 56. Henkel C.V., Burgerhout E., de Wijze D.L., Dirks R. P., Minegishi Y., Jansen H.J., Herman P., Spaink H.P., Dufour S., Weltzien F.A., Tsukamoto K., van den Thillart G.E.E.J. M., 2012. Primitive Duplicate Hox Clusters in the European Eel s Genome. PLoS ONE, 7: e32231. 38
Ide C., De Schepper N., Christiaens J., Van Liefferinge C., Herre A., Goemans G., Meire P., Belpaire C., Geeraerts C., Adriaens D., 2011. Bimodality in head shape in European eel. Journal of Zoology 285: 230 238. Kagawa H., Tanaka H., Unuma T., Ohta H., Gen K., Okuzawa K., 2003. Role of prostaglandin in the control of ovulation in the Japanese eel Anguilla japonica. Fisheries Science, 69: 234 241. Kamler E., 1992. Early Life History of Fish. An Energetics Approach. Chapman & Hall, London. Korzekwa K., Krejszeff S., Palińska-Żarska K., Czarkowski T.K., Żarski D., Nowosad J., Biłas M., Targońska K., Gomułka P, Horváth L., Müller T., Kucharczyk D., 2015. Bacterial infection of European eel (Anguilla aguilla L.) during female artificial maturation under fresh and saltwater conditions. Kucharczyk D., Łuczyński M., Kujawa R., Czerkies P., 1997. Effect of temperature on embryonic and larval development of bream (Abramis brama L.). Aquat Sci 59: 214 221. doi: 10.1007/BF02523274. Kucharczyk D., Łuczyński M., Kujawa R., Kamiński R., Ulikowski D., Brzuzan P., 1998. Influences of temperature and food on early development of bream (Abramis brama L.). Arch. Hydrobiol. 141, 243 256. Kucharczyk D., Müller T., Żarski D., Czarkowski T.K., Nowosad J., Targońska K., Krejszeff S., Palińska-Żarska K., Kupren K., Kwasek K., Biłas M., Kujawa R., Wyszomirska E., Król R., Gomułka P., Kowalski R.K., Ciesielski S., 2015. Is/ Does the European eel a multi-batch-spawner? (w przygotowaniu). Kujawa R., Kucharczyk D., Mamcarz A., 1997. Effect of temperature on embryonic development of asp (Aspius aspius L.). Pol. Arch. Hydrobiol. 44, 139 143. Kupren K., Mamcarz A., Kucharczyk D., 2011. Effect of variable and constant thermal conditions on embryonic and early larval development of fish from the genus Leuciscus (Cyprinidae, Teleostei). Czech J. Anim. Sci. 56, 70 80. Mordenti O., Biase A.D., Bastone G., Sirri R., Zaccaroni A., Parmeggiani, A., 2013. Controlled reproduction in the wild European eel (Anguilla anguilla): Two populations compared. Aquacul. Internat. 21: 1045 1063. Nowosad J., Kucharczyk D., Czarkowski T.K., Kwasek K., 2014a. Changes in body weight and eye size in female European eel kept in fresh and salt. Italian Journal of Animal Science; 13: 382 386. Nowosad J., Kucharczyk D., Łuczyńska J., Targońska K., Czarkowski T.K., Biłas M., Krejszeff S., Horvath L., Muller T., 2014b. Changes in European eel ovary development and body and ovary chemistry during stimulated maturation under controlled conditions: preliminary data. Aquacul. Int., DOI 10.1007/ s10499-014-9794-2 (on-line). Norma branżowa. BN-73/9147-16. 1973. Ryby słodkowodne. Przewóz i magazynowanie materiału zarybieniowego węgorza. Wydawnictwa Normalizacyjne, Warszawa. Ohta H., Kagawa H., Tanaka H., Okuzawa K., Hirose K., 1995. Changes in fertilization and hatching rates with time after ovulation induced by 17,20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one in Japanese eel, Anguilla japonica. Aquaculture, 139: 291 301. 39
Palstra A.P., van Ginneken V.J.T., Murk A.J., van den Thillart G.E.E.J.M., 2005. Are dioxin-like contaminants responsible for the eel (Anguilla anguilla) drama? Naturwissenschaften. 93: 145 148. Pedersen B.H., 2003. Induced sexual maturation of the European eel Anguilla anguilla and fertilisation of the eggs. Aquaculture 224, 323 338. Pedersen B.H., 2004. Fertilisation of eggs, rate of embryonic development and hatching following induced maturation of the European eel Anguilla anguilla. Aquaculture 237: 461 473. Pérez L., Peñaranda D.S., Dufour S., Baloche S., Palstra A.P., Van Den Thillart G.E.E.J.M., Asturiano J.F., 2011. Influence of temperature regime on endocrine parameters and vitellogenesis during experimental maturation of European eel (Anguilla anguilla) females. Gen. Comp. Endocrinol. 174: 51 59. Prigge E., Malzahn A.M., Zumholz K., Hanel R., 2012. Dietary effects on fatty acid composition in muscle tissueof juvenile European eel, Anguilla Anguilla (L.).Helgoland Marine Research 66: 51 61. Roland K., 2013. Molecular responses of peripheral blood mononuclear cells in European eel Anguilla anguilla following exposure to xenobiotics. Development of a low invasive multi-biomarker approach using sub-proteomic analysis. Praca doktorancka. Sieński J., 2011. Węgorze pod ochroną Unii Europejskiej. Dziennik Bałtycki, 2011-10-07. van Ginneken V., Vianen G., Muusze B., Palstra A., Verschoor L., Lugten O., Onderwater M., van Schie S., Niemantsverdriet P., van Heeswijk R., Eding E., van den Thillart G., 2005. Gonad development and spawning behaviour of artificially-matured European eel (Anguilla anguilla L.). Animal Biology. 55: 203 218. Vogel G., 2010. Europe Tries to Save Its Eels. Science. 329: 505 507. 40