Możliwości zastosowania PRP i PRF w sterowanej regeneracji tkanek w chirurgii stomatologicznej The opportunities of PRP and PRF application in GTR i oral surgery Autorzy_ Maja Chmielewska, Krzysztof Chmielewski, Bartłomiej Iwańczyk i Andrzej Wojtowicz Streszczenie: Gojenie tkanek miękkich i kości po zabiegach chirurgicznych jest procesem wiążącym się często z licznymi komplikacjami oraz zakażeniami. Celem przywrócenia hemostazy w miejscu uszkodzenia tkanek już ponad 100 lat temu opracowano koncepcję preparatów płytkowych. Wprowadzony przez dr. Choukroun a i współpracowników PRF należy do drugiej generacji koncentratów płytkowych. Ten autogenny materiał znacznie różni się od swoich prekursorów (PRP i PRGF). Prostota przygotowania, struktura siatki włóknika, zawartość leukocytów oraz przedłużone uwalnianie cytokin i czynników wzrostu sprawiły, że PRF sprawdza się jako matryca do gojenia i odbudowy tkanek, co potwierdzone zostało przez wielu autorów. Dzięki temu znalazł szerokie zastosowanie w chirurgii stomatologicznej, szczękowo-twarzowej i innych dziedzinach medycyny regeneracyjnej. Summary: Wound healing in oral surgery often involves bacterial infections and complications. In order to regain hemostasis in a place of tissue injury, over 100 years ago, the concept of platelet preparations was developed. Platelet-rich ibrin (PRF), introduced by Joseph Choukroun et al. is a second generation of platelet concentrates. This autologous biomaterial differs signiicantly from its predecessors (platelet-rich plasma, PRP). PRF can be characterised with a simpliied preparation procedure, ibrinous structure, high content of leucocytes and prolonged release of growth factors. All these features have made PRF a prosperous healing matrix, widely used in oral and maxillofacial surgery. Słowa kluczowe: osocze bogatopłytkowe, ibryna bogatopłytkowa, PRF, PRP, chirurgia stomatologiczna, regeneracja tkanek. Key words: platelet rich plasma, platelet rich ibrin, PRF, PRP, oral surgery, tissue regeneration _Czym jest PRP? W izolacji osocza bogatopłytkowego wykorzystuje się różnice w gęstości przepływowej czerwonych krwinek, płytek krwi i białych krwinek, zagęszczając płytki krwi i białe krwinki w małej objętości osocza przez odwirowanie krwi. Uzyskuje się przez to wysokie stężenie uwalnianych przez płytki czynników wzrostu, przekraczające stężenia tych substancji obserwowane we krwi pełnej (stężenia rzędu pg/ml do ng/ml), w małej objętości osocza, które można zaaplikować bezpośrednio w miejsce naprawy tkanki kostnej. Marx 1 zdeiniował PRP jako autogenne osocze, w którym stężenie płytek krwi przekracza wartość w krwi pełnej. Następnie opracował roboczą deinicję PRP, wg której powinno ono mieć co najmniej 5-krotnie wyższe stężenie płytek w osoczu w wyniku procesu, na który składają się 2 etapy wirowania. Deinicja ta nie zawsze jest przestrzegana przy sporządzaniu PRP, przez co powstało wiele metod preparacji PRP dających różne stężenia czynników wzrostu. Duża różnorodność metod otrzymywania PRP i stężeń czynników wzrostu w PRP może prowadzić do braku jasności w literaturze w odniesieniu do tego, jaki preparat jest w rzeczywistości stosowany w różnych badaniach przedklinicznych lub klinicznych. Podejmowano próby sklasyikowania różnych koncentratów płytek krwi, jednak różne określenia są często stosowane zamiennie, w wyniku czego powstały niejasności i nieporozumienia. Wiele urządzeń umożliwia otrzymywanie masy bogatopłytkowej PRP, której właściwo- 12 2_2014
ści wykazują dużą zmienność zarówno pod względem stężenia czynników wzrostów, jak i zawartości konkretnych komórek (np. leukocytów). Bez właściwych metod kontroli lub optymalizacji licznych zmiennych (np. stężenia/stosunku zawartości czynników wzrostu) w trakcie przygotowywania PRP, nie wiadomo, które składniki są potrzebne i korzystne, a które szkodliwe w odniesieniu do regeneracji tkanek. Wskutek tego wyniki każdego badania in vivo mają odniesienie do jednej, konkretnej metody preparacji/metody aplikacji/wskazania, co czyni porównanie wyników różnych badań praktycznie niemożliwym. Badania kliniczne nad zastosowaniem osocza bogatopłytkowego w chirurgii stomatologicznej i szczękowo-twarzowej są prowadzone od początku lat 90. ubiegłego wieku, pierwsze prace polskie od roku 2000 2. Od tego czasu wykonano wiele badań, w których oceniano skuteczność PRP w różnych zastosowaniach w chirurgii szczękowo-twarzowej i periodontologii. W bazie PubMed można znaleźć setki artykułów na temat zastosowań klinicznych PRP we wskazaniach chirurgii stomatologicznej. 3-7 _Czym jest PRF? PRF to autogenny materiał pozyskiwany z krwi pacjenta tuż przed zabiegiem. Nie ma ryzyka zakażenia krzyżowego, a przygotowanie preparatu jest znacznie uproszczone, tańsze i szybsze w porównaniu do wcześniejszych koncentratów płytkowych. Krew jest pobierana do suchych, sterylnych, próżniowych probówek o pojemności 10 ml bez dodatku antykoagulantów i odwirowywana jest na wolnych obrotach w dedykowanej do tego protokołu wirówce (wg pierwotnego protokołu 3000 rpm/12 min, w najnowszym protokole A-PRF 1500 lub 1300 rpm/14 min, w zależności od typu wirówki). Ilość krwi niezbędna do uzyskania membrany jest względnie niewielka. W zależności od potrzeb pobierane jest jednorazowo od kilku do kilkunastu probówek krwi w celu odwirowania i uzyskania membran PRF. Ilość pobranej krwi wahać się może zatem od kilkudziesięciu ml do 100-120 ml, co jest w pełni bezpieczne dla pacjenta (w stacjach krwiodawstwa pobierane jest do 450 ml krwi jednorazowo). Olbrzymią zaletą PRF jest prostota przeprowadzenia procedury oraz naturalne formowanie struktury włóknika będącego nośnikiem dla komórek, cytokin i czynników wzrostu. 8 Powstawanie trójwymiarowej struktury włóknika w naturalnym procesie kaskady wykrzepiania sprzyja jego dużej wytrzymałości i powolnemu uwalnianiu m.in. zawartych czynników. 9,10 W innych protokołach otrzymywania preparatów bogatopłytkowych, takich jak PRP (Platelet Rich Plasma) proces jest dużo bardziej złożony, ponieważ krew pobierana jest do probówek z dodatkiem antykoagulantów i po odwirowaniu jest rozdzielana na frakcje poddawane często dodatkowemu wirowaniu. Przed aplikacją kliniczną w sposób sztuczny wywoływany jest proces polimeryzacji włóknika przez dodanie trombiny (zazwyczaj pochodzenia wołowego) czy jonów wapnia. Stworzona w ten sposób sieć włóknika różni się strukturą połączeń pojedynczych włókien ibryny, co ma wpływ na sposób uwalniania cytokin i czynników wzrostu. Z PRP czynniki wzrostu uwalniane są natychmiast i w całej swojej objętości w chwili aplikacji materiału. 11,12 Naturalny proces polimeryzacji włóknika w protokole PRF sprzyja wychwytywaniu i aktywacji komórek oraz cytokin podczas wirowania. 8 Utworzona w sposób naturalny trójwymiarowa sieć ibrynowa pozwala na powolne uwalnianie zawartych czynników w pierwszym tygodniu. Ryc. 1 Ryc. 2 Ryc. 1_Krew po odwirowaniu. W probówce widoczne są 3 warstwy: górna warstwa bezpłytkowego osocza (PPP platelet-poorplasma), dolna warstwa czerwonych krwinek i PRF pomiędzy nimi. Ryc. 2_PRF wyjmowany z probówki. 2_2014 13
Ryc. 3 Ryc. 4 Ryc. 5 Ryc. 3 i 4_ Przygotowanie membran z PRF przy użyciu PRF Box (Process, Nicea, Francja). Ryc. 5_Gotowe do użycia membrany PRF. 14 2_2014 Po zakończeniu wirowania w protokole PRF z probówek wyjmuje się skrzepy i- brynowe, z których po delikatnym odciśnięciu w specjalnym pudełku PRF Box (Process, Nicea, Francja) 13 otrzymujemy uformowane, wytrzymałe membrany ibrynowe o jednorodnej grubości i szerokich możliwościach zastosowania. 14,15,16 Procedura przeprowadzana jest przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego, a membrany uzyskane w jej wyniku mogą pozostawać w przeznaczonym do tego pudełku (PRF Box) przez kilka kolejnych godzin, umożliwiając lekarzowi zastosowanie ich w odpowiednim momencie zabiegu bez dodatkowej presji czasowej. _PRP a PRF Preparaty płytkowe nie są nowością, bowiem koncepcja ta stopniowo ewoluowała od ponad 100 lat. 17 Przez lata zmieniały się procedury przygotowania, a przez to skład otrzymywanej ibryny oraz jej dostępność dla pacjentów. Protokoły bezpośrednio poprzedzające L-PRF można podzielić na 3 kategorie: P-PRP (pure platelet-rich plasma; laboratoryjna plazmafereza, Vivostat PRF, Anitua s PRGF), L-PRP (leucocyte- and platelet-rich plasma; Curasan, Friadent-Schütze, Regen, Plateltex, SmartPReP, PCCS, GPS, Magellan) oraz P-PRF (pure platelet-rich ibrin; Fibrinet PRFM). Ze względu na podstawowe różnice pomiędzy koncentratami i mnogość nazw, utrudniające komunikację, zaproponowany został podział na 2 grupy: PRP, wymagające antykoagulantów i sztucznego zapoczątkowania polimeryzacji włóknika oraz PRF, który nie wymaga żadnych dodatków. 18 Dodatkowo większość tych substancji, oprócz PRF, w procesie przygotowawczym jest wirowana 2-krotnie przy bardzo dużej prędkości wirówki (nawet 3000 g); na tym tle wyróżnia się prostota, szybkość i niski koszt produkcji PRF (pierwszy protokół PRF ok. 400 g, pojedyncze wirowanie). 11,19 Zarówno w protokole PRP, jak i PRF po odwirowaniu w probówce, tworzą się 3 warstwy. W obu przypadkach uzyskujemy warstwę czerwonych krwinek na dnie oraz PPP (platelet-poor plasma, acellular plasma), czyli ubogopłytkowe serum w górnej części probówki. Pomiędzy tymi warstwami można znaleźć odpowiednio: PRP, określany jako kożuszek ( buffy coat ) albo PRF. 8 W wielu systemach PRP warstwa istotna klinicznie oddzielana jest przez operatora za pomocą igły i strzykawki, co sprawia, że faktyczne stężenie czynników wzrostu i liczba płytek krwi są niepowtarzalne i nie do określenia, a technika jest bardzo wrażliwa względem wyczucia operatora. 20 W związku z procesem przygotowawczym powstają znaczące różnice w konsystencji i składzie preparatów. PRF, podobnie jak naturalny skrzep jest gęstą siecią włóknika i w organizmie ulega stopniowej przebudowie, podczas gdy większość typów PRP wykazuje konsystencję kleju tkankowego i szybko ulega rozpuszczeniu. 21 Trójwymiarowa struktura ibryny w PRF oraz zawartość i uwalnianie przekaźników komórkowych sprzyja migracji i osiedlaniu się komórek, stanowiąc podłoże dla osadzania się komórek macierzystych i angiogenezy. 9,22 Dzięki znaczącej redukcji obrotów wirówki i modyikacji czasu wirowania, w PRF obecne są większe ilości leukocytów. W nowym protokole doktora Choukroun a (A-PRF advanced platelet-rich ibrin zaawansowany PRF) znajduje się zwiększona liczba monocytów, które mają uwalniać BMP-2 i BMP-7 (bone morphogenic protein, białka morfogenetyczne kości) oraz jeszcze większe ilości VEGF niż L-PRF. 23 _Cytokiny i czynniki wzrostu Dostarczanie cytokin jest kluczowe dla procesu gojenia tkanek, ale ważny jest też sposób ich dostarczenia. 24,25 Stopniowa poli-
meryzacja i usieciowanie włóknika w procedurze PRF skutkuje uwięzieniem, a następnie przedłużonym uwalnianiem cytokin i czynników wzrostu z preparatu, utrzymującym się przez co najmniej tydzień. 21 Dodatek bydlęcej trombiny do preparatów poprzednich generacji (PRP, PRGF) skutkuje nagłym, masywnym wyrzutem cytokin i czynników wzrostu, a co za tym idzie, wyczerpaniem ich źródła w ciągu godziny. Zastosowanie chlorku wapnia wydłuża czas uwalniania czynników wzrostu z PRP. 12 W PRF zawarte są znaczne ilości VEGF (śródbłonkowego czynnika wzrostu), PDGF- AB (płytkopochodnego czynnika wzrostu AB), TGFβ-1 (transformującego czynnika wzrostu β-1) oraz TSP-1 (trombospondyny-1), która jest ważną glikoproteiną matrycową, biorącą udział w procesie komunikacji komórki z otoczeniem. 21 _Dyskusja Po użyciu PRF wielu autorów zaobserwowało zwiększoną migrację komórek, przyspieszenie angiogenezy i zmniejszenie nieuchronnego po zabiegu stanu zapalnego. 14 Korzyści zastosowania PRF: zmniejszenie stanu zapalnego zmniejszenie częstości infekcji przyspieszenie angiogenezy przyspieszone gojenie materiał autogenny niskie koszty pozyskania szybka i prosta procedura TGFβ-1 indukuje bliznowacenie tkanek w procesie gojenia. VEGF jest bardzo silnym stymulatorem wzrostu naczyń i tworzenia kości. 26 PDGF-AB i PDGF-BB należą do grupy czynników wzrostu dla mezenchymalnych linii komórkowych, zwiększających ich proliferację, migrację i przeżycie. 9 Dodatkowo, uwięzione w sieci strukturalnej PRF zostają krążące we krwi IGF-I i IGF- II (insulin-like growth factors, wpływające pozytywnie na syntezę kolagenu, proliferację i różnicowanie większości typów komórek, przez hamowanie wpływu sygnałów apoptotycznych), EGF (epidermal growth factor, oddziałujący z ibroblastami, komórkami naczyń i naskórkiem) oraz bfgf (basic i- broblast growth factor, czynnik wzrostu dla ibroblastów, mięśni gładkich i innych typów komórek). 9,22 Obecność leukocytów zapewnia zwiększoną zawartość mediatorów pro- i przeciwzapalnych, w tym IL-1β, IL-6, TNF-α czy IL-4. Dzięki temu PRF może być rozpatrywany jako węzeł odpornościowy ( immune node ). 10 Białe krwinki, odrzucane w niektórych protokołach PRP (np. Anitua PRGF) są fundamentalne dla PRF. 27 Z badań Dohan a i współpracowników wynika, że uwalniają one VEGF oraz TGFβ-1. Płytki krwi zawierają zarówno stymulatory (VEGF, bfgf), jak i inhibitory angiogenezy (endostatyna, TSP-1), więc obecność leukocytów może być kluczowa dla tego procesu. 21 2_2014 15
_autorzy Maja Chmielewska, Bartłomiej Iwańczyk, Andrzej Wojtowicz Zakład Chirurgii Stomatologicznej, Warszawski Uniwersytet Medyczny. Krzysztof Chmielewski Prywatna Praktyka Stomatologiczna, Gdańsk. Dzięki temu PRF wydaje się być dobrą matrycą do gojenia tkanek. 14,15,22,28,29 PRF znalazł zastosowanie w implantologii, sterowanej regeneracji kości i podnoszeniu dna zatoki szczękowej, 30-41 periodontologii, endodoncji 42-46 oraz wielu innych dziedzinach i zabiegach, nie tylko z zakresu procedur stomatologicznych. 47 Zaobserwowano zmniejszenie dolegliwości bólowych, przyspieszenie gojenia tkanek miękkich oraz zwiększoną gęstość powstającej tkanki kostnej (ocena radiologiczna) w przypadku użycia PRF do augmentacji zębodołów poekstrakcyjnych u pacjentów wymagających obustronnej ekstrakcji 3. zębów trzonowych żuchwy. 48 Takie zastosowanie PRF spowodowało też zmniejszenie frekwencji przypadków suchego zębodołu. 49 Rosnące zainteresowanie komórkami macierzystymi i ich potencjałem regeneracyjnym zostało powiązane z PRP, który może być nośnikiem i dodatkiem przy regeneracji chrząstek za pomocą komórek macierzystych. 50,51 Podczas implantacji ze wszczepieniem mezenchymalnych komórek macierzystych zastosowanie PRP zwiększyło tempo integracji kości z implantem. 52 Membrany PRF mogą służyć jako nośniki komórek okostnej, 53 nie wykluczona jest możliwość szerszego zastosowania PRF jako nośników komórek macierzystych oraz inżynierii tkankowej. W przeprowadzonych przez Kim i współpracowników badaniach porównano tempo i jakość gojenia defektów kostnych u królików przy użyciu TCP (tricalcium phosphate, grupa kontrolna), TCP i rhbmp-2 (recombinant human bone morphogenic protein-2, grupa doświadczalna A), oraz TCP i PRF (grupa doświadczalna B). Eksperyment wykazał wyższość grup A i B nad grupą kontrolną oraz wyższość grupy B (PRF) nad grupą A podczas pierwszych 4 tygodni gojenia. Tkanka kostna pod wpływem PRF powstawała szybciej, była lepiej ustrukturyzowana i bardziej zmineralizowana. PRF może okazać się dobrą, tańszą alternatywą dla stosowania rhbmp (synetetyczne białko morfogenetyczne kości). 54 Dodatkowo dużą zaletą PRF jest działanie hemostatyczne, czego dowiedziono przy użyciu PRF podczas ekstrakcji u pacjentów przyjmujących warfarynę po operacjach serca. U 50 pacjentów biorących udział w badaniu zmierzono współczynnik INR (średnia 3,16), usunięto 168 zębów, zanotowano tylko 2 przypadki krwoto- ku, opanowane w ciągu kilku godzin (pacjenci z INR=3.7) oraz brak przypadków odroczonego krwawienia i innych komplikacji. 55 PRF wymaga jednak bardzo sprawnej procedury przygotowawczej. Krew musi być pobrana i odwirowana szybko, czas od jej pobrania do początku wirowania nie może przekroczyć 2 min, jeżeli chcemy uzyskać dobrej jakości użyteczną ibrynę. W przypadku pobierania większej ilości krwi wirowanie probówek uruchamiane jest etapowo. Odpowiednie przygotowanie PRF wymaga też specjalnej wirówki, dedykowanych probówek i specjalnego pudełka (PRF Box), ale koszty są względnie niewielkie, zwłaszcza jeżeli uwzględnione zostaną korzyści z zastosowania preparatu. PRF jest materiałem, który może wesprzeć procesy gojenia, jednak musi zostać odpowiednio przygotowany i zastosowany. _Wnioski Uwzględniając rezultaty badań, aktualne zastosowania oraz możliwości jakie otwiera zastosowanie PRF, należałoby rozpowszechnić jego dostępność dla pacjentów, a zwłaszcza pacjentów z osłabionym procesem regeneracji tkanek i warunkami trudnymi do rehabilitacji. PRF jest łatwą do przygotowania matrycą i wydaje się dobrze sprawdzać przy regeneracji tkanek. Synteza tego preparatu nie wymaga substancji stymulujących krzepnięcie (trombina, chlorek wapnia), jest metodą o niskich kosztach i wysokim, powtarzalnym efekcie terapeutycznym, jednak wskazania do stosowania preparatów PRP i PRF wydają się nieco odmienne._ Piśmiennictwo: 1. Wojtowicz A, Maciejasz P, Jovanowic S: Clinical Use if recombinant human bone morhogenetic protein hrbmp2 in the bone augmentation of the mandible a case report. Implants, International magazine of oral implantology (Polish edition) 2009, 3 s. 16-19. 2. Kochanowska I, Chaberek S, Wojtowicz A, Marczyński B, Włodarski K, Dytko, M, Ostrowski K: Expression of gene for BMP2, BMP4 and BMP6 in various part of human skeleton. BMC Musculoskeletal Disord. 2007, 8, 12-7. 3. Wojtowicz A, Chaberek S, Urbanowska E, Ostrowski K: Comparison eficiency of platelet rich Plasma, hemopoietic stem cells, and bone marrow in augmentation of mandibular bone defects. NY State dental Journal 2007, v. 73, nr 2, s 41-45. Pełen spis piśmiennictwa dostępny u wydawcy. 16 2_2014