Instrukcja użytkowania testu KPC/Metallo-B-Lactamase Confirm Kit (98006) Instrukcja użytkowania testu KPC/MBL and OXA-48 Confirm Kit (98015) Instrukcja użytkowania testu Triple disk (68912) PRZEGLĄD: DNZ DATA WYDANIA: 20.02.2014 JĘZYK: Polski Zestaw KPC/Metallo- -Lactamase Confirm Kit Zestaw KPC/Metallo-beta-lactamase and Oxa-48 Confirm Kit WYŁĄCZNIE DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO GRUPA PRODUKTÓW: Zestawy do wykrywania beta-laktamazy. PRODUCENT: ROSCO Diagnostica A/S, Taastrupgaardsvej 30, DK-2630 Taastrup, Denmark. PRZEZNACZENIE: GRUPA ODBIORCÓW: Tabletki stosowane są do jakościowej identyfikacji in vitro mechanizmów oporności drobnoustrojów metodą dyfuzyjno-krażkową/tabletkową, w celu potwierdzenia mechanizmu, za pomocą którego drobnoustrój uzyskał oporność na określone związki przeciwdrobnoustrojowe. Omawiany zestaw przeznaczony jest do wykrywania karbapenemaz: KPC, MBL i OXA-48 u bakterii z rodzaju Enterobacteriaceae. Wyłącznie do użytku przez profesjonalnie przeszkolony personel. ZASADA DZIAŁANIA: Cztery rurki z tabletkami zawierającymi u czystego i w kombinacji z inhibitorami różnych -laktamaz. Inhibitory dodawane są w celu rozróżnienia izolatów z mechanizmami oporności od tych, które takich mechanizmów nie posiadają (patrz wyjaśnienie poniżej). Ponadto, do zestawów KPC/MBL i OXA-48 Confirm Kit (98015) dodatkowo dołączono jedną rurkę z tabletkami zawierającymi 30 g Temocyliny w celu wykrycia izolatów produkujących laktamazy OXA-48 lub pokrewne. Jeżeli mikroorganizm wykazuje obniżoną wrażliwość na karbapenemy, to powody mogą być następujące: 1. Mikroorganizm wykazuje nadprodukcję AmpC. Ze względu na powolną hydrolizę karbapenemów przez enzymy AmpC, mechanizm ten prawdopodobnie związany jest również z innymi mechanizmami oporności, takimi jak: oporność wielolekowa związana z aktywnym usuwaniem leków, utrata poryn lub aktywność innych -laktamaz. Kloksacylina jest inhibitorem enzymu AmpC. Antybiotyk ten jest stosowany w celu odróżnienia mechanizmu AmpC od KPC, jako że oba te mechanizmy są hamowane przez kwas fenyloboronowy. A zatem, różnica wielkości stref zahamowania wzrostu pomiędzy em a em + Kloksacylina 5 mm dowodzi aktywności AmpC. 2. Mikroorganizm wytwarza metalo- -laktamazy, które skutecznie rozkładają karbapenemy. Mechanizm oporności MBL hamowany jest przez kwas dipikolinowy (DPA), a zatem różnica w wielkości stref zahamowania wzrostu drobnoustroju pomiędzy em a em + DPA 5 mm dowodzi jego obecności. DPA, w przeciwieństwie do EDTA, nie posiada samoistnej aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Dlatego też, wyniki testu z użyciem DPA są łatwiejsze w interpretacji. 1
3. Mikroorganizm produkuje enzymy KPC. Enzymy KPC hamowane są przez kwas fenyloboronowy. Jednakże, kwas fenyloboronowy jest również inhibitorem enzymów AmpC. A zatem, w celu zwiększenia specyficzności testu, dodatkowo zastosowano kombinację z Kloksacyliną w celu odróżnienia mechanizmu KPC od AmpC. Różnica w wielkości stref zahamowania wzrostu drobnoustroju 4 mm pomiędzy em a + kwas fenyloboronowy, z jednoczesnym brakiem różnicy ( 4 mm) pomiędzy a + Kloksacylina wskazuje na obecność mechanizmu oporności KPC. 4. Mikroorganizm z rodzaju Enterobacteriaceae produkuje enzymy OXA-48 lub pokrewne. Negatywne wyniki wszystkich testów synergii łącznie z brakiem strefy zahamowania wzrostu wokół tabletki z Temocyliną (30 g) wskazują na obecność mechanizmu oporności OXA-48 lub pokrewnego. Co więcej, izolaty z mechanizmem oporności OXA-48 wykazują również oporność na Piperacylinę + Tazobaktam. Należy zwrócić uwagę jeżeli zarówno przy użyciu u, jak również jego kombinacji ze wszystkimi inhibitorami nie obserwujemy stref zahamowania wzrostu drobnoustroju, wynik testu z Temocyliną jest nieprawidłowy, a ogólny rezultat niejednoznaczny. Test z użyciem Temocyliny jest ważny wyłącznie dla bakterii z rodzaju Enterobacteriaceae. SZCZEGÓŁOWE INSTRUKCJE: ZAWARTOŚĆ ZESTAWU: Szczegółowa instrukcja ROSCO pt. Detection of resistance mechanisms powinna być dostępna w każdym laboratorium pracującym z produktami do diagnostyki firmy ROSCO. Najnowsze wydanie instrukcji użytkowania można bezpłatnie pobrać u lokalnego dystrybutora, ze strony internetowej firmy ROSCO (www.rosco.dk) lub bezpośrednio z ROSCO Diagnostica A/S: E-mail: info@rosco.dk Fax: + 45 43 52 73 74 4 lub 5 rurek, z których każda zawiera 50 tabletek: 1., kod:, 2. + kwas fenyloboronowy (inhibitor KPC i AmpC), kod: MRPBO, 3. + Kloksacylina (inhibitor AmpC), kod: MRPCX, 4. + kwas dipikolinowy (inhibitor metalo- -laktamaz), kod: MRPDP, 5. Temocylina 30 g (wyłącznie w teście OXA-48 Confirm Kit 98015). PRZECHOWYWANIE/POSTĘPOWANIE: Przechowywać w temperaturze 2-8 O C w dostarczonym pudełku lub zamknięte rurki aż do daty ważności podanej na etykiecie. Przed ściągnięciem zamknięcia z rurki, należy przez 30-60 minut pozostawić je w temperaturze pokojowej. Po otwarciu rurki, a szczególnie, kiedy umieszczona została w dyspenserze, należy przechowywać ją w temperaturze pokojowej maksymalnie do 2 miesięcy. W razie konieczności, jeżeli wykorzystywana będzie w czasie dłuższym niż 2 miesiące, dyspensery można przechowywać w temp. 2-8 O C. Zawsze zamykać rurki oryginalnymi zielonymi zamknięciami, nigdy nie umieszczać dyspensera w lodówce. W przypadku przechowywania rurek w temp. 2-8 O C, przed użyciem pozostawić w temperaturze pokojowej, jak opisano powyżej. 2
ŚRODKI OSTROŻNOŚCI: Tylko do diagnostyki in vitro. Podczas pracy z materiałem potencjalnie zakaźnym należy podjąć odpowiednie środki ostrożności oraz zachować MATERIAŁY WYMAGANE, ALE NIE ZAPEWNIONE: techniki pracy aseptycznej. Może być używany tylko przez odpowiednio przeszkolony i wykwalifikowany personel laboratoryjny. Przed wyrzuceniem należy wysterylizować wszystkie odpady zakaźne. Patrz Karta Charakterystyki. Standardowe wyposażenie mikrobiologiczne ezy, podłoża cieplarka itd., oraz odczynniki biochemiczne. bakteriologiczne, PROCEDURA: 1. Wykorzystując świeżą, czystą kulturę przygotować zawiesinę badanego mikroorganizmu o gęstości 0,5 McFarlanda. 2. Przy pomocy strylnej wymazówki lub szpatułki Drigalskiego posiać zawiesinę bakterii na całą powierzchnię Agaru Mueller Hinton. 3. Przy użyciu dyspensera (pojedynczego), nałożyć po 1 tabletce z każdej rurki zestawu na powierzchnię agaru, upewniając się, że przestrzeń między nimi pozwoli na odpowiednie zmierzenie stref zahamowania wzrostu. Należy zauważyć, że więcej niż 1 Confirm Kit może być wykonany na 1 płytce. 4. Inkubować w 35 O C 1 O C przez 18 2 godziny (przez noc). 5. Zmierzyć i zapisać średnice stref zahamowania wzrostu. Brak strefy wokół tabletki odpowiada strefie wynoszącej 9 mm. INTERPRETACJA WYNIKÓW: Wyniki interpretuje się poprzez porównanie stref zahamowania wzrostu wokół różnych krążków: 1. Porównać strefę zahamowania wzrostu wokół tabletki z em do stref zahamowania wokół każdej tabletki z em + inhibitory. Jeżeli różnice wynoszą do 3 mm, oznacza to, że organizm nie wykazuje oporności typu KPC i/lub AmpC. 2. Zmierzyć strefę zahamowania wzrostu wokół tabletki z em (MRP 10) i porównać ze strefami wokół dwóch tabletek: + Kloksacylina (MRPCX) oraz + kwas fenyloboronowy (MRPBO). Jeżeli strefa zahamowania wzrostu wokół MRPCX jest 5 mm, zaś strefa zahamowania wzrostu wokół MRPBO jest 4 mm w porównaniu do strefy wokół tabletki z czystym antybiotykiem (bez inhibitora), wówczas mikroorganizm wykazuje obecność wyłącznie mechanizmu AmpC. 3. Zmierzyć strefę zahamowania wzrostu wokół tabletki z em (MRP 10) i porównać ze strefami wokół dwóch tabletek: + Kloksacylina (MRPCX) oraz + kwas fenyloboronowy (MRPBO). Jeżeli strefa zahamowania wzrostu wokół MRPCX jest 3 mm, zaś strefa zahamowania wzrostu wokół MRPBO jest 4 mm w porównaniu do strefy wokół tabletki z czystym antybiotykiem (bez inhibitora), wówczas mikroorganizm wykazuje obecność mechanizmu KPC. Można również porównywać strefy zahamowania wzrostu pomiędzy tabletkami MRPCX oraz MRPBO. Jeżeli strefa zahamowania wzrostu wokół tabletki MRPBO jest 4 mm od strefy wokół tabletki MRPCX, wówczas mikroorganizm jest KPC pozytywny. 4. Zmierzyć strefę zahamowania wzrostu wokół tabletki z em (MRP 10) i wokół tabletki z em + DPA (MRPDP). Jeżeli strefa zahamowania wzrostu wokół tabletki MRPDP jest 5 mm w porównaniu do tabletki z czystym antybiotykiem, wówczas mikroorganizm wykazuje aktywność metalo- - laktamaz. Uwaga: należy testować jedynie izolaty oporne na Ceftazydym. Izolaty wrażliwe na Ceftazydym mogą dawać fałszywie pozytywne wyniki na obecność mechanizmu MBL. 3
5. Izolaty wykazujące dla u wartość MIC 0,25 g/ml (strefa zahamowania wzrostu wokół tabletki z em 25 mm) mogą produkować karbapenemazy (metalo- - laktamazy VIM-1 lub pokrewne) trudne do wykrycia za pomocą testu KPC/MBL Confirm Kit. W celu identyfikacji takich izolatów należy użyć tabletek z Imipenemem i em oraz tabletki Diatabs z kwasem dipikolinowym (DPA), którą umieszcza się pomiędzy tabletkami z Imipenemem i em (w odległości 10 mm od krawędzi jednej do krawędzi drugiej tabletki). Synergizm pomiędzy DPA i Imipenem oraz/lub pomiędzy DPA i em wskazuje na obecność mechanizmu MBL. 6. Należy zwrócić uwagę na strefę zahamowania wzrostu drobnoustroju wokół tabletki z Temocyliną 30 g. Jeżeli nie ma strefy zahamowania wzrostu, wówczas szczep jest prawdopodobnie OXA-48 pozytywny. W 80% przypadków występowania OXA-48 towarzyszą mu również inne mechanizmy oporności, np. CTX-M lub ESBL, co można wykryć używając tabletek CAZ/kwas klawulanowy lub + Tazobaktam. 7. Możliwe jest, aby dany mikroorganizm wykształcił więcej niż jeden mechanizmów oporności. Tak więc, jeżeli np. wartość w pkt. 4 wynosi 5 mm i w pkt. 3 wynosi 4 mm, wówczas mikroorganizm jest zarówno MBL, jak i KPC pozytywny, chociaż w wielu przypadkach mechanizm MBL może maskować i utrudniać wykrycie mechanizmu KPC. Żadna z kombinacji mechanizmów oporności nie jest niemożliwa i więcej niż jeden Confirm Kit mogą być testowane na jednej płytce z podłożem. 8. Przy interpretacji wyników należy posługiwać się tabelą 1. Izolaty zarówno KPC, jak i MBL pozytywne zostały opisane w Grecji i w Niemczech. Firma Rosco Diagnostica opracowała tabletkę z kombinacją trzech związków: + kwas fenyloboronowy + kwas dipikolinowy, która pozwala na wykrycie obu wymienionych mechanizmów oporności (po porównaniu stref zahamowania wzrostu ze strefami wokół tabletek: + DPA oraz + kwas fenyloboronowy). Potrójna tabletka (68912) jest zatem przeznaczona do wykrywania obecności obu mechanizmów oporności: MBL i KPC w tym samym izolacie (tabela 2). KONTROLA JAKOŚCI: Pomimo tego, że ROSCO Diagnostica A/S produkuje, póki co, najbardziej stabilne krążki antybiogramowe (tabletki), konieczne jest regularne wykonywanie badań kontroli jakości. Powinno się je wykonywać w oparciu o co najmniej jeden szczep, który daje reakcję dodatnią, oraz jeden, który daje reakcję ujemną. Uzyskane strefy zahamowania wzrostu dla kontroli ujemnej (np. E. coli ATCC 25922), wokół tabletek kombinowanych (z inhibitorami) a samym karbapenemem powinny wynosić do 3 mm. Każdy inny wynik oznacza, że produkt stracił swą aktywność i nie powinien być już wykorzystywany. Jako kontrolne szczepy dodatnie wykorzystać można: K. pneumoniae NCTC 13438, KPC pozytywny K. pneumoniae NCTC 13439, MBL pozytywny K. pneumoniae ATCC BAA-1705, KPC pozytywny K. pneumoniae ATCC BAA-2146, MBL pozytywny Jako kontrolne szczepy negatywne wykorzystać można: K. pneumoniae ATCC 700603 4
Tabela 1: + kwas fenyloboronowy MRPBO + DPA MRPDP + Kloksacylina MRPCX Temocylina 30 g AmpC + utrata poryn 4 mm i 3 mm 5 mm 12 mm ESBL + utrata poryn (a) 3 mm 3 mm 3 mm 12 mm KPC + Kloksacylina (MRPCX) 4 mm 3 mm 3 mm zmienna 4 mm - - - M L 4 mm 5 mm 3 mm zmienna OXA-48 i pokrewne 3 mm 3 mm 3 mm brak strefy zahamowania wzrostu OXA-48 + ESBL (a) 3 mm 3 mm 3 mm brak strefy zahamowania wzrostu (a): synergizm CAZ/kwas klawulanowy Ani AmpC, jak i KPC oraz M L: wszystkie strefy do 3 mm od siebie. Szczepy Oxa-48 wykazują negatywny wynik z KPC + MBL Confirn Kit, ale są oporne na Temocylinę (brak strefy zahamowania wzrostu wokół tabletki Neo-Sensitabs Temocillin 30 g). Tabela 2: Tabletka potrójna (MER + DPA + BO) KPC MRPDP 4 mm MBL MRPBO 4 mm KPC + MBL MRPDP MRPBO 4 mm i 4 mm LITERATURA: www.rosco.dk Dystrybutor: 5