BADANIA NAD ZASTOSOWANIEM ETANOLOWEGO EKSTRAKTU PROPOLISU U CIELĄT Z OBJAWAMI BIEGUNKI

Medicina Veterinaria 2(2) 2003, 85-95 BADANIA NAD ZASTOSOWANIEM ETANOLOWEGO EKSTRAKTU PROPOLISU U CIELĄT Z OBJAWAMI BIEGUNKI BoŜena Chudoba-Drozdowska, Robert Kupczyński, Adam Roman Streszczenie. Przeprowadzone badania miały na celu wykazanie wpływu etanolowego ekstraktu propolisu (EEP) podawanego cielętom z objawami biegunki. Badania wykonano na 40 cielętach rasy hf w wieku od 7 dnia Ŝycia, które podzielono na 5 grup. Przez okres 1 lub 2 tygodni cielętom podawano wraz z mlekiem zróŝnicowane dawki EEP (2 lub 4 ml). Ocenę wpływu zastosowanego preparatu u cieląt oparto na obserwacjach klinicznych, badaniach bakteriologicznych kału, oznaczeniu parametrów hematologicznych krwi oraz białka całkowitego i jego frakcji. Badania wykazały, Ŝe zastosowany u cieląt z biegunką dodatek EEP do paszy spowodował poprawę ich zdrowotności, nastąpiło złagodzenie i zahamowanie objawów biegunki oraz znaczna redukcja ogólnej liczby drobnoustrojów w kale od 42,93 do 77,46% (w tym E. coli od 27,69 do 77,83%) w zaleŝności od ilości i długości okresu podawania preparatu. Odnotowano takŝe korzystny wpływ propolisu na parametry hematologiczne krwi oraz poziom białka całkowitego i γ-globulin w surowicy krwi. U cieląt otrzymujących EEP stwierdzono wyŝsze przyrosty dobowe masy ciała w porównaniu z grupą kontrolną. Słowa kluczowe: cielęta, etanolowy ekstrakt propolisu (EEP), biegunka, E. coli, parametry hematologiczne i biochemiczne krwi WSTĘP Biegunki są najczęściej występującym problemem zdrowotnym, jak równieŝ czynnikiem związanym ze śmiertelnością cieląt w neonatalnym okresie ich Ŝycia [de la Fuente i in. 1998, McClure 2001]. Etiologia biegunek jest złoŝona, gdyŝ poza czynnikami środowiskowymi i Ŝywieniowymi, ich przyczyną są czynniki zakaźne, zwłaszcza enterotoksyczne szczepy E. coli, korona- i rotawirusy, Cryptosporidium sp. i inne [Wernicki, Rzedzicki 1988b, García i in. 2000, Callaway i in. 2003, Sunderland i in. 2003]. Terapia biegunek u cieląt opiera się na stosowaniu środków farmakologicznych działających antybakteryjnie (np. antybiotyki), osłaniająco na błonęśluzową przewodu pokarmowego, korekcji zaburzeń równowagi kwasowo-zasadowej oraz na nawadnianiu organizmów cieląt płynami wieloelektrolitowymi [Albrycht i in. 1994, Wernicki 1996, McClure 2001, Constable i in. 2001, Sunderland i in. 2003]. Stosowanie jednak antybio-

86 B. Chudoba-Drozdowska i in. tyków czy innych substancji antybakteryjnych, wymaga ciągłych obserwacji odnośnie ich efektywności ze względu na zdolność narastania oraz przekazywania oporności drobnoustrojów na chemioterapeutyki [Wernicki, Rzedzicki 1988 a, Rypuła i in. 1999, Gunn i in. 2003]. Bradford i in. [1999] sugerują, Ŝe stosowanie antybiotyków u zwierząt moŝe prowadzić do powstania rezerwuaru bakterii opornych, które mogłyby być potencjalnym źródłem infekcji dla człowieka. Alternatywą dla chemioterapeutyków są naturalne związki, takie jak mieszanki ziół [Saba i in. 1999, 2000], ekstrakt z zielonej herbaty [Ishihara i in. 2001], czy inne naturalne dodatki do paszy, np. bentonit, humodetrynitowa odmiana węgla brunatnego, zeolit, kaolin oraz torf [Dembiński i in. 1985, Janeczek i in. 1997, Chudoba-Drozdowska 1998, Chudoba-Drozdowska i in. 2000]. W badaniach tych wykazano pozytywny wpływ zastosowanych środków na zdrowotność cieląt, przyrosty masy ciała oraz kształtowanie się wskaźników profilu metabolicznego, uzyskując lepsze ekonomiczne efekty odchowu cieląt. Celem pracy były badania nad wpływem dodatku etanolowego ekstraktu propolisu (EEP) do paszy dla cieląt wykazujących zaburzenia ze strony przewodu pokarmowego na florę bakteryjną ich przewodu pokarmowego, nasilenie biegunki oraz kształtowanie się wybranych parametrów hematologicznych i biochemicznych krwi. MATERIAŁ I METODY Badania wykonano na 40 cielętach rasy holsztyńsko-fryzyjskiej w wieku, począwszy od 7 dni ich Ŝycia. Były one utrzymywane w oborze (miejscu urodzenia), w pojedynczych kojcach ściołowych. śywienie cieląt oparte było na mleku pełnym, a od 2 tygodnia Ŝycia otrzymywały dodatek siana łąkowego ad libitum. Do badań wybrano cielęta wykazujące kliniczne objawy biegunki, które podzielono losowo na 5 grup, liczących po 8 sztuk: grupa I kontrolna, nieotrzymująca preparatu, grupa II otrzymywała ekstrakt propolisu w ilości 2 ml/dobę/szt. przez okres 1 tygodnia, grupa III 2 ml preparatu/dobę/szt. przez 2 tygodnie, grupa IV 4 ml preparatu/dobę/szt. przez 1 tydzień, grupa V 4 ml/dobę/szt. przez 2 tygodnie. Zastosowano 10% etanolowy ekstrakt propolisu, standaryzowany przez producenta, który zawierał 100 mg propolisu/ml. Preparat podawano cielętom raz dziennie wraz z mlekiem. Ocenę oddziaływania preparatu na organizmy cieląt oparto na obserwacjach klinicznych, ze szczególnym uwzględnieniem nasilenia u nich biegunki. Intensywność biegunki oceniono w skali od 0 do 3 punktów [Kupczyński in. 2003]: 0 brak biegunki; 1 kał luźny, ale uformowany, słabe nasilenie biegunki; 2 kał luźny lub wodnisty, nieuformowany, umiarkowane nasilenie biegunki; 3 kał wodnisty lub z domieszkąśluzu, ewentualnie krwi, silna biegunka. Kał cieląt do badań bakteriologicznych pobierano bezpośrednio z odbytu do jałowych pojemników, jego analizy wykonano na podstawie instrukcji PZH [Instrukcja metodyczna 1983]. Od wszystkich cieląt pobierano krew z Ŝyły szyjnej zewnętrznej, w której oznaczono parametry hematologiczne: hematokryt, stęŝenie hemoglobiny, liczbę czerwonych i białych ciałek krwi, wskaźniki czerwonokrwinkowe (MCV, MCH, MCHC) przy uŝyciu analizatora hematologicznego Sysmex K-4500, a w surowicy krwi poziom białka całkowitego (Bc) metodą biuretową i jego frakcji metodą elektroforezy Acta Sci. Pol.

Badania nad zastosowaniem etanolowego... 87 na Ŝelu agarowym w komorze Cormay Diagnostics z odczytem frakcji w densytometrze DS-2 (Cormay). Terminy pobierania krwi, kału oraz oceny nasilenia biegunki u cieląt przedstawiono w tabeli 1. Cielęta waŝono w 7 i 21 dniu Ŝycia i na tej podstawie określono dobowe przyrosty masy ciała w tym okresie. Uzyskane wyniki badań poddane zostały analizom statystycznym przy uŝyciu programu statystycznego Statgraphics ver. 5.0 z uwzględnieniem średnich, odchyleń standardowych oraz istotności róŝnic między grupami i kolejnymi terminami badań testem Duncana. Tabela 1. Schemat doświadczenia Table 1. Diagram of experiment Grupa Group Terminy pobierania krwi, kału oraz oceny nasilenia biegunki u cieląt The terms of blood and faeces sampling as well as estimations of diarrhoea intensification at calves 7 dzieńŝycia 7 day of life 14 dzieńŝycia 14 day of life 21 dzieńŝycia 21 day of life I X X X II X X III X X IV X X V X X WYNIKI I DYSKUSJA Oceniając stan zdrowotny cieląt w dniu rozpoczęcia badań stwierdzono u wszystkich zwierząt występowanie biegunki o zbliŝonym nasileniu (tab. 2). Najwyraźniejsze jej objawy wystąpiły u cieląt grupy I, IV i V, ocena punktowa nasilenia biegunki wyniosła odpowiednio 2,38, 2,54 i 2,5 pkt. W trakcie badań własnych stwierdzono szczególnie korzystne oddziaływanie ekstraktu propolisu, podawanego w ilości 4 ml/dobę/sztukę (grupa IV i V). Objawy biegunki u cieląt tych grup w dniu zakończenia badań ustąpiły. Nieco słabszy efekt uzyskano podając cielętom preparat w ilości 2 ml/dobę/sztukę. Przy tej dawce konieczne było jego dłuŝsze stosowanie. Cielęta kontrolne w dniu zakończenia badań charakteryzowały się słabym nasileniem biegunki (tab. 2). W literaturze fachowej prezentowane są róŝne metody terapii biegunek u cieląt [Constable i in. 2001, McClure 2001, Sunderland i in., 2003]. Sunderland i in. [2003] stosując w leczeniu biegunki u cieląt na tle E. coli danofloxacin 18%, sulfonamidy lub gentamycynę stwierdzili u większości przypadków (93,2 93,9%) ustąpienie objawów klinicznych w 4 dniu po rozpoczęciu leczenia. Przydatność róŝnych naturalnych dodatków w profilaktyce i leczeniu zaburzeń przewodu pokarmowego cieląt wykazano po zastosowaniu m.in. węgla brunatnego, kwasów huminowych oraz ich mieszanek z naturalnymi kopalinami [Chudoba-Drozdowska 1998, Chudoba-Drozdowska i in. 2000, Janeczek i in. 1997], a takŝe bentonitu [Dembiński i in. 1985]. Korzystne efekty uzyskali równieŝ Kondracki i in. [1994] po zastosowaniu u cieląt preparatu Neopropolisvet, zawierającego w swoim składzie oprócz antybiotyków i ziół, propolis. W wielu badaniach dotyczących czynników infekcyjnych biegunki u cieląt, zawsze podkreśla się etiologiczne znaczenie róŝnych enteropatogennych szczepów E. coli Medicina Veterinaria 2(2) 2003

88 B. Chudoba-Drozdowska i in. [China i in. 1998, de la Fuente i in. 1998, Bradford i in. 1999, García i in. 2000, Sunderland i in. 2003]. Enteropatogeny występujące w kale cieląt z biegunką równieŝ są wykrywane u cieląt zdrowych, a infekcje mieszane częściej występują u cieląt z biegunką niŝ u zdrowych [Wernicki, Rzedzicki 1988b; de la Fuente i in. 1998]. Tabela 2. Nasilenie objawów biegunki Table 2. Intensification of diarrhoea symptoms x x x Ocena objawów biegunki (pkt) Przyrosty dobowe Grupa Estimate of diarrhoea symptoms (points) Daily gain Group 7 dzieńŝycia 14 dzieńŝycia 21 dzieńŝycia (kg) 7 day of life 14 day of life 21 day of life SD x SD SD SD I 2,38±0,92 A 1,94±1,15 a 1,06±0,50 aa 0,309±0,208 II 2,34±0,64 B 1,14±0,90 B 0,421±0,197 III 2,17±0,73 C 0,45±0,73 C 0,392±0,286 IV 2,54±0,62 D 0,53±0,45 D 0,414±0,261 V 2,50±0,53 E 0,25±0,38 E 0,493±0,260 Statystyka* I<<IV; I<II Objaśnienia Explanations: 1) w okresie 14 dni in term of 14 days, > istotność róŝnic pomiędzy grupami przy p 0,05 significant differences between groups at p 0,05 >> istotność róŝnic pomiędzy grupami przy p 0,01 significant differences between groups at p 0,01 a, b istotność róŝnic pomiędzy terminami oceny przy p 0,05 significant differences between terms of estimate making at p 0,05 A, B istotność róŝnic pomiędzy terminami oceny przy p 0,01 significant differences between terms of estimate making at p 0,01 * Charakterystyka statystyczna Statistical characteristic W dniu rozpoczęcia badań najwyŝszą ogólną liczbę drobnoustrojów stwierdzono w kale cieląt grupy IV (26,43x10 7 cfu/g), natomiast najniŝszą u grupy II (13,58x10 7 cfu/g). Wśród flory bakteryjnej najwyŝsza liczba E. coli występowała w kale cieląt grupy I (40,83x10 7 cfu/g), u pozostałych grup była niŝsza, u cieląt grupy V wyniosła jedynie 8,0x10 7 cfu/g (tab. 3). Rozpatrując zmiany ilościowe dotyczące liczby drobnoustrojów stwierdzono, Ŝe u grupy kontrolnej nastąpiło jej obniŝenie się w 14 dniu Ŝycia, o 37%, przy redukcji E. coli, wyniosła w 14 dniu 49,79% i 67,62% w 21 dniu ich Ŝycia. U tych cieląt słaba biegunka jednak utrzymywała się nadal (tab. 2), wśród badanych drobnoustrojów stwierdzono wzrost liczby Enterococcus faecalis (o 64,08%). Podanie cielętom ekstraktu z propolisu w ilości 2 ml/dobę/szt. przez 1 tydzień spowodowało obniŝenie się ogólnej liczby drobnoustrojów, o 42,93%. Większą redukcję ogólnej liczby drobnoustrojów w kale cieląt, o 77,46%, uzyskano po podaniu takiej samej dawki preparatu przez 2 tygodnie (grupa III), natomiast redukcja liczby E. coli u tej grupy wyniosła 77,83%. Podanie cielętom preparatu w ilości 4 ml/dobę/szt. przez 1 tydzień spowodowało 53,35% obniŝenie liczby drobnoustrojów w kale cieląt, a przez 2 tygodnie (grupa V) 78,14%, przy czym redukcja liczby E.coli o 57,50%. NaleŜy zaznaczyć, Ŝe liczba tych bakterii w kale cieląt w dniu rozpoczęcia badań była znacznie niŝsza, w porównaniu do innych grup. Wiele badań wskazuje na zmienną i stosunkowo duŝą niewraŝliwość szczepów E. coli na antybiotyki [Wernicki, Rzedzicki 1988a, Rypuła i in. 1999, Gunn i in. 2003], przy czym znacznie większa jest antybiotykooporność szczepów E. coli wyizolowanych Acta Sci. Pol.

Badania nad zastosowaniem etanolowego... 89 od cieląt z biegunką, niŝ cieląt zdrowych [Gunn i in. 2003]. Oprócz określania wraŝliwości patogenów na chemioterapeutyki określano takŝe wraŝliwość szczepów E. coli na naturalne związki. W badaniach in vitro wraŝliwości 19 szczepów E. coli na ekstrakt z zielonej herbaty uzyskano minimalne stęŝenie hamujące (MIC) w przedziale 200 do 500 µg/ml [Ishihara i in. 2001]. W badaniach tych częstotliwość występowania biegunki u cieląt otrzymujących ten ekstrakt była niŝsza niŝ u cieląt kontrolnych. Podobnie wyniki, jak w badaniach własnych uzyskano po zastosowaniu u cieląt ekstraktu z grejpfruta [Kupczyński in. 2003]. Tabela 3. Zmiany ilościowe bakterii w kale cieląt w kolejnych pobraniach (10 7 cfu/g) Table 3. Quantitative changes of bacterium in calves faeces in following sampling (10 7 cfu/g) Grupa I Group I Grupa II Group II Grupa III Group III Grupa IV Group IV Grupa V Group V Wyszczególnienie Specification Ogólna liczba bakterii Total of bacterium 7 dzieńŝycia 7 day of life x + SD 14 dzieńŝycia / 14 day of life 21 dzieńŝycia / 21 day of life x + SD % redukcji lub wzrostu w stosunku do początku badań % of reduction or growth in relation to start of studies x + SD % redukcji lub wzrostu w stosunku do początku badań % of reduction or height in relation to start of studies 23,57 + 31,39 14,70 + 6,77 37,70 14,75 +21,70 37,42 Escherichia coli 40,83 + 51,81 20,50 + 7,51 49,79 15,67 + 6,08 67,62 Klebsiella oxytoca 8,00 + 6,08 9,42 + 1,15 + 17,75 6,33 + 9,90 20,88 Enterococcus faecalis 13,00 + 14,14 3,50 73,08 21,33 + 64,08 Ogólna liczba bakterii Total of bacterium 13,58 + 8,79 7,75 + 0,26 42,93 Escherichia coli 28,33 + 22,67 9,17 + 7,03 67,63 Klebsiella oxytoca 10,40 + 10,24 6,33 + 6,66 39,13 Enterococcus faecalis 2,00 100 Ogólna liczba bakterii Total of bacterium 22,67 + 15,66 5,11 + 4,83 77,46 Escherichia coli 27,83 + 15,69 6,17 + 6,08 77,83 Klebsiella oxytoca 17,50 + 3,54 3,00 + 2,12 82,86 Enterococcus faecalis Ogólna liczba bakterii Total of bacterium 26,43 + 22,59 12,33 + 7,06 53,35 Escherichia coli 21,67 + 19,02 15,67 +18,48 27,69 Klebsiella oxytoca 31,20 + 50,97 9,00 + 8,49 71,54 Enterococcus faecalis Ogólna liczba bakterii Total of bacterium 14,55 + 11,77 3,18 + 0,02 78,14 Escherichia coli 8,00 + 8,88 3,40 + 1,67 57,50 Klebsiella oxytoca 22,40 + 26,71 2,75 + 1,71 87,72 Enterococcus faecalis Medicina Veterinaria 2(2) 2003

90 B. Chudoba-Drozdowska i in. Od wielu lat istnieje duŝe zainteresowanie propolisem jako substancją leczniczą, nie tylko człowieka, ale równieŝ zwierząt [Gliński i in. 1987, Meresta i in. 1989, Meresta 1997, Malinowski 2002]. W zaleŝności od rejonu geograficznego (szaty roślinnej) jak i warunków klimatycznych propolis charakteryzuje się określonym składem chemicznym i właściwościami biologicznymi [Kujumgiev i in. 1999, Hegazi i in. 2000]. Ma on działanie antybakteryjne, antywirusowe, przeciwpierwotniacze, przeciwzapalne, a nawet znieczulające [Gliński i Meresta 1993, Keskin i in. 2000, Stojko i in. 2001]. Rozpoznano około 208 substancji wchodzących w skład propolisu [Marcucci 1995]. UwaŜa się, Ŝe aktywność antybakteryjna propolisu jest wypadkową synergistycznego działania flawonoidów, estrów, kwasów aromatycznych, aminokwasów, sekwiterpenów (w tym diterpenów) i innych związków [Marcucci 1995, Kujumgiev i in. 1999]. W badaniach in vitro stwierdzono właściwości bakteriostatyczne i bakteriobójcze (określając MIC i MBC) w przypadku wielu bakterii i grzybów. Wyniki niektórych prac sugerują, Ŝe propolis charakteryzuje się dobrymi właściwościami bakteriobójczymi odnośnie szczepów bakterii Gram-dodatnich, natomiast słabszymi, jeśli chodzi o Gram-ujemne [Keskin i in. 2001], zwłaszcza w stosunku do Enterobacteriaceae [Drago i in. 2000]. Innego zdania są Hegazi i in. [2000], którzy stwierdzili duŝą aktywność propolisu pochodzącego z Francji i Niemiec w stosunku do np. E. coli, uzaleŝniając to jego pochodzeniem. Istnieje zatem potrzeba standaryzacji metod jego ekstrakcji i aktywności biologicznej, uwzględniając MIC oraz MBC [Gliński i Meresta, 1993]. Ekstrakty etanolowe propolisu przechowywane przez wiele lat, charakteryzują się wraz z wiekiem wzrostem aktywności bakteriostatycznej i bakteriobójczej [Meresta 1997]. Jego działanie przecibakteryjne zwłaszcza istotne jest w przypadku bakterii opornych na antybiotyki czy inne chemioterapeutyki [Meresta i in. 1989]. Zawsze jednak mimo określonego in vivo działania bakteriobójczego danego środka waŝne są badania terenowe nad efektywnością terapeutyczną. Analizując średni poziom badanych parametrów hematologicznych w dniu rozpoczęcia badań, mimo pewnych wahań, nie stwierdzono róŝnic statystycznych pomiędzy poszczególnymi grupami cieląt (tab. 4). Wartość hematokrytowa była najniŝsza u cieląt grupy V (0,34 l/l), natomiast najwyŝsza u grupy I (0,37 l/l). Średnie wartości stęŝenia hemoglobiny i MCH były na zbliŝonym poziomie u poszczególnych grup. Wartości badanych parametrów hematologicznych mieściły się w szerokim przedziale wartości referencyjnych podawanych przez Knowles a i in. [2000] dla cieląt klinicznie zdrowych. U cieląt z objawami biegunki stwierdza się wzrost wartości hematokrytu, a takŝe poziomu Hb i MCHC, czemu towarzyszy zmniejszenie się MCV [Hejłasz i Nicpoń 1980, Cole i in. 1997, Constable i in. 2001]. Hejłasz i in [1980] u cieląt z biegunką stwierdzili wartość Ht na poziomie 35,14 l/l, wyŝsze wartości poziomu Ht uzyskano wywołując u cieląt biegunkę doświadczalnie [Albrycht i in. 1994, Constable i in. 2001]. Na przestrzeni okresu badawczego u cieląt grup doświadczalnych stwierdzono obni- Ŝenie się wartości hematokrytowej wraz z ustąpieniem objawów biegunki. U cieląt kontrolnych Ht podlegał stopniowemu obniŝeniu. Statystycznie wysoko istotny wzrost (p 0,01) stęŝenia hemoglobiny, MCH i MCHC stwierdzono u cieląt grupy II oraz MCH i MCHC u cieląt grupy V. Uzyskane wielkości sięgały górnych poziomów wartości normatywnych lub nieznacznie je przekraczały [Knowles i in. 2000], jednak biorąc pod uwagę dobry kliniczny stan zdrowia cieląt naleŝy przypuszczać, iŝ było to spowodowane korzystnym działaniem zastosowanego preparatu na układ czerwonokrwinkowy cieląt. Podobny wpływ na układ czerwonokrwinkowy, zastosowanych jako dodatek do Acta Sci. Pol.

Badania nad zastosowaniem etanolowego... 91 paszy dla cieląt mieszanek mineralno-ziołowych, uzyskali Saba i in [2000]. W badaniach własnych wpływ kitu pszczelego związany z jego dawką i długością podawania nie był jednoznaczny. Najkorzystniejsze zmiany stwierdzono u cieląt grupy II i V. Zastosowane, we wcześniejszych badaniach jako dodatki do paszy dla cieląt kwasy huminowe z węglem brunatnym spowodowały wzrost stęŝenia hemoglobiny w ich krwi [Janeczek i in. 1997], natomiast w innych badaniach nad zastosowaniem róŝnych naturalnych kopalin nie stwierdzono ich wpływu na poziom parametrów hematologicznych [Chudoba-Drozdowska 1998, Chudoba-Drozdowska i in. 2000]. Tabela 4. Średnie wartości parametrów hematologicznych we krwi cieląt Table 4. Mean values of the hematological parameters in blood of calves Grupa Group Hematokryt Haematocrit 1/l Hemoglobina Haemoglobin mmol/l Erytrocyty Red blood cells T/l MCV fl MCH fmol MCHC mmol/l Leukocyty White blood cells G/l x SD x SD x SD x SD x SD x SD x SD Pobranie w 7 dniu Ŝycia Sampling in 7 day of live I 0,37±0,03 6,90±0,68 8,32±0,64 44,72±1,26 0,83±0,03 18,53±0,63 9,41±2,57 II 0,35±0,05 6,06±0,93 A 7,31±1,14 44,05±2,09 0,83±0,03 A 18,83±0,78 A 9,04±2,43 III 0,35±0,06 6,53±1,14 7,94±1,24 44,87±5,13 a 0,84±0,08 18,76±0,64 8,63±2,37 IV 0,36±0,07 6,81±1,43 8,41±1,62 42,77±3,40 0,81±0,03 18,97±1,46 7,83±3,56 V 0,34±0,06 6,75±1,62 7,72±1,04 44,40±1,53 0,88±0,20 B 19,75±4,54 B 9,46±4,87 Statystyka * Pobranie w 14 dniu Ŝycia Sampling in 14 day of live I 0,35±0,05 6,6±0,92 8,07±0,96 43,41±1,58 0,82±0,03 18,80±0,24 10,91±2,40 II 0,31±0,04 7,87±0,73 A 7,36±1,77 42,86±5,63 1,25±0,23 A 25,32±2,41 A 6,80±2,49 IV 0,31±0,07 5,8±1,16 7,11±1,50 43,80±3,43 0,81±0,04 18,69±1,88 9,0±1,51 Statystyka * II<<I, IV II<<I, IV I<<II Pobranie w 21 dniu Ŝycia Sampling in 21 day of live I 0,33±0,06 6,2±1,02 7,75±1,08 42,88±2,03 0,80±0,03 18,57±0,41 8,16±2,32 III 0,30±0,02 5,90±0,49 6,89±0,44 43,54±7,35 a 0,86±0,12 19,67±1,29 9,39±2,79 V 0,30±0,05 7,35±2,29 7,04±1,03 40,00±4,04 1,00±0,29 B 22,81±5,93 B 7,78±1,55 Statystyka * III<IV V<<I,III Objaśnienia: jak w tabeli 2 Explanations: like in the Table 2 Poziom białka całkowitego w surowicy krwi cieląt w dniu rozpoczęcia badań był u poszczególnych grup dość zróŝnicowany i wahał się od 54,13 g/l u grupy V do 59,38 g/l u grupy kontrolnej (p 0,01). Cole i in. [1997] podają, Ŝe wzrost poziomu białka całkowitego w surowicy krwi cieląt moŝe wynikać m.in. z odwodnienia organizmu. Na przestrzeni okresu badawczego nastąpiło obniŝenie się poziomu białka całkowitego w surowicy krwi cieląt grupy IV i V, u grup II i III pozostało na prawie niezmienionym poziomie, natomiast u cieląt kontrolnych w 21 dniu Ŝycia zaznaczyło się jego obniŝenie. W 7 dniu Ŝycia cieląt średni poziom albumin w surowicy ich krwi był stosunkowo wyrównany, jedynie niŝszy poziom odnotowano u cieląt grupy II. Na przestrzeni okresu badawczego stwierdzono ich wzrost u grupy I i III (p 0,05). Największe róŝnice dotyczące frakcji białkowych wystąpiły w przypadku α-globulin w poszczególnych pobra- Medicina Veterinaria 2(2) 2003

92 B. Chudoba-Drozdowska i in. niach (tab. 5), z tendencją spadkową u wszystkich grup cieląt. Podobne zmiany dotyczyły γ-globulin w surowicy krwi, przy czym u cieląt otrzymujących wyŝszą dawkę preparatu, uzyskane wartości w dniu zakończenia badań nieznacznie przewyŝszały wartości początkowe. Świadczyć to moŝe o pewnym stymulującym wpływie propolisu na procesy odpornościowe i w okresie wygasania biernej odporności siarowej nie obserwowano tak wyraźnego spadku γ-globulin, jak u cieląt grupy kontrolnej. W tym okresie Ŝycia cieląt zawartość γ-globulin w surowicy krwi ulega fizjologicznemu obni- Ŝeniu, wraz z obniŝeniem się białka całkowitego [Chudoba-Drozdowska 1998, Cole i in. 1997]. Tabela 5. Średnie wartości białka całkowitego oraz jego frakcji w surowicy krwi cieląt Table 5. Mean values of the total protein and its fractions in blood serum of calves Grupa Group Białko całkowite Total protein g/l Albuminy Albumins g/l Globuliny Globulins g/l α β γ x SD x SD x SD x SD x SD Pobranie w 7 dniu Ŝycia Sampling in 7 day of live I 59,38±4,17 28,88±3,72 ab 12,7±1,47 aa 9,29±1,60 8,5±2,13 II 54,50±7,39 23,89±2,36 12,53±1,23 b 9,34±2,23 8,63±3,44 III 57,25±4,42 27,50±2,45 c 12,3±2,14 c 9,88±0,95 7,3±2,02 IV 58,24±4,50 27,93±2,92 12,1±1,36 9,39±2,39 9,2±3,19 V 54,13±6,83 29,20±4,20 10,1±1,75 8,36±2,35 6,5±0,88 I<<V, Statystyka * V<<I,III,IV I<II, V<II,III,IV Pobranie w 14 dniu Ŝycia Sampling in 14 day of live IV<V I 60,29±3,74 34,00±6,23 a 10,79±1,92 a 8,56±1,25 7,19±1,02 II 55,83±2,04 27,87±3,27 10,1±1,01 b 10,13±2,41 8,1±2,15 IV 57,91±5,73 28,04±2,98 10,9±1,65 9,04±2,32 9,4±2,34 Statystyka * IV<<I,II Pobranie w 21 dniu Ŝycia Sampling in 21 day of live I 57,57±2,59 33,03±2,93 b 10,16±1,50 A 7,53±1,33 7,04±0,66 III 51,14±1,14 27,96±2,58 10,0±1,72 c 7,56±1,24 6,9±1,11 V 57,45±5,88 30,75±4,07 8,5±1,27 8,88±2,11 7,3±1,09 Statystyka * III<I,IV I<III Objaśnienia: jak w tabeli 2 Explanations: like in the Table 2 Wyraźny wzrost poziomu Bc i γ-globulin w surowicy krwi cieląt uzyskano po zastosowaniu naturalnych dodatków [Chudoba-Drozdowska 1998, Chudoba-Drozdowska i in. 2000]. RównieŜ zastosowanie mieszanek mineralno-ziołowych w Ŝywieniu cieląt wpływa na lepsze wykorzystanie białka zawartego w paszy i wyŝsze poziomy tego wskaźnika w surowicy krwi [Saba i in. 2000, 2002]. Oceniając średnie przyrosty masy ciała cieląt w okresie badań stwierdzono, Ŝe mimo braku róŝnic statystycznych były one bardzo zróŝnicowane (tab. 2). W dniu zakończe- Acta Sci. Pol.

Badania nad zastosowaniem etanolowego... 93 nia badań cielęta otrzymujące propolis osiągnęły wyŝsze dobowe przyrosty w porównaniu do cieląt kontrolnych. U cieląt grupy V były one najwyŝsze i wyniosły 0,493 kg/dobę, natomiast u cieląt kontrolnych 0,309 kg/dobę. WyŜsze przyrosty masy ciała cieląt doświadczalnych potwierdzają pozytywny wpływ zastosowanego preparatu na ich zdrowotność. W innych badaniach po zastosowaniu u cieląt naturalnych dodatków przyrosty dobowe ich masy ciała były podobne [Chudoba-Drozdowska i in. 2000, Janeczek i in. 1997]. Na wielkość przyrostów dobowych młodych cieląt wpływ ma szereg czynników, w tym związanych z organizacją Ŝywienia, w tym okresu wprowadzania pasz stałych [Bilska i Wójcik 2003]. PODSUMOWANIE Wyniki przeprowadzonych badań wskazują, Ŝe zastosowany u cieląt etanolowy ekstrakt propolisu jest przydatnym środkiem poprawiającym zdrowotność cieląt z objawami biegunki. Świadczy o tym działanie łagodzące i hamujące objawy biegunki oraz znaczna redukcja liczby drobnoustrojów w kale cieląt, a zwłaszcza redukcja liczby E. coli. Preparat równieŝ korzystnie wpłynął na kształtowanie się parametrów hematologicznych krwi oraz poziomu białka całkowitego i γ-globulin w surowicy krwi. W efekcie cielęta doświadczalne charakteryzowały się wyŝszymi przyrostami dobowymi masy ciała w porównaniu do kontrolnych. Zastosowanie wyŝszej dawki umoŝliwia skrócenie czasu stosowania preparatu. PIŚMIENNICTWO Albrycht A., Bieniek K., Cąkała S., Kondracki M., Bik D., 1994. Wpływ podawania płynów elektrolitowych na wyrównanie zaburzeń metabolicznych występujących w przebiegu doświadczalnej biegunki u cieląt. Med. Wet. 50, 563 566. Bilska A., Wójcik J., 2003. Wpływ róznego sposobu Ŝywienia cieląt na ich wzrost i rozwój Ŝwacza. Zesz. Nauk. Przegl. Hod., 69, 189 196. Bradford P.A., Petersen P.J., Fingerman I.M., White D.G., 1999. Characterization of expandedspectrum cephalosporin resistance in E. coli isolates associated with bovine calf diarrhoeal disease. J. Antimicrobial Chemotherapy, 44, 607 610. Callaway T.R., Elder R. O., Keen J. E., Anderson R.C., Nisbet D. J., 2003. Forage feeding to reduce preharvest escherichia coli populations in cattle, a review. J. Dairy Sci. 86, 852 860. China B., Pirson V., Mainil J., 1998. Prevalence and molecular typing of attaching and effacing Escherichia coli among calf populations in Belgium. Vet. Microb., 63, 249 259. Chudoba-Drozdowska B., 1998. Węgiel brunatny w chowie cieląt. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol., 455, 173 184. Chudoba-Drozdowska B., Janeczek W., Kupczyński R., 2000. Influence of brown coal, humic acids and their mixture fed to calves on health and formation of chosen blood indexes. Vet. Med. Czech. 45, 116 117. Cole D. J., Roussel A.J., Whitney M. S., 1997. Interpreting a bovine CBC: Collecting a sample and evaluating the erythron. Vet. Med. 92, 460 469. Constable P.D., Thomas E., Boisrame B., 2001. Comparison of two oral electrolyte solutions for the treatment of dehydrated calves with experimentally induced diarrhoea. Vet. J. 162, 129 140. de la Fuente R., García A., Ruiz-santa-Quiteria J.A., Luzón M., Cid D., García S., Orden J.A., Gómez-Bautista M., 1998. Proportional morbidity rates of enteropathogens among diarrheic dairy calves in central Spain. Prev. Vet. Med. 36, 145 152. Medicina Veterinaria 2(2) 2003

94 B. Chudoba-Drozdowska i in. Dembiński Z. Więckowski W., Kulińska A., 1985. Zastosowanie bentonitu produkcji krajowej w schorzeniach przewodu pokarmowego nowo narodzonych cieląt. Med. Wet. 41, 361 362. Drago L., Mombelli B., de Vecchi E., Fassina M.C., Tocalli L., Gismondo M. R., 2000. In vitro antimicrobial activity of propolis dry extract. J. Chemother. 12, 390 395. García A., Ruiz-Santa-Quiteria J.A., Orden J. A., Cid D., Sanz R., Gómez-Bautista M., de la Fuente R., 2000. Rotavirus and concurrent infections with other enteropathogens in neonatal diarrheic dairy calves in Spain. Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 23, 175 183. Gliński Z., Jarosz J., Maresta T., 1987. Przeciwdrobnoustrojowe działanie propolisu. Med. Wet., 2, 43, 74 79. Gliński Z., Maresta T., 1993. Próba standaryzacji aktywności przeciwbakteryjnej kitu pszczelego. Med. Wet., 1, 49, 27 29. Gunn G.J., Hall M., Low J.C., 2003. Comparison of antibiotic resistance for Escherichia coli populations isolated from groups of diarrhoeic and control calves. Vet. J. 165, 172 174. Hegazi A.G, Abd El Hady F.K., Abd Allah F.A., 2000. Chemical composition and antimicrobial activity of European propolis. Z. Naturforsch. 55c, 70 75. Hejłasz Z., Nicpoń J., 1980. Biegunki cieląt a zaburzenia w układach buforowych krwi matek i noworodków próby regulacji równowagi kwasowo-zasadowej. Med. Wet. 36, 602 605. Instrukcja metodyczno-organizacyjna Zakładu Bakteriologii PZH dla stacji sanitarno- -epidemiologicznych. Warszawa 1983. Ishihara N., Chu D.C., Akachi S., Juneja L.R., 2001. Improvement of intestinal microflora balance and prevention of digestive and respiratory organ diseases in calves by green tea extracts. Livest. Prod. Sci. 217 229. Janeczek W., Chudoba-Drozdowska B., Rojkowski A., Pogoda-Sewerniak K., Weinmann A., 1997. Wpływ kwasów huminowych oraz ich mieszanek z naturalnymi kopalinami na wzrost i zdrowotność cieląt. Zesz. Nauk. AR Wroc. Zoot. 43, 7 25. Keskin N., Hazir S., Baser K. H., Kurkcuoglu M., 2001. Antibacterial activity and chemical composition of Turkish propolis. Z. Naturforsch. 56c, 1112 1115. Knowles T.G., Edwards J.E., Bazeley K.J., Brown S. N., Butterworth A., Warriss P.D., 2000. Changes in the blood biochemical and haematological profile of neonatal calves with age. Vet. Rec. 147, 593 598. Kondracki M., Bednarek D., Bieniek K., 1994. Przydatność preparatu Neopropolisvet w leczeniu zaburzeń przewodu pokarmowego u cieląt. śycie Wet. 10: 382 383. Kujumgiev A., Tsvetkova I., Serkedjieva Y., Bankova V., Christov R., Popov S. 1999. Antibacterial, antifungal and antiviral activity of propolis of different geographic origin. J. Ethnopharmacol. 64, 235 240. Kupczyński R., Chudoba-Drozdowska B., Roman A., 2003. Wstępne badania nad zastosowaniem ekstraktu z grejpfruta u cieląt z objawami biegunki. Mat. Konf. śywienie a zdrowie zwierząt oraz aktualne problemy higieny i prewencji weterynaryjnej. Ciechocinek 4 7. 09. 2003, 74 76. Malinowski E., 2002. The use of some immunomodulators and non-antibiotic drugs in a prophylaxis and treatment of mastitis. Pol. J. Vet. Sci. 5, 197 202. Marcucci M.C., 1995. Propolis: chemical composition, biological properties and therapeutic activity. Apidologie, 26, 83 99. Maresta L., Maresta T., Burdziński J., Chmurzyński P., 1989: Leczenie mastitis u bydła ekstraktem propolisu. Med. Wet., 45, 392 394. McClure J.T., 2001. Oral fluid therapy for treatment of neonatal diarrhoea in calves. Vet. J. 162. 87 89. Meresta T., 1997. Zmiany aktywności przeciwbakteryjnej ekstraktów propolisu w czasie wieloletniego przechowywania. Med. Wet., 53, 277 278. Acta Sci. Pol.

Badania nad zastosowaniem etanolowego... 95 Rypuła K., Klimentowski S., Kotowski K., Śmielewska-Łoś E. 1999. WraŜliwość na chemioterapeutyki bakterii izolowanych od cieląt i prosiąt ze schorzeniami układu oddechowego i pokarmowego. Med. Wet. 55, 391 396. Saba L., Bis-Wencel H., Nowakowicz-Dąbek B., Stenzel R., Ondrasovic M., 1999. Wpływ mieszanek mineralno-ziołowych w okresie odchowu cieląt na wskaźniki hematologiczne. Ann. UMCS, EE, 1999, XVII, 347 352. Saba L., Stenzel R., Bis-Wencel H., Wnuk W., Usban J., 2000. Wpływ mieszanek ziołowych na poziom wybranych wskaźników profilu metabolicznego w surowicy krwi cieląt. Ann. UMCS, EE XVIII, 183 189. Stojko A., Pytel A., Stojko J., Juszko-Piekut M., Moździerz A., 2001: Właściwości biotyczne apiterapeutyku Propol-0. XXXVIII Naukowa Konferencja Pszczelarska, Puławy, 13 14 marca, 129 130. Sunderland S.J., Sarasola P., Rowan T.G., Giles C.J., Smith D.G., 2003. Efficacy of danofloxacin 18% injectable solution in the treatment of Escherichia coli diarrhoea in young calves in Europe. Research Vet. Sci., 74, 171 178. Wernicki A., Rzedzicki J., 1988a. LekowraŜliwość szczepów Escherichia coli izolowanych w okresie neonatalnym od cieląt zdrowych oraz z klinicznymi objawami biegunki. Med. Wet. 44, 85 87. Wernicki A., Rzedzicki J., 1988b. Występowanie wybranych drobnoustrojów enteropatogennych u cieląt zdrowych oraz z objawami biegunki w wieku do trzeciego tygodnia Ŝycia. Med. Wet. 44, 137 138. THE STUDIES ON APPLICATION OF AN ETHANOL EXTRACT OF PROPOLIS AT CALVES WITH DIARRHOEA SYMPTOMS Abstract. The studies were executed in aim of determining of an ethanol extract of propolis (EEP) influence, which was administered to calves with diarrhoea symptoms. The research were executed on 40 calves of Holstein-Friesian race, beginning from 7 days of their life, divided on 5 groups. Through period of 1 or 2 weeks, the calves were fed with different doses (2 or 4 ml) of EEP alongside with milk. The estimation of influence of applied preparation was based on clinical observation, bacteriological examination of faeces, hematological blood parameters as well as on marking of total protein and its fraction. The research were showed that EEP supplement, which was applied to calves with diarrhoea, caused an improvement of calves wholesome and appeasement and inhibition of diarrhoea symptoms. The EEP also caused considerable reduction of microorganisms number in faeces, from 42,93 to 77,46% (in this E. coli from 27,69 to 77,83%), what was depended on quantity and duration of administering of EEP. The advantageous effect of propolis on hematological blood parameters as well as total protein levels and gamma globulins in blood serum was affirmed. At calves receiving EEP, higher circadian growths of body weight in comparison to control group was affirmed. Key words: calves, ethanolic extracts of propolis (EEP), diarrhoea, E. coli, haematological and biochemical blood parameters BoŜena Chudoba Drozdowska, Robert Kupczyński, Adam Roman, Katedra Higieny Zwierząt i Ichtiologii, Zakład Higieny Zwierząt i Środowiska, Akademia Rolnicza we Wrocławiu ul. Chełmońskiego 38 c, 51 630 Wrocław, korespondencyjny e-mail: misiek@ozi.ar.wroc.pl Medicina Veterinaria 2(2) 2003