Aktywność granulocytów u dzieci z nawracającymi zakażeniami dróg oddechowych

Praca oryginalna Aktywność granulocytów u dzieci z nawracającymi zakażeniami dróg oddechowych The activity of granulocytes in children with recurrent infections of respiratory tract Barbara Jakubczak 1, Urszula Demkow 1, 2, Maria Wąsik 1 1 Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego AM w Warszawie, kierownik: prof. M. Wąsik 2 Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc, kierownik: mgr. A. Borowska Summary: Acute upper respiratory tract infection (URTI) is a common disease in young children. URTI contributes to approximately 20% of mortality in children younger than 5 years of age. Infections of the upper respiratory tract are the most common cause of viral morbidity in children. They represent the most frequent problem in general pediatric practice and are responsible for more than one third of school absences. On the other hand respiratory tract infections through MALT system play a positive role in maturation and development of immune system. Many different immunologic disturbances can occur during the development of respiratory infections. Disorders of granulocyte functions are the principal cause of inflammation in the upper respiratory tract. Chemiluminescence of granulocytes is a renowned method for the estimation their overall activity as measured by the production of reactive oxygen species. The goal of the study was to evaluate chemiluminescent activity of granulocytes from 41 children with recurrent infections of the respiratory tract compared to 30 healthy children. Chemiluminescent response to all the examined stimuli in children with recurrent infections was significantly lower compared to control.. In the examined group of 41 children depressed response to at least 1 stimulus was detected in 32 (78%) cases. The use of both fmlp and opsonised zymosan allowed to detect defect of granulocyte function in 93,75% cases. This defect may be related to delayed maturation of the immune system in certain children or may be induced by intensive therapy with antibiotics. Pneumonol. Alergol. Pol. 2005, 73, 160:166 Key words: respiratory tract infections in children, immune system, granulocytes, chemiluminescence Wstęp Nawracające zakażenia dróg oddechowych (NZDO) stanowią powszechny problem w praktyce klinicznej (1, 2). Stanowią one najczęstszą przyczynę konsultacji pediatrycznych i powodują około 1/3 absencji szkolnych (1, 2, 3). Z drugiej jednak strony zakażenia dróg oddechowych poprzez system MALT (Mucosa Associated Lymphoid Tissue) odgrywają ważną rolę w rozwoju i dojrzewaniu układu odpornościowego u dzieci (3). Odporność organizmu na zakażenia bakteryjne, wirusowe i grzybicze jest uwarunkowana prawidłowym współdziałaniem odporności nieswoistej wrodzonej i swoistej nabytej (4, 5). U noworodków i małych dzieci przeważa odporność nieswoista (4, 5, 6). W miarę dojrzewania układu immunologicznego mechanizmy odporności nieswoistej zostają wzmocnione przez swoistą, nabytą odpowiedź immunologiczną. Mechanizmy odporności nieswoistej pozostają w stałej gotowości obronnej choć u małych dzieci nie są jeszcze w pełni skuteczne, co może być powodem nawracających zakażeń [7]. Głównymi komórkami odporności nieswoistej są fagocyty (granulocyty, monocyty i makrofagi). Stanowią one pierwszą linię obrony przed zakażeniami. Granulocyty obojętnochłonne są najszybciej reagującą i dominującą liczbowo populacją komórek żernych krwi obwodowej. Zdolne są one do fagocytowania drobnoustrojów, wewnątrzkomórkowego ich zabijania i degradacji. Warunkiem sprawności granulocytów jest prawidłowy przebieg ich przemian metabolicznych [8, 9, 10, 11]. Procesowi wewnątrzkomórkowego zabijania towarzyszy aktywacja szeregu enzymów, która prowadzi do wytwarzania reaktywnych form tlenu i uwalniania wolnych rodników tlenowych (10, 11), co nosi nazwę wybuchu tlenowego respiratory burst. Znanych jest kilka metod oceny wybuchu tlenowego występującego w fagocytujących granulocytach (12, 13, 14, 15, 16). Ponieważ procesowi wybuchu tlenowego towarzyszy emisja światła chemiluminescencja, więc liczbę powstałych fotonów można mierzyć przy użyciu luminometru lub fotopowielacza licznika scyntylacyjnego określając wskaźniki chemiluminescencji (CI) (18, 19, 20). W granulocytach chemiluminescencję można indukować różnymi drogami: przez receptor chemotaktyczny (fmlp), receptor dla fragmentu Fc przeciwciała i dopełniacza (opsonizowany zymo- Pneumonologia i Alergologia

Aktywność granulocytów u dzieci z nawracającymi zakażeniami dróg odechowych san OZ) oraz drogą pozareceptorową (PMA) [12]. Ocenę zdolności komórek do chemiluminescencji przeprowadza się dwuetapowo. W pierwszym etapie bada się chemiluminescencję spontaniczną, w drugim, po dodaniu czynnika pobudzającego (chemiluminescencja stymulowana). W celu wzmocnienia reakcji stosuje dwa związki o dużej wydajności kwantowej: luminol i lucygenina. Związki te łatwo przechodzą w procesie utleniania w stan wzbudzenia, co pozwala na wzmocnienie efektów świecenia ok. 100 razy [12]. W praktyce klinicznej badanie chemiluminescencji znalazło zastosowanie w diagnostyce przewlekłej choroby ziarniniakowej, a także w nawracających zakażeniach, zapaleniu stawów, oparzeniach, urazach, posocznicach noworodków, zaburzeniach metabolicznych i innych. Coraz częściej stosuje się ocenę chemiluminescencji we wrodzonych i nabytych defektach czynnościowych granulocytów [18]. Ocena chemiluminescencji jest badaniem zalecanym przez Światową Organizację Zdrowia WHO [21] do oceny stanu odporności nieswoistej. Uważa się, że jest to metoda pośrednia oceny właściwości bakteriobójczych komórek żernych. Objawy zaburzeń czynności granulocytów mogą być związane ze zmniejszeniem ich liczby lub upośledzeniem ich zdolności do fagocytozy i zabijania wewnątrzkomórkowego [22]. Zakłócenie tylko jednej funkcji tych komórek może prowadzić do ciężkich nawracających zakażeń, w tym zakażeń układu oddechowego [23]. Cel pracy 1. Ocena aktywności metobolicznej granulocytów obojętnochłonnych mierzona testem chemiluminescencji u dzieci chorujących na NZDO w porównaniu do dzieci zdrowych. 2. Określenie przydatności zastosowania jednoczasowej stymulacji fmlp, OZ i PMA do oceny zaburzeń czynności granulocytów mierzonej chemiluminescencją, Materiał i metody Grupa badana obejmowała 41 dzieci (21 dziewczynek i 20 chłopców), w wieku od 1 roku do 15 lat (średnia wieku 7,0±4,19) chorujących na NZDO. Za kryterium nawracających zakażeń uznano 8 lub więcej epizodów zakażeń dróg oddechowych w ciągu roku. U tych chorych nie stwierdzano chorób alergicznych, hematologicznych i innych o podłożu immunologicznym oraz wykluczano dzieci z rozpoznanymi wadami wrodzonymi i innymi przewlekłymi chorobami. Badania immunologiczne wykonywano w okresie zdrowia, tj. bez klinicznych cech zakażenia i co najmniej 3 tygodnie po ostatniej infekcji, antybiotykoterapii, szczepieniu oraz co najmniej 3 miesiące po przebyciu choroby zakaźnej Grupa kontrolna obejmowała 30 dzieci zdrowych (11 dziewczynek i 19 chłopców), w wieku od 1 roku do 15 lat (średnia wieku 6,9±4). Do grupy kontrolnej zakwalifikowano dzieci, które w ciągu ostatniego miesiąca nie przebyły żadnej choroby zakaźnej, nie przyjmowały leków (w szczególności antyoksydantów, immunomodulatorów, antybiotyków) oraz miały prawidłowy obraz morfologiczny krwi obwodowej. Badania prowadzone były zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Komisję Bioetyczną AM w Warszawie. Rodzice pacjentów wyrazili pisemną zgodę na udział dziecka w badaniach po wcześniejszym zapoznaniu się z protokołem badawczym. Krew do badań pobierano z żyły łokciowej z jednorazowego wkłucia metod. U dzieci pobierano ok. 1,5 ml krwi. Do badania czynności granulocytów metodą chemiluminescencji oraz do izolacji granulocytów jako antykoagulantu stosowano heparynę (10 j./ml). Badanie wykonywano do dwóch godzin od pobrania materiału. Morfologię krwi obwodowej pobierano na wersenian potasu i wykonywano badanie w analizatorze hematologicznym Micro Diff II, firmy Coulter. Ocena chemiluminescencji. Badanie pomiaru światła emitowanego przez komórki krwi obwodowej wykonano w liczniku scyntylacyjnym Wallac 1409 firmy Wallac, Finland (z opcją do chemiluminescencji). Wykorzystywane w badaniu odczynniki przygotowywano według procedur opisanych wcześniej przez innych autorów [12, 13]. Odczynniki Luminol (5-amino,2,3-dihydro1,4-ftalazynodion) firmy Sigma ( stężenie 10-5 mola). Do 5 ml PBS dodawano 50 µl roztworu macierzystego luminolu (stężenie 10-3 mola) nfmlp (n-formylo-metionylo-leucylo-fenyloalanina) firmy Sigma(stężenie 10-5 mola). Opsonizowany zymosan (stężenie 20 mg/ml) PMA (ester forbolu) firmy Sigma (stężenie 1µg/ml) Płyn Hanksa z dodatkiem 0,5% hydrolizatu laktoalbuminy i NaHCO 3 (Wytwórnia Surowic i Szczepionek w Lublinie) do rozcieńczania krwi. Wykonanie badania. Krew pobraną na heparynę rozcieńczano 5x płynem Hanksa (50 µl krwi i 200 µl płynu Hanksa). Do probówki dodawano 200 µl luminolu (w stężeniu 10-5 mola), a następnie dodawano 50 µl rozcieńczonej krwi. Probówkę wstawiano do licznika scyntylacyjnego i uruchomiano przyciskiem startowym pomiar chemiluminescencji spontanicznej (pomiar tzw. tła). Oznaczano 15 sek.impulsy emitowanego światła. Po uzyskaniu 3 do 5 wyników pomiarowych wyłączano aparat. Następnie do tej samej probówki dodawano 20 µl fmlp (w stężeniu 10-3 mola). Ponownie uruchamiano licznik przyciskiem startowym i mierzono chemiluminescencję stymulowaną. Czas pomiaru chemiluminescencji stymulowanej nie przekraczał 60 min. (wyłączano aparat w przypadku spadku aktywności). Do dru- Polska 2005/73 161

B. Jakubczak i wsp. giej probówki dodawano 200 µl luminolu, 50 µl rozcieńczonej krwi i 20 µl opsonizowanego zymosanu (w stężeniu 20 mg/ml) i ponownie mierzono chemiluminescencję stymulowaną. Do trzeciej probówki dodawano 200 µl luminolu, 50 µl rozcieńczonej krwi i 20 µl PMA (w stężeniu 1µg/ml) i ponownie mierzono chemiluminescencję stymulowaną. Odczytane impulsy światła emitowane przez granulocyty w objętości 10 µl krwi przeliczano uwzględniając liczbę granulocytów w 1 µl. Obliczano wartość chemiluminescencji przypadającą na jedną komórkę (imp./kom.) w czasie maksymalnej odpowiedzi. Dla ilościowej oceny stymulacji granulocytów wprowadzono pojęcie indeksu chemiluminescencji (Cl), którego wartość jest proporcjonalna do ilorazu chemiluminescencji stymulowanej do spontanicznej. We wszystkich grupach oceniano indeks chemiluminescencji oraz czas potrzebny do uzyskania maksymalnej odpowiedzi na każdy stymulator. Uwzględniając leukocytozę oraz odsetek granulocytów obojętnochłonnych obliczano liczbę impulsów światła emitowanego przez na jedną komórkę w czasie 1 min. Analiza statystyczna wyników. Do analizy statystycznej wykorzystano program statystyczny STATISTICA 5.1; 97/00 w polskiej wersji. Do oceny istotności statystycznej różnic między badanymi paramerami stosowano testy nieparameryczne dla prób niezależnych (test U Manna-Whitneya) oraz test Wicoxona. Za poziom istotności przyjmowano p<0,05. Z uzyskanych wyników obliczano wartości średnie, odchylenia standardowe oraz medianę. Wyniki grupy zdrowych dzieci nie miały rozkładu normalnego, dlatego zastosowano metodę percentylową do obliczenia wartości odniesienia. Obliczano wartość 5 i 95 percentyla. Zakres wyników prawidłowych przyjmowano wyniki mieszczące się między 5 i 95 percentylem. Wyniki Wiek oraz wyniki leukocytozy w grupie kontrolnej i grupie badanej były porównywalne. Podobnie, odsetki limfocytów i granulocytów we krwi obwodowej nie różniły się istotnie statystycznie między grupą kontrolną i badaną (Tab. I.) Granulocyty dzieci chorujących na NZDO odpowiadały na stosowane stymulatory znacznie słabiej niż granulocyty dzieci zdrowych. Prawidłową odpowiedź na wszystkie stymulatory, stwierdzono tylko w 9 na 41 badanych dzieci. Obniżona odpowiedź granulocytów na stosowane stymulatory wystąpiła u 32 badanych dzieci z nawracającymi zakażeniami. Różnice średnich impulsów światła emitowanego w czasie 1min przez 1 komórkę w odpowiedzi na wszystkie trzy stosowane stymulatory były istotne statystycznie niższe w grupie dzieci chorujących na NZDO w porównaniu do grupy dzieci zdrowych. Porównano również czas uzyskania maksymalnej odpowiedzi (szczytowej produkcji wolnych rodników) po zastosowaniu fmlp, OZ i PMA, który nie różnił się istotnie statystycznie w obu porównywanych grupach dzieci (Tab.II). Spośród 41 dzieci badanych w 14 przypadkach zaobserwowano obniżoną odpowiedź na wszystkie stymulatory. U 6 chorych stwierdzono obniżoną odpowiedź na dwa stymulatory: fmlp i OZ, u jednego wystąpiło obniżenie odpowiedzi jednocześnie na fmlp i PMA a u 2 pacjentów stwierdzono defekt odpowiedzi jednocześnie na zymosan i PMA (Tab. III). Obniżoną odpowiedź na jeden stymulator stwierdzono u 9 chorych, z tego u 4 pacjentów była to obniżona odpowiedź na fmlp i u 3 obniżoną odpowiedź na zymosan oraz u 2 obniżoną odpowiedź na PMA (Tab.III). U chorych, u których obserwowano niską odpowiedź lub brak odpowiedzi, szczególnie po stymulacji fmlp, wykonywano oznaczenie aktywności mieloperoksydazy granulocytów. Badanie to wykonano u 25 chorych na NZDO. Tylko u jednego pacjenta stwierdzono brak aktywności tego enzymu, w pozostałych przypadkach aktywność była porównywalna do grupy kontrolnej. Tabela I. Wyniki badań i zakresy chemiluminescencji granulocytów krwi w zależności od zastosowanych stymulatorów uzyskane w grupie zdrowych dzieci. Table I. The results of chemiluminescence assay in different ranges depending on stimulator used in the group of healthy children. Wynik Result Cl Spont. CI FMLP OZ PMA Czas/time (min) 162 Pneumonologia i Alergologia CI. Czas/time (min) CI Czas/time (min) Średnia / Mean 0,13 48,9 11,3 81,4 20,6 71,26 31,1 SD 0,23 50,4 6,6 55,6 7,9 72,5 11,2 Mediana / Median 0,08 34,4 10,0 81,1 20,5 56,2 30,0 Percentyl 0,05 0,04 7,6 4,9 10,8 10,4 2,4 13,7 Percentyl 0,95 0,39 136,3 29,0 189,6 31,5 229,9 52,2 CI index chemiluminescencji; OZ opsonizowany zymosan

Aktywność granulocytów u dzieci z nawracającymi zakażeniami dróg odechowych Tabela II. Porównanie chemiluminescencji w grupie dzieci zdrowych i dzieci chorujących na nawracające zakażenia. Table II. The comparison of chemiluminescence index in the group of children with recurrent infection and in healthy children. Symulator Zdrowe/ Healthy n=30 Indeks chemiluminescencji/ci NZDO/ Recurrent infections n=41 Spontaniczna 0,13±0,2 0,11±0,1 ns Badane grupy / Examined groups p Czas maksymalnej odpowiedzi / Time Zdrowe/ Healthy n=30 NZDO Recurrent infections n=41 FMLP 48,9±50,4 17,6±20,2 0,000022 11,3±6,6 15,9±10,6 0,20 OZ 81,4=±55,6 29,7±33,7 0,000019 20,6±7,9 18,8±9,7 0,36 PMA 71,3±72,5 18,2±26,8 0,000065 31,1±11,2 31,4±9,6 0,82 p Tabela III. Częstość występowania obniżonego indeksu chemiluminescencji w odpowiedzi na różne stymulację. Table III. Frequency of decreased results of chemiluminescence stimulated by different factors. Pojedyńcze stymulatory i ich zestawy obniżające CI / Single stimulators and their set decreasing CI Dzieci zdrowe/healthy children n=30 NZDO/Recurrent infections n=41 Liczba/N % Liczba/N % FMLP+OZ+PMA 0 0 14 34,1 FMLP+OZ 0 0 6 14,6 FMLP+PMA 0 0 1 2,4 OZ+PMA 0 0 2 4,9 FMLP 1 3,3 4 9,8 OZ 1 3,3 3 7,3 PMA 1 3,3 2 4,9 Z grupy dzieci chorujących na NZDO, u których stwierdzono indeks chemiluminescencji granulocytów poniżej dolnej granicy wyników obserwowanych w grupie kontrolnej, wydzielono trzy podgrupy z obniżoną na wszystkie trzy stymulatory, na dwa z trzech stymulatorów i na jeden z trzech symulatorów (Ryc.1). Analizie poddano wyniki uzyskane w grupie 32 dzieci, u których zastosowanie trzech stymulatorów umożliwiło wykrycie defektu odpowiedzi granulocytów przynajmniej na jeden stymulator. W przypadku zastosowania tylko fmlp rozpoznanie defektu byłoby niemożliwe u 21,88% dzieci z nawracającymi się zakażeniami. Stosując tylko opsonizowany zymosan rozpoznanie defektu byłoby niemożliwe u 21,87% a w przypadku stosowania tylko PMA nie rozpoznanie defektu dotyczyłoby aż 40,6% dzieci z nawracającymi się zakażeniami. Zastosowanie fmlp i OZ wykrywało w tej grupie defekt granulocytów u 93,75% dzieci. Brak rozpoznania dotyczyłby tylko 6,25% badanych. Zastosowanie fmlp i PMA wskazywało na defekt występujący tylko u 87,6% dzieci badanych a brak rozpoznania dotyczyłby 12,38% badanych. Przyjmując, że 32 dzieci z grupy 41 badanych z nawracającymi zakażeniami ma zaburzoną czynność granulocytów w zakresie odpowiedzi na czynniki stymulujące do emisji światła zastosowanie przynajmniej dwóch stymulatorów zwiększało znacznie czułość tego testu. Ryc.1 Częstość występowania niskiej odpowiedzi granulocytów w grupie dzieci chorujących na NZDO. The frequency od low response in the group of children with recurrent infections. Polska 2005/73 163

B. Jakubczak i wsp. Dyskusja W niniejszej pracy wykazano, że granulocyty dzieci chorujących na NZDO odpowiadały istotnie statystycznie słabiej na wszystkie stosowane stymulatory w porównaniu z granulocytami dzieci zdrowych. Może to wynikać z wyczerpania zasobów energetycznych komórki, czyli reaktywnych form tlenu lub złuszczania się błonowych receptorów dla fmlp i Fc immunoglobulin, o czym świadczą obniżone wartości Cl po stymulacji fmlp i zymosanem. Depresyjnie na aktywność metaboliczną granulocytów może także działać antybiotykoterapia wywierająca hamujący wpływ na metabolizm tlenowy granulocytów [12]. Z danych w piśmiennictwie wynika, że częstość występowania defektu czynności granulocytów dotyczy od 12 do 100 % chorych na NZDO [24, 25]. Wyniki przedstawione w tej pracy są porównywalne z większością doniesień innych autorów [26, 27, 28, 29]. Zjawisko obniżonej chemiluminescencji, zarówno u dzieci jak i osób dorosłych chorujących na NZDO, opisano w wielu pracach [30, 31, 32, 33]. Badania Sikory i wsp. wykazały obniżoną chemiluminescencję granulocytów u dzieci chorych na NZDO [32]. Podobnie u dzieci chorych na nawracające lub przedłużające się zapalenia płuc obserwowano niskie wartości chemiluminescencji granulocytów [34, 35]. W chorobach zapalnych o nawracającym przebiegu obserwowano niskie wartości chemiluminescencji po stymulacji fmlp i OZ, natomiast prawidłowe po stymulacji PMA. Odpowiedź na stymulację PMA może być związana z miejscem jego działania, czyli z zachowaną lub zmienioną zdolnością do fosforyzacji czynnika cytozolowego oksydazy NADPH [36]. Zaobserwowano, że granulocyty mogą występować w kilku stanach czynnościowych: spoczynkowym, reaktywowanym, aktywowanym i wyczerpanym. Granulocyty osób zdrowych wykazują stosunkowo niską spoczynkową aktywność ocenioną chemiluminescencją i aktywnie odpowiadają na stymulację [37]. Natomiast u osób chorujących na NZDO komórki te mogą znajdować się w stanie preaktywowanym, aktywowanym lub wyczerpanym co powoduje, że mimo pobudzania ich różnymi stymulatorami nie odpowiadają znaczącym wzrostem wytwarzania wolnych rodników tlenowych [37]. W prezentowanej pracy nie stwierdzono jednak statystycznie istotnych różnic wartości chemiluminescencji spontanicznej w grupach badanych dzieci zdrowych oraz dzieci chorujących na NZDO, co upoważnia do wnioskowania, że obniżona zdolność do wybuchu oddechowego nie była efektem preaktywacji granulocytów. Nie można jednak wykluczyć stanu ich wyczerpania. Stan ten byłby bardzo silny i długotrwały biorąc pod uwagę, że prezentowane badania były przeprowadzone po upływie 3 tygodni od ostatniego epizodu choroby i po zakończonym leczeniu. Wyniki badań innych autorów oceniające wpływ fazy choroby i jej leczenia na zjawisko chemiluminescencji są sprzeczne. Braun i wsp. wykazali wzrost chemiluminescencji u chorych na ciężkie zapalenie płuc w porównaniu do chorych z obrzękiem płuc spowodowanym niewydolnością krążenia [38]. Adachi i wsp opisali pobudzenie chemiluminescencji zarówno w granulocytach izolowanych, jak i pełnej krwi u chorych we wczesnym okresie zapalenia płuc w porównaniu z osobami zdrowymi [39]. W trakcie leczenia obserwowano u tych chorych normalizację parametrów chemiluminescencji i stopniowy powrót do wartości obserwowanych u osób zdrowych. Podobnie Teramoto i wsp. [40] obserwowali podwyższoną aktywność chemiluminescencyjną granulocytów chorych na astmę i z przewlekłe zapalenie płuc w porównaniu z wartościami u osób zdrowych. Lewandowicz- Uszyńska stwierdziła w grupie dzieci chorych na astmę lub astmę powikłaną (NZDO) znacznie wyższą stymulowaną fmlp i PMA chemiluminescencję granulocytów w porównaniu z grupą kontrolną (35, 36). Przy czym, w grupie dzieci chorych na astmę powikłaną NZDO wykazano niższą stymulowaną aktywność metaboliczną granulocytów w porównaniu z grupą dzieci chorych tylko na astmę [75]. Lewandowska i wsp. również obserwowali upośledzenie chemiluminescencji u chorujących na nawracające zapalenia płuc w porównaniu z dziećmi, które chorowały na zapalenie płuc sporadycznie. Dzieci, u których obserwowano słabą chemiluminescencję na początku choroby wracały do zdrowia wolniej. Zabuska-Jabłońska i wsp.[41], Zgliczyński [18] obserwowali także niskie wartości chemiluminescencji w granulocytach osób dorosłych chorujących na nawracające zapalenia płuc. Wydaje się, że zasadnicze różnice mogą być spowodowane różnym odstępem czasu pomiędzy badaniem a okresem aktywnej choroby i jej leczeniem. Chorzy zakwalifikowani do niniejszej pracy byli badani w okresie zdrowia co potwierdzono badaniem lekarskim i prawidłowym wynikiem leukocytozy. Krew pobierano przynajmniej 3 tygodnie po zakończeniu leczenia. Wykrycie różnych dróg przekazywania sygnałów z błony komórkowej do wnętrza komórki w zależności od zastosowanego stymulatora stwarza możliwość kompleksowej oceny czynności granulocytów. Poprzez jednoczasowe zastosowanie 164 Pneumonologia i Alergologia

Aktywność granulocytów u dzieci z nawracającymi zakażeniami dróg odechowych stymulatorów angażujących różne szlaki enzymatyczne w komórce prowadzące do tego samego końcowego efektu jakim jest wybuch tlenowy i zabicie sfagocytowanych bakterii można wnioskować o sprawności określonego szlaku enzymatycznego i obecności lub braku określonego izoenzymu. Ponieważ enzymy te występują nie tylko w granulocytach, ale również ich obecność stwierdzano w limfocytach, można się spodziewać, że zaburzonej czynność granulocytów mogą towarzyszyć pewne zmiany w czynności limfocytów [42, 43]. Jednym z celów podjętych w tej pracy badań było określenie korzyści z jednoczasowego zastosowania trzech stymulatorów do oceny zaburzeń zdolności granulocytów krwi obwodowej do produkcji reaktywnych form tlenu ocenianej za pomocą testu chemiluminescencji. W niniejszej pracy przeprowadzono również analizę częstości występowania defektu odpowiedzi na fmlp, OZ i PMA. Z indywidualnych wyników zdrowych dzieci wyliczono dolny i górny zakres spotykanych w tych grupach wyników z ogólnie przyjętym prawdopodobieństwem na poziomie 95% (tab.1). W grupie dzieci zdrowych tylko wyniki 3 dzieci nie mieściły się w tym zakresie, sugerując obniżoną odpowiedź na jeden z trzech stosowanych stymulatorów (tab.3). W grupie dzieci chorujących na NZDO obniżoną odpowiedź lub jej brak stwierdzono u 32 dzieci z grupy 41 (78%). Defekt odpowiedzi obserwowano na wszystkie trzy, na dwa z trzech oraz tylko na jeden z trzech stymulatorów odpowiednio u 14 z 41 (34%), 9 z 41(22%) i 9 z 41 (22%) dzieci. Analizując wyniki w tej grupie 32 dzieci, w której wystąpiła istotnie obniżona odpowiedź lub jej brak stwierdzono, że błędny wynik sugerujący prawidłową czynność granulocytów w przypadku badania z zastosowaniem tylko fmlp, OZ lub PMA dotyczyłby odpowiednio 21,88%, 21,87% i aż 40,6% dzieci chorych na NZDO. Zastosowanie fmlp i OZ wykrywało w tej grupie defekt granulocytów u 93,75% dzieci. Brak rozpoznania dotyczyłby tylko 6,25% badanych. Zastosowanie fmlp i PMA wskazywało na defekt występujący tylko u 87,6% dzieci badanych a brak rozpoznania dotyczyłby 12,38 % badanych. Przyjmując, że 32 dzieci z grupy 41 badanych z nawracającymi zakażeniami miało obniżoną odpowiedź granulocytów w zakresie odpowiedzi na czynniki stymulujące syntezę rodników i emisję światła, zastosowanie trzech stymulatorów zwiększyło w sposób istotny czułość tego testu. Przedstawione wyniki sugerują dużą przydatność tak wykonywanego badania. U 9 dzieci z nawracającymi zakażeniami, u których nie wykryto zmian w zdolności do wybuchu tlenowego stymulowanych granulocytów poszukiwać należałoby zmian w czynności komórek odpowiedzialnych za immunologiczną odpowiedź swoistą. Ponieważ nie stwierdzono istotnych różnic w czasie, w którym odpowiedź stymulowanych granulocytów, zarówno dzieci z tendencją do nawracających w porównaniu do odpowiednich grup kontrolnych, uzyskiwała wartość maksymalną to analizę tego parametru można pomijać przy wykonywaniu diagnostycznych badań rutynowych. Wnioski 1. W grupie dzieci chorujących na nawracające zakażenia chemiluminescencja granulocytów aktywowanych jest obniżona. 2. Czułość testu chemiluminescencji, stosowanego do oceny aktywności granulocytów obojętnochłonnych krwi obwodowej, zwiększa się gdy jest on wykonywany z zestawem stymulatorów aktywujących zarówno różne błonowe drogi przekazywania sygnału, jak i różne wewnątrzkomórkowe szlaki enzymatyczne prowadzące do wybuchu tlenowego. Piśmiennictwo 1. Guidelines for research on acute respiratory infections: memorandum from a WHO meeting. Bull World Health Organ 1982; 60:521-533 2. A program for the control of acute respiratory tract infections in children: memorandum of a reunion of the WHO. Bull World Health Organ 1984; 62:229-242 3. Howel D, Webster S, Hayes J i wsp. The impact of recurrent throat infection on children and their families. Fam Pract 2002; 19: 242 246 4. Gupta BD, Parakh M, Arora A Management of community acquired respiratory infections. Indian J Pediatr 2001; 68 Suppl 2: S39 S49 5. Crowe Jr JE, Williams JV Immunology of viral respiratory tract infection in infancy. Paediatr Respir Rev 2003; 4: 112 119 6. Daele J, Zicot AF. Humoral immunodeficiency in recurrent upper respiratory tract infections. Some basic, clinical and therapeutic features. Acta Otorhinolaryngol Belg 2000; 54: 373 390 7. Kramer V.: Evaluation of certain immunological parameters in infants and small children with recurrent respiratory tract infection, Int.Rev. Allergol. Clin. Immunol., 1998, 4, 150-154 8. Paśnik J.: Preaktywacja( priming) neutrofila przez TNF-α-wpływ na wybrane funkcje neutrofila, Post. Hig. Med. Dośw.1998; 52, 2, 139-155. 9. Wysocka J.: Metody oceny funkcji granulocytów, Diagn. Lab., 1998, 34, 483-495. 10. Zeman K., Majewska E.: Receptory granulocytów obojętnochłonnych (neutrofili) krwi obwodowej. I.Charakterystyka struktury i biologicznej funkcji receptorów, Postępy Biologii Kom., 1991, 18, 1-18 Polska 2005/73 165

B. Jakubczak i wsp. 11. Zeman K. I wsp.: Contemporary diagnostics of chronic granulomatous disease, Cent. Eur. J. Immunol., 2000; 25, 113 12. Jurczak W.J., Skotnicki A. B., Zgliczyński M. i wsp.: Chemiluminescencja granulocytów, Przegl. Lek., 1993; 50, 53-58 13. Zimmermann B., Dalhoff K., Braun J.: Impaired neutrophil exocytosis in patients with severe pneumonia, Intens. Care Med., 1999; 25: 44-51 14. Zeman K., Kantorski J.: Receptory granulocytów obojętnochłonnych (neutrofili) krwi obwodowej. II.Charakterystyka struktury i biologicznej funkcji receptorów, Postępy Biologii Kom., 1991, 18, 19-30 15. Cockeran R., Theron A.J., Steel H.C., i wsp..: Proinflammatory interactions of pneumolysin with human neutrophils, J. Infect. Dis., 2001, 183, 604-611. 16. Elbim C., Gougerat Pocidalo M.A.: Priming study of human phagocytes oxidative burst by using flow cytometry, Hematol. Cell Ther., 1996, 38, 527-535 17. Van Dyke K., Castranowa V.: Cellular chemiluminescence, CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida, 1987, 95-97 18. Zgliczyński J.M., Kwasnowska E., Stelmaszyńska T i wsp.: Functional states of neutrophils as suggested by whole blood chemiluminescence, Acta Bioch. Pol., 1988, 35, 331-342 19. Koie T., Suzuki K., Shimoyama T. i wsp. Effect of interferon-alfa on production of reactive oxygen species by human neutrophils, Lumnesence,2001, 16, 39-43 20. Komatsu H., Tsukimori K., Hata K. i wsp.: The charakterization of super oxide production of human neonatal neutrophil, Early Human Development, 2001, 65, 11-19 21. Raport of WHO Scientific Group: Primary immunodeficiency diseases, Clin. Exp. Immunol.,109, Suppl., 1, 26-28 22. Sasson Y., Zeltser D., Rogowski O. i wsp: Neutrophilia of infection/inflammation: are we really dealing wih inflamated leukocytes?, J. Med. Sci, 1998, 29,217-229 23. Ottonello L., Dapino P., Pastorino G. Et all.: Neutrophil dysfunction and increased susceptibility to infection, Europ. J. Clin. Inv., 1995, 25, 687-692. 24. Bernatowska E.: Zakażenia dróg oddechowych u dzieci: diagnostyka, leczenie. Problemy laryngologiczne w codziennej praktyce, Servier, 1998, 2, 2-8. 25. Jung A., Kalicki B., Rutka J. i wsp.: Czynniki wpływające na nawrotowość zakażeń układu oddechowego u dzieci, w: Postępy w pneumonologii i alergologii dziecięcej, red. R. Kurzawa, A. Jung, J. Żuber, Warszawa, 1996. 26. Kowalska M., Kowalska H., Zawadzka-Głos L. i wsp.: Dysfunction of peripheral blood granulocyte oxidative metabolism in children with recurrent upper respiratory tract infections. Intern. J. Ped. Othorhin., 2003, 67, 365-371 27. Lakshman R., Finn A.: Neutrophil disorders and their management, J. Clin. Pathol., 2001, 54, 1, 7-19 28. Ley K.: Molecular mechanisms of leukocyte recruitment in the inflammatory process, Cardio-vasc. Res., 1996, 32, 733-742 29. Maly F. E. i in.: Functional states of neutrophils as suggested by whole blood chemiluminescence, J. Immunol., 1989, 142, 1260-1267 30. Mitkowska Z.: Chemiluminescencja (CL) w diagnostyce posocznicy noworodków, Przegl. Ped., 1995, 25, 221-225 31. Murphy S., van Epps D.E.: Neutrophil and monocyte function in pediatric patients with recurrent pneumonia, Am. Rev. Respir. Dis., 1982, 126, 92-96 32. Sikora J.P.: Chemiluminescent assessment of aerobic metabolism of peripheral blood polymorphonuclear leukocytes in children with increased susceptibility to respiratory tract infections, Centr. Eur. J. Immunol., 1996, 21, 1, 33-38 33. Zeller J., Landay A.L., Lint T.F. i wsp..: Aggregated C- reactive protein binds to human polymorphonuclear leukocytes and potentiates Fc receptor-mediated chemiluminescence, J. Lab. Clin. Med., 1986, 567-575 34. Lewandowicz-Uszyńska A.: The influence of selected stimulators on chemiluminescence of neutrophils in whole blond in children with bronchial astma, Pol. Merk. Lek., 2003, 28, 393-396 35. Lewandowicz-Uszyńska A. i wsp.: Aktywność neutrofili oceniana testem chemiluminescencji u dzieci z zapaleniem płuc, Acta Bio-Optica, 1995, 3, 109 36. Lewkowicz P., Lauk-Pachuła B., Górańska N. i wsp..: Próba standaryzacji pomiaru chemiluminescencji krwi pełnej jako metody oceny funkcji ludzkich granulocytów w badaniach in vitro, Diagn. Lab., 1999, 35, 497-510 37. Zhong L., Jiang H., Xie W., i wsp..: Role sof PLC-β2 and β3 and PI3Kγ in chemoattractant- mediated signal transduction, Science, 2000, 287, 1046-1049 38. Braun J., Pein M., Djonlagic H. i wsp.: Production of reactive oxygen species by central venous and arterial neutrophils in severe pneumonia and cardiac lung edema, Intens. Care Med., 1997, 23, 170-176 39. Adachi S., Suzuki K., Yamoto T.: Studiem of neutrophil function in the elderly: especially analysis of bedridden patients and patients with bacterial infection, Kansenhogaku Zasshi, 1993, 67, 1083-1093 40. Teramoto S., Shu C.Y., Ouchi Y., i wsp..: Increased spontaneous production and generation of superoxide anion by blood neutrophils in patients with asthma, J. Asthma, 1996, 33, 149-155. 41. Zabuska-Jabłońska K., Broniek A.: Disturbances of polymorphonuclear neutrophil leukocyte chemiluminescence in patients with chronic of recurrent respiratory tract infections, Pneumonol. Alergol. Pol., 1997, 65, 649-656 42. Ward S.G. i wsp..: PI 3-kinase: a pivotal pathway in T- cell activation?, Immunol. Today, 1996, 17, 187-197 43. Wymann M. P., Sozzani S., Altruda F., i wsp..: Lipids on the move: phosphoinositide 3-kinases in leukocyte function, Immunology Today, 2000, 21, 260-264 Wpłynęła: 25.06.2005 r. Adres: Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego AM, ul. Marszałkowska, Warszawa 166 Pneumonologia i Alergologia