ZMIANY WYSOKOCZ STECZKOWYCH -GLUKANÓW I AKTYWNO CI -GLUKANAZY W PROCESIE S ODOWANIA J CZMIENIA BROWARNEGO

SCIENTIARUM POLONORUMACTA Technologia Alimentaria 3(2) 2004, 137-146 ZMIANY WYSOKOCZ STECZKOWYCH -GLUKANÓW I AKTYWNO CI -GLUKANAZY W PROCESIE S ODOWANIA J CZMIENIA BROWARNEGO Zbigniew Czarnecki, Maria Czarnecka, Agata piewak Akademia Rolnicza w Poznaniu Streszczenie. W pracy badano zmiany zawarto ci -glukanów oraz aktywno ci -glukanazy podczas s odowania w dziesi ciu odmianach j czmienia browarnego. Okre lono równie zawarto -glukanów w brzeczkach sporz dzonych z otrzymanych s odów. Stwierdzono, e poziom -glukanów w badanych j czmieniach waha si w granicach 2,5-4,5% s.s., a najwyzszy by w odmianach Cooper i Rudzik. Proces s odowania powodowa redukcj tych zwi zków nawet o ok. 80%. Zawarto -glukanów w brzeczkach do wiadczalnych by a skorelowana z ich zawarto ci w j czmieniach. Podczas s odowania obserwowano znacz cy wzrost aktywno ci -glukanazy, chocia nie stwierdzono istotnej korelacji miedzy aktywno ci enzymu a zawarto ci -glukanów w brzeczce kongresowej. S owa kluczowe: j czmie browarny, s ód, -glukan, -glukanaza WST P -glukan, podobnie jak celuloza, jest polimerem -D-glukozy i charakteryzuje si wyst powaniem w cz steczce wi za -1,3 obok dominuj cych, identycznych jak w celulozie wi za -1,4. -glukan obok takich zwi zków jak ksylany czy mannany nale- y do hemiceluloz. W ziarnach j czmienia szczególnie bogate w hemicelulozy s upina i bielmo [Sieliwanowicz i Ha asi ska 2000]. J czmie zawiera -glukany, w których wi zania -1,4 mi dzy cz steczkami glukozy wyst puj w ilo ci 70-74%, a wi zania -1,3 w ilo ci 26-30%. Masa cz steczkowa -glukanów ziarna j czmienia przekracza 2000 kda. W nienaruszonej cianie komórkowej -glukan jest kowalencyjnie zwi zany z bia kami [Anderson 1990, Brudzy ski 1997]. Zawarto -glukanów jest wa nym wska nikiem selekcyjnym w hodowli nowych odmian j czmienia browarnego. Zawarto ich w j czmieniu browarnym nie powinna przekracza 4,5% s.s. Czynniki, które maj istotny wp yw na zawarto tych zwi zków w ziarnie to przede wszystkim odmia- Adres do korespondencji Corresponding author: prof. dr hab. Zbigniew Czarnecki, Instytut Technologii ywno ci Pochodzenia Ro linnego Akademii Rolniczej w Poznaniu, ul. Wojska Polskiego 31, 60-624 Pozna, e-mail: zbyczar@au.poznan.pl

138 Z. Czarnecki... na, czyli czynnik genetyczny i warunki uprawy, w tym klimat. D ugotrwa e opady w okresie dojrzewania i zbioru powoduj wzrost zawarto ci -glukanów w ziarnie j czmienia. Zawarto rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych -glukanów zale y mi dzy innymi od wielko ci cz steczek glukanu, aktywno ci enzymów i temperatury w czasie wegetacji ro lin. Na poziom -glukanów w sposób istotny wp ywa tak e proces suszenia s odu a przede wszystkim warunki pocz tkowej fazy tego procesu [Baca i in. 1998 a, b, Brudzy ski 1997, Kato i Sasaki 1995]. Obecno 1,3-1,4- -D-glukanów mo e prowadzi do powstawania problemów podczas filtrowania brzeczki lub piwa. Problemy te wynikaj z dwóch podstawowych w a- ciwo ci -glukanu: rozpuszczalno ci w wodzie i zdolno ci do tworzenia roztworów charakteryzuj cych si wysok lepko ci. -glukan wyst puj cy w s odzie wp ywa tak e na powstawanie zm tnie, osadów lub elu w gotowym piwie. Problemy te mog wyst powa cz sto wtedy, gdy u yjemy z ej jako ci s odu le kie kuj cego, nierówno wyro ni tego, a tak e s odów z j czmion ozimych. W s abo s oduj cym j czmieniu ilo rozpuszczalnego -glukanu w stosunku do jego ogólnej ilo ci wynosi do 67%, podczas gdy w dobrze s oduj cym do 25%. W zasadzie zarówno j czmie, jak i ka de ogniwo procesu technologicznego produkcji piwa mo e mie wp yw na zawarto -glukanów. -glukany pozostaj ce w s odzie przechodz nast pnie do brzeczki i dalej do piwa. Powoduj one woln separacj brzeczki oraz s ab filtracj piwa a tak e powstawanie osadów w czasie jego przechowywania [Anderson 1990, Baca i Go biewski 1997, Baca i in. 1998 a, b, Brudzy ski 1997, Ednej i in. 1991]. Zasadnicz rol w degradacji -glukanu w warunkach przemys owych odgrywaj bez w tpienia endo- -glukanazy. Jeden z wyst puj cych w s odzie enzymów endo- - -1,4-glukanaza wykrywany jest w j czmieniu, drugi endo- -1,3-glukanaza syntetyzowany jest w czasie kie kowania ziarna. Zastosowanie optymalnych warunków zacierania, powoduj cych zachowanie endogennych -glukanaz lub dodanie ich podczas zacierania lub le akowania mo e obni y ilo -glukanu w piwie poni ej dopuszczalnego poziomu. Enzymy te mog zmniejsza mas cz steczkow -glukanów lub je ca kowicie degradowa. Nale y tak e pami ta, e dodatek 20-40% j czmienia nie s odowanego do produkcji piwa mo e powodowa du y wzrost ogólnej zawarto ci -glukanu w brzeczce i piwie ale tak e wzrost ci aru cz steczkowego glukanów. W warunkach laboratoryjnych do degradacji wielocz steczkowego -glukanu najcz - ciej jest stosowana lichenaza, która wykazuje zarówno aktywno endo- -1,3-, jak i endo- -1,4-glukanazy. W ostatnich latach coraz wi ksze zainteresowanie wzbudza enzym zwi zany z katabolizmem -glukanu, okre lany jako solubilaza. Do wiadczenia prowadzone z u yciem enzymów takich jak -glukanaza, -amylaza i ksylanaza dowiod y, e lepko g ównie powodowana jest przez -glukan, dopiero w dalszej kolejno ci przez pentozany. Skrobia i bia ka powoduj niewielki wzrost lepko ci ekstraktu [Bhatty i in. 1991, Carbonell i in. 1990, Komornicki 1990, Sieliwanowicz i Ha asi ska 2000, Todo 1989]. Oznaczanie zawarto ci -glukanów zarówno w ziarnie, jak i brzeczce i piwie jest utrudnione z powodu obecno ci skrobi (ziarno) i enzymów rozk adaj cych -glukany. Do oznaczania -glukanów stosuje si kilka podstawowych metod takich, jak metoda hydrazonowa i calcofluorowa oraz metody enzymatyczne, w tym najcz ciej stosowan metod enzymatyczn z lichenaz [Aman i Graham 1987, Koliatsou i Palmer-Geoff 2003, Mc Cleary i Nurthen 1986].

Zmiany wysokocz steczkowych -glukanów... 139 Celem naszych bada by o okre lenie wp ywu procesu s odowania 10 ró nych odmian j czmienia w warunkach przemys owych na poziom zawartych w s odzie -glukanów a tak e stwierdzenie jak proces ten wp ywa na aktywno -glukanazy s odu. W pracy oznaczano tak e zawarto -glukanów w brzeczkach kongresowych, wykonanych z badanych s odów w celu stwierdzenia czy istnieje zale no mi dzy poziomem -glukanów w brzeczce a aktywno ci -glukanazy. MATERIA I METODY J CZMIE oznaczanie suchej substancji oznaczanie zawarto ci ß-glukanu MOCZENIE S ODOWANIE J CZMIE po 96 godzinach s odowania SUSZENIE I ODKIE KOWANIE oznaczanie suchej substancji oznaczanie zawarto ci ß-glukanu oznaczanie aktywno ci ß-glukanazy S ÓD PRZEMIA oznaczanie suchej substancji oznaczanie zawarto ci ß-glukanu oznaczanie aktywno ci ß-glukanazy ZACIERANIE I FILTRACJA BRZECZKA KONGRESOWA oznaczanie zawarto ci ß-glukanu Technologia Alimentaria 3(2) 2004

140 Z. Czarnecki... W pracy wykorzystano ró ne odmiany j czmienia browarnego stosowanego do produkcji s odu na skal przemys ow przez s odowni Soufllet Polska, pochodz cego ze zbiorów w 2000 roku. By y to nast puj ce odmiany: Cooper, Mieszanka czeska, Sunrise, Optic 1 (z upraw du skich), Optic 2 i Optic 3 (z upraw czeskich), Rudzik, Prisma, Rasbet, Regina. Proces s odowania j czmienia oraz rozdrabniania s odu prowadzono w s odowni Soufllet Polska, zgodnie z parametrami technologicznymi obowi zuj cymi w tym zak adzie. Z poszczególnych otrzymanych s odów sporz dzano brzeczk kongresow. Oznaczanie zawarto ci -glukanu oraz aktywno ci -glukanazy wykonywano na ró nych etapach produkcji s odu i brzeczki przedstawionych na schemacie 1. Dla realizacji za o onych bada zastosowano nast puj ce metody analityczne: oznaczanie -glukanu w j czmieniu [Mc Cleary i Codd 1991], oznaczanie -glukanu w s odzie [Mc Cleary i Nurthen 1986], oznaczanie -glukanu w brzeczce kongresowej [Mc Cleary i Nurthen 1986], oznaczanie aktywno ci -glukanazy [Materia y Megazyme], oznaczanie zawarto ci suchej substancji w ziarnie i s odzie [PN-A-79083-5, PN-R 74110]. Obliczenia statystyczne obejmowa y analiz wariancji jednoczynnikow oraz analiz korelacyjn. WYNIKI I DYSKUSJA Zawarto -glukanu w j czmieniach odmian u ytych do bada by a zró nicowana i waha a si w granicach 2,5-4,5% s.s. (rys. 1). Wyniki te s podobne do uzyskiwanych w badaniach innych autorów [Aman i Graham 1987, Baca i Go biewski 1997, Bhatty i in. 1991, Kato i Sasaki 1995, Komornicki 1990]. Ró nice w ilo ci tych zwi zków w poszczególnych odmianach dochodz nawet do 100%, na co mo e mie wp yw wiele czynników, w tym czynnik genetyczny. Dla potwierdzenia tej tezy przeprowadzono oznaczenia dla czeskiego j czmienia odmiany Optic. Dwie próbki pochodzi y z upraw w Czechach, jedna z Danii. Okaza o si, e mimo ró nych warunków klimatycznych wyst pi y niewielkie ró nice w zawarto ci -glukanu. Porównuj c uzyskane wyniki dla wszystkich badanych j czmieni mo na stwierdzi, e ró nice mi dzy odmianami, z wyj tkiem odmiany Cooper i Rudzik, by y niewielkie, cho istotne statystycznie ( = 0,05). W odmianach Cooper i Rudzik poziom -glukanów by wy szy ni w pozosta ych odmianach. Nie przekracza on jednak norm okre lonych przez przemys s odowniczy, dlatego te j czmie ten mo e by wykorzystywany do produkcji s odu browarnego. Po 96 godzinach s odowania, we wszystkich badanych odmianach j czmienia nast pi o znaczne obni enie zawarto ci -glukanu (nawet powy ej 50%), a w wypadku odmiany Rasbet a o ok. 80%. Poziom -glukanu po tym czasie s odowania j czmienia zawiera si w przedziale 0,5-2,0% s.s. Porównuj c uzyskane warto ci z pocz tkow ilo ci -glukanu w j czmieniu mo na zaobserwowa pewn prawid owo w zachodz cych zmianach. Na przyk ad j czmie odmiany Cooper charakteryzowa si najwy sz zawarto ci -glukanu (4,8% s.s.), a po s odowaniu przez 96 h jego ilo zmala- a do 2,0% s.s. W wypadku j czmienia Rasbet (najni sza ilo -glukanu 2,3% s.s.) po tym samym czasie s odowania poziom -glukanu by najni szy i wynosi 0,3%.

Zmiany wysokocz steczkowych -glukanów... 141 6,0 5,0 NIR(0,05) = 0,18 LSD(0.05) = 0.18 4,83 4,0 3,87 % s.s. % d.m. 3,0 2,0 2,09 2,61 2,79 2,25 2,70 2,82 2,80 2,68 2,68 1,0 0,0 0,85 Cooper 1,07 1,03 0,69 Miesz. czeska 0,28 0,72 0,50 0,34 0,20 1,00 0,53 0,94 0,51 0,53 0,27 0,34 0,37 Sunrise Rudzik Rasbet Optic 1 Optic 2 Optic 3 Regina Prisma j czmie barley Odmiana Variety po 96 godz. s odowania after 96 hours s ód malt 1,18 0,48 Rys. 1. Zmiany zawarto ci -glukanów w czasie s odowania Fig. 1. -glucans changes during malting W gotowym s odzie, jak wynika z przeprowadzonych oznacze, w wypadku wszystkich odmian j czmienia browarnego poziom -glukanów obni y si proporcjonalnie i waha si w przedziale 0,2-0,9% s.s. Ogólnie tak znaczn redukcj badanych zwi zków mo na by interpretowa jako efekt wysokiej aktywno ci enzymatycznej, która charakteryzuje prawie wszystkie badane odmiany j czmienia [Anderson 1990, Baca i Go biewski 1997, Carbonell i in. 1990, Kato i Sasaki 1995]. Zawarto -glukanów w brzeczce kongresowej, w zale no ci od odmiany z której wyprodukowano s ód, wynosi a 200-400 mg/l (rys. 2). Zró nicowanie tych wyników jest do znaczne i we wszystkich wypadkach by y one wy sze od standardów przyj tych w browarnictwie na poziomie do 200 mg/l [Baca i Go biewski 1997, Baca i in. 1998 a, b]. Jednak zachowuj c w a ciwe parametry procesu produkcji piwa ta ilo -glukanów nie dyskwalifikuje jeszcze badanych s odów. Zawarto -glukanów w brzeczce kongresowej jest skorelowana z ich zawarto ci w j czmieniu (r = 0,796), natomiast nie stwierdzono istotnej korelacji mi dzy zawarto ci -glukanów w brzeczce kongresowej a jej zawarto ci w j czmieniu w czasie s odowania i w s odzie gotowym (r = 0,445, r = 0,333) (rys. 4). Uzyskane dane sugeruj, e na poziom -glukanów w brzeczce istotny wp yw ma przede wszystkim ich zawarto w j czmieniu. Nie ma natomiast istotnej zale no ci mi dzy procesem s odowania a zawarto ci -glukanów w brzeczce, pomimo znacznego obni enia ich poziomu w gotowym s odzie. Aktywno -glukanazy w wi kszo ci analizowanych odmian wzrasta a w czasie prowadzenia procesu s odowania (rys. 3). Najwy szy wzrost aktywno ci badanych Technologia Alimentaria 3(2) 2004

142 Z. Czarnecki... mg/l 500 400 403 NIR(0,05) = 31 LSD(0.05) = 31 341 406 300 200 256 285 229 285 252 210 271 100 0 Cooper Miesz. czeska Sunrise Rudzik Rasbet Optic 1 Optic 2 Optic 3 Regina Prisma Odmiana Variety Rys. 2. Zawarto -glukanów w brzeczce kongresowej Fig. 2. -glucans content in wort (U/kg) 500 400 388 NIR(0,05) = 28 LSD(0.05) = 28 355 371 405 408 300 237 254 311 238 299 291 286 312 246 240 274 248 295 200 159 171 100 0 Cooper Miesz. czeska Sunrise Rudzik Rasbet Optic 1 Optic 2 Optic 3 Regina Prisma Odmiana Variety po 96 godz. s odowania after 96 hours s ód malt Rys. 3. Zmiany aktywno ci -glukanazy w czasie s odowania Fig. 3. -glucanase activity changes during malting

Zmiany wysokocz steczkowych -glukanów... 143 6,0 5,0 Ziarno, % Grain, % 4,0 3,0 2,0 y = 0,0089x + 0,386 1,0 0,0 200 250 300 350 400 450 Brzeczka, mg/l Wort, mg/l j czmie barley po 96 godz. s odowania after 96 hours s ód malt Rys. 4. Zawarto -glukanów w brzeczce w porównaniu z j czmieniem i s odem Fig. 4. Wort -glucans compared to barley and malt 450 Aktywno -glukanazy, U/kg -glucanase activity, U/kg 400 350 300 250 200 150 100 200 250 300 350 400 450 Brzeczka, mg/l Wort, mg/l po 96 godz. s odowania after 96 hours s ód malt Rys. 5. Zawarto -glukanów w brzeczce w porównaniu z aktywno ci -glukanazy Fig. 5. Wort -glucans compared to -glucanase activity Technologia Alimentaria 3(2) 2004

144 Z. Czarnecki... enzymów w czasie s odowania wyst pi u odmian Cooper (237-388 U/kg w s odzie), Optic 3 (240-405 U/kg w s odzie) i Regina (274-408 U/kg w s odzie), co stanowi o rednio wzrost aktywno ci enzymów o ok. 60%. W dwóch wypadkach, w odmianach Rudzik i Optic 1 obserwowano do znaczne obni enie si aktywno ci badanego enzymu w s odzie (odpowiednio nawet do 59 i 71 U/kg) w stosunku do jego aktywno ci w czasie s odowania. Mo na próbowa t umaczy to le prowadzonym procesem suszenia s odu. Nie wp yn o to jednak istotnie na poziom -glukanu w obu s odach, który by porównywalny z innymi odmianami (0,5% s.s.). wiadczy oby to o wystarczaj cej, nawet w takim wypadku, aktywno ci -glukanazy. Nie stwierdzono istotnej zale no ci mi dzy aktywno ci -glukanazy s odu a zawarto ci beta-glukanów w brzeczce kongresowej (r = 0,23) (rys. 5). Ten brak zale no ci mo e by równie potwierdzeniem wcze niejszego spostrze enia dotycz cego przede wszystkim zwi zku mi dzy zawarto ci -glukanów w brzeczce a ich zawarto ci w j czmieniu. PODSUMOWANIE Z analizy wyników dotycz cych zmian poziomu -glukanów uzyskanych w trzech ró nych etapach produkcji s odu mo na wnioskowa, e proces s odowania powodowa redukcj tych zwi zków nawet o 80% w stosunku do ich ilo ci wyj ciowej. Przebieg tych zmian by zró nicowany i charakterystyczny dla poszczególnych odmian, zale a jednak od kilku czynników w tym pocz tkowej zawarto ci -glukanów w j czmieniu, która w badanych odmianach waha a si w granicach 2,5-4,5% s.s. Spo ród badanych odmian najwi cej -glukanów wyst powa o w odmianach Cooper i Rudzik, chocia i tu ich ilo nie przekroczy a granicy dopuszczalnej. Zawarto -glukanów w brzeczce kongresowej otrzymywanej z badanych odmian j czmienia waha a si w granicach 200-400 mg/l. Ilo tych zwi zków w brzeczce kongresowej by a skorelowana z ich zawarto ci w j czmieniu, z którego by a otrzymana, natomiast nie stwierdzono istotnej korelacji mi dzy zawarto ci -glukanów w brzeczce a ich zawarto ci w s odzie. Du rol odgrywa a w czasie s odowania aktywno -glukanazy, która jest odpowiedzialna za redukcj -glukanów podczas tego procesu. Jednak nie stwierdzono bezpo redniego zwi zku pomi dzy aktywno ci tego enzymu w s odzie a zawarto ci -glukanów w brzeczce kongresowej. Uzyskane wyniki raz jeszcze potwierdzaj konieczno klasyfikacji odmian j czmienia browarnego pod k tem zawarto ci -glukanów i enzymów odpowiedzialnych za ich degradacj, jak równie okre lania aktywno ci -glukanaz w s odzie i na dalszych etapach produkcji piwa.

Zmiany wysokocz steczkowych -glukanów... 145 PI MIENNICTWO Aman P., Graham H., 1987. Analysis of total and insoluble mixed-linked (1-3)(1-4) -D-glucans in barley and oats. J. Agric. Food Chem. 35, 704-709. Anderson I.W. 1990. The effect of -glucan molecular weight on the sensivity of dye binding assay procedures for -glucan estimation. J. Inst. Brew. 96, 323-326. Baca E., Go biewski T., 1997. Nowe spojrzenie na wska niki warunkuj ce warto technologiczn j czmienia i s odu browarnego. Przem. Ferm. Ow. Warz. 10, 18-22. Baca E., Pawlikowska B., Micha owska D., Go biewski T., 1998 a. Jako j czmienia, warunki s odowania a zawarto -glukanu w brzeczce (1). Przem. Ferm. Ow. Warz. 8, 24-26. Baca E., Pawlikowska B., Micha owska D., Go biewski T., 1998 b. Jako j czmienia, warunki s odowania a zawarto -glukanu w brzeczce (2). Przem. Ferm. Ow. Warz. 9, 34-36. Bhatty R.S., Mc Gregor A.W., Rossnagel B.G., 1991. Total and acid-soluble -glucan content of hulles barley and its relationship to acid-extract viscosity. Cereal Chem. 68 (3), 221-227. Brudzy ski A., 1997. Beta glukan i problemy filtracji piwa. Przem. Ferm Ow. Warz. 2, 7-8. Carbonell J.V., Sendra J.M., Todo V., 1990. Kinetics of -glucan degradation in beer by exogenous -glucanase treatment. J. Inst. Brew. 96, 81-84. Ednej M.J., Marchylo B.A., Mc Gregor A.W., 1991. Structure of total barley beta-glucan. J. Inst. Brew. 97, 39-44. Kato T., Sasaki A., 1995. Genetic variation of beta-glucan contens and beta-glucanase activities in barley and their relationships to malting quality. Jap. J. Breed. 4, 471-477. Komornicki J., 1990. Kontrola -glukanów w browarze. Przem. Ferm. Ow. Warz. 7, 23. Koliatsou M., Palmer-Geoff H., 2003. A new method to assess mealiness and steeliness of barley varieties and relationship of mealiness with malting parameters. J. Am. Soc. Brew. Chem. 61 (3), 114-118. Mc Cleary B.V., Codd R., 1991. Measurrement of (1-3), (1-4)- -D-glucan in barley and oats: a streamlined enzymic procedure. J. Sci. Food Agric. 55, 303-312. Mc Cleary B.V., Nurthen E., 1986. Measurment of (1-3), (1-4)- -glucan in malt, wort and beer. J. Inst. Brew. 92, 168-173. Megazyme Malt and bacterial beta-glucanase and cellulase- Assay procedure. Azo-barley glucan method, KMBGL 01/03. PN-R 74110. J czmie. Metody bada. PN-A-79083-5. 1998. S ód browarny. Metody bada Oznaczanie wilgotno ci. Sieliwanowicz B., Ha asi ska A., 2000. Aktywno ci enzymatyczne s odu wp ywaj ce na poziom beta-glukanu brzeczki. Przem. Ferm. Ow. Warz. 12, 21-24. Todo V., 1989. Kinetics of -glucan degradation in wort by exogenous -glucanases treatment. J. Inst. Brew. 95, 419-422. Technologia Alimentaria 3(2) 2004

146 Z. Czarnecki... CHANGES OF HIGH MOLECULAR WEIGHT -GLUCANS AND -GLUCANASE ACTIVITY DURING GERMINATION OF BARLEY Abstract. Changes in beta-glucan content and beta-glucanase activity during malting process were investigated in ten varieties of barley grain. Beta-glucans in standard wort obtained from experimantal malts were also determined. Beta-glucan content range in barley varieties was 2.5-4.5% dm. Maximum amount of -glucan was in Cooper and Rudzik varieties. Malting process reduced beta-glucan amount even to 80%. There was evident correlation between beta-glucan content in barley grain and in malt wort. Significant increase of beta-glucanase activity was observed as a effect of malting process. No correlation between beta-glucanase activity in malt and beta-glucan level in wort was found. Key words: barley, malt, -glucans, -glucanase Zaakceptowano do druku Accepted: 20.09.2004 r. Do cytowania - For citation: Czarnecki Zb., Czarnecka M., piewak A., 2004. Zmiany wysokocz steczkowych -glukanów i aktywno ci -glukanazy w procesie s odowania j czmienia browarnego., Technol. Aliment. 3(2), 137-146.