ECOLOGICAL CHEMISTRY AND ENGINEERING S Vol. 15, No. 4 2008 Teresa KRZYŚKO-ŁUPICKA 1 EKOLOGICZNE SKUTKI DZIAŁANIA HERBICYDU FOSFOORGANICZNEGO NA DIAZOTROFY GLEBOWE W OKRESIE WIOSENNYM. CZĘŚĆ II ECOLOGICAL EFFECTS OF PHOSPHOORGANIC HERBICIDE ON SOIL DIAZOTROPHS IN SPRING. PART II Streszczenie: Badano wpływ herbicydu Roundup na liczebność i intensywność wiązania azotu przez glebowe drobnoustroje niesymbiotyczne (diazotrofy), w glebie nienawoŝonej i nawoŝonej obornikiem, w okresie wiosennym. Liczebność diazotrofów oznaczano metodą płytkową na bezazotowej poŝywce Fenglerowej, a potencjalną aktywność wiązania azotu molekularnego przez diazotrofy glebowe zmodyfikowaną metodą Pochona. Analizy chemiczne obejmowały oznaczenie ph i mineralnych form azotu metodą Greweling-Peecha. Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono statystycznie istotne hamowanie liczebności diazotrofów po 7 i 30 dniach działania herbicydu zarówno w glebie nienawoŝonej, jak i w glebie z obornikiem. Początkowo teŝ herbicyd statystycznie istotnie hamował proces wiązania azotu. Natomiast po 30 dniach w glebie nienawoŝonej, a po 90 dniach w glebie nawoŝonej obornikiem potencjalna aktywność wiązania azotu atmosferycznego w obecności herbicydu Roundup była okresowo większa. Równolegle w obiektach z herbicydem obserwowano wzrost stęŝenia azotu amonowego i spadek stęŝenia azotu azotanowego, przy czym róŝnice te były większe w obiektach bez obornika. Słowa kluczowe: gleba, Roundup, diazotrofy, intensywność wiązania azotu, wiosna Powszechne stosowanie herbicydu Roundup w ochronie roślin prowadzi do mniejszych lub większych zaburzeń równowagi biologicznej gleby. Jeszcze do niedawna uznawano go za herbicyd przyjazny dla środowiska, bo degradowany jest prawie wyłącznie pod wpływem wytwarzanych przez drobnoustroje enzymów [1]. Jednak kwas aminometylofosfonowy (AMPA) [2] moŝe ulegać w glebie kumulacji albo wolniejszej degradacji niŝ glifozat (substancja aktywna Roundupu) [3], dlatego prowadzi to do wzmoŝonego rozwoju grzybów [4], niekorzystnego z punktu widzenia Ŝyzności gleby [5]. 1 Katedra Biotechnologii i Biologii Molekularnej, Uniwersytet Opolski, ul. kard. B. Kominka 4, 45-035 Opole, tel. +48 77 401 60 57, email: teresak@uni.opole.pl
596 Teresa Krzyśko-Łupicka Te zaburzenia równowagi dynamicznej oddziaływają na rozwój i aktywność mikroorganizmów glebowych, a tym samym na kierunek i dynamikę prowadzonych przez nią procesów biochemicznych [6]. Procesy, takie jak: nitryfikacja, denitryfikacja, amonifikacja, redukcja azotanów, dysymilacja i biologiczna redukcja azotu molekularnego do jonów amonowych, regulują stęŝenia poszczególnych form azotu w glebie. Jednym ze zjawisk zaburzenia metabolizmu bakterii w obecności herbicydów jest biologiczne wiązanie wolnego azotu, które zapewnia utrzymanie równowagi pomiędzy ilością azotu molekularnego a ilością azotu azotanowego i amonowego w glebie. Dzięki temu utrata azotu z gleby do atmosfery spowodowana denitryfikacją nie jest bezpowrotna. Biologiczna redukcja azotu molekularnego do jonów amonowych jest prowadzona przez zróŝnicowane pod względem systematycznym wolno Ŝyjące i symbiotyczne bakterie określane terminem diazotrofy, które cechuje obecność kompleksu nitrogenazy [7]. Rozwój i ich aktywność zaleŝy od właściwości herbicydu, fizykochemicznych właściwości gleb i ich aktywności biologicznej, zabiegów agrotechnicznych, w tym terminu stosowania herbicydów i warunków klimatycznych [8-10]. Rozkład materii organicznej i towarzyszące mu wzmoŝone rozmnaŝanie drobnoustrojów przebiegają najsilniej wiosną, gdy gleba jest najbardziej wilgotna, a najsłabiej w suchym okresie letnim [5]. NawoŜenie obornikiem zwykle wpływa dodatnio zarówno na wzrost biomasy mikroorganizmów, jak teŝ aktywność enzymatyczną gleb [9]. Aktywność enzymatyczna (dehydrogenazy, katalazy, fosfatazy alkalicznej, proteolityczna) gleb zaleŝy od pory roku, największa charakteryzuje gleby badane latem, a najmniejszą stwierdzano w próbkach gleby pobranej wiosną. ChociaŜ inną dynamikę stwierdzono dla aktywności amylolitycznej, która największe wartości osiągała wiosną i jesienią [11]. TakŜe stopień zahamowania aktywności nitrogenazy bakterii symbiotycznych z rodzaju Rhizobium zaleŝał od czasu działania Roundupu i ilorazu C/N w glebie [8]. Wachowska [12] wskazuje na niekorzystne zmiany środowiska, prowadzące do okresowego hamowania rozwoju bakterii z rodzaju Azotobacter, a w miarę zanikania substancji aktywnej Roundupu do odbudowy jej populacji. Niewielu autorów podejmuje, związany z porą roku, problem wiązania azotu atmosferycznego przez diazotrofy niesymbiotyczne w obecności Roundupu. Celem badań była laboratoryjna ocena wpływu Roundupu na liczebność i intensywność wiązania azotu przez diazotrofy niesymbiotyczne w okresie wiosennym w glebie nienawoŝonej i nawoŝonej obornikiem. Materiał i metodyka badań Materiał badawczy stanowiły próbki gleby brunatnej właściwej o ph = 5,5, pobrane z warstwy gleby 0 25 cm, w okresie wiosennym. Wyjściowa zawartość azotu amonowego w roztworze glebowym wynosiła 6,33 mg (kg s.m.) 1, a azotu azotanowego 112,3 mg (kg s.m. gleby) 1. Doświadczenie wazonowe załoŝono w następujących obiektach: I - Gleba (G), II - Gleba + Roundup (GH), III - Gleba + obornik (GO), IV - Gleba + obornik + Roundup
Ekologiczne skutki działania herbicydu fosfoorganicznego na diazotrofy glebowe w okresie 597 (GOH). Do kaŝdego wazonu wprowadzono 1 kg badanej powietrznie suchej gleby. Roundup rozpylono na powierzchni wazonów w ilości równowaŝnej dawce polowej 2,67 10 3 cm 3, a dojrzały obornik wprowadzono w ilości równowaŝnej dawce polowej 1,33 g kg 1. Za podstawę obliczenia przyjęto masę 5 cm warstwy ornej na powierzchni 1 ha. Glebę inkubowano w temperaturze 20 C przez 7, 30 i 90 dni, utrzymując stałą wilgotność na poziomie 60% pojemności wodnej. Liczebność diazotrofów oznaczano metodą płytkową na bezazotowej poŝywce Fenglerowej [13] w temperaturze 28 C, a potencjalną aktywność wiązania azotu molekularnego przez diazotrofy glebowe oznaczano zmodyfikowaną metodą Pochona [14]. Wyniki podano w przeliczeniu na 1 g suchej masy gleby. Obliczenia statystyczne wykonano metodą analizy wariancji z zastosowaniem testu Duncana. Analizy chemiczne wykonywane po 7, 30 i 90 dniach z próbek uśrednionych obejmowały: oznaczenie ph KCl metodą potencjometryczną i mineralnych form azotu metodą Greweling-Peecha [15]. Wyniki i ich omówienie Dodatek herbicydów do gleby zazwyczaj okresowo hamuje rozwój diazotrofów niesymbiotycznych. Nie zmniejsza się przy tym zawartość azotu amonowego, a nawet czasami wzrasta w porównaniu z glebą kontrolną (nietraktowaną herbicydem). Zapewne ta grupa mikroorganizmów przystosowuje się do występującego w środowisku herbicydu [6, 9]. Podobne zaleŝności zaobserwowano w badaniach własnych w okresie wiosennym po 7 i 30 dniach. Stwierdzono statystycznie istotne hamowanie liczebności diazotrofów w obiektach z Roundupem zarówno w glebie nienawoŝonej, jak i w glebie z obornikiem (rys. 1). Sugeruje to, Ŝe wzrost substancji organicznej wpływał na wydłuŝenie czasu zanikania Roundupu w glebie [16]. Diazotrofy niesymbiotyczne najwyraźniej okazały się słabszymi konkurentami w glebach pobranych w okresie wiosennym, a i duŝe wyjściowe stęŝenie jonów amonowych w glebie najwyraźniej wykazywało działanie hamujące ich wzrost. Przyczyn tego zjawiska moŝna dopatrywać się takŝe we wzroście kwasowości gleb, co spowodowało selekcję wraŝliwych szczepów wiąŝących azot molekularny. Termin aplikacji herbicydu Roundup do gleby ma znaczny wpływ na liczebność i aktywność diazotrofów glebowych. O ile jesienią obserwowano okresową stymulację ich rozwoju [17], o tyle zastosowanie Roundupu w okresie wiosennym znacznie przyhamowało ich rozwój. Początkowo teŝ herbicyd znacząco hamował proces wiązania azotu zarówno w glebie nawoŝonej, jak i nienawoŝonej. Natomiast po 30 dniach w glebie nienawoŝonej, a po 90 dniach w glebie nawoŝonej obornikiem potencjalna aktywność wiązania azotu w obecności Roundupu była okresowo większa (rys. 2), pomimo obecności herbicydu i duŝego stęŝenia jonów amonowych. W okresie jesiennym wzrost intensywności wiązania azotu obserowano tylko po 90 dniach w glebie nienawoŝonej [17]. W okresie wiosennym zaobserwowano większy wpływ substancji organicznej zarówno na potencjalne wiązanie azotu atmosferycznego, jak i stęŝenie jonów azotanowych niŝ w okresie jesiennym.
598 Teresa Krzyśko-Łupicka GOH - gleba nawoŝona obornikiem traktowana herbicydem. Wartości oznaczone takimi samymi literami nie róŝnią się dla p 0,05 Rys. 1. Ogólna liczebność diazotrofów w glebie w obecności herbicydu w okresie wiosennym [jtk (g s.m. gleby) 1 ] GOH - gleba nawoŝona obornikiem traktowana herbicydem. Wartości oznaczone takimi samymi literami nie róŝnią się dla p < 0,05 Rys. 2. Intensywność wiązania azotu [Dn] w obecności herbicydu w okresie wiosennym
Ekologiczne skutki działania herbicydu fosfoorganicznego na diazotrofy glebowe w okresie 599 Równolegle w obiektach z herbicydem juŝ od 7 dnia obserwowano wzrost stęŝenia azotu amonowego, który utrzymywał się na stałym wysokim poziomie około 140 mg kg 1 s.m. gleby przez cały okres trwania doświadczenia (rys. 3). Tak duŝe stęŝenie N-NH 4 moŝe być jednak wynikiem intensywnie przebiegających wiosną procesów amonifikacji, stymulowanych przez Roundup, a nie bezpośrednio wiązania azotu molekularnego. W okresie jesiennym stęŝenie N-NH 4 w analogicznych obiektach było 4-krotnie mniejsze i wykazywało tendencję spadkową [17]. GOH - gleba nawoŝona obornikiem traktowana herbicydem Rys. 3. StęŜenie N-NH 4 [mg (kg s.m.) 1 ] w glebie w zaleŝności od czasu działania herbicydu Roundup wyraźnie do 30 dnia zmniejszał stęŝenie azotu azotanowego w glebie, po czym stymulował jego wzrost, ale stęŝenie azotu azotanowego w glebie nienawoŝonej po 90 dniach było zbliŝone do stęŝenia azotu w obiekcie bez herbicydu. W glebie nawoŝonej obornikiem w obecności herbicydu obserwowano prawie 1,5 raza większe stęŝenie azotanów niŝ w obiekcie bez herbicydu (rys. 4). Stosowanie obornika sprzyjało nagromadzaniu się N-NO 3 w glebie, a w obecności Roundupu najwyraźniej następował wzrost procesu nitryfikacji. Odmienne zaleŝności zaobserwowano w okresie jesiennym, gdyŝ stęŝenie azotu azotanowego wzrastało w glebie nienawoŝonej traktowanej Roundupem [17]. Obserwowany wzrost kwasowości gleb traktowanych Roundupem (rys. 5) mógł być przyczyną hamowania rozwoju diazotrofów wraŝliwych na odczyn ph gleby, np. Azotobacter chroococcum, a funkcję tę przejęły inne mniej wraŝliwe szczepy Azotobacter vinelandii, który dobrze znosi ph = 3 5,5 [18], bakterie naleŝące do rodziny Enterobacteriaceae [5] czy bakterie z rodzajów: Azomonas, Beijerinckia, Arthrobacter, Bacillus i Clostridium [19].
600 Teresa Krzyśko-Łupicka GOH - gleba nawoŝona obornikiem traktowana herbicydem Rys. 4. StęŜenie N-NO 3 [mg (kg s.m.) 1 ] w glebie w zaleŝności od czasu działania herbicydu GOH - gleba nawoŝona obornikiem traktowana herbicydem Rys. 5. Zmiany odczynu ph gleby w zaleŝności od czasu działania herbicydu w okresie wiosennym Jednak ocena zagroŝeń stwarzanych przez środki ochrony roślin jest sprawą trudną. Według kryterium Domsha [20], wszelkie zmiany badanego procesu zarówno hamowanie, jak i stymulacja, wynoszące ponad 50% w stosunku do kontroli, oraz czas trwania tego zaburzenia powyŝej 60 dni moŝna uznać za groźne dla środowiska. W badaniach własnych stwierdzono tylko okresowe zaburzenia procesu wiązania azotu atmosferycznego przez diazotrofy niesymbiotyczne. Biologiczne wiązanie azotu decyduje w duŝej mierze o zwiększeniu produktywności biologicznej ekosystemów polowych i trawiastych [19]. Roundup zastosowany do odchwaszczania w okresie wiosennym sprzyja zwiększeniu zasobności gleb w azot amonowy.
Wnioski Ekologiczne skutki działania herbicydu fosfoorganicznego na diazotrofy glebowe w okresie 601 1. W okresie wiosennym Roundup silniej hamował rozwój diazotrofów niesymbiotycznych niŝ intensywność wiązania azotu. Po 30 dniach w glebie nienawoŝonej, a po 90 dniach w glebie z obornikiem obserwowano stymulację procesu biologicznego wiązania azotu. 2. W obiektach z herbicydem obserwowano wzrost stęŝenia azotu amonowego, który utrzymywał się na stałym, wysokim poziomie około 140 mg kg 1 s.m. gleby przez cały okres doświadczenia. 3. Roundup do 30 dnia wyraźnie obniŝał stęŝenie azotu azotanowego w glebie nienawoŝonej, ale po 90 dniach było ono podobne jak w obiekcie bez herbicydu. Literatura [1] La Nauze I., Rosenberg H. i Show P.C.: Biochim. Biophis. Acta., 1970, 212, 332-350. [2] Dick R.E. i Quinn, J.P.: Appl. Microbiol. Biotechnol., 1995, 43, 545-550. [3] Rueppel M.L., Brighwell B.B., Schaefer J. i Marvel J.T.: J. Agric. Food Chem., 1997, 25, 517-528 [4] Araujo A.S.F., Monteiro R.T.R. i Abarkeli R.B.: Chemosphere, 2003, 52, 799-804. [5] Myśków W. i Kobus J.: Post. Mikrobiol., 1986, 25(3/4), 243-255. [6] Strzelec A.: Rocz. Glebozn., 1986, 37(1), 129-138. [7] Wielbo J. i Skorupska A.: Post. Mikrobiol., 2005, 44(1), 47-56. [8] Grossbard E.: Effect on soil microflora. [w:] Herbicides: Physiology, Biochemistry, Ecology. Edit. Audus L.J. Academic Press, London 1976. [9] Hauke -Pacewiczowa T.: Pamięt. Puław., 1971, 46, 5-48. [10] Koper J. i Piotrowska A.: Z. Nauk. Akad. Techn.-Rol., Bydgoszcz, 1999, 220(44), 151-158. [11] Cieśla W. i Koper J.: Rocz. Glebozn., 1990, 41(3/4), 73-83. [12] Wachowska U. i Banaszkiewicz T.: Natur. Sci., 1999, 2(Y), 191-200. [13] Fenglerowa W.: Acta Microbiol. Pol., 1970, 14(2), 203-206. [14] Pfeifer-Maliszewska W.: Metody oznaczania potencjalnej aktywności procesu wiązania wolnego azotu w glebie. Prace z dziedziny mikrobiologii gleby. PTG, Warszawa 1974. [15] Nowosielski O.: Metody oznaczania potrzeb nawozowych. PWRiL, Warszawa 1974. [16] Mensink H i Janssen P.: Environmental health criteria for glyphosate. International Programme on Chemical Safety 1994. [17] Krzyśko-Łupicka T. i Grata K.: Ecol. Chem. Eng. S, 2008, 15(1), 95-102. [18] Bergey s manual of determinative bacteriology. Wiliams and Wilkins, Baltimore 1994. [19] Barabasz W.: Post. Mikrobiol., 1992, 31(1), 3-40. [20] Domsh K.H.: WRO. Techn. Rep. Agric. Res. Cpounc. WRO. Begbroke. Hill Yarnton. Oxford 1980, 59, 5-6. ECOLOGICAL EFFECTS OF PHOSPHOORGANIC HERBICIDE ON SOIL DIAZOTROPHS IN SPRING. PART II Summary: The main aim of the research was to check how Roundup affects the number and intensity of nitrogen absorption by diazotrophs, depending on the soil organic substance content. The number of diazotrofs has been determined by means of the plate method based on the nitrogen free Fengler s medium and their potential ability of atmospheric nitrogen absorption by means of the modified Pochon s method. It has been found that the 7 and 30 days herbicide presence seems to inhibition of diazotroph number in both, manured and non-manured soil. However, after 90 days differences in tested objects have not been observed. Potential ability of atmospheric nitrogen absorption has been obvoiusly suppressed after its 7 days activity in the
602 Teresa Krzyśko-Łupicka manured and non-manured soil. Parallely Roundup favored increase of the concentration of ammonium-nitrate and decrease nitrogen-nitrate in tested objects. The use of Roundup in order to fight weeds has shown the influence on the increase in ammonium-nitrate, simultaneously improving crops development. Keywords: soil, Roundap, diazotrophs, N-fixing activity, spring