XI. Antybiotyki i chemioterpeutyki ćwiczenia praktyczne W przedstawionych ćwiczeniach narysuj i zinterpretuj otrzymane wyniki badań mechanizmów oporności. Opisz rodzaje krążków użytych do badań oraz sposób wykonania oznaczenia. Ćwiczenie 1. Oznaczanie wrażliwości szczepów na metycylinę Szczególne niebezpieczeństwo stanowią szczepy tzw. gronkowców metycylinoopornych (oksacylinoopornych) występujące zarówno wśród gatunków koagulazododatnich (MRSA ang. methicillin resistant Staphylococcus aureus) jak i koagulazoujemnych (MRCNS ang. methicillin resistant coagulase negative staphylococci). Zasada metody: Mechanizm oporności na metycylinę Polega na zmianie docelowego miejsca wiązania antybiotyku b-laktamowego - zmianie w białkach wiążących penicyliny-pbp (transpeptydazy) co jest powodem całkowitego braku lub zmniejszenia zdolności łączenia się leku z komórką bakteryjną. Oporność na metycylinę warunkowana jest obecnością nowego białka wiążącego penicylinę zwanego PBP2a lub PBP2, kodowanego przez gen meca zlokalizowany w chromosomie i stanowiący cześć regionu noszącego nazwę SCCmec (gronkowcowa kaseta chromosomalna mec, ang. staphylococcocal cassette chromosome mec). W odróżnieniu od pozostałych białek PBP, białko PBP2a nie ulega hamowaniu przez antybiotyki β-laktamowe z powodu obniżonego powinowactwa do tych antybiotyków. Białko PBP2a zachowuje natomiast swoją funkcję enzymatyczną i uczestniczy w syntezie ściany komórkowej, ale jego ekspresja zachodzi tylko w obecności β-laktamu. Podłoże: MHA (Muller-Hinton agar). Zawiesina bakteryjna o gęstości 0,5 McFarlanda. Zawiesinę posiać metodą murawkową na podłoże jałową wymazówką. Umieścić krążek z cefoksytyna 30 mg. Inkubować przez 24h w temp. 33-35 C, w atmosferze tlenowej.
Odczyt wyników: wykonać pomiar wielkości strefy zahamowania wzrostu (zwrócić szczególną uwagę na pojedyncze kolonie w strefie). Odczyt przeprowadzić w świetle odbitym. Interpretacja wyników: Szczepy oporne na meticylinę są klinicznie oporne na wszystkie antybiotyki β-laktamowe, czyli na: penicyliny, penicyliny z inhibitorami, cefalosporyny, cefalosporyny z inhibitorami, monobaktamy, karbapenemy. Uwaga: Nie należy oznaczać wrażliwości na inne leki z tej grupy, a wykonanie takiego oznaczenia może prowadzić do uzyskiwania niewiarygodnych wyników (aktywność in vitro, przy braku skuteczności klinicznej). Otrzymany wynik w ćwiczeniu 1. Strefa zahamowania wzrostu ( w mm) Otrzymany wynik Ćwiczenie 2. Oznaczanie mechanizmu oporności MLS B Zasada metody: Mechanizm oporności na makrolidy, linkosamidy i streptograminy B Mechanizm tej oporności związany jest z modyfikacją miejsca docelowego działania leku, co warunkowane jest obecnością genów erm kodujących metylazy rybosomalne. Metylacja dużej podjednostki rybosomu powoduje oporność krzyżową w mechanizmie MLS B typu (kmls B ) konstytutywnego lub indukcyjnego (imls B ) wobec antybiotyków działających na to samo miejsce. Zawsze należy wykonać oznaczenie metodą dwóch krążków, bo jedynie metoda dyfuzyjnokrążkowa pozwala wykryć indukcyjny mechanizm oporności na makrolidy, linkosamidy i streptograminy B.
Podłoże MHA Zawiesina bakteryjna o gęstości 0,5 McFarlanda Nanosimy zawiesinę na podłoże jałową wymazówką, nakładamy krążki z erytromycyną 15 mg i klindamycyną 2 mg w odległości 15-26 mm od krawędzi krążków. Inkubacja: 16-18 h w temp. 33-35 C, w atmosferze tlenowej. Odczyt i interpretacja wyników: W przypadku oporności na erytromycynę należy zwracać uwagę na spłaszczenie strefy zahamowania wzrostu dookoła krążka z klindamycyną od strony krążka z erytromycyną (kształt litery D) świadczące o indukcyjnym mechanizmie oporności MLS B.
Interpretacja wyników: W przypadku stwierdzenia mechanizmu MLS B zarówno konstytutywnego, jak i indukcyjnego, ze względu na ryzyko niepowodzenia terapeutycznego, w leczeniu nie powinno się stosować: makrolidów, linkosamidów, streptogramin B............ Ćwiczenie 3. Oznaczanie mechanizmów oporności ESBL Zasada metody: Mechanizm oporności typu ESBL Jednym z najistotniejszych klinicznie i epidemiologicznie mechanizmów oporności na leki u pałeczek Gram-ujemnych (z rodziny Enterobacteriaceae oraz pałeczek niefermentujących) jest wytwarzanie tzw. β-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL). Są to enzymy zdolne do hydrolizy: penicylin, cefalosporyn (z wyjątkiem cefamycyn, np. cefoksytyny), monobaktamów (aztreonamu). Najważniejsza jest ich aktywność względem cefalosporyn III i IV generacji. Uwagi: Pomimo, że ESBL są hamowane przez inhibitory β-laktamaz (kwas klawulanowy, sulbaktam i tazobaktam), szczepy ESBL+ nierzadko okazują się oporne in vitro na połączenia β-laktamów z inhibitorami. Co jednak ważniejsze, szczepy ESBL+ mogą wykazywać wrażliwość in vitro na leki należące do substratów ESBL, zwłaszcza na przynajmniej niektóre cefalosporyny III/IV generacji i/lub aztreonam. Podłoże MHA, zawiesina bakteryjna o gestosci 0,5 McFarlanda, inkubacja 16-18h w temp. 35 o C± 2 o C, w atmosferze tlenowej Do wykrywania ESBL może być stosowany tzw. test dwóch krążków (DDST). W wariancie podstawowym tej metody stosuje się krążki z ceftazydymem 30 µg i cefotaksymem 30 µg ułożone w odległości 2 cm (pomiędzy środkami) od krążka z amoksycyliną z kwasem klawulanowym 20/10 µg. W celu zwiększenia czułości testu można dodawać krążki z cefpodoksymem 10 µg i/lub aztreonamem 30 µg. Wynik pozytywny testu polega na wyraźnym powiększeniu strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z ceftazydymem lub cefotaksymem (cefpodoksymem, aztreonamem) od strony krążka zawierającego kwas klawulanowy. Powiększenie to może przybierać bardzo różne kształty.
Interpretacja wyników: Przyjęto zalecenie, by szczepy wytwarzające ESBL traktować jako szczepy oporne na: wszystkie penicyliny (bez połączeń z inhibitorami), cefalosporyny (z wyjątkiem cefamycyn), aztreonam. W przypadku ciężkich zakażeń oraz w przypadku chorych z czynnikami ryzyka, szczepy ESBL+ bywają traktowane jako z definicji oporne również na połączenia antybiotyków β- laktamowych z inhibitorami β-laktamaz, chociaż zagadnienie to pozostaje przedmiotem kontrowersji i wymaga więcej danych klinicznych. Podane zalecenia należy stosować mniej restrykcyjnie w przypadku szczepów ESBL+ izolowanych z miejsc ciała, w których leki ulegają zagęszczeniu............ Ćwiczenie 4. Oznaczanie mechanizmu typu MBL - β-laktamazy hydrolizujace karbapenemy (tzw. karbapenemazy) Obecnie, coraz powszechniej uważa się, że każdy izolowany w szpitalu szczep pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae powinien być poddany wstępnemu badaniu na możliwość wytwarzania karbapenemazy typu MBL lub KPC. Szczepy te powinno się traktować jako jedne z potencjalnie najgroźniejszych patogenów człowieka.
Zasada metody: Metalo-β-laktamazy klasy B (tzw. enzymy MBL) - zwane tak ze względu na wykorzystywanie jonów Zn 2+ jako kofaktorów reakcji hydrolizy β-laktamów. Szczepy MBL+ są oporne lub wykazują obniżoną wrażliwość na: penicyliny, cefalosporyny, karbapenemy, połączenia z inhibitorami b-laktamaz (brak wpływu inhibitorów). Test wykonuje sie metodą dyfuzyjno-krążkową, a płytki MHA z posianym szczepem bakterii przygotowuje się jak w rutynowych badaniach wrażliwości na leki wg zaleceń CLSI (jak wyżej). Na płytce układa sie zestaw krążków: krążek z EDTA (10 μl 0,5M EDTA, ph 7,3-7,5) i po jego obu stronach krążki z ceftazydymem 30 μg i imipenemem 10 μg, odległe od krążka z EDTA o 2 cm (miedzy środkami krążków). Dodatkowo, można też wykonać oznaczenie z drugim zestawem krążków, w którym krążek środkowy zawiera kwas 2-merkaptopropionowy zamiast EDTA. Krążki z EDTA (i 2-MPA) należy przygotować samodzielnie na kilka minut przed ułożeniem na płytce. Odczyt wyniku EDTA (2-MPA) jest inhibitorem MBL, w związku z tym, o wytwarzaniu tych enzymów świadczy pojawienie się i wyraźne powiększenie strefy wokół krążka z ceftazydymem i/lub karbapenemem od strony krążka zawierającego inhibitor (obraz bardzo podobny do dodatniego wyniku oznaczania ESBL metoda dwóch krążków, DDST)............