Michał Starzycki Elżbieta Starzycka-Korbas Jacek Żebrowski. IHAR PIB w Poznaniu 2016

Transkrypt

1 Badania metabolomu roślin rzepaku Brassica napus L. zmutowanych pod wpływem pierwotnego porażenia fitoplazmami. Investigation of metabolome Brassica napus L. mutants after primary infection by phytoplasmas like organism Michał Starzycki Elżbieta Starzycka-Korbas Jacek Żebrowski IHAR PIB w Poznaniu 2016

2 Występowanie patogenów rzepaku pochodzenia grzybowego w zależności od fizjologicznej fazy rozwoju roślin Patogen Faza rozwoju roślin Liścienie Rozeta Rozeta (okres zimy) Pąkowanie Kwitnienie Formowanie łuszczyn Phoma lingam Sclerotinia sclerotiorum Alternaria spp. Cylindrosporium concentricum Verticillium dahliae

3 Najważniejsze chorobotwórcze grzyby występujące w Polsce. Wyniki po sekwencjonowaniu DNA ITS Tab. 1. Wstępne badania patogenów występujących na rzepaku w okresie wczesnej wiosny lp sygnatura próby Identyfikacja ITS C Phoma eupyrena 2 002C Phoma eupyrena 3 003C Alternaria tenuissima/ Dioscorea polystachya 4 004C Alternaria tenuissima/ Dioscorea polystachya 5 005C Dioscorea/ Cladosporium 6 006C Phoma eupyrena 7 007C Phoma eupyrena 8 008C Phoma eupyrena 9 009C Phoma eupyrena C Phoma eupyrena C Phoma eupyrena C Phoma eupyrena C Phoma eupyrena C Phoma eupyrena C Phoma eupyrena C Phoma eupyrena C Phoma eupyrena J Fusarium sp./ Gibberella avenacea J Mucor hiemalis J Epicoccum nigrum J Alternaria tenuissima/ Dioscorea polystachya J brak produktu PCR J Verticillium J Leptosphaeria maculans XXXXXXXXXXXXXXXX J Plectosphaerella (również (Verticillium sp.; Colletotrichum pisi)) C Phoma eupyrena J Leptosphaeria maculans XXXXXXXXXXXXXXXX C Davidiella tassiana C Verticillium J Phoma eupyrena C Phoma eupyrena J Verticillium J Trichosporon sp J Verticillium G brak próby

4 Zgnilizna twardzikowa Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary Molekularna identyfikacja występowania patogenicznych grzybów wobec rzepaku techniką sekwencjonowania ITS1 ITS4. Heterogenne DNA Informacja o przynależności gatunkowej patogena (NCBI / BLAST). S. sclerotiorum, Katalog M. Starzycki 2015

5 Analiza agresywności patotypów S. sclerotiorum w warunkach in vitro, wyrażona zdolnością do zmiany zabarwienia pożywki pod wpływem kwasu szczawiowego Odległość wiąz Diagram drzewa Pełne wiązanie Odległ. euklidesowa Analizowano pod względem DNA 42 nowe patotypy S. sclerotiorum (dodano do kolekcji 20, miernik 20). Użyto starterów mikrosatelitarnych SSR. poddano sekwencjonowaniu DNA (7) w celu stwierdzenia czystości gatunkowej. Agresywność oceniona (mm) zdolnością grzyba S. sclerotiorum do przerastania pożywki PDA z indykatorem po 48h hodowli. (Badania 2015).

6 Rzepak ozimy porażony przez fitoplazmy (ważna choroba z uwagi na zmutowane potomstwo) Przyczyną są bakterie powodujące chorobę fitoplazmatyczną - fylloidozę

7 Symptomy towarzyszące porażeniu rzepaku ozimego przez fitoplazmy Symptomy porażenia zależne są od fizjologicznego stadium rozwoju rzepaku: - najsilniejsze przed kwitnieniem - silne podczas kwitnienia - słabsze po kwitnieniu Najczęściej obserwowane deformacje: - płatki korony przekształcone w liście - miodniki zmienione w małe pąki - w miejscu słupka może wyrastać siewka o wydłużonych liścieniach - łuszczyny przypominające rozdęte pomarszczone małe strąki grochu

8 Gatunki fitoplazm oznaczone do 2016 allocasuarinae" americanum" asteris" aurantifolia" australiense" balanitae" brasiliense" caricae" castaneae" cirsii" cocosnigeriae" cocostanzaniae" convolvuli" costaricanum" cynodontis" fragariae" fraxini" graminis" japonicum" luffae" lycopersici" malasianum" mali" omanense" oryzae" palmae" palmicola" phoenicium" pini" pruni" prunorum" pyri" rhamni" rubi" solani" spartii" sudamericanum" tamaricis" trifolii" ulmi" vitis" ziziphi"

9 Ewolucyjne pochodzenie patotypów fitoplazm (Bertaccini A. 1998) A. laidlawii (Acholoplasma laidlawii) VK (grapevine yellow strain) CPh OY RPh MIAY SAY AAY STOL (stolbur strain) (clover phyllody strain) (onion yellow strain) (rape phytoplasma) (Michigen AYS) (Severe strain AAY) (American aster yellow)

10 Scheme of the research Plants infected by phytoplasmas Analysis of DNA and pathogen identification Seed sowing in vitro culture Observations of plants development Normal plants 70% Abnormal plants 30% Isolation of (2n) forms Production of (1n) forms Observations of plants Observations of plants development (453) development (200)

11 Wyniki 558 pz wz wz 1. Roślina C. roseus nieporażona przez fitoplazmy. 2. C. roseus wzorzec porażenia. 3. Roślina B. napus nieporażona przez fitoplazmy Rośliny B. napus porażone rzez fitoplazmy. Rys. 1. Amplifikowane DNA fitoplazm (558 pz) po analizie PCR przy użyciu starterów fa16/ra16 (Ahrens, Seemuller 1992, Schneider i in. 1993). Kontrolne rośliny C. roseus

12 Na polach doświadczalnych Borowa, Małyszyna i Bąkowa (HR Grupa IHAR Spółki z o. o.) do 2015 roku odnotowano podobną liczbę porażonych przez fitoplazmy roślin B. napus. Na powierzchni ok. 100 m 2 zaobserwowano od 2-5 roślin z typowymi morfologicznymi deformacjami kwiatów i kwiatostanów.

13 KONSEKWENCJE PORAŻENIA RZEPAKU OZIMEGOW PRZEZ FITOPLAZMY

14 Zmiany fenotypowe towarzyszące potomstwu rzepaku po pierwotnym porażeniu przez fitoplazmy

15 Rośliny staśmione - brak patogena 558 pz wz wz 1. Roślina C. roseus nieporażona przez fitoplazmy, 2. C. roseus wzorzec porażenia, 3. Roślina B. napus porażona przez fitoplazmy - wzorzec 4-7. Rośliny B. napus staśmione nieporażona przez fitoplazmy. Rys. 3. Analiza staśmionych roślin rzepaku ozimego przy użyciu PCR i starterów fa16/ra16 amplifikujących fragmenty DNA o długości 558 pz. (Ahrens, Seemuller 1992, Schneider i in. 1993)

16 Tab. 1. Obserwacje prowadzone na roślinach powstałych ze skrzyżowania form zdrowych i staśmionych Przed jaryzacją Po jaryzacji Liczba roślin Liczba roślin Liczba roślin Liczba roślin ogółem zniekształconych ogółem zniekształconych Po 4 miesiącach wszystkie rośliny były staśmione

17 Tab. 2. Obserwacje prowadzone na roślinach z chowu wsobnego form staśmionych Przed jaryzacją Po jaryzacji Liczba roślin Liczba roślin Liczba roślin Liczba roślin ogółem zniekształconych ogółem zniekształconych Po 4 miesiącach wszystkie rośliny były staśmione

18 Potomstwo F 1 B. napus po pierwotnej infekcji roślin matecznych fitoplazmami

19 Cd. Badania związane z deformowanymi roślinami rzepaku zmutowanymi przez fitoplazmy Roślina rzepaku zmutowanastaśmiona przekazana do badań metabolomicznych.

20 Region białek 2A 2S Rys. 1. Wykres wskazujący zmiany na poziomie metabolomu białek rzepaku staśmianego (2S) do prawidłowo rozwiniętego (2A)

21 Zmiany zachodzące na poziomie metabolomu roślin staśmionych rzepaku w porównaniu do identycznych genotypów bez staśmień + silny sygnał zmian, - brak zmian L.p. Symbol badanej rośliny Zmiany na poziomie lipidów Zmiany na poziomie białek Zmiany na poziomie polisacharydów 1. 1A A A A A A A A A A A A A A Skala zmian: ( - =0),brak różnic, (+ =1), różnica mała, różnica średnia (++ =2), różnica b. duża (+++ =3)

22 Wykres statystyczny bloku zmian zachodząceych na poziomie metabolomu staśmionych roślin rzepaku 4,0 Ramkowy wiele zmiennych Arkusz1 10v*18c Średnia; Współczynnik: Średnia±Błąd std; Wąs: Średnia±2*Odch.std 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0-0,5-1,0 Lipidy Białka Polisacharydy Średnia Średnia±Błąd std Średnia±2*Odch.std Odstające Ekstremalne

23 Podsumowanie Konsekwencje porażenia rzepaku ozimego przez fitoplazmy: Deformacje kwiatostanów i kwiatów roślin porażonych. Mutacyjny wpływ patogena na potomstwo - powstawanie roślin staśmionych. Negatywne skutki zapylenia krzyżowego pyłkiem pochodzącym z roślin staśmionych - rozwój tylko egzemplarzy staśmionych. Po przeprowadzonych badaniach stosując spektroskop FTIR (w dalekiej podczerwieni z transformatą fourierowską) odnotowano różnice w metabolomie regionów charakterystycznych dla białek, polisacharydów i lipidów. Podobne wyniki otrzymano w ubiegłym roku.

24 Uczestnicy seminarium poświęconego fitoplazmom na rzepaku Bąków 2003

25