Opracowanie optymalnych parametrów odzyskiwania białek z kręgosłupów dorsza bałtyckiego (Gadus morhua) oraz fizykochemiczna charakterystyka produktów

Transkrypt

1 Politechnika Gdańska Wydział Chemiczny Katedra Chemii, Technologii i Biotechnologii Żywności Rozprawa doktorska Opracowanie optymalnych parametrów odzyskiwania białek z kręgosłupów dorsza bałtyckiego (Gadus morhua) oraz fizykochemiczna charakterystyka produktów mgr inż. Elżbieta Skierka Promotor rozprawy dr hab. inż. Maria Sadowska Gdańsk, 2008

2 Dziękuję Pani dr hab. inż. Marii Sadowskiej za cenne wskazówki i pomoc podczas wykonywania i redagowania rozprawy oraz wszystkim, którzy przyczynili się do jej powstania 2

3 Spis treści Streszczenie 1. Wprowadzenie Charakterystyka ubocznych produktów przemysłu rybnego Skład chemiczny i budowa kręgosłupów ryb Wartość biologiczna białek ryb Budowa kości Charakterystyka kolagenu kości Wydzielanie niekolagenowych składników z surowców łącznotkankowych Ekstrakcja białek mięśniowych Wydzielanie białek niekolagenowych na drodze hydrolizy enzymatycznej Fizykochemiczna charakterystyka kolagenu Budowa kolagenu Wiązania sieciujące kolagen Genetyczne typy kolagenu Rozpuszczalność kolagenu Wpływ obróbki enzymatycznej kolagenu na jego rozpuszczalność Metody izolacji kolagenu z tkanki łącznej Otrzymywanie kolagenu lub żelatyny z kości zwierząt stałocieplnych Otrzymywanie kolagenu lub żelatyny z kości zwierząt wodnych Metody wydzielania białek z roztworu Metody chemiczne Interakcje białek z polisacharydami Karageny Sposoby wydzielania kolagenu z roztworu Funkcjonalne właściwości preparatów białkowych Rozpuszczalność Wodochłonność i wiązanie oleju Właściwości emulgujące Żelowanie Właściwości pianotwórcze Wykorzystanie hydrolizatów białkowych Cel pracy

4 12. Materiały i postępowanie doświadczalne Materiały Wydzielanie białek mięśniowych z kręgosłupów dorsza bałtyckiego Demineralizacja kręgosłupów Otrzymywanie preparatu białek mięśniowych Określenie właściwości funkcjonalnych mączki białek mięśniowych Ekstrakcja kolagenu z kręgosłupów dorsza bałtyckiego Właściwości fizykochemiczne preparatu kolagenowego Ekstrakcja żelatyny z kręgosłupów dorsza bałtyckiego Metody analityczne Analiza statystyczna Wyniki i dyskusja wyników Skład podstawowy kręgosłupów dorsza bałtyckiego Ekstrakcja białek mięśniowych z kręgosłupów nieorganicznymi rozpuszczalnikami Metoda enzymatyczna wydzielania białek mięśniowych Ustalenie optymalnych parametrów demineralizacji kręgosłupów Demineralizacja EDTA Demineralizacja HCl Otrzymywanie preparatu białkowego Właściwości funkcjonalne preparatu białkowego Ocena przydatności preparatu białek mięśniowych z dorsza jako dodatku do różnych przetworów spożywczych Rozpuszczalność kolagenu w kwasie octowym Wpływ obróbki enzymatycznej na rozpuszczalność kolagenu w kwasie octowym Rekonstytucja włókien kolagenowych z roztworu κ-karagenem Cieplna rozpuszczalność kolagenu kręgosłupów dorsza bałtyckiego Właściwości fizykochemiczne preparatu kolagenowego Podsumowanie Piśmiennictwo Dorobek naukowy

5 Streszczenie Celem pracy było opracowanie procesu technologicznego odzyskiwania białek z kręgosłupów dorsza bałtyckiego (Gadus morhua) oraz określenie fizykochemicznych właściwości białek mięśniowych i kolagenu. Proces technologiczny składa się trzech etapów: wydzielania białek mięśniowych, demineralizacji kręgosłupów oraz ekstrakcji kolagenu. Białka mięśniowe wydzielano z kręgosłupów dwiema metodami: chemiczną 5 % roztworem NaCl o ph 7,5 i/lub 0,1 M roztworem NaOH przy stosunku surowa do rozpuszczalnika od 1 : 2 do 1 : 12 (w : v) oraz enzymatyczną stosując trypsynę lub alkalazę w stężeniu od 2,5 do 40 mg/g surowca. Wszystkie procesy i operacje jednostkowe prowadzono w temp. 4 C. Stwierdzono, że 0,1 M roztwór NaOH jest lepszym rozpuszczalnikiem białek mięśniowych niż 5 % roztwór NaCl. Po dwukrotnej 15 min ekstrakcji przy stosunku surowca do rozpuszczalnika 1 : 2 (w : v), z zastosowaniem intensywnego mieszania można całkowicie wyekstrahować sumę białek sarkoplazamtycznych i miofibrylarnych, podczas gdy stosując trypsynę lub alkalazę można maksymalnie zhydrolizować odpowiednio ok. 60 i 55 % białek mięśniowych zawartych w surowcu. Uzyskany na drodze alkalicznej ekstrakcji preparat białek mięśniowych charakteryzuje się nieomal trzykrotnie większą rozpuszczalnością w zasadowym środowisku w porównaniu do komercyjnie dostępnego preparatu białek wieprzowych. Ponadto posiada on 16 krotnie większą zdolność pienia w zakresie ph od 6 do 12. Otrzymane białko charakteryzuje się 2 krotnie mniejszą zdolnością wiązania oleju oraz prawie 5,5 krotnie mniejszą zdolnością wiązania wody w porównaniu z białkowym preparatem wieprzowym. Demineralizację odbiałczonych kręgosłupów dorsza bałtyckiego prowadzono w 0,1 M; 0,5 M i 1,0 M roztworze HCl oraz kompleksując jony metali kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) o stężeniu 0,1 M i 0,5 M. Ustalono, że najlepszy efekt demineralizacji kręgosłupów uzyskano po zastosowaniu 1,0 M roztworu HCl. Po dwukrotnej 30 min ekstrakcji z zastosowaniem mieszania można wydzielić 100 % soli mineralnych z kręgosłupów otrzymując oseinę. Roztworem EDTA maksymalnie usuwa się 72 % soli. Kolagen z oseiny rozpuszczano w 0,5 M roztworze kwasu octowego przy stosunku surowca do rozpuszczalnika od 1 : 4 do 1 : 8 (w : v), przez 24, 48 i 72 h w 4 ºC. Zbadano wpływ obróbki enzymatycznej na rozpuszczalność kolagenu z oseiny. Pepsynę stosowano w stężeniu od 1,5 do 8 mg/g oseiny. Po 24 h ekstrakcji przy optymalnym stężeniu enzymu (4 mg/g surowca) maksymalnie rozpuszcza się ok. 75 % kolagenu. Kolagen rozpuszczony w kwasie octowym można nieomal całkowicie rekonstytuować κ-karagenem, przy stosunku polisacharydu do białka 1 : 1 (w : w). Kolagen z kręgosłupów dorsza bałtyckiego denaturuje w 14,4 C, a przelicznik hydroksyproliny na kolagen wynosi 15,7. 5

6 1. Wprowadzenie Dostawy ogółem dorsza bałtyckiego (Gadus morhua) w Polsce w roku 2003 wynosiły 20,12 tys. ton, w tym 12,36 tys. ton z połowów bałtyckich a 7,76 tys. ton z importu (Kołodziej i Kołodziejski, 2005). Po przetworzeniu całej ryby na filety bez skóry powstają odpady o różnych właściwościach i przydatności technologicznej. Sumaryczna masa odpadów może przekraczać 60 % masy surowca wyjściowego. Kręgosłup wraz z płetwami stanowi ok. 15 % całej masy ryby (Sikorski, 1992; Gildberg i inni, 2002). Część odpadów przemysłu rybnego przetwarzana jest na mączkę rybną lub wykorzystywana w niewielkim stopniu jako składnik karmy w hodowli zwierząt futerkowych, natomiast pozostała część trafia na wysypiska śmieci jako odpady szczególnie uciążliwe dla środowiska. Brak zagospodarowania tych odpadów stanowi poważny problem ze względu na wzrastającą ilość zanieczyszczeń środowiska. Kręgosłupy otrzymane po filetowaniu ryb zawierają dużo przylegającej tkanki mięśniowej, która jest niewykorzystanym źródłem pełnowartościowego białka. Białka mięśniowe można odzyskać na drodze ekstrakcji nieorganicznymi rozpuszczalnikami, lub hydrolizy enzymatycznej. Rybne hydrolizaty białkowe mogą znaleźć zastosowanie jako dodatki do zup, makaronów, pieczywa oraz jako substytuty mleka i jako składniki dietetycznej żywności (Synowiecki i Sikorska-Wiśniewska, 1997; Simpson i inni, 1998; Silva i inni, 1999; Clemente, 2000; Jun i inni, 2004; Je i inni, 2005). Białka miofibrylarne ryb można również wykorzystać do formowania folii biodegradowalnych (Cuq i inni 1997a,b). Elementy kostne ryb zawierają ok. 30 % białka w suchej masie, tzn. kolagenu oraz ok % soli mineralnych (Gildberg i inni, 2002), stanowią zatem cenne źródło kolagenu i związków mineralnych. Kolagen dzięki unikalnym właściwościom fizycznym i chemicznym może być stosowany w przemyśle spożywczym, skórzanym, biotechnologicznym i fotograficznym. Coraz częściej stosuje się go w medycynie, gdzie służy do produkcji nici chirurgicznych, protez, gąbek oraz sztucznych tkanek stosowanych jako implanty. Może być także nośnikiem antyseptyków i enzymów. Zdenaturowany kolagen, czyli żelatyna stosowana jest w żywności oraz w przemyśle biomedycznym (Ogawa i inni, 2004). Popyt na żelatynę z surowców morskich (skór, kości i płetw) wzrasta od początku lat osiemdziesiątych, kiedy to pojawiły się pierwsze przypadki gąbczastej encefalopatii bydła (BSE). Stwierdzenie, że nowa, śmiertelna odmiana choroby Creutzfelda-Jakoba jest ludzkim odpowiednikiem choroby BSE oraz, że jej przyczyną może być spożywanie produktów żywnościowych pochodzących od zarażonego bydła (Fishbein, 1998; Lis, 1999), przyczyniło się do opracowania metod pozyskiwania żelatyny rybnej, jako alternatywy dla żelatyny bydlęcej. Otrzymywanie żelatyny z kolagenu obecnego w skórach i kościach ryb, może rozwiązać problem 6

7 zagospodarowania tych odpadów, i jednocześnie pozwoli pozyskać cenny produkt stosowany jako teksturotwórczy składnik żywności (Muyonga i inni, 2004a,b). Kolagen rybny może być dobrym substytutem kolagenu pozyskiwanego dotąd z tradycyjnych surowców. Nie niesie on ryzyka zachorowania na chorobę BSE, oraz nie budzi zastrzeżeń ze względów religijnych. Do tej pory wiele badań poświęcono otrzymywaniu kolagenu ze skór ryb. Opracowano metody ekstrakcji kolagenu z tego surowca (Gómez-Guillén i inni, 2002; Nagai i Suzuki, 2000; Sadowska i inni, 2003), a także metodę strącania kolagenu z roztworów -karagenem (Sadowska i Kołodziejska, 2005). Natywny nie zanieczyszczony kolagen można otrzymać z kręgosłupów dorsza bałtyckiego po uprzednim usunięciu z nich towarzyszących mu białek i soli mineralnych. Obecność tych składników pogarsza funkcjonalne właściwości otrzymanego preparatu kolagenowego. Kolagen ryb, szczególnie żyjących w zimnych wodach, różni się znacznie właściwościami fizykochemicznymi od kolagenu zwierząt stałocieplnych (Sadowska i Kotłowski, 1999). Dotyczy to szczególnie dużej rozpuszczalności kolagenu ryb w rozcieńczonych kwasach. Również fizykochemiczne właściwości kolagenu tego samego zwierzęcia są różne w różnej tkance łącznej. Różnice te dotyczą przede wszystkim stopnia usieciowania, zależnego od pełnionej przez kolagen funkcji w organizmie. Kolagen kości jest bardziej usieciowany niż kolagen skóry, ze względu na pełnioną funkcję podporową. Dlatego opracowana metoda ekstrakcji kolagenu ze skór dorsza bałtyckiego może okazać się nieprzydatna do ekstrakcji kolagenu z kręgosłupów. 2. Charakterystyka ubocznych produktów przemysłu rybnego O jakości i ilości odpadów decyduje zakres stosowanej obróbki poszczególnych gatunków ryb i kierunek przetwórstwa. Podczas filetowania ryb otrzymuje się w zależności od gatunku różne ilości odpadów, stanowiących od ok. 40 do ok. 60 % masy ryby (tab. 1). Odpady dzielimy na miękkie i twarde. Do odpadów miękkich zaliczamy na ogół całość odpadów po obróbce ryb pelagicznych takich jak: szproty, śledzie, sardynki, makrele itp. oraz wnętrzności pochodzące z wszystkich pozostałych gatunków ryb. Do odpadów twardych zalicza się głowy i kręgosłupy. Wymienione odpady mogą być wykorzystane do bezpośredniego skarmiania mięsożernych zwierząt futerkowych lub służyć jako surowiec do produkcji takich materiałów paszowych jak mączki rybne, hydrolizaty białkowe, kiszonki lub koncentraty roślinno-rybne (Bakuła i Apozański, 2001). 7

8 Tabela 1. Przybliżony udział różnych części ciała w ogólnej masie ryb [%] (Sikorski, 1971; Gildberg i inni, 2002) Gatunek Głowa Kręgosłup Skóra Wnętrzności Konger Pałasz nie oznaczono 13 Dorsz Morszczuk Ostrobok Piotrosz Produkty uboczne po filetowaniu ryb są bogatym źródłem białek (tab. 2), przy czym znaczny udział we frakcji białek ma kolagen. Ok. 85 % masy kręgosłupów dorsza bałtyckiego po mechanicznym filetowaniu stanowi tkanka mięśniowa (Gildberg i inni, 2002). Z jednej tony kręgosłupów dorsza bałtyckiego można odzyskać ok. 110 kg pełnowartościowych białek mięśniowych oraz ok. 50 kg kolagenu. Tabela 2. Skład podstawowy surowców odpadowych przemysłu rybnego Części ciała Zawartość [%]: białka kolagenu popiołu Głowy nie oznaczono nie oznaczono Kręgosłupy Płetwy nie oznaczono nie oznaczono Łuska Chrząstka 1 14 nie oznaczono nie oznaczono Skóry nie oznaczono 1 Konarzewski i inni, Sadowska i inni,

9 3. Skład chemiczny i budowa kręgosłupów ryb 3.1. Wartość biologiczna białek ryb Białka mięśniowe stanowią podstawowy składnik budulcowy mięśni. Ze względu na dużą zawartość niezbędnych aminokwasów, mają znaczną wartość biologiczną (tab. 3) oraz wywierają istotny wpływ na cechy sensoryczne żywności (Sikorski, 2004). Tabela 3. Aminokwasy niezbędne w białkach mięsa ryb i bezkręgowców morskich oraz ziaren pszenicy w porównaniu z wzorcem FAO/WHO z 1991 r. (Sikorski, 2004) Aminokwasy niezbędne [% w białku] Surowiec Phe + Tyr Ile Leu Lys Met + Cys Thr Trp Val Dorsz 7,0 5,5 8,1 8,5 4,0 4,5 0,9 5,6 Krab 9,5 4,7 9,0 8,9 4,7 5,2 1,6 5,0 Krewetka 8,5 3,8 8,6 9,4 3,9 4,1 1,0 4,4 Kryl 10,7 5,4 8,4 9,8 4,7 4,4 1,7 4,1 Pszenica 8,6 4,3 6,7 2,8 3,5 2,9 1,2 4,6 Wzorzec FAO/WHO 6,3 2,8 6,6 5,8 2,5 3,4 1,1 3,5 Ogólny skład aminokwasowy białek mięsa ryb i bezkręgowców morskich wielu gatunków jest bardzo podobny. Mięso ryb zawiera wszystkie niezbędne aminokwasy w ilościach przekraczających ustalone we wzorcu FAO/WHO, z wyjątkiem tryptofanu (tab. 3). Ryby są zatem bogatym źródłem cennego białka o bardzo dobrych właściwościach biologicznych i spożywane razem z produktami zbożowymi ubogimi w lizynę i treoninę wzbogacają ogólny skład aminokwasowy diety. Dzięki temu organizm człowieka może optymalnie wykorzystać również mniej wartościowe biologicznie białka nasion zbóż (Sikorski, 2004). Zawartość różnych białek w surowcach rybnych zmienia się w znaczny sposób podczas cyklu rocznego, przykładowo w miarę dojrzewania gonad lub głodówki ryb następuje wzrost udziału białek nierozpuszczalnych w 5 % roztworze NaCl, czyli białek tkanki łącznej, na skutek ubywania białek mięśni (Bykowski i inni, 1973). W zależności od gatunku, stanu fizjologicznego, a także miejsca, z którego próbka została pobrana zawartość białka surowego w świeżym mięsie ryb zmienia się w przedziale od 13 do 24 % (Sikorski, 1992). W większości gatunków zawartość białek w mięsie ryb jest podobna do zawartości w mięsie zwierząt rzeźnych. Do celów towaroznawczych ryby dzieli się na cztery grupy w zależności 9

10 od procentowej zawartości białka surowego, na zawierające: poniżej 10 %, od 10 do 15 %, od 15 do 20 % i ponad 20 % białka surowego, np. łosoś, pelamida i inne (Sikorski, 2004) Budowa kości Kości, zarówno zwierząt lądowych jak i ryb, są zmineralizowaną tkanką łączną, która tworzy złożoną hierarchiczną strukturę (rys. 1). Jednostką strukturalną elementów kostnych są zmineralizowane włókienka kolagenowe (poziom 2), które składają się z bardzo twardego materiału soli mineralnych oraz delikatnych włókienek tropokolagenu (poziom 1). Zmineralizowane włókienka tropokolagenu ulegają polimeryzacji i łączą się wzdłużnie (poziom 3). Natomiast wskutek agregacji włókienek tworzą się cylindryczne włókna (poziom 4). Na wyższych poziomach organizacji, początkowa struktura pierwszorzędowa kości podlega wewnętrznemu przebudowaniu, w wyniku którego formuje się drugorzędowa struktura kości zawierająca centralny kanał dla naczyń krwionośnych i nerwów, który jest nazwany systemem Haversa (poziom 5). Poziomy 6 i 7 dotyczą odpowiednio pojedynczych kręgów i całego szkieletu kostnego (Wang, 2004). Włókna kolagenowe zawarte w tkance kostnej są odpowiedzialne za wytrzymałość na rozciąganie kości, przez co zmniejszają kruchość i łamliwość substancji mineralnych. Kości oprócz kolagenu w suchej masie zawierają % soli mineralnych. Głównym składnikiem mineralnym kości jest fosforan wapnia (ok. 85 %), resztę stanowią: węglan wapnia (10 %), fosforan magnezu (1,5 %), fluorek wapnia (0,3 %), chlorek wapnia (0,2 %) i sole sodu (2 %) (Gildberg i inni, 2002) Charakterystyka kolagenu kości W kościach występuje prawie wyłącznie kolagen typu I. Stanowi on % całej zawartości substancji organicznych kości. Pozostałe składniki to m.in. osteokalcyna, osteonektyna, proteoglikany oraz małe ilości kolagenu typu II, III, V, VI, IX, X, XII, XIV i XXV. Istotną cechą kolagenu jest wieloetapowa synteza, obejmująca procesy niezależne bezpośrednio od zapisu genetycznego. Daje to możliwość wytworzenia wręcz nieskończonej liczby odmiennych białek również u tego samego osobnika, mimo że są one produktem tych samych genów. Ta heterogenność, której regulacyjne zasady są nieznane, jest zapewne przyczyną zróżnicowania kolagenu poszczególnych tkanek albo nawet fragmentów tej samej tkanki lub narządu (Kucharz, 1999; Tzaphlidou, 2005). 10

11 a) b) c) d) e) f) g) h) Rysunek 1. Siedem poziomów hierarchii w szkielecie kostnym ryby: a) poziom 7 szkielet kostny; b) poziom 6 kręg; c) poziom 5 widok kręgu; d) poziom 5 struktura warstwowa kręgu; e) poziom 4 włókna kolagenowe; f) poziom 3 włókienka kolagenowe; g) poziom 2 zmineralizowane włókienka kolagenowe; h) poziom 1 podstawowe składniki: kryształy soli mineralnych (lewa strona) i część włókienka tropokolagenu (prawa strona) (wg Wang, 2004) Kolagen typu I występujący w kościach jest kodowany przez te same geny, co kolagen typu I skóry czy innych narządów, ale różni się istotnie, co jest wynikiem modyfikacji posttranslacyjnych. Najlepiej poznaną cechą kolagenu kości jest jego nierozpuszczalność. 11

12 Tylko ok. 0,5 % całej zawartości kolagenu kości można wyekstrahować za pomocą roztworu chlorku sodowego. W tych samych warunkach, za pomocą roztworu kwasu octowego rozpuszczono zaledwie 1 %. Analogiczne ilości kolagenu dla skóry są znacznie większe. Jest to wynikiem wytwarzania licznych wiązań poprzecznych, które mogą mieć budowę odmienną niż te w kolagenie innych narządów. Kolagen kości charakteryzuje się również inną glikolizacją reszt hydroksylowych aminokwasów (Kucharz, 1999). 4. Wydzielanie niekolagenowych składników z surowców łącznotkankowych 4.1. Ekstrakcja białek mięśniowych Białka niekolagenowe, stanowiące ok. 20 % ogólnej zawartości białek w skórach bydlęcych i cielęcych, można podzielić na cztery frakcje ze względu na ich rozpuszczalność: białka rozpuszczalne w buforze fosforanowym o ph 9 lub w roztworze NaCl, ich zawartość mieści się w granicach od 20 do 30 % ogólnej ilości białek niekolagenowych, białka rozpuszczalne w rozcieńczonych roztworach NaOH o ph 12,0-12,5 w temp. 20 o C, stanowią również % całkowitej zawartości białek niekolagenowych, frakcja zawierająca od 10 do 30 % białek niekolagenowych, to białka które ulegają ekstrakcji rozcieńczonym 0,05 M kwasem octowym, białka ekstrahowane bardziej stężonymi roztworami wodorotlenków w podwyższonej temp., to frakcja najtrudniej rozpuszczalnych białek, w której większość białek niekolagenowych przechodzi do roztworu razem z kolagenem (Pietrzykowski, 1973). Lepszym rozpuszczalnikiem białek mięśniowych jest 0,01 M roztwór NaOH od 0,45 M roztworu NaCl. Podczas ekstrakcji rozdrobnionych, jak i całych skór dorsza bałtyckiego rozpuszcza on wszystkie białka niekolagenowe (Sadowska i inni, 2003). Również w przypadku wołowych kręgów i żeber roztwór NaOH okazał się skuteczniejszym rozpuszczalnikiem białek mięśniowych niż roztwór NaCl. Po 24 h traktowania kręgów oraz żeber wołowych 4 % roztworem NaCl o temp. 4 ºC można z nich wyekstrahować odpowiednio 17 i 14 % białek mięśniowych, natomiast stosując jako rozpuszczalnik 0,05 M NaOH ok. 26 % (Boles i inni, 2000). Ze skór kalmara można wyekstrahować 5, 10 i 15 % roztworem NaCl odpowiednio 35, 27 i 24 % całkowitej ilości białka surowego, przy kilku procentowej stracie kolagenu (Kołodziejska i inni, 1999). Do ekstrakcji białek niekolagenowych stosuje się roztwory wodorotlenku sodu o różnym stężeniu. Białka mięśniowe skór, kręgosłupów oraz płetw tuńczyka wydziela się 12

13 używając 0,1 M roztworu NaOH (Nagai i Suzuki, 2000), zaś z tkanki chrzęstnej rekina 1-2 M roztworem NaOH (Cho i inni, 2004), natomiast do rozpuszczenia białek niekolagenowych mięsa foki stosuje się 4 M roztwór NaOH (Shahidi i Synowiecki, 1996). Trudno ustosunkować się do skuteczności ekstrakcji białek mięśniowych roztworami o różnym stężeniu NaOH z wymienionych surowców, ponieważ cytowani autorzy nie podają wydajności ekstrakcji tych białek. Parametry ekstrakcji białek mięśniowych: rodzaj użytej soli, siła jonowa roztworu i jego ph, stosunek rozpuszczalnika do surowca, stopień rozdrobnienia materiału, temp., czas i krotność ekstrakcji są inne dla różnych tkanek rozmaitych zwierząt. Różnice te wynikają z innej zawartości białek niekolagenowych i ich rozpuszczalności (Sadowska, 1992). Roztwór NaOH jest lepszym rozpuszczalnikiem białek mięśniowych żabnicy i morszczuka niż roztwór Ca(OH) 2 (Batista, 1999). Białka mięśniowe morszczuka najsłabiej rozpuszczają się przy ph 5 6, zaś żabnicy przy ph 5. Rozpuszczalność w tym ph wynosi odpowiednio 17 i 9 %, co związane jest z punktem izoelektrycznym tych białek. Powyżej i poniżej ph punktu izoelektrycznego rozpuszczalność białek wzrasta, przy czym jest znacznie większa w alkalicznym zakresie ph. Czas ekstrakcji nieznacznie wpływa na wydajność izolacji białek. Przedłużenie czasu z 60 do 120 minut zwiększa ilość wyekstrahowanych białek z odpadów morszczuka zaledwie o 3 %, a żabnicy o 8 % (Batista, 1999). Wydajność ekstrakcji białek zwiększa się wraz ze wzrostem ilości rozpuszczalnika w układzie (Sadowska i inni, 2003). Najczęściej ekstrakcję prowadzi się przy dziesięciokrotnie większym udziale rozpuszczalnika w stosunku do surowca uzyskując zadawalające wydajności. Przy wyższych stosunkach, uzyskuje się bardzo rozcieńczone ekstrakty, natomiast przy niskich stosunkach występują problemy z lepkością i żelowaniem roztworów, przez co oddzielenie ekstraktów jest trudne (Batista, 1999). Rozpuszczalność białek w roztworach NaOH, jak i Ca(OH) 2 zwiększa się zaledwie o 10 % wraz ze wzrostem temp. z 22 do 55 o C (Batista, 1999). Wzrost temp. z 20 do 80 o C powoduje zwiększenie efektywności izolacji białek roztworem NaOH z mięsa foki po mechanicznym odmięśnianiu jedynie o 7 % (Shahidi i Synowiecki, 1996). Wydajność ekstrakcji białek mięśniowych w tych samych warunkach zależy również od gatunku zwierzęcia. Białka mięśniowe żabnicy w ph 12 rozpuszczają się z wydajnością ok. 50 % podczas gdy białka morszczuka z ok. 85 % (Batista, 1999). 13

14 4.2. Wydzielanie białek niekolagenowych na drodze hydrolizy enzymatycznej Do wydzielenia białek z kręgosłupów ryb i z kruszu kostnego powstałego po mechanicznym odmięśnianiu kości stosuje się enzymy pochodzenia bakteryjnego o handlowych nazwach Alkalaza 2,4 L, Neutraza, Protamex, zwierzęcego trypsyna i roślinnego papaina. Najczęściej stosowana jest trypsyna i alkalaza (Simpson i inni, 1998, Gildberg i inni, 2002). Papaina enzym pochodzenia roślinnego hydrolizuje białka mięśniowe pozostałe na kościach indyka po mechanicznym odmięśnieniu z taką samą wydajnością jak enzymy proteolityczne pochodzenia bakteryjnego (Fonkwe i Singh, 1996). Wydajność hydrolizy enzymatycznej zależy między innymi od stosowanego enzymu, rodzaju i stężenia substratu, czasu inkubacji, ph oraz temp. Enzymy takie jak: alkalaza, neutraza i protamex hydrolizują białka mięśniowe kręgosłupów dorsza bałtyckiego z dużo wyższą wydajnością (ok. 44 %), niż trypsyna (ok. 27 %), (rys. 2). Taki wynik można tłumaczyć tym, że frakcja sarkoplazmatyczna z mięśni dorsza zawiera białka, które są inhibitorami dla trypsyny wieprzowej, trypsyny z dorsza i chymotrypsyny (Gildberg i inni, 2002). Może to również wynikać z różnic specyficzności działania enzymów na wiązania peptydowe, zależne od rodzaju reszt aminokwasowych, pomiędzy którymi są one utworzone. Z kruszu kostnego indyka po mechanicznym odmięśnieniu kości, stosując papainę można zhydrolizować ok. 46 % białek mięśniowych (Fonkwe i Singh, 1996). Wydajność hydrolizy enzymatycznej zależy od rodzaju zastosowanego surowca. Białka sarkoplazmatyczne i miofibrylarne tilapii mozambijskiej po trawieniu alkalazą rozpuszczają się z wydajnością ok. 15 % (Abdul Hamid i inni, 2002), natomiast z żołądków tuńczyka z 24 % (Guẻrard i inni, 2001). Wydajność hydrolizy odpadów z krewetki (głowy i mięśnie) alkalazą wynosiła nieco powyżej 50 % (Gildberg i Stenberg, 2001). Efektywność enzymatycznego trawienia zależy również od stężenia enzymu. Hydrolizując wnętrzności owcy protezą P Amino 6 w stężeniu w stosunku do surowca 0,5 % rozpuszczono 45 % białek. Po zwiększeniu stężenia enzymu w układzie do 1 % wydajność wzrosła do 64 %. Dalsze zwiększanie stężenia enzymu nie powoduje wzrostu wydajności hydrolizy. Stosując łagodne warunki hydrolizy enzymatycznej nie można całkowicie usunąć białek mięśniowych pozostałych na elementach kostnych zwierząt. 14

15 stopieo ekstrakcji [%] Alkalaza Neutraza Protamex Trypsyna wieprzowa Trypsyna dorsza Rysunek 2. Wpływ różnych enzymów proteolitycznych na stopień hydrolizy białek mięśniowych kręgosłupów dorsza bałtyckiego (wg Gildberg i inni, 2002) Hydrolizaty rybne otrzymuje się także trawiąc białka enzymami zawartymi w tkankach i przewodzie pokarmowym. Aby wytworzyć optymalne warunki dla takiej hydrolizy zakwasza się środowisko i ogrzewa rozdrobnioną masę rybną do temp. bliskiej wartości optymalnej dla działania proteaz. Niskie ph zabezpiecza również surowiec i powstający produkt przed rozwojem szkodliwych drobnoustrojów. Jako środki zakwaszające i utrwalające stosuje się kwasy mineralne lub organiczne, względnie miesza się rozdrobnione ryby z surowcami węglowodanowymi, np. z melasem, z których w skutek fermentacji powstaje kwas mlekowy. Stosując czystą kulturę Lactobacillus plantarum można doprowadzić do obniżenia ph masy zawierającej dodatek melasu do 4,2 w czasie ok. 24 h. Hydrolizaty dystrybuuje się w postaci ciekłej, lub po zmieszaniu z innymi suchymi materiałami, jako paszę o zawartości % wody. Niektóre hydrolizaty zawierają więcej składników odżywczych i wzrostowych, niż mączka rybna suszona w wysokiej temp. (Sikorski, 1980). Zastąpienie ekstrakcji chemicznej procesem enzymatycznym zapobiega tworzeniu się produktów o niekorzystnym działaniu fizjologicznym, jak np. D-aminokwasy i lizynoalanina (Clemente, 2000). 15

16 5. Fizykochemiczna charakterystyka kolagenu 5.1. Budowa kolagenu Kolagen jest głównym składnikiem tkanki łącznej kręgowców i bezkręgowców. Występuje w skórze, ścięgnach, chrząstkach, kościach, błonach łącznotkankowych, naczyniach krwionośnych. U wszystkich kręgowców jego udział wynosi ok. 30 % ogólnej ilości białka (Sadowska, 1992). Strukturę pierwszorzędową kolagenu tworzy od 19 do 21 aminokwasów, wśród których glicyna stanowi 1/3 ich ogólnej ilości. Charakterystyczna dla kolagenu jest obecność w nim hydroksyproliny i hydroksylizyny. Aminokwasy te bardzo rzadko i w nieznacznych ilościach występują w innych białkach. Kolagen zawiera ponadto bardzo małą ilość metioniny, fenyloalaniny i tyrozyny oraz pozbawiony jest cysteiny (wyjątek stanowi kolagen typu III) i tryptofanu (Garrone, 2001). Zawartość hydroksyproliny w kolagenie zależy od jego pochodzenia, gatunku i temp. przyżyciowej zwierzęcia. Kolagen skór zimnowodnego dorsza zawiera od 4,1 % (Sikorski i inni, 1984) do 8 % (Yamaguchi i inni, 1976), a kolagen ciepłowodnej złotej rybki 12,1 % hydroksyproliny (Sikorski, 1994). Kolagen błon łącznotkankowych różnych mięśni bydlęcych zawiera od 6,6 % do 11,1 % hydroksyproliny (Sadowska, 1992). Zawartość kolagenu najczęściej oznacza się na podstawie zawartości w nim hydroksyproliny stosując odpowiedni przelicznik. Dlatego dokładna znajomość zawartości tego aminokwasu jest niezbędna. Podstawową jednostką strukturalną kolagenu jest tropokolagen zbudowany z trzech lewoskrętnych łańcuchów polipeptydowych, skręconych wokół siebie w prawoskrętny superheliks. Tropokolagen posiada na obydwu końcach krótkie fragmenty niehliksowe, złożone z ok. 15 aminokwasów, zwane telopeptydami. W utrzymaniu konformacji cząsteczki uczestniczą oddziaływania hydrofobowe i elektrostatyczne oraz wiązania wodorowe między łańcuchami tworzącymi superheliks. Duży udział w stabilizowaniu struktury kolagenu ma także oddziaływanie z wodą, gdyż cząsteczki wody pośredniczą w tworzeniu międzyłańcuchowych wiązań wodorowych (Sikorski, 1994; Kucharz, 1999). Poszczególne cząsteczki tropokolagenu łączą się ze sobą w polimery na zasadzie głowa do ogona i bok do boku, tworząc fibryle i włókna o różnej długości i średnicy. Sąsiednie, równoległe cząsteczki są przesunięte względem siebie o 1/4 długości. W wyniku tego włókienko kolagenu wykazuje poprzeczne prążkowanie o okresie identyczności ok. 70 nm. 16

17 5.2. Wiązania sieciujące kolagen Produkt translacji (protokolagen) podlega licznym posttranslacyjnym modyfikacjom, zarówno wewnątrz komórkowym, jak i pozakomórkowym. Polegają one przede wszystkim na hydroksylacji niektórych reszt proliny i lizyny z wytworzeniem reszt hydroksyprolinowych i hydroksylizylowych, glikozylacji niektórych reszt hydroksylizylowych (poprzez wiązanie galaktozy i glukozy oraz w mniejszych ilościach mannozy, fruktozy, arabinozy, ksylozy i rybozy), ograniczonej proteolizie prokolagenu z uwolnieniem tropokolagenu i propeptydów oraz na wytwarzaniu wewnątrzcząsteczkowych i międzycząsteczkowych, kowalencyjnych wiązań poprzecznych. W miarę starzenia się kolagenu powstają kowalencyjne wiązania sieciujące, przede wszystkim w odcinkach nieheliksowych. Z powodu braku cysteiny nie ma w kolagenie mostków dwusiarczkowych (wyjątek stanowi kolagen typu III) stabilizujących strukturę większości innych białek. Posiada on natomiast wiązania aldolowe (powstałe na drodze kondensacji aldolowej), wiązania aldiminowe (typu zasady Schiffa), oraz - glutamylowe wiązania peptydowe powstające pomiędzy grupami karboksylowymi łańcuchów bocznych kwasu glutaminowego i asparaginowego oraz hydroksylowymi seryny, tyrozyny i hydroksyproliny. Reakcją poprzedzającą tworzenie wiązań stabilizujących strukturę kolagenu jest oksydatywna deaminacja reszt lizyny i hydroksylizyny, znajdujących się na końcach N i C terminalnych peptydów (rys. 3). NH 2 CH 2 O 2,Cu 2+ (CH 2 ) 3 oksydaza lizylowa NH CH CO reszta lizyny Rysunek 3. Oksydatywna deaminacja reszty lizyny CHO (CH 2 ) 3 NH CH CO reszta allizyny Wiązania aldolowe powstają podczas kondensacji aldolowej dwóch sąsiadujących grup aldehydowych. Produktem reakcji są, - nienasycone aldehydy (rys. 4), które reagują z resztą histydyny lub hydroksylizyny tworząc nowe wiązania sieciujące (rys. 5). 17

18 NH CH CO (CH 2 ) 3 NH CH CO (CH 2 ) 3 NH CH CO (CH 2 ) 3 CHO + CHO CHO CH CHO -H 2 O CH C CHO (CH 2 ) 3 (CH 2 ) 2 (CH 2 ) 2 NH CH CO reszty allizyny NH CH CO NH CH CO reszta aldolowa Rysunek 4. Kondensacja aldolowa reszt allizyny NH CH CO (CH 2 ) 3 NH CH N N NH CH (CH 2 ) 2 CHOH CH 2 N HC CH CH 2 CH CO (CH 2 ) 2 CO NH CH CO Rysunek 5. Reszta dehydro histydylo hydroksymerodesmozyny Reszty allizyny mogą tworzyć wiązania sieciujące, wewnątrz- lub międzycząsteczkowe nie tylko w reakcji aldolowej, lecz również w reakcji z niezmienionymi resztami lizyny lub hydroksylizyny: CH(CH 2 ) 3 CHO + CH(CH 2 ) 3 CH=NCH 2 CHOH(CH 2 ) 2 CH H 2 NCH 2 CHOH(CH 2 ) 2 CH reszta dehydrohydroksylinonorleucyny CH(CH 2 ) 2 CHOHCHO + H 2 NCH 2 CHOH(CH 2 ) 2 CH CH(CH 2 ) 2 CHOHCH=NCH 2 CHOH(CH 2 ) 2 CH CH(CH 2 ) 2 COCH 2 NHCH 2 CHOH(CH 2 ) 2 CH reszta hydroksylizyno-5-oksonorleucyny 18

19 Najważniejszą rolę w stabilizowaniu struktury włókien kolagenowych odgrywają wiązania typu aldiminowego z udziałem hydroksylizyny i hydroksyallizyny, które w miarę starzenia się kolagenu ulegają przegrupowaniu w bardziej stabilne wiązania ketoiminowe: NH CH (CH 2 ) 2 CO CH 2 NH CH 2 CHOH (CH 2 ) 2 CO NH CH CO Również cukry tworzą między- i wewnątrzcząsteczkowe wiązania sieciujące wiążąc się z kolagenem wiązaniem estrowym lub, O - glikozydowym. Zarówno liczba jak i rodzaj wiązań sieciujących zależą od źródła kolagenu oraz od wieku zwierzęcia. Kolagen ze ścięgna Achillesa zawiera więcej wiązań sieciujących niż kolagen ze skóry, a kolagen starego osobnika zawiera ich więcej niż kolagen osobnika młodego. W kolagenie starszych zwierząt jest więcej trwale związanych sacharydów niż w kolagenie młodszych osobników. Stopień usieciowania kolagenu wpływa na jego funkcjonalne właściwości, takie jak: pęcznienie, rozpuszczalność w zimnych rozpuszczalnikach i gorących roztworach, temp. skurczu, wytrzymałość mechaniczną (Sadowska, 1992) Genetyczne typy kolagenu Dotychczas zidentyfikowano i scharakteryzowano 27 typów genetycznych kolagenu. Dla wszystkich jednak istnieje wspólny model w postaci sztywnego potrójnego heliksu. Różnią się one składem podjednostkowym. Makrocząsteczka kolagenu może składać się z trzech takich samych łańcuchów ( 1 ) 3, trzech różnych ( 1, 2, 3 ) lub różnych kombinacji poszczególnych łańcuchów np. [ 1 ( 2 ) 2 ]. Poszczególne typy genetyczne różnią się masą cząsteczkową, długością cząsteczki, składem i sekwencją aminokwasową, stopniem hydroksylacji reszt proliny i lizyny, stopniem glikozylacji reszt hydroksylizyny, strukturą przestrzenną, lokalizacją tkankową oraz specyfiką biosyntezy i przemian posttranslacyjnych (Bańkowski, 1982; Bańkowski i Pałka, 1989; Sadowska i Kotłowski, 1999; Li i inni, 2005). Wśród białek kolagenowych wyróżniamy kolageny tworzące włókna (typ I, II, III, V, XI), kolageny tworzące układy sieciowe (typ IV, VIII, X) oraz kolageny z przerywaną strukturą superhelisy (typ IX, XII, XIV, XVI, XIX, XX, XXI, XXII), kolagen tworzący włókna koralikowe (typ VI) kolagen tworzący włókna kotwiczące (typ VII), oraz 19

20 niesklasyfikowane kolageny typu XIII, XV, XVII i XVIII (Bailey i Light, 1989; Kucharz, 1999; Li i inni, 2005). Typ I kolagenu tworzy grube i mocne włókna charakteryzujące się dużą stabilnością cieplną, rozciągliwością i mechaniczną wytrzymałością. Występuje głównie w skórze, ścianach tętnic i ścięgnach. Składa się on z dwóch podjednostek 1 (I) i jednej podjednostki 2 (I) tworząc makrocząsteczkę [ 1 (I)] 2 2 (I), a także w niewielkich ilościach występuje w postaci homotrimeru [ 1 (I)] 3 (Kucharz, 1999). Kolagen typu III o cienkich włóknach może być obecny w namięsnej niektórych mięśni, skórach, ścięgnach i tętnicach tylko w połączeniu z kolagenem typu I. Zbudowany jest z trzech podjednostek 1 (III) połączonych mostkami disulfidowymi reszt cysteiny, co znacznie zmniejsza jego rozpuszczalność (Glanville i Fietzek, 1976). Kolagen typu IV nie tworzy struktury włóknistej, typ V tworzy delikatne włókna i jest charakterystyczny dla tkanki śródmięśniowej. Kolagen typu V stanowi 20 % całkowitej zawartości kolagenu w zrębie rogówki i jest wkomponowany we włókna kolagenu typu I (Bańkowski, 1982; Sadowska, 1992). Typ II występuje nieomal wyłącznie w tkance chrzęstnej. W kolagenie typu VII, VIII i IX występują obszary o nieuporządkowanej strukturze podatnej na działanie nieswoistych enzymów proteolitycznych. Skóra i mięśnie ryb zawierają kolagen typu I i V (Sato i inni, 1991; Mizuta i inni, 2002). Zawartość hydroksyproliny w kolagenie jest inna w różnych typach genetycznych i na przykład w bydlęcym kolagenie typu I, III i IV wynosi odpowiednio: 13,1; 17,4 i 16,6 %. Również inna jest ilość zawartych w kolagenie sacharydów. W kolagenach typu I i III ok % hydroksylizyny jest związane z mono i disacharydami, w kolagenie typu II %, zaś w kolagenie typu IV ok. 80 % (Sadowska i Kotłowski, 1999) Rozpuszczalność kolagenu Rozpuszczalność kolagenu w solach obojętnych i rozcieńczonych kwasach Dojrzały usieciowany kolagen tworzący włókna jest nierozpuszczalny w zimnych rozcieńczonych kwasach i roztworach buforowych. Można go rozpuścić dopiero po rozdrobnieniu i intensywnej obróbce chemicznej lub enzymatycznej. Młody tropokolagen rozpuszcza się w obojętnym roztworze chlorku sodu lub słabo zasadowym buforze fosforanowym. Traktując skóry kalmarów 10 % roztworem NaCl po 24 h w temp. pokojowej rozpuszcza się 32 % zawartego w nich kolagenu (Kołodziejska, 1999). W 4,7 % roztworze NaCl rozpuszcza się 3,4 i 2,4 % kolagenu ze skór okonia nilowego, odpowiednio młodego 20

21 i dorosłego osobnika (Muyonga i inni, 2004). Rozpuszczalność kolagenu ryb nie zależy tak istotnie od wieku zwierzęcia, bowiem większość tkanki jest corocznie odnawiana, a tym samym stopień usieciowana nie wzrasta w tak dużym stopniu jak w przypadku zwierząt lądowych (Kittiphattanabawon i inni, 2005). Rozpuszczalność kolagenu zależy również od jego pochodzenia. Kolagen zwierząt ciepłokrwistych jest mniej rozpuszczalny od kolagenu zwierząt morskich. Buforem cytrynianowym o ph 3,5, roztworem kwasu cytrynowego lub 0,5 M roztworem kwasu octowego można wyekstrahować ze skóry starego bydła tylko 0,7 % kolagenu (Reich, 1970), a ze skóry świni 1,7 %. Taktując jagnięce i owcze skóry 3 % kwasem octowym można wydzielić odpowiednio: 18,8 i 3,0 % kolagenu (Yates, 1968). Kolagen mięśniowy ze zwierząt morskich rozpuszcza się w rozcieńczonych kwasach organicznych oraz kwaśnych buforach (Yamaguchi i inni, 1976; Kołodziejska i inni, 1999), jego rozpuszczalność jest znacznie większa niż kolagenu z mięśni zwierząt stałocieplnych. Np. rozpuszczalność kolagenu pochodzącego z mięśni bydlęcych w buforze cytrynianowym o ph 3,5 wynosi tylko 2,6 % (Sadowska i Kotłowski, 1999), natomiast z mięśni dorsza aż 76,3 % kolagenu ogółem (Yamaguchi i inni, 1976). Stosując kąpiel w 0,5 M kwasie octowym, można całkowicie wyekstrahować kolagen ze skóry makreli i rekina (Nagai i Suzuki, 2000). Na podstawie wyników opublikowanych prac trudno jest określić różnice w rozpuszczalności kolagenu w zależności od gatunku ryb, ponieważ poszczególni autorzy stosują różne warunki ekstrakcji. Istotne znaczenie ma również rodzaj tkanki z jakiej pochodzi kolagen. Kolagen skór ryb łatwiej rozpuszcza się niż kolagen z kości. Ze skór różownika karaibskiego można wyekstrahować 43 % kolagenu, podczas gdy z kości zaledwie 19 % (Kittiphattanabawon i inni, 2005). Natomiast z kręgosłupów ryb 0,5 M kwasem octowym ekstrahuje się ok. 10 % mniej kolagenu niż ze skór, a z łusek zaledwie 5 % (Nagai i Suzuki, 2000). Różnice w rozpuszczalności kolagenu ze skór i kości wskazują na odmienną konformację obu kolagenów. Kolagen kości wyróżnia się większym stopniem usieciowania, co jest prawdopodobnie spowodowane podporową funkcją szkieletu (Kittiphattanabawon i inni, 2005) Efektywność rozpuszczania kolagenu podobnie jak białek mięśniowych zależy od stopnia rozdrobnienia surowca, rodzaju kwasu, ph środowiska, stosunku rozpuszczalnika do materiału, krotności i czasu ekstrakcji. Najwięcej kolagenu, ok. 90 %, rozpuszcza się w 0,5 M kwasie octowym z rozdrobnionych skór dorsza bałtyckiego przy stosunku surowca do rozpuszczalnika 1 : 40 (w : v), natomiast przy stosunku 1 : 6 do roztworu przechodzi ok. 60 % kolagenu. W tych samych warunkach z całych skór ekstrahuje się odpowiednio 40 i 20 % 21

22 zawartego w skórach kolagenu (Sadowska i inni, 2003). Przy tym samym stosunku surowca do rozpuszczalnika kwasem solnym i mlekowym z całych skór można wydzielić odpowiednio 18 % i 85 % kolagenu po 24 h (Skierka i Sadowska, 2007). Prowadząc trzykrotną 24 h ekstrakcję całych skór 0,5 M kwasem cytrynowym w stosunku kwasu do skór 4 : 1 (v : w) można z nich wydzielić ok. 85 % tego białka (Sadowska i inni, 2003). W alkalicznym środowisku kolagen rozpuszcza się w niewielkim stopniu. Traktując bydlęcą tkankę mięśniową 0,1 M roztworem NaOH wyekstrahowano ok. 10 % zawartego w niej kolagenu (Sadowska i inni, 1983/84), podczas gdy alkaliczny ekstrakt tkanki mięśniowej karpia i pstrąga nie zawierał kolagenu (Sato i inni, 1991). Ekstrakcja roztworem NaOH stosowana jest w celu usunięcia niekolagenowych białek. Cieplna rozpuszczalność kolagenu Ogrzewanie mięśni bydlęcych przez 3 h w wodzie o temp. 90 C powoduje rozpuszczenie ok % kolagenu. Ogrzewanie przez 20 min w 75 C rozdrobnionej bydlęcej namięsnej prowadzi do wydzielenia ok. 32 % kolagenu zawartego w materiale, podczas gdy w tych samych warunkach rozpuszcza się dwukrotnie więcej kolagenu ze skór świń (Sadowska i Kotłowski, 1999). Kolagen ostrygi nie rozpuszcza się w czasie 2 h ogrzewania w temp. 90 C (Sadowska, 1992). To samo białko z solonych skór śledzia rozpuszcza się całkowicie w wodzie o temp. 45 C po 1 h ogrzewania, podczas gdy ze skór marynowanych już po 15 min Natomiast kolagen z surowych skór łososia można wyekstrahować po 30 min ogrzewaniu w wodzie o temp. 100 C. Kolagen z głów dorsza bałtyckiego jest znacznie trudniej rozpuszczalny niż kolagen ze skór. Dopiero po 2 h ogrzewania surowca w temp. 100 C wydzielono 73 % kolagenu (Kołodziejska i inni, 2008). Rozpuszczalność cieplną kolagenu można zwiększyć przez zastosowanie wstępnej obróbki chemicznej lub enzymatycznej. Traktowanie skór bydlęcych 10 % roztworem NaOH nasyconym Na 2 SO 4 w czasie dłuższym niż 24 h czyni kolagen rozpuszczalnym w temp. 60 C. Rozpuszczalność kolagenu podczas ogrzewania zależy od środowiska. Chlorek sodu obniża temp., przy której kolagen zaczyna się rozpuszczać. Rozpuszczalność kolagenu skór dorsza bałtyckiego w wodzie znacznie wzrasta po przekroczeniu temp. 30 C, a w temp. 40 C rozpuszcza się ok. 80 % kolagenu. Ilość kolagenu rozpuszczalnego zwiększa się, gdy surowiec traktuje się 0,45 M NaCl. Już w temp. 30 C uwalnia się ok. 70 % kolagenu zawartego w surowcu, a 90 % w temp. 40 C. Chlorek sodu obniża prawdopodobnie temp. cieplnej denaturacji kolagenu (Sadowska i inni, 2003). 22

23 Stabilność cieplna kolagenu Temp. denaturacji kolagenu kręgowców mieści się w zakresie od 5 do 50 ºC (Privalov, 1982) Denaturacja cieplna kolagenu przejawia się między innymi obniżeniem lepkości roztworu. Zjawisko to wykorzystywane jest do wyznaczania temp. denaturacji (T D ) rozpuszczalnego kolagenu, przy której lepkość istotna roztworu osiąga połowę wartości początkowej. Denaturacja prowadzi do zniszczenia uporządkowanej struktury potrójnego heliksu przez usunięcie wiązań wodorowych i hydrofobowych stabilizujących strukturę białka. Produktem pierwszego etapu denaturacji kolagenu są łańcuchy polipeptydowe, które mogą występować w postaci: monomerów (składniki ), dimerów (składniki ) i trimerów (składniki ). Składniki ( ) powstają w przypadku gdy wszystkie łańcuchy kolagenu połączone są ze sobą kowalencyjnymi wiązaniami sieciującymi, gdy wiązanie występuje tylko miedzy dwoma łańcuchami polipeptydowymi po ogrzaniu nastąpi rozpad na monomer ( ) i dimer ( ). Brak wiązań kowalencyjnych w cząsteczce kolagenu powoduje jej rozpad do łańcuchów ( ). W drugim etapie następuje denaturacja form helikalnych i białko przybiera strukturę globularną (Sadowska, 1992). Podczas denaturacji włókien kolagenu następuje ich znaczny skurcz nawet o 75 % w stosunku do pierwotnej długości. Temp. kurczenia się kolagenu jest ok. 20 C wyższa od temp. denaturacji (Sikorski, 2002). Na temp. denaturacji T D i skurczu kolagenu T S wpływają takie czynniki jak: ph, obecność elektrolitów i ich rodzaj, szybkość ogrzewania, naturalna temp. życia organizmu, zawartość wody w kolagenie, stopień jego usieciowania oraz zawartość iminokwasów (prolina, hydroksyprolina) (Sadowska, 1992). Wykazano, że temp. skurczu i temp. denaturacji wzrasta wraz ze zwiększeniem stopnia usieciowania białka oraz z zawartością proliny i hydroksyproliny (tab. 4). Hydroksyprolina odgrywa ważną rolę w stabilizacji helisy ponieważ przyczynia się do tworzenia wiązań wodorowych. Zawartość iminokwasów koreluje ze środowiskiem życia (tab. 4). Kolagen ryb żyjących w zimnych wodach ma mniejszą zawartość iminokwasów, a tym samym posiada niższą temp. denaturacji (Kittiphattanabawon i inni, 2005). Cząsteczki kolagenu w roztworze denaturują blisko górnej granicy temp. przeżycia zwierzęcia, z którego kolagen jest ekstrahowany. Kolagen rybi posiada mniejszą stabilność termiczną (o ok. 20 C) niż kolagen ssaków, ponieważ zawiera mniej iminokwasów (Sikorski, 2000; Giraud-Guille i inni, 2000). Temp. skurczu cieplnego zależy również od stopnia uwodnienia kolagenu. Suchy kolagen jest oporny na ogrzewanie w temp. nawet do ok. 260 C (Sadowska, 1992). Obniżenie lub wzrost kwasowości środowiska powoduje obniżenie wartości T S. Glikozaminoglikany towarzyszące kolagenowi 23

24 zabezpieczają białko przed zmianami w cząsteczce, jakie mogą powstać w wyniku podwyższenia temp. (Reich, 1970). Tabela 4. Zależność pomiędzy temp. denaturacji T D i skurczu T S a zawartością iminokwasów w kolagenie Pochodzenie kolagenu klimat iminokwasy* T D [ O C] T S [ O C] Skóra świńska 220 a 37 a Skóra cielęca 215 a 36 b 65 c Skóra dorsza (Gadus morhua) zimny 130 b 15 a 40 c Skóra mintaja (Theragra chalcogramma) zimny 17 a Skóra karpia (Ctenopharyngodon idella) Skóra rozdymki (Takifugu rubripes) umiarkowany 186 a 28 a umiarkowany 170 e 28 e Skóra Lucjana (Lutjanus vitta) tropikalny 212 d 31 d Skóra okonia nilowego (Lates niloticus) tropikalny 200 f 36 f *Ilość reszt hydroksyproliny i proliny / 1000 reszt aminokwasów a Zhang i inni, 2007 b Ogawa i inni, 2004 c Reich, 1970 d Jongjareonrak i inni, 2005 c Nagai i inni, 2002 f Muyonga i inni, 2004 a b Wpływ ph na rozpuszczalność kolagenu Punkt izoelektryczny kolagenu mieści się w zakresie ph 6-9 (Foegeding i inni za Jongjareonrak i inni, 2005). Wartość ph, przy której kolagen osiąga maksimum rozpuszczalności zależy od jego pochodzenia i rodzaju obróbki jakiej został poddany surowiec. Najwyższą (ok. 100 %) rozpuszczalność kolagenu ekstrahowanego kwasem octowym ze skóry lucjana (Lutianus vitta), uzyskano w roztworze o ph 3 (Jongjareonrak i inni, 2005). Natomiast w przypadku kolagenu ze skóry i kości różownika karaibskiego (Priacanthus tayenus) białko najlepiej rozpuszczało się w ph odpowiednio 2 i 5 (Kittiphattanabawon i inni, 2005; Nalinanon, 2007). Kolagen z wyżej wymienionych ryb 24

25 najsłabiej rozpuszcza się przy ph 7. W tym ph kolagen skóry lucjana traci całkowicie rozpuszczalność. Natomiast rozpuszczalność kolagenu skóry i kości różownika karaibskiego w neutralnym ph wynosi odpowiednio 30 i 10 %. W alkalicznym środowisku rozpuszczalność kolagenu ze skóry lucjana nieznacznie rośnie i przy ph 10 osiąga wartość ok. 10 %. Natomiast w przypadku kolagenu ze skóry i kości różownika karaibskiego zwiększa się odpowiednio do 50 % i 10 % (Kittiphattanabawon i inni, 2005). Wpływ soli na rozpuszczalność kolagenu Sól, zależnie od stężenia zwiększa rozpuszczalność lub powoduje wysolenie białka. Rozpuszczalność w roztworze soli jest funkcją siły jonowej, napięcia powierzchniowego, momentu dipolowego oraz zmniejszenia powierzchni cząsteczek białka wskutek agregacji. Zatem rozpuszczalność zależy od czynników wpływających na elektrostatyczne oddziaływania cząsteczek białka i na strukturę wody. Jony soli obojętnych, w małym stężeniu zmniejszają elektrostatyczne przyciąganie sąsiednich cząsteczek białka, co sprzyja rozproszeniu cząsteczek w rozpuszczalniku. Duże stężenie soli wpływa na strukturę wody. Małe jony niszczą te struktury i tworzą nowe, stabilniejsze struktury wodno - jonowe zwiększając tym samym napięcie powierzchniowe. Duże aniony niszczą struktury, ale nie są w stanie stworzyć nowych stabilniejszych struktur. Sole budujące stabilne struktury wodno-jonowe zmniejszają rozpuszczalność białka, powodując jego wysolenie. W przeciwieństwie do nich sole, które wywołują niewielki wzrost napięcia powierzchniowego zwiększają rozpuszczalność białka. Przy dużym stężeniu soli dochodzi do hydratacji jonów i powstaje niedobór dipoli wodnych niezbędnych do uwodnienia białka, co może prowadzić do agregacji cząsteczek białka i jego wysolenia. Rozpuszczalność kolagenu skóry różownika karaibskiego oraz lucjana (Lutianus vita) w kwasie zmniejsza się gdy stężenie NaCl przekracza 2 %. Największy spadek rozpuszczalności kolagenu obserwuje się przy wzroście stężenia soli z 3 do 4 % (Kittiphattanabawon i inni, 2005; Jongjareonrak i inni, 2005; Nalinanon i inni, 2007). Rozpuszczalność kolagenu zmniejsza się do 30 % przy stężeniu NaCl 4 %. Dalszy wzrost stężenia soli powoduje niewielki spadek rozpuszczalności kolagenu (Kittiphattanabawon i inni, 2005; Jongjareonrak i inni, 2005). Poszczególne typy kolagenu wykazują inną rozpuszczalność w roztworach obojętnych soli. Rozpuszczony kolagen typu I można strącić z roztworu stosując NaCl w stężeniu 2 M. Kolagen typu V wysala się przy stężeniu chlorku sodu 4,5 M (Sato i inni, 1991). 25

26 Wpływ obróbki enzymatycznej kolagenu na jego rozpuszczalność Poddanie tkanki łącznej działaniu nieswoistych dla kolagenu enzymów proteolitycznych takich jak: pepsyny, trypsyny, pankreatyny (Higheberger, 1961; Nishihara, 1962), ficyny, bromelainy lub papainy (Hochstadt i inni, 1960) zwiększa wydajność ekstrakcji kolagenu. Enzymy nieswoiste nie atakują natywnego kolagenu. Działają jedynie na globularne fragmenty (telopeptydy) znajdujące się na końcach makrocząsteczek kolagenu. Odszczepiając telopeptydy usuwają one międzycząsteczkowe wiązania sieciujące, nawet te najbardziej trwałe w kwaśnym środowisku (Bailey i Light, 1989; Hickman i inni, 2000). Enzymy te nie naruszają łańcuchów głównych (rys. 6) i rozpuszczony kolagen daje się łatwo rekonstytuować (Higheberger, 1961; Nishihara, 1962; Bailey i Light, 1989; Hickman i inni, 2000). Podczas obróbki enzymatycznej surowców łącznotkankowych zachodzi nie tylko modyfikacja fizykochemicznych właściwości kolagenu, ale także hydroliza białek mu towarzyszących. pepsyna pepsyna Rysunek 6. Schemat działania pepsyny na kolagen wg Bailey i Light (1989) Pepsyna odszczepia telopeptydy zawierające tyrozynę w ilości 2 do 3 % masy kolagenu. Optimum ph działania pepsyny i trypsyny zależy od pochodzenia enzymu. Optymalne ph działania trypsyny zwierząt stałocieplnych mieści się najczęściej w zakresie od 7,0 do 9,0. Rybne trypsyny mogą wykazywać optymalne działanie nawet przy ph 10. Trypsyna działa w szerokim zakresie temp. od 35 do 60 C zależnie od organizmu i temp. jego bytowania. Pepsyna izolowana z żołądka ryb przejawia największą aktywność przy ph 3, a zwierząt stałocieplnych przy ph 2 (Reich, 1970; Kołodziejska, 1999) Wpływ obróbki enzymatycznej na rozpuszczalność kolagenu zależy od jego pochodzenia, aktywności enzymu, stosunku enzymu do substratu i czasu trawienia. Kolagen skór niektórych gatunków ryb rozpuszcza się całkowicie w kwasie octowym (Nagai i inni, 26

27 2002; Nagai i inni, 2001; Senaratne i inni, 2006), a w innych przypadkach rozpuszczalność tego białka wzrasta zaledwie o ok. 5 % (Jongjareonrak i inni, 2005). Kolagen z meduzy (Nagai i inni, 2000), ze skór mątwy (Nagai i inni, 2001) i rozdymki (Nagai i inni, 2002 ), łusek sardynki (Nagai i inni, 2004) oraz ze skór streczela (Senaratne i inni, 2006) jest całkowicie rozpuszczalny w 0,5 M kwasie octowym po trawieniu pepsyną przy stosunku masowym enzym : surowiec 1 : 10 (w : w). Stosując kąpiel w 0,5 M kwasie solnym można przeprowadzić do roztworu zaledwie 6 % kolagenu zawartego w mięśniach łososia. Po zastosowaniu pepsyny w stosunku enzym : substrat 1 : 10 (w : w) rozpuszczalność kolagenu wzrosła do 93 % (Eckhoff i inni, 1998). Wydajność ekstrakcji kolagenu z mięśni ramion i płaszcza ośmiornicy w 0,5 M kwasie octowym zwiększa się z 9 % do 80 % po zastosowaniu pepsyny w stosunku enzym : substrat 1 : 20 (w : w) (Mizuta i inni, 2003). Dojrzały, usieciowany kolagen skór bydlęcych można rozpuścić w kwasie organicznym lub nieorganicznym po wstępnym traktowaniu surowca pepsyną lub trypsyną, przy stosunku enzymu do surowca od 1 : 50 do 1 : 200 (w : w) (Higheberger, 1961; Nishihara, 1962). Nieznaczny wzrost rozpuszczalności kolagenu (z ok. 13 % do 18 % i 19 %), można uzyskać po zastosowaniu wstępnej obróbki skór owczych odpowiednio -amylazą i pepsyną (Yates, 1968). Nieomal całkowicie rozpuszczalny w 0,2 M kwasie octowym staje się kolagen płaszcza kalmara (Loligo pealei) po traktowaniu go -amylazą (Hunt i inni, 1970). Tak duże różnice zmian rozpuszczalności kolagenu po działaniu enzymu wynikają przypuszczalnie z innej lokalizacji i rodzaju międzycząsteczkowych wiązań sieciujących, szczególnie tych utworzonych z udziałem sacharydów. 6. Metody izolacji kolagenu z tkanki łącznej Istnieją dwie podstawowe metody izolacji kolagenu z tkanki łącznej. Pierwsza z nich polega na usunięciu z tkanki łącznej składników towarzyszących kolagenowi czyli: innych białek, mukopolisacharydów i lipidów. Druga metoda oparta jest na bezpośredniej ekstrakcji i rekonstytucji rozpuszczonego kolagenu. Wybór metody zależy od zawartości kolagenu w surowcu, właściwości kolagenu i białek niekolagenowych, lipidów oraz od zastosowania otrzymanego izolatu kolagenowego (Sadowska, 1992). Podstawowy problem jaki występuje przy wykorzystaniu pierwszej metody jest trudność w otrzymaniu izolatu wolnego od białek niekolagenowych. Do ekstrakcji albumin i globulin stosuje się roztwory obojętnych soli takich jak: NaCl lub KI. Roztworami tych soli można wyekstrahować ok. 80 % białek towarzyszących kolagenowi. Pozostałe białka można 27

28 usunąć dopiero po intensywnej ekstrakcji 0,1 M roztworem NaOH. Zastosowanie alkaliów powoduje jednak straty kolagenu i modyfikuje jego strukturę (Sadowska i inni, 1983/84). Ilość kolagenu rozpuszczonego w 0,1 M roztworze NaOH zależy od pochodzenia białka. Warunki ekstrakcji: rodzaj użytej soli, siła jonowa roztworu i jego ph, stosunek rozpuszczalnika do tkanki, stopień rozdrobnienia materiału, temp., czas i krotność ekstrakcji zależą od rodzaju użytej tkanki. Różnice te wynikają z innej zawartości białek niekolagenowych, ich rozpuszczalności jak i właściwości kolagenu. Otrzymany tym sposobem kolagen jest nierozpuszczalny, charakteryzuje się małą zdolnością pęcznienia w rozcieńczonych kwasach, i dla tego ma ograniczone zastosowanie. Istnieją trzy metody otrzymywania roztworu kolagenu: bezpośrednia ekstrakcja tkanki łącznej kwasem organicznym ekstrakcja kwasem kolagenu z surowców łącznotkankowych po wstępnej chemicznej obróbce. ekstrakcja kwasem kolagenu z materiału poddanego obróbce enzymatycznej Bezpośrednia ekstrakcja tkanki łącznej kwasem organicznym ma praktyczne zastosowanie jedynie w przypadku tkanki łącznej, w której kolagen usieciowany jest międzycząsteczkowo wiązaniami nietrwałymi w kwaśnym środowisku. Takimi właściwościami charakteryzuje się kolagen skór np. dorsza i morszczuka. Tkanka łączna przed ekstrakcją jest dokładnie odtłuszczana, pozbawiana tkanki mięśniowej i dezynfekowana roztworem wody utlenionej lub roztworem aldehydu mrówkowego (Sadowska, 1992). Najczęściej do ekstrakcji stosuje się 0,5 M roztwór kwasu octowego. Temp. i czas działania użytych roztworów zależą od pochodzenia tkanki łącznej. Wstępna obróbka tkanki łącznej alkaliami (NaOH, Ca(OH) 2 ) ma na celu rozluźnienie struktury usieciowanego kolagenu, a przez to zwiększenie jego rozpuszczalności w kwasach. Alkalia powodują również rozpuszczenie innych składników tkanki łącznej, których obecność pogarsza jakość produktów kolagenowych (Sadowska, 1992) Otrzymywanie kolagenu lub żelatyny z kości zwierząt stałocieplnych Proces otrzymywania roztworu żelatyny z kości jest dłuższy w porównaniu do stosowanego podczas otrzymywania żelatyny ze skór. Składa się z ośmiu etapów: rozdrabiania wstępnego surowca, odtłuszczania, suszenia, rozdrabniania, polerowania, demineralizacji, odkwaszania oraz ekstrakcji. Surowiec rozdrabnia się na kawałki o wymiarach mm. Operacja ta jest niezbędna do osiągnięcia odpowiedniej wydajności 28

29 ekstrakcji tłuszczu. Większe rozdrobnienie kości nie jest celowe gdyż powoduje powstanie znacznej ilości miału, który utrudnia ekstrakcję tłuszczu. Odtłuszczanie prowadzi się gorącą wodą o temp C przez 6 do 7 h w otwartym warniku. Odtłuszczony i wysuszony ciepłym powietrzem krusz kostny rozdrabnia się na kawałki o wymiarach mm otrzymując śrut kostny. Śrut kostny poleruje się w celu usunięcia zanieczyszczeń kości w postaci resztek mięsa, żył, krwi, włosów i ewentualnie zanieczyszczeń mechanicznych. Śrut kostny polerowany jest najważniejszym półproduktem do otrzymywania żelatyny. Ponieważ w kościach obecne są sole mineralne niezbędnym etapem jest demineralizacja. Demineralizację (macerację) kości można osiągnąć działając na śrut kostny kwasem solnym. Macerację prowadzi się rozcieńczonym kwasem solnym dodawanym w ilości: 6 7 % zimą i 4,5 5,5 % latem. Najkorzystniejszą temp. dla tego procesu jest 15 C. Podwyższenie temp. powoduje większe straty kolagenu, a obniżenie zmniejsza znacznie szybkość reakcji (Zyss, 1953). W wyniku procesu otrzymywane są rozpuszczalne w wodzie sole: Ca 3 (PO 4 ) HCl 2 CaCl 2 + Ca(H 2 PO 4 ) 2 Ca 3 (PO 4 ) HCl 3 CaCl H 3 PO 4 Wytworzony kwas fosforowy reaguje z nową porcją fosforanu wapnia: Ca 3 (PO 4 ) H 3 PO 4 3 Ca(H 2 PO 4 ) 2 Maceracja śrutu kostnego trwa od 5 do 10 dni. Codziennie dodaje się świeżą porcję kwasu. Gotowy produkt przemywa się wodą. Po usunięciu soli mineralnych oraz pozostałych składników kości (tab. 5) otrzymuje się kolagen, który nosi nazwę oseiny (łac. osseus - kostny). Istnieją dwie metody otrzymywania kolagenu i żelatyny z oseiny: zasadowa i kwasowa. W metodzie zasadowej surowiec poddaje się działaniu NaOH lub nasyconego mleka wapiennego przez okres od 14 do 60 dni (ph 12,5). W takim środowisku poprzeczne wiązania w kolagenie zostają rozluźnione, dlatego też proces ten jest stosowany głównie do obróbki surowca ze starych zwierząt. Metoda kwasowa stosowana jest natomiast głównie do obróbki surowca z młodych osobników. Młody kolagen nie jest jeszcze tak mocno usieciowany i nie wymaga intensywnej i długotrwałej wstępnej obróbki alkaliami. Proces prowadzi się przez jeden dzień w roztworze kwasu siarkowego (ph 1-2). Tak przygotowany surowiec poddaje się następnie wielostopniowej ekstrakcji gorącą wodą (Seybold, 1999). Inną metodą, w wyniku, której można otrzymać żelatynę techniczną z kości jest metoda dyfuzyjna. Początkowe etapy procesu są identyczne jak w przypadku metody oseinowej aż do otrzymania śrutu kostnego polerowanego. Metoda dyfuzyjna polega na wielokrotnym działaniu parą i gorącą wodą na śrut kostny. Wynikiem takiego działania jest częściowe rozpuszczenie kolagenu w wodzie i otrzymanie żelatyny. Składniki mineralne zawarte 29

30 w kościach nie ulegają żadnym przemianom. Oddzielenie soli mineralnych oraz przejście części kolagenu w żelatynę następuje w temp. powyżej 100 C. Aby osiągnąć maksymalną wydajność stosuje się temp. dochodzące do ok. 130 C. Tabela 5. Skład kości zwierząt stałocieplnych (wg Nicolas-Simonnot i inni, 1997) Składnik Zawartość [%] Fosforan wapnia Ca 3 (PO 4 ) 2 52 Pozostałe sole mineralne 12 Białka 29 Tłuszcz 1 Woda Otrzymywanie kolagenu lub żelatyny z kości zwierząt wodnych W przeciągu kilku ostatnich lat ukazały się prace na temat otrzymywania kolagenu i żelatyny z odpadów przemysłu rybnego m.in. z kręgosłupów ryb. Jednakże kręgosłupy nie nadają się do przerobu w identyczny sposób jak kości ssaków. Kolagen wykazuje m.in. większą rozpuszczalność w kwasach, dlatego proces demineralizacji musi być prowadzony w bardziej łagodnych warunkach niż ten przedstawiony w metodzie oseinowej. Cały proces prowadzi się w temp. 4 C, aby kolagen nie uległ denaturacji, gdyż ma on niższą temp. denaturacji w porównaniu z kolagenem zwierząt stałocieplnych. Rozdrobnione kręgosłupy poddaje się ekstrakcji 0,1 M roztworem NaOH przez 6 h zmieniając roztwór co 2 h w celu usunięcia białek mięśniowych (Nagai i Suzuki, 2000; Kittiphattanabawon i inni, 2005). Proces demineralizacji prowadzi się jednym ze sposobów: w roztworze EDTA lub HCl. Używając 0,5 M roztworu EDTA o ph 7,4 po pięciokrotnej wymianie roztworu co 24 lub 8 h można całkowicie usunąć związki mineralne odpowiednio z kości tuńczyka i różownika karaibskiego (Nagai i Suzuki, 2000; Kittiphattanabawon i inni, 2005). Stosując kąpiel w 3 % roztworze kwasu solnego w temp C przez 9 12 dni, wymieniając roztwór kwasu co 3 dni ze szkieletów okonia nilowego (Lates niloticus) usuwa się 76 % związków mineralnych otrzymując oseinę (Muyonga i inni, 2004 a, b). Następnie zdemineralizowane kręgosłupy odtłuszcza się stosując ekstrakcję 10 % roztworem alkoholu butylowego w ciągu 18 h lub 24 h, zmieniając roztwór alkoholu co 6 h (Nagai i Suzuki, 2000; Kittiphattanabawon i inni, 2005). Kolagen z tak przygotowanej oseiny ekstrahuje się dwukrotnie 0,5 M kwasem 30

31 octowym w czasie od 24 do 72 h. W wyniku tak przeprowadzonego procesu uzyskuje się kolagen z wydajnością w zakresie ok % w zależności od gatunku ryby (Kittiphattanabawon i inni, 2005; Nagai i Suzuki, 2000). Z kręgosłupów ryb można również ekstrahować żelatynę. Uzyskuje się ją z oseiny po 5 h ekstrakcji wodą o temp. ok. 60 C z 40 % wydajnością (Muyonga i inni, 2004 a, b). 7. Metody wydzielania białek z roztworu 7.1. Metody chemiczne Czynnikami najczęściej używanymi do strącania białek są sole nieorganiczne, których jony łatwo tworzą wodziany ((NH 4 ) 2 SO 4, Na 2 SO 4 lub MgSO 4 ), rozpuszczalniki organiczne (etanol, metanol, aceton), glikol polietylenowy, zmiana ph i temp. Stężenie soli potrzebne do wysolenia białka zależy od jego właściwości i od ph środowiska. Najczęściej stosuje się duże stężenia soli (ok %), a w skrajnym przypadku doprowadza się roztwór do wysycenia solą. Białko najłatwiej jest wysolić w punkcie izoelektrycznym, gdyż brak ładunków elektrycznych sprzyja łączeniu się cząsteczek w większe agregaty, łatwo wypadające z roztworu. Wysalanie białek jest procesem odwracalnym. Po zmniejszeniu stężenia soli, np. przez dializę, można ponownie rozpuścić strącone białko. Wykazuje ono swoje rodzime właściwości, ponieważ wysalanie nie powoduje denaturacji (Wierzbicki, 1999; Milewski, 2000). Efekt podobny do wysalania wywołuje dodanie do roztworu białka etanolu lub acetonu. Działanie rozpuszczalników jako czynników powodujących strącanie białek polega na zmniejszeniu stałej dielektrycznej roztworu; jeżeli rozpuszczalniki te działają krótko i w niskiej temp., białko nie ulega denaturacji i można je rozpuścić. Strącanie acetonem, etanolem i solami wykorzystuje się do frakcjonowania białek (Wierzbicki, 1999; Milewski, 2000). Ze względu na duże stężenie soli wysalanie nie jest dobrą metodą do otrzymywania, precypitatów białkowych, które by mogły być wykorzystane w przemyśle żywnościowym. Jedną z metod otrzymywania preparatów białkowych jest wydzielanie białek za pomocą glikozaminoglikanów lub roślinnych polisacharydów (Sadowska i Kołodziejska, 2005; Sadowska i inni, 2005). 31

32 7.2. Interakcje białek z polisacharydami Proces odzysku białka z roztworu polega na dodaniu do niego polisacharydu. W celu osiągnięcia maksymalnej wydajności tworzenia kompleksów białka z polisacharydem ustala się optymalne ph i inne warunki środowiska. Po strąceniu nierozpuszczalnych kompleksów białkowo-polisacharydowych osad oddziela się poprzez wirowanie i/lub filtrację (Schmitt i inni, 1998). Korzyści odzyskiwania białek za pomocą jonowych polisacharydów to: wysoka wydajność odzyskiwania białek, możliwość selektywnego odzyskiwania białek z ich mieszanin, wyższa termostabilność białek w kompleksach z jonowymi polisacharydami (Dumitriu i Chornet, 1998). Zastosowanie tej metody na skalę przemysłową wymaga eksperymentalnego określenia optymalnych warunków odzysku białka, tj. rodzaju polisacharydu, stosunku masowego polisacharyd: białko, ph oraz siły jonowej. Białka oraz polisacharydy obecne w produktach żywnościowych przez swoją zdolność do żelowania, zagęszczania oraz właściwości powierzchniowe odgrywają ważną rolę w kształtowaniu struktury oraz stabilności produktów. Na właściwości funkcjonalne tych biopolimerów w produktach żywnościowych duży wpływ mają oddziaływania między nimi. Zazwyczaj właściwości funkcjonalne takich kompleksów białkowo-polisacharydowych są lepsze od właściwości każdego z biopolimerów oddzielnie (Schmitt i inni, 1998). Stabilność roztworów biopolimerów W roztworze wodnym dwuskładnikowej mieszaniny białka i polisacharydu obserwuje się trzy możliwe zjawiska: segregacyjny rozdział faz (termodynamiczna niekompatybilność biopolimerów), wzajemną rozpuszczalność biopolimerów, asocjacyjny rozdział faz (powstawanie kompleksów biopolimerów), (Albertsson za Dickinsonem, 2003; Doublier i inni, 2000; Syrbe i inni, 1998; Tolstoguzov, 2003; Turgeon i inni, 2003). Gdy białko i polisacharyd odpychają się wzajemnie, wówczas reakcja między tymi biopolimerami jest energetycznie niekorzystna (endotermiczna), a biopolimery są niekompatybilne termodynamicznie (Schmitt i inni, 1998). Oznacza to, że cząsteczki każdego z biopolimerów wykazują tendencje do otaczania się cząsteczkami tego samego typu (Tolstoguzov, 2003). W takich warunkach oddziaływania między rozpuszczalnikiem, 32

33 a poszczególnymi biopolimerami są silniejsze niż oddziaływania między tymi biopolimerami. Prowadzi to do powstania niemieszającego się układu i ostatecznego utworzenia się dwóch faz, z których każda wzbogacona jest w jeden z biopolimerów, z podziałem rozpuszczalnika między obie fazy (rys. 7 A). Takie zjawisko nazywane jest segregacyjnym rozdziałem faz (Doublier i inni, 2000; Turgeon i inni, 2003; Mleko, 2004). Przykładem termodynamicznej niekompatybilności biopolimerów mogą być mieszaniny białka z niejonowym polisacharydem lub białka z anionowym polisacharydem posiadającym wypadkowy ładunek tego samego znaku, co białko (Doublier i inni, 2000). Polisacharydy Białka + Segregacyjny rozdział faz Asocjacyjny rozdział faz Niekompatybilność biopolimerów Całkowita mieszalność biopolimerów Tworzenie kompleksów biopolimerów A B C Rysunek 7. Oddziaływania biopolimerów w mieszaninach (wg Tolstoguzov, 1991) Całkowite mieszanie się biopolimerów zachodzi, gdy nie występują oddziaływania przyciągające między nimi, a roztwór jest bardzo rozcieńczony. Oba biopolimery tworzą wówczas homogeniczną mieszaninę (rys. 7 B). Wzrost stężenia biopolimerów w mieszaninie prowadzi do ograniczenia ich wzajemnej rozpuszczalności (Tolstoguzov, 2003). Zjawisko wzajemnej rozpuszczalność biopolimerów występuje bardzo rzadko. Istnieje tylko kilka potwierdzonych przypadków. Jednym z nich jest mieszanina albuminy osocza oraz pektyny (Semenova i inni, za Dickinsonem, 1998). Zazwyczaj w mieszaninach białek i polisacharydów obserwuje się rozdział faz. Przyczyną tego zjawiska jest termodynamiczna 33

34 niekompatybilność biopolimerów lub powstawanie kompleksów biopolimerów, jako wynik odpowiednio oddziaływań odpychających i przyciągających między biopolimerami (Dickinson, 2003; Syrbe i inni, 1998). Jeżeli oddziaływania miedzy białkiem i polisacharydem są przyciągające, a zatem energetycznie korzystne (egzotermiczne), wówczas biopolimery są kompatybilne termodynamicznie. W mieszaninach biopolimerów kompatybilnych, np. o przeciwnych ładunkach sumarycznych, zachodzi asocjacyjny rozdział faz, jako wynik powstawania kompleksów rozpuszczalnych (wypadkowy ładunek kompleksu jest różny od zera) lub nierozpuszczalnych (wypadkowy ładunek kompleksu wynosi zero) (Schmitt i inni, 1998). W takich warunkach powstają dwie fazy, z których jedna jest wzbogacona w powstałe kompleksy i nazywana jest koacerwatem, a drugą stanowi rozpuszczalnik z niewielką ilością obu biopolimerów (rys. 7 C). Możliwa jest również precypitacja kompleksów białkowo-polisacharydowych. Proces asocjacyjnego rozdziału faz przebiega w kilku etapach. Rozpoczyna się od powstania rozpuszczalnych kompleksów, które oddziaływują ze sobą tworząc agregaty, z których powstają niestabilne krople i/lub osad, ulegające ostatecznie sedymentacji tworząc fazę koacerwatu (Doublier i inni, 2000). Strącanie nierozpuszczalnych kompleksów zazwyczaj następuje w układach zawierających białko i polisacharyd będący silnym polikwasem, np. takim jak -karagen (de Kruif i inni, 2004). Rodzaje oddziaływań w kompleksach białkowo-polisacharydowych W tworzeniu kompleksów między białkami i polisacharydami udział biorą oddziaływania: elektrostatyczne, Van der Waals a, hydrofobowe, wodorowe, kowalencyjne. Najczęściej kompleksy białek z polisacharydami powstają w wyniku oddziaływań elektrostatycznych między przeciwnie naładowanymi grupami funkcyjnymi biopolimerów (Schmitt i inni, 1998). W oddziaływaniach anionowych polisacharydów z białkami udział biorą grupy karboksylowe ( COO - ) w pektynie, grupy sulfonowe ( OSO - 3 ) w κ-karagenie i agarze oraz ε-aminowe grupy reszt lizyny, guanidynowe grupy reszt argininy oraz N-końcowe grupy α-aminowe białek (rys. 8) (Sadowska i Łagocka, 1997). Kompleksy jonowe białek i polisacharydów z grupami sulfonowymi mogą również powstawać poprzez wytworzenie mostków solnych między jednoimiennie naładowanymi grupami: COO - - białek i OSO 3 polisacharydów przy ph, w którym białkowe grupy aminowe nie są już protonowane (rys. 9) (Sadowska i Łagocka, 1997). 34

35 COOH NH 3 + OSO 3 - COOH NH 3 + OSO 3 - Rysunek 8. Schemat tworzenia kompleksu białko-κ-karagen, gdzie kolorami oznaczono - łańcuch białka, - łańcuch κ-karagenu C=O NH 2 C=O NH 2 O - O - Ca 2+ Ca 2+ OSO 3 - OSO 3 - Rysunek 9. Schemat tworzenia mostków solnych w kompleksie białko-κ-karagen, gdzie kolorami oznaczono - łańcuch białka, - łańcuch κ-karagenu Znacznie rzadziej w tworzeniu kompleksów białek z polisacharydami uczestniczą oddziaływania hydrofobowe czy wiązania wodorowe (Doublier i inni, 2000). Oddziaływania jonowe, hydrofobowe oraz wiązania wodorowe mogą prowadzić do słabego (odwracalnego) lub silnego (trudno odwracalnego) wiązania białka z polisacharydem, w zależności od warunków środowiska: ph, rodzaju rozpuszczalnika, zawartości Ca 2+ (Dickinson i inni, 1998). Białka i polisacharydy mogą również wiązać się ze sobą przez chemiczną reakcję wolnych grup aminowych białek z grupami karboksylowymi polisacharydów i wytworzenie, kowalencyjnych wiązań amidowych. Takie wiązania są silne, trwałe i specyficzne, dlatego kompleksy powstałe z ich udziałem są nieodwracalne, stabilne i niewrażliwe na zmiany ph lub siły jonowej (Schmitt i inni, 1998). Czynniki wpływające na tworzenie jonowych kompleksów białko-polisacharyd Charakter i właściwości jonowych kompleksów białkowo-polisacharydowych są głównie wypadkową czynników fizykochemicznych, takich jak: ładunek cząsteczki polimerów, ph środowiska, siła jonowa, stosunek białko : polisacharyd, masa cząsteczkowa polimerów, temp., ciśnienie. Najważniejszym czynnikiem, decydującym o tworzeniu jonowych kompleksów białkowo-polisacharydowych, jest ph środowiska, od którego zależy stopień zjonizowania grup funkcyjnych obu biopolimerów. W mieszaninie białka 35

36 i anionowego polisacharydu największą wydajność tworzenia kompleksów obserwuje się przy ph niższym od punktu izoelektrycznego białka (ph < pi), gdy cząsteczki obu biopolimerów posiadają przeciwny ładunek sumaryczny (Schmitt i inni, 1998). W przypadku, gdy oba biopolimery posiadają wypadkowy ładunek ujemny (ph > pi) tworzenie kompleksów również jest możliwe ze względu na występowanie w cząsteczce białka dodatnio naładowanych regionów, zwanych łatkami (patches), w których obecne są zjonizowane grupy aminowe NH + 3 (Schmitt i inni, 1998). Lokalne oddziaływanie grup NH + 3 białka - z grupami OSO 3 polisacharydu pozwala przezwyciężyć wzajemne odpychanie między anionowym polisacharydem i białkiem o ujemnym ładunku sumarycznym. W efekcie powstają kompleksy białkowo-polisacharydowe, co prowadzi do asocjacyjnego rozdziału faz (Dickinson, 1998; Schmitt i inni, 1998; Syrbe i inni, 1998). Trwałość kompleksów białkowo-polisacharydowych zależy od: rozmieszczenia zjonizowanych grup na powierzchni białka, od łatwości rozwijania natywnej struktury białka, elastyczności cząsteczki polisacharydu oraz gęstości ładunku polisacharydu. O tym czy powstałe kompleksy są rozpuszczalne czy nie rozpuszczalne, odwracalne czy nieodwracalne decydują warunki środowiska wodnego oraz stosunek białka do polisacharydu w układzie (Dickinson, 1998). W przypadku, gdy jeden z polimerów znajduje się w nadmiarze uzyskuje się kompleksy rozpuszczalne ze względu na obecność niezobojętnionych ładunków (Schmitt i inni, 1998). Stosunek białka do polisacharydu optymalny dla powstawania kompleksów jest indywidualny dla każdego układu, dlatego wyznaczany jest eksperymentalnie. Aby tworzenie kompleksów białkowo-polisacharydowych było możliwe, siła jonowa roztworu powinna mieć taką wartość by, po zredukowaniu części ładunków biopolimerów przez mikrojony, liczba ładunków obecnych na biopolimerach była wystarczająca, do utworzenia oddziaływań przyciągających cząsteczki. Przy dużej sile jonowej wypadkowy ładunek biopolimerów jest zredukowany przez oddziaływanie z mikrojonami, co prowadzi do osłabienia sił przyciągania elektrostatycznego między makrocząsteczkami (Schmitt i inni, 1998). Kompleksy jonowe białek i polisacharydów powstają najwydajniej w niskiej temp., gdyż takie warunki sprzyjają oddziaływaniom elektrostatycznym oraz tworzeniu wiązań wodorowych. Wzrost temp. ułatwia powstanie oddziaływań hydrofobowych i wiązań kowalencyjnych miedzy biopolimerami, przez ekspozycję reaktywnych regionów polimerów w skutek termicznej denaturacji białek globularnych i konformacyjnych zmian struktury polisacharydów (Schmitt i inni, 1998). 36

37 7.3. Karageny Karageny (rys. 10) są izolowane głownie z gatunków czerwonych wodorostów (alg) i są szeroko stosowane do zagęszczania, żelowania i jako czynniki stabilizujące w przemyśle żywnościowym (Clark i Ross-Murphy za Uruakpa i inni, 2004; Baeza inni, 2002). κ-karagen jest liniowym, sulfonowanym polisacharydem o charakterze polianionu. Występuje w postaci trzech głównych frakcji kappa (κ), jota (ι) i lambda (λ). Różnią się one stopniem sulfonowania i zawartością 3,6-anhydrogalaktozy. Różnice w składzie i kompozycji przekładają się na różne cechy funkcjonalne tych polisacharydów. κ i ι są zdolne do tworzenia żeli, w przeciwieństwie do λ (Yuguchi i inni, 2002). ι ma 32 % (wagowo) grup zestryfikowanych, natomiast κ-karagen 25 % (Enriguez i Filck za Dickinson i inni, 1998). κ -karagen jest zbudowany z 1,3-β-D-galakto piranozydyu i 1,4-α-D-galaktopiranozydu (Wilska-Jeszka, 1994). OSO 3 CH 2OH O O O O OH O OSO 3 n Rysunek 10. Fragment cząsteczki κ-karagenu Omawiane polisacharydy są podobne w szkielecie cząsteczkowym do struktury agarozy, jednakże ta ostatnia jest neutralna i nie zawiera grup sulfonowych (Armisen i Galatas za Spagnuolo i inni, 2005). Karageny w swoich właściwościach i strukturze są podobne do siarczanu chondroityny - jednego z glikozaminoglikanów. 8. Sposoby wydzielania kolagenu z roztworu Rozpuszczalne formy kolagenu są zdolne do samobudowy struktury fibrylarnej również in vitro. Proces ten nosi nazwę rekonstytucji kolagenu. Jego siłą napędową są przede wszystkim siły oddziaływania jonowego, wynikające z asymetrycznego rozmieszczenia reszt aminokwasów kwaśnych i zasadowych wzdłuż cząsteczki tropokolagenu. W jednych obszarach tropokolagenu występuje zagęszczenie ładunku ujemnego, a w innych ładunku dodatniego. Taki niesymetryczny rozkład ładunków łącznie ze specyficznym oddziaływaniem fenolowych grup OH reszt tyrozyny prowadzi najpierw do określonej orientacji cząsteczek tropokolagenu, następnie do ich ułożenia się w określonym porządku, aż wreszcie prowadzi 37

38 do powiązania w sieć cząsteczek tropokolagenu siłami wiązania elektrostatycznego i wytworzenia nadrzędnej struktury czwartorzędowej (Lasek, 1978). Rozpuszczony kolagen można wydzielić powtórnie w postaci fibrylarnej, zmieniając warunki, w których się on znajduje. Proces ten można przeprowadzić różnymi sposobami: przez wysalanie lub strącanie alkoholem, przez dializę lub strącanie przez ogrzewanie roztworu kolagenu. W pobliżu punktu izoelektrycznego, przy stałej sile jonowej i temp. odczyn środowiska ma znaczny wpływ na powstawanie fibryl. Dla tropokolagenu, znaleziono dwa maksima skuteczności tworzenia się fibryli, pierwsze pomiędzy ph 4 a 5, drugie przy ph równym 9. Przy stałym ph siła jonowa wpływa na proces w ten sposób, że szybkość powstawania fibryli rośnie odwrotnie proporcjonalnie do niej, o ile wartość siły jonowej jest mniejsza od 0,3; natmiast powyżej 0,3 wzrost siły jonowej przyspiesza powstawanie fibryl (Reich, 1970). Wielkość fibryl, jaką można osiągnąć przy rekonstytuowaniu kolagenu z jego roztworów zależy od szybkości powstawania fibryl. Szybkość ta zależy od ph, siły jonowej środowiska, temp., obecności określonych związków. Rekonstytucja jest procesem dwufazowym: najpierw następuje agregacja (tworzenie zarodków), a następnie tworzenie się fibryl przez przyłączanie się dalszych cząsteczek tropokolagenu do zarodków o pseudokrystalicznej strukturze. Szybkość wzrostu zależy przy tym ogólnie od powierzchni utworzonych agregatów i od stężenia tropokolagenu (Reich, 1970). Przez wysalanie lub strącanie alkoholem otrzymuje się raczej kolagen bezpostaciowy niż fibrylarny. Ogrzewanie obojętnych roztworów kolagenu do C powoduje wzrost zmętnienia roztworu wskutek tworzenia się fibryl. Końcowym efektem jest żelowanie, początkowo klarownego roztworu. Powstały żel składa się z fibryl (Reich, 1970). Kolagen bydlęcy strąca się przy 5 % stężeniu NaCl (Sadowska, 1992). Skuteczną metodą strącania bydlęcego kolagenu jest zastosowanie glikozaminoglikanów (GAG) lub roślinnych polisacharydów. Rozpuszczony bydlęcy kolagen strąca się w 100 % po zastosowaniu chondroityny A i C w stosunku mukopolisacharyd : kolagen, 1 : 8 (Sadowska i inni, 1995), zaś karagenem z 99 % wydajnością przy zastosowaniu stosunku karagen : kolagen, 1 : 40 (Sadowska i Strojk, 1998). Różne typy glikozaminoglikanów wpływają na wytwarzanie fibryli o różnej długości, średnicy i orientacji przestrzennej. Dodatek GAG do roztworu kolagenu ze skóry bydła, otrzymanego na drodze ekstrakcji 0,15 M roztworem kwasu solnego, powoduje natychmiastowe powstanie włókien. Ilość włókien wzrasta wraz z ilością dodanych GAG i stężeniem kolagenu. Warunkami optymalnymi roztworu są ph 3 i nieobecność soli. Całkowite strącenie kolagenu z roztworu 38

39 kwasu solnego w postaci włókien i fibryli uzyskuje się przy stosunku wagowym suchych reagentów kolagen : GAG 1 : 0,3. Jednak strącanie kolagenu GAG jest nieekonomiczne, ze względu na ich wysoką cenę. Niektóre polisacharydy jak: karboksymetyloceluloza, alginian sodu, agar, pektyny i karageny są używane do odzyskiwania składników białkowych z odcieków przemysłowych. W przypadku strącania κ-karagenem kolagenu skór dorsza, wyekstrahowanego 0,5 M kwasem cytrynowym lub 0,15 M roztworem kwasu solnego, najlepsze wyniki uzyskuje się w zakresie ph 2,2 3. Stężenie chlorku sodu do 5 % w roztworze nie wpływa na wydajność rekonstytucji. Lepszą wydajność strącenia uzyskuje się w temp. 0 C (45 % straconego kolagenu) niż w temp. 20 C (16 %), w 0,5 M roztworze kwasu cytrynowego o zawartości 1,5 % kolagenu i 0,2 % κ-karagenu. Wynika to z faktu, że κ-karagen tworzy silnie uwodnione agregaty powodując zmętnienie roztworu. Ilość strąconych fibryl zależy od stężenia zarówno κ-karagenu jak i kolagenu. Kolagen ze skór dorsza, rozpuszczony w kwasie cytrynowym, można wydzielić w stosunku wagowym suchych reagentów 1 : 0,4 (kolagen : κ-karagen), przy stężeniu białka w rozworze wynoszącym 1,5 0,08 %. Przy bardzo małym stężeniu białka 0,012 % strącono fibryle kolagenowe w stosunku 1 : 8,3 (białko : polisacharyd). Kolagen wyekstrahowany ze skór bydła roztworem kwasu solnego, ulegał całkowitemu strąceniu w postaci fibryl przy stosunku kolagenu do κ-karagenu 1 : 0,025. Taka rozbieżność wyników może wynikać z różnej zawartości lizyny, hydroksylizyny, argininy i N-końcowych α-aminowych grup w tych dwóch typach kolagenu oraz różnych rozmiarów cząsteczek w kwaśnym roztworze (Sadowska, 2005). 9. Funkcjonalne właściwości preparatów białkowych Funkcjonalne właściwości białek występujących w żywności są bardzo ważne w przetwórstwie żywności i w formowaniu produktów żywnościowych. Niektóre z tych właściwości to: rozpuszczalność, wiązanie wody, oleju, właściwości emulgujące, pianotwórcze, lepkość i żelowanie. Na właściwości te wywierają wpływ czynniki, wynikające z budowy białka takie jak: konformacja i masa cząsteczkowa białka a także ph, siła jonowa i obecność innych składników żywności. Ranga tych właściwości zmienia się wraz z rodzajem produktu żywnościowego, w którym preparat białkowy został zastosowany. Na przykład, białka o dużej zdolności wiązania wody są pożądane w różnego rodzaju przetworach mięsnych, podczas gdy białka o dużej zdolności emulgowania są przydatne do otrzymywania sosów sałatkowych, kiełbas, zup, ciast i wyrobów cukierniczych (np. kremów) 39

40 (Ahmedna i inni, 1999). Na funkcjonalne właściwości białek wpływają zarówno metody i warunki ich ekstrakcji jak i pośrednie etapy otrzymywania ekstrahowanych białek takie jak oczyszczanie i suszenie (Yu i inni, 2007). Mitchell i Ledward (za Mwasaru i inni, 1999) uważają, że wiele receptur produkowanej żywności powstawało bez uwzględnienia wiedzy o interakcjach składników żywności. Dlatego wśród technologów żywności istnieje potrzeba zrozumienia zachowania się poszczególnych składników w produkowanych artykułach spożywczych (Mwasaru i inni, 1999). Obecny stan wiedzy na temat funkcjonalnych właściwości białek występujących w różnych surowcach, pozwala na otrzymywanie produktów o standardowej jakości. Główną rolę w kształtowaniu pożądanych cech sensorycznych przetworów odgrywają funkcjonalne właściwości białek Rozpuszczalność Wiele białek nie tworzy rzeczywistych roztworów nie rozpraszających światła, lecz jedynie układy koloidalne. Na tak rozumianą rozpuszczalność białka zawartego w żywności duży wpływ mają właściwości tego białka, rozpuszczalnika i środowiska. Duże znaczenie ma również uwikłanie białka w strukturze produktu, decydujące o dostępie rozpuszczalnika do rozpuszczanego materiału (Sikorski, 2002). Rozpuszczalność białka zależy od jego budowy i cech rozpuszczalnika, od temp. i odczynu środowiska, współdziałania z innymi białkami oraz od stężenia i ładunku innych jonów. Rozpuszczalność wpływa na niektóre pozostałe funkcjonalne właściwości, przede wszystkim na żelowanie oraz działanie na granicy faz. Utrata rozpuszczalności wskutek obróbki żywności w drastycznych warunkach jest w wielu przypadkach wskaźnikiem denaturacji i następczego sieciowania białka (Sikorski, 2002). Wpływ ph na rozpuszczalność W roztworach wodnych rozpuszczalność białek jest najmniejsza w pi, gdyż wobec braku zewnętrznego ładunku elektrycznego cząsteczki nie odpychają się i nie mają dużej warstwy hydratacyjnej, co sprzyja ich agregacji. W środowisku o ph niższym i wyższym od pi, duży dodatni lub ujemny ładunek elektryczny białka indukuje wzrost sił odpychających, co powoduje rozfałdowanie białka i wzrost jego rozpuszczalności. Dużą rolę w odgrywają też oddziaływania grup hydrofilowych z dipolami wody (Kaur i Singh, 2007; Sikorski, 2002). Większość roślinnych i zwierzęcych białek posiada pi przy ph 4-5 (Vani i Zayas, 1995). 40

41 Mała rozpuszczalność preparatu w szerokim zakresie ph jest wskaźnikiem denaturacji białek (Hermansson, 1979; Kinsella, 1979; Lillford, 1983; Nakai, Uważa się, że białka roślinne (np. sojowe) o dobrych właściwościach funkcjonalnych powinny być rozpuszczalne w 90 % (KeShun za Chew i inni, 2003). Dobra rozpuszczalność białek z nasion i mąki rośliny o nazwie Bilphia sapida w kwaśnym i alkalicznym zakresie ph pozwala zastosować je do wytwarzania żywności takiej jak analogi mięsa, białek mleka oraz napojów bogatych w białka (Kinsella,1979; Olaofe i inni, 1998; Olaofe i inni, 1993; Oshodi i Ekperigin, 1989; Pomeranz, 1991). Wpływ siły jonowej na rozpuszczalność Wpływ siły jonowej na rozpuszczalność białka wiąże się prawdopodobnie ze zjawiskiem solwatacji, wysalania oraz oddziaływań elektrostatycznych (Kinsella, 1979) Rozpuszczalność w roztworze soli jest funkcją siły jonowej, napięcia powierzchniowego, momentu dipolowego oraz zmniejszenia powierzchni cząstek wskutek agregacji (Sikorski, 2004). Zatem rozpuszczalność zależy od czynników wpływających na elektrostatyczne oddziaływania cząsteczki białka i na struktury wody. Sole budujące stabilne struktury wodno-jonowe zmniejszają rozpuszczalność białka, powodując jego wysolenie, gdyż zwiększają siły oddziaływań między cząsteczkami białka. Przy niskim ph, wszystkie grupy karboksylowe są protonowane i białko uzyskuje ładunek dodatni, powodując zmniejszenie odpychania jonów chlorkowych i wzmocnienie hydrofobowych oddziaływań, które prowadzą do tworzenia nierozpuszczalnych agregatów białkowych. Przy wysokich wartościach ph wzrasta ujemny ładunek białka, a w połączeniu z obecnością soli następuje dysocjacja agregatów białkowych i przez to wzrost rozpuszczalności (Aluko i Yada, 1995) Wodochłonność i wiązanie oleju Wodochłonność jest to zdolność utrzymywania w strukturze białka wody własnej lub dodanej, wbrew działaniu sił zewnętrznych np. grawitacji, siły odśrodkowej, ciśnienia, sił kapilarnych (Sikorski, 2002). Wodochłonność jest istotną cechą białek charakterystycznych dla żywności o gęstej konsystencji takiej jak: homogenizowane zupy mięsne, ciasta, kremy (Adeyeye i inni, 1994; Seena i Sridhar, 2005). Wodochłonność decyduje o soczystości, właściwościach reologicznych, a także o ubytku masy wskutek obróbki cieplnej przetworów mięsnych, rybnych i produktów roślinnych. Mechanizm zdolności adsorpcji oleju/tłuszczu przez białka tłumaczy się jako fizyczne uwięzienie oleju (Kinsella, 1979), a duża 41

42 powierzchnia białka i hydrofobowość polepszają zdolność wiązania oleju (Chau i Cheung, 1998). Wszystkie czynniki zacieśniające strukturę białek zmniejszają wodochłonność. Dlatego w obszarze bliskim pi wodochłonność białek jest najmniejsza (Sikorski, 2004). Duża rozpuszczalność białek rybnych lub roślinnych obniża zdolność wchłaniania wody (Orban i inni, 1992; Dev i Quensel, 1986) Na zdolność białek do wiązania wody ma przede wszystkim wpływ: skład aminokwasowy, konformacja białka oraz hydrofobowość/hydrofilowość powierzchniowa (Barbut, 1999). Duży wpływ na konformację białka i jego hydrofobowość wywierają metody przetwarzania żywności. Obróbka termiczna powoduje obniżenie zdolności do wiązania wody i oleju, podczas gdy procesy fermentacyjne podwyższają te właściwości (Yu i inni, 2007). Ogrzanie mąki z orzecha ziemnego do 175 ºC powoduje nieodwracalną denaturację białka a przez to zmniejsza zdolność wiązania wody i oleju (Yu i inni, 2007). Natomiast znaczny wzrost wodochłonności i zdolności wiązania oleju przez białka orzecha ziemnego można uzyskać poddając białka procesowi fermentacyjnemu z udziałem grzyba Rhizopus oligsporus. Białka po trawieniu enzymami proteolitycznymi rozkładają się na rozpuszczalne oligopeptydy, co powoduje odsłonięcie większej ilości grup hydrofobowych a w następstwie zwiększenie zdolności wiązania oleju i stabilizowania emulsji (Yu i inni, 2007) Właściwości emulgujące Białka ułatwiają tworzenie emulsji nie mieszających się cieczy i stabilizują powstający układ. Zmniejszenie średnicy kropel cieczy np. lipidu, rozproszonych w fazie ciągłej, np. w wodzie, powoduje wykładniczy wzrost powierzchni międzyfazowej. Pracę niezbędną do zwiększenia powierzchni międzyfazowej można zmniejszyć, obniżając napięcie powierzchniowe przez przyłączenie cząsteczek białka do powierzchni kropli. Błona białkowa tworząca się wokół kropli lipidu, mająca ładunek elektryczny, zapobiega flokulacji, tzn. tworzeniu agregatów kropel i podstojowi, a także koalescencji, tzn. tworzeniu ciągłej fazy lipidowej (Sikorski, 2002). Białka są zbudowane z naładowanych elektrycznie aminokwasów, nie naładowanych elektrycznie, polarnych aminokwasów i z nie polarnych aminokwasów, co czyni białka potencjalnymi emulgatorami, tzn. surfaktantami posiadającymi jednocześnie hydrofilowe i hydrofobowe właściwości, dzięki czemu mającymi zdolność do oddziaływania z wodą i olejem jednocześnie (Mwasaru, 1999). Zdolność emulgowania białek zależy od równowagi hydrofilowo - lipofilowej, na którą ma wpływ ph środowiska (Sathe i inni, 1982a,b) a także od konformacji białka, jego ładunku, 42

43 siły jonowej, rozmiaru kropelek tłuszczu i napięcia powierzchniowego (Hung i Zayas, 1991; Lawal i inni, 2005) i ilości rozpuszczonego białka. Im wyższa rozpuszczalność białek tym stabilność emulsji jest większa. Wynikać to może z faktu, że rozpuszczone białko wpływa na stabilność emulsji poprzez tworzenie białkowego filmu dokoła kropelek tłuszczu jak również dzięki równowadze między przyciągającymi siłami van der Waalsa a odpychającymi siłami elektrostatycznymi. Dodatek NaCl o stężeniu w zakresie od 0 0,5 M do białek pochodzących z rośliny strączkowej o nazwie Vigna unguiculata powoduje wzrost ich rozpuszczalności, nawet w pi, a zatem powoduje również wzrost ich zdolności emulgujących (Ragab i inni, 2004). Poza wyżej wymienionym zakresem stężeń soli, zdolność emulgowania białek obniża się, ponieważ następuje efekt wysolenia białek. Niekiedy bywa tak, że wraz ze wzrostem stężenia soli rośnie również zdolność emulgowania. W niskim ph, białka posiadają dodatni ładunek elektryczny, wówczas dodatek NaCl powoduje, że przeciwnie naładowane jony chlorkowe oddziaływują z białkami przez co zmniejsza się odpychanie między jednoimiennie naładowanymi cząsteczkami białka i wzmacniają się oddziaływania hydrofobowe, dzięki czemu wzrasta zdolność emulgowania (Aluko i Yada, 1995). Wraz ze wzrostem udziału fazy rozproszonej i zmniejszeniem średnicy kuleczek lipidowych wzrasta ilość białka niezbędna do stabilizowania emulsji. Aby zapewnić dużą szybkość tworzenia ochronnej warstwy wokół zdyspergowanych kropel tłuszczu, należy wprowadzić do emulsji 0,5 5 % białka. Na efektywność emulgowania wpływa również temp. Ogrzewanie w temp ºC może spowodować częściowe rozfałdowanie struktury białka bez zmiany jego rozpuszczalności, zżelowanie ochronnej warstwy wokół kropel lipidów oraz zmniejszenie lepkości środowiska. Umiarkowane ogrzewanie może korzystnie wpływać na zdolności emulgujące białka pod warunkiem, że wywołana przez nie zmiana konformacji zwiększa hydrofobowość powierzchniową nie zmieniając rozpuszczalności (Sikorski, 2002) Żelowanie Żelowanie polega na tworzeniu uporządkowanej, przestrzennej struktury, cząsteczek polimerów, zdolnej do zatrzymania rozpuszczalnika i substancji rozpuszczonych albo wypełniaczy (Sikorski, 2002). W piśmiennictwie najczęściej stosowanym parametrem pomiaru zdolności żelowania jest LGC (ang. Least Gelation Concentration). LGC jest definiowane jako najmniejsze stężenie białka, przy którym żel pozostaje w odwróconej 43

44 probówce (Arogundade i inni, 2004). Im niższa jest wartość LGC tym białko ma lepsze właściwości żelujące (Akintayo i inni, 1999). Żelowanie jest nie tylko funkcją stężenia białka, ale także związane jest z rodzajem białka, ze składnikami niebiałkowymi i z rozpuszczalnością białka (Sathe i Salunkhe, 1981). Udział takich składników żywności jak lipidy i węglowodany ma wpływ na właściwości żelujące preparatów białkowych (Sathe i inni, 1982). Istnieje bezpośrednia korelacja między LGC a zawartością globulin w nasionach roślin strączkowych (Fleming i inni, 1975). Natomiast miozyna i aktomiozyna są w głównej mierze odpowiedzialne za żelowanie i elastyczne właściwości struktury gotowej wędliny, ponadto miozyna ma także największy udział w żelowaniu przetworów rybnych (Grabowska, 1974). ph wpływa na żelowanie białek zmieniając ładunek i równowagę elektrostatyczną pomiędzy i wewnątrz cząsteczek białka (Poole i inni, 1984). Wiązania o charakterze elektrostatycznym mają duży wpływ na formowanie struktury żelu wraz z oddalaniem się wartości ph od punktu izoelektrycznego białka (Schneph, 1992). Wytrzymałość żelu wzrasta wraz ze wzrostem stężenia białka. Natomiast czas żelowania maleje gdy stężenie białka wzrasta powyżej stężenia minimalnego (Mulvihill i Kinsella, 1987). Białka mogą tworzyć po ogrzaniu odwracalne lub nierozpuszczalne żele. Do białek tworzących nierozpuszczalne żele należą najczęściej białka o masie cząsteczkowej ponad 60 kd, zawierające w składzie aminokwasowym ponad 30 % reszt hydrofobowych, jak np. albumina jaja. Białka żelujące odwracalnie zawierają poniżej 30 % reszt hydrofobowych np. albumina osocza, niektóre białka soi oraz żelatyna. Odwracalność żelowania zależy od udziału poszczególnych rodzajów wiązań w utrzymaniu struktury żelu, właściwości i stężenia białka, warunków ogrzewania, siły jonowej i odczynu środowiska. Gdy mamy określone stężenie białka to wówczas zdolność żelowania zależy głównie od wielkości i kształtu łańcuchów polipeptydowych w strukturze żelu. Zazwyczaj żeli nie tworzą białka globularne o masie cząsteczkowej poniżej 23 kd (Sikorski, 2002) Właściwości pianotwórcze W produktach żywnościowych piana powstaje wskutek zdyspergowania pęcherzyków powietrza w ciągłej fazie ciekłej lub półstałej masie zawierającej białko. Piana współuczestniczy w powstawaniu pożądanych, sensorycznych właściwości np. tekstury chleba, pieczywa cukierniczego, bitej śmietany i lodów (Sikorski, 2002). Tworzenie piany jest analogiczne do powstawania emulsji. W przypadku piany, białko otacza pęcherzyki 44

45 powietrza, powietrze jest fazą niepolarną. Teoretycznie, amfifilowy charakter białek czyni je dobrymi czynnikami działającymi na granicy faz powietrze woda, co zapobiega koalescencji pęcherzyków powietrza (Yu J i inni, 2007). Zdolność tworzenia piany (FC, ang. Foaming Capasity) i stabilność piany (FS, ang. Foaming Stability) są często stosowane jako wskaźniki właściwości pianotwórczych izolatów białkowych. Białka pienią się podczas ubijania ze względu swą aktywność powierzchniową. Graham i Phillips (1976) łączą dobrą zdolność pienienia z giętkimi fragmentami białek, które posiadają właściwość obniżania napięcia powierzchniowego, podczas gdy białka globularne, które stosunkowo trudno ulegają denaturacji powierzchniowej nie wykazują dobrych właściwości pianotwórczych. Bardzo ważną cechą piany jest jej stabilność to znaczy duża trwałość w czasie. Zależy ona od jakości białek jako czynników pianotwórczych (Lin i inni., 1974). Właściwości pianotwórcze zależą od ph. FC globulin, otrzymanych z rośliny Vigna unguiculata, rośnie ze wzrostem ph i stężenia NaCl. FS tych białek jest lepsza w wysokim zakresie ph niezależnie od siły jonowej (Aluko i Yada, 1995). Dodatek soli wzmaga pienienie białek z dala od punktu izoelektrycznego (Halling, 1981). Mechanizm wspólnego oddziaływania stężenia soli i jonów wodorowych na właściwości pianotwórcze izolatów białkowych został wyjaśniony na podstawie wpływu tych czynników na elektrostatyczne odpychanie pomiędzy cząsteczkami białka (Aluko i Yada, 1995), wpływu soli na agregację białek (Kinsella, 1981) i efektu ochronnego kationów sodowych i anionów chlorkowych na asocjacje białek (Poole i inni, 1984). Wzrost objętości pian stabilizowanych przez białka po dodaniu NaCl tłumaczy się wzrostem rozpuszczalności białek (Halling, 1981; Kinsella, 1979; Sathe i inni., 1982b). Zwiększenie rozpuszczalności powoduje wzrost adsorpcji cząsteczek na powierzchni pęcherzyków co przyczynia się do wzrostu zdolności pienienia, ale wywołuje spadek elastyczności białkowych błonek co z kolei powoduje obniżenie stabilności piany. NaCl redukuje powierzchnię cząsteczek białka niezbędną do wystąpienia wymaganych właściwości reologicznych dla stabilności piany (Kinsella, 1981). Największa stabilność piany i minimalna rozpuszczalność pojawiają się w izoelektrycznym zakresie ph białek. Umiarkowana rozpuszczalność białek jest niezbędna by umożliwić pojawienie się powierzchniowej adsorpcji białek. Wiele białek łatwo koaguluje w punkcie izoelektrycznym co powoduje redukcję stabilności białkowej otoczki (Mwasaru i inni, 2000). Właściwości pianotwórcze białek bardzo różnią się w zależności od pochodzenia białka, odzwierciedlają one skład, konformację, strukturę, oddziaływania z innymi składnikami i z bezpośrednim ich 45

46 otoczeniem (Mwasaru i inni, 2000). 10. Wykorzystanie hydrolizatów białkowych Hydroliza enzymami proteolitycznymi powoduje stopniową zmianę właściwości białek wywołaną zniszczeniem pierwotnej konformacji i fragmentacją cząsteczek. Najczęściej w przemyśle żywnościowym białka modyfikuje się enzymatycznie aby: poprawić reologiczne właściwości wyrobów, wytworzyć pożądane cechy smakowo zapachowe, polepszyć właściwości funkcjonalne białek oraz inaktywować białka szkodliwe biologicznie. Stopień hydrolizy można regulować poprzez dobieranie odpowiednich parametrów reakcji lub stosując enzymy o dużej specyficzności działania względem substratów lub niektórych wiązań peptydowych. Daleko posunięta hydroliza prowadzi do powstania mieszaniny wolnych aminokwasów i peptydów, zwanej hydrolizatem białkowym, przydatnej jako składnik dietetycznej żywności dla dzieci, ludzi starszych lub osób ze schorzeniami przewodu pokarmowego, wątroby, trzustki i nerek oraz jako przyprawy smakowe (Clemente, 2000; Silva i inni, 1999). Hydrolizaty rybne są od dawna popularne w krajach Azji i dostępne w postaci rozmaitych sosów i past. Hydrolizę enzymatyczną wykorzystuje się również do wytwarzania peptonów dla celów mikrobiologicznych i dodatków do żywności (Synowiecki i Sikorska-Wiśniewska, 1997). Hydrolizaty białkowe z ryb są aktualnie używane do produkcji substytutów mleka lochy dla odstawionych prosiąt, jako pokarm dla ryb i innych zwierząt (Simpson i inni, 1998). Hydrolizaty białkowe mogą być źródłem peptydów o działaniu przeciwutleniającym, powierzchniowo aktywnych, peptydów poprawiających wartość odżywczą (Kołakowski, 1986; Jun i inni, 2004; Je i inni, 2005) oraz peptydów hamujących proliferację komórek raka piersi (Picot i inni, 2006) jak również peptydów o właściwościach sensorycznych (tab. 6). Kolejność ułożenia aminokwasów w łańcuchach peptydowych decyduje o ich smaku. Wyróżnia się pięć podstawowych smaków: słodki, słony, gorzki, kwaśny i umami. W zależności od stosowanego enzymu i czasu reakcji można uzyskać hydrolizaty białkowe o różnych właściwościach sensorycznych. Wraz ze wzrostem stopnia hydrolizy białek powyżej 10 % zwiększa się gorycz produktu (Synowiecki i inni, 1996, Kołakowski, 2005). Ocena sensoryczna białkowych hydrolizatów wykazała, że wszystkie trzy bakteryjne preparaty enzymatyczne; Alkalaza 2,4 L, Neutraza i Protamex przyczyniły się do powstania bardziej gorzkich hydrolizatów niż preparaty otrzymane przy udziale trypsyny. Nie odczuwano żadnej różnicy między enzymatycznymi preparatami bakteryjnymi a Protamexem, 46

47 który był specjalnie zaprojektowany do tego, aby nie wytwarzać gorzkich hydrolizatów białkowych (Gildberg i inni, 2002). Tabela 6. Przykłady peptydów o właściwościach sensorycznych (wg Obrycka, 1998) Peptyd Struktura Smak Aspartam Asp-PheOMe Słodki Alitam L-Asp-D-AlaNH 2 Słodki Słodkie peptydy lizynowe N-Ac-PheLys; N-Ac-Gly-Lys Słodki Aminomalonowe peptydy D-Ama-L-PheOMe Słodki D-Ama-L-Phe-OEt Peptydy białka sojowego Gly-Leu, Phe-Leu, Leu-Phe, Gorzki Leu-Lys, Arg-Leu, Arg-Leu-Leu Peptydy sera Lys-Pro, Phe-Pro, Gorzki Val-Pro, Leu-Pro γ- glutamylowe peptydy Glu-γ-Gly, Glu-γ-Ala, Kwaśny / Cierpki Glu-γ-Glu Hydrolizaty białek ryb Glu-Glu, Ser-Glu-Glu, Umami Glu-Ser, Thr-Glu, Glu-Asp, Asp-Glu-Ser Kwaśne peptydy Gly-Asp, Gly-Asp-Gly, Umami Ala-Glu, Ala-Glu-Ala, Val-Glu-Val, Glu-Leu Zasadowe peptydy Orn-Tau x HCl, Lys-Tau x HCl, Słony / Umami Orn-Gly x HCl, Lys-Gly x HCl Peptydy buforujące Gly-Leu, Pro-Glu, Intensyfikatory smaku Val-Glu, β-ala-his Oligomery Glu Glu-Glu, Glu-Glu-Glu Maskujące goryczkę Hydrolizaty białkowe mogą być źródłem peptydów o wielu innych właściwościach (tab. 7) m.in. peptydów o działaniu opioidowym, gdzie charakterystyczna sekwencja zaczyna się od tyrozyny, peptydów wpływających na system immunologiczny, peptydów wpływających na proces krzepnięcia krwi i hamujących aktywność chymozyny, peptydów inhibitorów niektórych proteaz ustrojowych i bakteryjnych silnym peptydowym inhibitorem pepsyny i chymozyny jest występująca naturalnie pepstatyna A i jej syntetyczne analogi (Stepaniak, 1996). 47

48 Tabela 7. Przykłady peptydów o określonym działaniu (wg Obrycka, 1998; Dziuba, 1997) Działanie Peptyd Pochodzenie Antybiotyki i czynniki antywirusowe Neuroaktywne peptydy Regulatory i inhibitory enzymów: a) peptydy o działaniu przeciwnadciśnieniowym Phe-Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Asn- Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala- Pro-Ser-Ile-Thr-Cys-Val-Arg- Arg-Ala-Thr Pro-Pro-Gly-Pro Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro- Ile-Pro-Asn-Ser-Leu Gly-Glu Thr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser- Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu- Val-Thr-Leu-Phe-Lys-Asn-Ala- Ile-Ile-Lys-Asn-Ala-Tyr-Lys-Lys-Gly-Glu Val-Leu-Pro Ala-Ala-Pro Pro-Leu-Pro Leu-Gln-Pro Pro-Tyr-Pro Ile-Pro-Pro Leu-Val-Leu Val-Ala-Pro Val-Arg-Pro Leu-Arg-Pro Leu-Ser-Pro Phe-Ala-Pro Białka mleka Kolagen kurcząt Białka mleka Mięso kurcząt β-endorfina człowieka Mięso kurcząt Mięso kurcząt Mięso kurcząt Białka zapasowe nasion Białka zapasowe nasion Białka zapasowe nasion Białka zapasowe nasion i mięso kurcząt Białka zapasowe nasion i mięso kurcząt Białka zapasowe nasion i mięso kurcząt Białka zapasowe nasion Białka zapasowe nasion Białka zapasowe nasion b) peptydy o działaniu przeciwzakrzepowym i hamujące aktywność chymozyny Arg-Gly-Asp Gly-Pro-Arg Gly-Pro-Arg-Gly Gly-Pro-Arg-Gly-Pro Lys-Arg-Asp-Ser Mięso kurcząt Mięso kurcząt Mięso kurcząt Mięso kurcząt Białka zapasowe nasion 48

49 11. Cel pracy Wykorzystanie odpadowych surowców przemysłu rybnego takich jak: skóry, głowy i kręgosłupy jako źródła pełnowartościowych białek mięśniowych, kolagenu i żelatyny to nie tylko zmniejszenie ilości uciążliwych dla środowiska odpadów, czy też bardziej racjonalne ich wykorzystanie, ale otrzymanie wartościowych produktów, które mogą znaleźć wielorakie zastosowanie. Białka mięśniowe mogą być użyte do wzbogacania w składniki białkowe niektórych produktów żywnościowych, otrzymywania biologicznie aktywnych peptydów, czy też wykorzystane łącznie z żelatyną czy kolagenem do wytwarzania biodegradowalnych opakowań a przez to stworzenie możliwości zmniejszenia ilości odpadowych opakowań z tworzyw sztucznych. Kolagen natomiast ma szerokie zastosowanie w wielu gałęziach przemysłu m.in. spożywczym, skórzanym, biomedycznym farmaceutycznym, fotograficznym (Ogawa i inni., 2004). W ostatnim czasie ukazały się publikacje dotyczące prób zastosowania rybiego kolagenu i żelatyny do wytwarzania opakowań biodegradowalnych (Tylingo, 2006; Sztuka i Kołodziejska, 2007; Piotrowska i inni, 2007). Dodatkową zaletą kolagenu i żelatyny z ryb jest ich bezpieczeństwo zdrowotne, gdyż nie stwarzają one zagrożeń jakie przypisuje się produktom pochodzenia bydlęcego. Jest to również bardzo istotne w przypadku materiałów opakowaniowych, które mają kontakt z żywnością. Kręgosłupy dorsza bałtyckiego (Gadus morhua) otrzymane w wyniku filetowania ryb są cennym surowcem do otrzymywania pełnowartościowych białek mięśniowych oraz kolagenu. W dostępnym piśmiennictwie brak jest informacji odnośnie kompleksowego zagospodarowania kręgosłupów innego niż produkcja mączki rybnej. W ramach rozprawy doktorskiej postawiono za cel opracować proces technologiczny pozyskiwania białek mięśniowych i kolagenu z kręgosłupów oraz przeprowadzić fizykochemiczną charakterystykę wydzielonych białek. Izolację białek niekolagenowych postanowiono przeprowadzić dwiema metodami: przez wyczerpującą ekstrakcję nieorganicznymi rozpuszczalnikami: 5 % NaCl i/lub 0,1 M NaOH lub na drodze enzymatycznej hydrolizy trypsyną lub alkalazą. Otrzymuje się w ten sposób rozcieńczone roztwory białek mało przydatne w praktycznym wykorzystaniu, dlatego należy określić najlepsze warunki strącania białek z roztworu poprzez zamianę ph. Aby określić potencjalne zatasowanie preparatu białek mięśniowych wymagane jest zbadanie również ich właściwości funkcjonalnych. Natywny nie zanieczyszczony kolagen z kręgosłupów dorsza można otrzymać dopiero po uprzednim usunięciu z nich soli mineralnych, gdyż pogarszają one właściwości preparatów kolagenowych. Związki mineralne najczęściej wydziela się za pomocą roztworu HCl lub EDTA otrzymując w ten sposób oseinę (Nagai i Suzuki, 2000; Kittiphattanabawon i inni, 49

50 2005). Kolejnym etapem realizacji celu badań było ustalenie najlepszych parametrów ekstrakcji kolagenu z oseiny 0,5 M roztworem kwasu octowego. Kolagen kości jest trudno rozpuszczalny, dlatego postanowiono zbadać również wpływ obróbki enzymatycznej pepsyną na rozpuszczalność kolagenu z oseiny. Pepsyna odcinając telopeptydy usuwa wiązania sieciujące, przez co zwiększa rozpuszczalność kolagenu. Podobnie jak w przypadku białek mięśniowych roztwór kolagenu miał by ograniczone zastosowanie, dlatego należałoby ustalić warunki rekonstytucji kolagenu. Do tego celu stosuje się sole obojętne, glikozaminoglikany lub kwaśne polisacharydy. Zastosowanie zwierzęcych glikozaminoglikanów jest ekonomicznie nieopłacalne ze względu na małą ich zawartość w tkance łącznej i duży koszt ich otrzymywania. Bardzo dobre wyniki rekonstytucji włókien kolagenowych z roztworu uzyskuje się κ-karagenem i dlatego wybrano ten polisacharyd. Kolagen kręgosłupów jest mało poznanym białkiem dlatego należało by zbadać również jego właściwości fizykochemiczne oraz kompleksu kolagenowo-karagenowgo. 50

51 12. Materiały i postępowanie doświadczalne Materiały Materiałem do badań były kręgosłupy dorsza bałtyckiego (Gadus morhua), uzyskane po mechanicznym filetowaniu. Kręgosłupy rozdrobniono w wilku o średnicy oczek siatki = 0,5 cm. Materiał dokładnie wymieszano, podzielono na porcje o masie ok. 0,5 kg i przechowywano w woreczkach polietylenowych w temp. 18 C. Stosowano trypsynę z trzustki wieprzowej firmy Fluka o aktywności 95 U/mg, alkalazę firmy Novo Industri A/S o aktywności 1,5 U/g oraz pepsynę firmy Fluka o aktywności 766 U/mg. Do strącania kolagenu z roztworu stosowano κ-karagen firmy Fluka BioChemika Wydzielanie białek mięśniowych z kręgosłupów dorsza bałtyckiego Ekstrakcja białek Białka mięśniowe ekstrahowano z kręgosłupów roztworami 5 % NaCl i/lub 0,1 M NaOH zgodnie ze schematem przedstawionym na rys. 11. Stosunek surowca do rozpuszczalnika wynosił: 1 : 2, 1 : 4, 1 : 6, 1 : 8, 1 : 10 i 1 : 12 (w : v). Stosowano trzy różne warianty ekstrakcji. Surowiec traktowano w pierwszym etapie 5 % roztworem NaCl, a następnie 0,1 M roztworem NaOH, w pierwszym i drugim etapie 5 % roztworem NaCl lub w dwóch kolejnych etapach roztworem 0,1 M NaOH. W ekstraktach, po pierwszym i po drugim etapie oznaczano zawartość białek mięśniowych i hydroksyproliny. Zbadano również wpływ przechowywania zamrażalniczego przez okres ok. 5 miesięcy na wydajność ekstrakcji białek niekolagenowych przy stosunku surowca do rozpuszczalnika 1 : 2, dla wszystkich wariantów ekstrakcji. Określono także jak zmieni się wydajność ekstrakcji białek w 0,1 M roztworze NaOH po zastosowaniu mieszania przy stosunku surowca do rozpuszczalnika 1 : 2; 1 : 4; 1 : 8 (w : v). Próby mieszano przez 15 lub 30 min przy 300 obr/min, następnie wirowano przez 20 min przy x g. W supernatancie oznaczano ilość uwolnionych białek, natomiast osad zalewano nową porcją zasady i ponownie mieszano. Wyniki wyrażone są jako procent wyekstrahowanego białka i kolagenu w stosunku do całkowitej ich zawartości w kręgosłupach. Wszystkie doświadczenia wykonano w trzech oddzielnych powtórzeniach. 51

52 Kręgosłupy dorsza bałtyckiego 0,1 M NaOH lub 5 % NaCl Homogenizacja 2 min, obr/min, 4 o C Ekstrakcja 24 h, 4 o C Wirowanie 20 min, x g, 4 o C Ekstrakt I 0,1 M NaOH lub 5 % NaCl Homogenizacja 2 min, obr/min, 4 o C Ekstrakcja 24 h, 4 o C Wirowanie 20 min, x g, 4 o C Osad Ekstrakt II Rysunek 11. Schemat ekstrakcji białek mięśniowych kręgosłupów dorsza bałtyckiego Hydroliza enzymatyczna białek Białka mięśniowe kręgosłupów dorsza hydrolizowano wg schematu przedstawionego na rys. 12. Stosowano trypsynę lub alkalazę w stężeniach: 2,5; 5; 10; 15; 20; 30; 40 mg/g surowca. Enzymy rozpuszczano w wodzie w takiej objętości, aby stosunek surowca do rozpuszczalnika wynosił: 1 : 2, 1 : 6 i 1 : 10 (w : v). Próby homogenizowano przez 2 min przy 4 tys. obr/min. Czas hydrolizy enzymatycznej wynosił 24 lub 48 h. Po tym czasie mieszaninę odwirowano, osad odrzucano, natomiast w ekstrakcie oznaczano zawartość białka ogółem. Reakcja przebiegała w środowisku obojętnym. Dodatkowo określono wydajność hydrolizy enzymatycznej w zależności od temp. i czasu. Hydrolizę prowadzono w temp. 4, 10 i 36 o C. 52

53 Stosunek surowca do rozpuszczalnika wynosił 1 : 2 (w : v), a stężenie enzymu 30 mg/g surowca. Wyniki wyrażone są stopniem rozpuszczalności białka. Stopień ekstrakcji białek [%] wyznaczano ze wzoru: Stopień hydrolizy = A / B x 100% gdzie: B stężenie białek mięśniowych w mieszaninie reakcyjnej, A stężenie produktów enzymatycznej hydrolizy białek w ekstrakcie. Przeprowadzono po trzy oddzielne doświadczenia dla każdego z wariantów hydrolizy. Kręgosłupy dorsza bałtyckiego Wodny roztwór trypsyny lub alkalazy 2,5-40 mg/g surowca Homogenizacja 2 min, 4 C Hydroliza 24 lub 48h, 4 C Wirowanie 20 min, xg,4 C Osad Ekstrakt Rysunek 12. Schemat procesu technologicznego wydzielania białek mięśniowych z kręgosłupów Demineralizacja kręgosłupów Demineralizacja EDTA Demineralizację kręgosłupów dorsza przeprowadzono zgodnie ze schematem przedstawionym na rys. 13. Proces prowadzono przy użyciu 0,1 oraz 0,5 M roztworu EDTA o ph 7,5. Surowiec mieszano z roztworem EDTA w stosunku 1 : 5 (w : v). Czas demineralizacji wynosił 24 lub 48 h bez przerwy oraz w cyklach 24 h każdorazowo ze świeżą porcją roztworu EDTA przez 48, 72 i 96 h. 53

54 W osadach po filtracji oznaczano zawartość suchej masy oraz popiołu. W supernatantach określono straty kolagenu poprzez oznaczenie zawartości w nich hydroksyproliny. Oznaczano również ph roztworów po 24 h demineralizacji. Wszystkie badania wykonano w pięciu niezależnych powtórzeniach. Kręgosłupy dorsza bałtyckiego pozbawione tkanki mięśniowej 0,1 M roztwór EDTA lub 0,5 M roztwór EDTA 5 : 1 (v : w) Homogenizacja 2 min, obr/min, 4 o C 1 4 x Demineralizacja 24 h lub 48 h, 4 C Filtracja 4 C Roztwór związków mineralnych Oseina Rysunek 13. Schemat technologiczny demineralizacji kręgosłupów dorsza bałtyckiego roztworem EDTA Demineralizacja kwasem solnym Demineralizację kręgosłupów dorsza bałtyckiego pozbawionych tkanki mięśniowej przeprowadzono przy użyciu roztworów kwasu solnego o stężeniach: 0,1, 0,5 oraz 1,0 M. Proces przeprowadzono zgodnie ze schematem przedstawionym na rys. 14. Stosunek surowca do roztworu kwasu solnego wynosił 1 : 5 (w : v). Próby inkubowano przez 24 lub 48 h bez przerwy oraz 48 lub 72 h, zmieniając porcję kwasu na świeżą co 24 h. Proces był prowadzony w temp. 4 C bez mieszania. Dodatkowo demineralizację kręgosłupów w 1,0 M roztworze HCl prowadzono przy stosunku surowca do rozpuszczalnika 1 : 3 i 1 : 7 bez mieszania oraz przy stosunku 1 : 3; 54

55 1 : 5; 1 : 7, mieszając próby dwukrotnie przy 300 obr/min przez 0,5; 1 lub 2 h każdorazowo z nową porcją kwasu. Kręgosłupy dorsza bałtyckiego pozbawione tkanki mięśniowej 0,1 M roztwór HCl lub 0,5 M roztwór HCl lub 1,0 M rozwór HCl 5 : 1 (v : w) Homogenizacja 2 min, obr/min, 4 o C 1 3 x Demineralizacja 24 lub 48 h, 4 C Filtracja 4 C Roztwór związków mineralnych Oseina Rysunek 14. Schemat technologiczny demineralizacji kręgosłupów dorsza bałtyckiego roztworem HCl Po demineralizacji roztwory filtrowano przez bawełnianą tkaninę. Nie można było zastosować wirowania, ponieważ nie uzyskano wyraźnego podziału między osadem a supernatantem. W osadach i supernatantach po demineralizacji wykonano identyczne oznaczenia jak w przypadku demineralizacji EDTA. Wszystkie badania zrealizowano w pięciu niezależnych powtórzeniach. Płukanie oseiny W celu usunięcia pozostałości 1,0 M roztworu HCl kręgosłupy po procesie maceracji płukano zimną bieżącą wodą. Oseinę zalewno wodą i następnie mieszano przez 1 h w łaźni lodowej. Po określonym czasie mierzono ph układu, próbę odsączano i pozostałość zalewano kolejną porcją wody. Proces powtarzano sześciokrotnie. Po każdym etapie w roztworach oznaczano stężenie hydroksyproliny w celu określenia strat kolagenu w trakcie płukania. 55

56 12.4. Otrzymywanie preparatu białek mięśniowych Określenie zmian rozpuszczalności mieszaniny białek sarkoplazmatycznych i miofibrylarnych względem ph Ekstrakt białek mięśniowych o ph doprowadzano 1 M roztworem HCl do ph w zakresie 2,0 6,5 co 0,5 jednostki mieszając próby w łaźni lodowej, celem uniknięcia denaturacji białek. ph kontrolowano w sposób ciągły. Próbę odniesienia stanowił roztwór białek mięśniowych o ph Wszystkie próby uzupełniono wodą destylowaną do jednakowej objętości. Strącony osad białek oddzielano przez wirowanie 20 min, przy x g, w temp. 20 o C. Supernatanty filtrowano i oznaczano w nich zawartość białka. Ilość białek niestrąconych wyrażono jako procent wyjściowej zawartości białka w próbie: R = A / B x 100 gdzie: R - ilość białek niestrąconych [%], A - stężenie białka w supernatancie [mg/cm 3 ], B - stężenie białka w próbie odniesienia [mg/cm 3 ]. Otrzymywanie mączki białkowej Preparat białkowy otrzymywano przez strącenie białek w wyznaczonym pi. Następnie osad białek odwirowano przy x g przez 20 min w 20 o C i suszono w temp. 25 o C. Wysuszone białka rozcierano w moździerzu do postaci proszku. W tak otrzymanej mączce białkowej oznaczono suchą masę, zawartość kolagenu oraz białka ogółem oraz skład aminokwasowy Określenie właściwości funkcjonalnych mączki białek mięśniowych Wszystkie oznaczenia właściwości funkcjonalnych preparatów białek mięśniowych wykonano w trzech oddzielnych powtórzeniach. Rozpuszczalność białek Badano rozpuszczalność 2 % roztworu preparatu białkowego w zależności od ph (2-12) i siły jonowej (0; 0,35; 0,7). Próby doprowadzano do odpowiedniego ph 1 M roztworem NaOH i 1 M roztworem HCl. Dla zapewnienia pożądanej siły jonowej użyto NaCl. Po osiągnięciu właściwych parametrów, próby mieszano 30 min w temp. pokojowej mieszadłem magnetycznym. Następnie mieszaninę sączono, a w przesączach oznaczano 56

57 zawartość białka metodą Lowry ego (Lowry i inni, 1951). Rozpuszczalność (%) preparatu białkowego obliczono ze wzoru: X = (A / B) 100% gdzie: B wyjściowe stężenie białka [mg/cm 3 ], A stężenie białka w przesączu [mg/cm 3 ] Zdolność pienienia (FC) i stabilność piany (FS) 2% roztwór preparatu białkowego o odpowiednim ph (2-12) i sile jonowej (0; 0,35; 0,7) mieszano przez 30 min w temp. pokojowej po czym mierzono objętość roztworu. Następnie próbki homogenizowano ( obr/min) przez 3 min i po 60 s mierzono objętość powstałej piany. W celu oznaczenia stabilności powstałej piany mierzono objętość piany po upływie 10, 20 i 30 min od homogenizacji (Aruna i inni, 1993). Zdolność pienienia obliczono ze wzoru: FC = (V 1 / V) 100% gdzie: V objętość roztworu przed homogenizacją [cm 3 ], V 1 objętość piany po upływie 60 s po homogenizacji [cm 3 ] Stabilność piany (%) obliczono ze wzoru: FS = (V 2 / V 1 ) 100% gdzie: V 2 objętość piany po upływie 10, 20 i 30 min po homogenizacji [cm 3 ], V 1 objętość piany po upływie 60 s po homogenizacji [cm 3 ] Zdolność utrzymywania wody (WHC) Do 5 g preparatu białkowego dodano 40 cm 3 wody i mieszano mieszadłem magnetycznym przez 30 min. Zawiesinę przeniesiono ilościowo na sączek umieszczony w zestawie do sączenia pod próżnią. Mieszaninę sączono pod próżnią do momentu usunięcia wody. Następnie sączek wraz z osadem ważono na wadze analitycznej. Sączek o masie równej masie sączka, na którym sączono osad nasycono wodą. Nadmiar nie wchłoniętej przez sączek wody usunięto pod próżnią, po czym sączek zważono na wadze analitycznej. Zdolność wiązania wody (g wody / g białka ) obliczano z zależności: WHC = [(m s + o m s - m n ) / m n ] 100% gdzie: 57

58 m s masa sączka mokrego [g], m s + o masa sączka mokrego wraz z mokrym osadem [g], m n masa naważki białka [g] Zdolność wiązania oleju Do 5 g preparatu białkowego dodano 40 cm 3 oleju rzepakowego i dalej postępowano analogicznie jak w punkcie zdolność utrzymania wody. Zdolność żelowania Roztwory białka o stężeniu 4, 6, 7 i 8 % o ph 10 poddano w probówkach ogrzewaniu do temp. 70 ºC, po czym przeniesiono do lodu na 15 min. Po schłodzeniu próby przechylano w celu sprawdzenia zestalenia się roztworów. Próby uznano za zżelowane, gdy zawartość probówki nie przemieszczała się po jej przechylaniu Ekstrakcja kolagenu z kręgosłupów dorsza bałtyckiego Ekstrakcję kolagenu ze zdemineralizowanych kręgosłupów dorsza bałtyckiego prowadzono wg schematu przedstawionego na rys. 15. Oseinę mieszano lub homogenizowano z 0,5 M roztworem kwasu octowego w stosunku surowiec : rozpuszczalnik 1 : 4, 1 : 6, 1 : 8 (w : v). Pepsynę stosowano w stężeniach: 1,5; 2,5; 4; 6; i 8 mg/g surowca. Próby inkubowano w temp. 4 ºC przez 24, 48 lub 72 h. Następnie mieszaninę wirowano przez 20 min przy x g. Osad po ekstrakcji ponownie mieszano z kwasem z dodatkiem pepsyny lub bez w/w stosunkach. Czynność powtarzano do trzech razy. W supernatantach oznaczono zawartość hydroksyproliny w celu określenia stopnia rozpuszczalności kolagenu. Wyniki wyrażone są, jako procent wyekstrahowanego kolagenu w stosunku do jego całkowitej zawartości w oseinie. Wszystkie oznaczenia wykonano w trzech niezależnych powtórzeniach. 58

59 Oseina 0,5 M roztwór CH 3 COOH, pepsyna Mieszanie / Homogenizacja 5 lub 15 min, obr/min, 4 o C 1 3 x Ekstrakcja 24, 48 lub 72 h, 4 C Wirowanie 20 min, x g 10 C, Osad Roztwór kolagenu Rysunek 15. Schemat technologiczny otrzymywania ekstraktu kolagenu z oseiny Właściwości fizykochemiczne preparatu kolagenowego Wszystkie badania właściwości fizykochemicznych preparatu kolagenowego wykonano w trzech niezależnych powtórzeniach. Wyznaczenie temperatury denaturacji preparatu kolagenowego po liofilizacji Temp. denaturacji wyznaczona została metodą wiskozymetryczną (w wiskozymetrze Brookfield a - model DV-III+ z przystawką do małych objętości, sterowanym komputerowo za pomocą programu Rheocalo ). Sporządzono 2 % roztwór preparatu kolagenowego i mierzono lepkość w zakresie temp. od 4 C do 25 C przy szybkości ścinania 17 s -1 używając wrzeciono SC

60 Wyznaczenie przelicznika hydroksyproliny na kolagen Roztwór kolagenu otrzymany po ekstrakcji kwasem octowym umieszczono w woreczkach dializacyjnych i zanurzono w wodzie redestylowanej do czasu uzyskania ph 5,5. W oczyszczonym preparacie oznaczono zawartość suchej masy oraz zawartość hydroksyproliny, na podstawie których wyznaczono przelicznik hydroksyproliny na kolagen. Rekonstytucja włókien kolagenowych z roztworu karagenem Przygotowano 3 serie roztworów kolagenu w 0,5 M kwasie octowym o stężeniu: 2; 1,5; 1 i 0,5 %. Roztwory kolagenu i 0,5 % roztwór κ-karagenu w 0,5 M kwasie octowym mieszano w stosunku 1 : 1 mieszadłem magnetycznym przez 5 min. Następnie próby odwirowano przy x g w 4 C w czasie 20 min. W supernatancie oznaczano pozostałość niestrąconego kolagenu metodą Lowry ego. Wyniki przedstawiono jako procent strąconego kolagenu w stosunku do jego początkowej zawartości w próbie. Wpływ ph i stężenia soli na rozpuszczalność preparatu kolagenowo-karagenowego Zbadano rozpuszczalność preparatu kolagenowo-karagenowego w zależności od ph i stężenia soli. Przygotowano 3 serie próbek o stężeniu preparatu 0,5 %. Naważkę kolagenu rozpuszczano w odpowiedniej objętości uniwersalnego buforu Brittona i Robinsona (Wierzbicki i Zgirski, 1999) o ustalonym ph w zakresie od 2 do 9 i stężeniu soli od 0 do 3 %. Tak przygotowane próby mieszano przez 30 min przy 300 obr/min w temp. 4 ºC. Następnie mieszaninę wirowano przy x g obr/min przez 20 min. W supernatantach oznaczono zawartość hydroksyproliny i przeliczono na kolagen. Wyniki wyrażono, jako procent rozpuszczonego kolagenu Ekstrakcja żelatyny z kręgosłupów dorsza bałtyckiego Surowiec ogrzewano w wodzie w stosunku 1 : 6 (w : v) w czasie od 15 do 120 min w temp. 45, 70 i 100 C. Po określonym czasie próby wirowano przez 20 min przy x g w temp. 10 C. W supernatantach oznaczono zawartość hydroksyproliny wskaźnika cieplnie rozpuszczonego kolagenu. Wyniki wyrażono jako procent rozpuszczonego kolagenu w stosunku do jego zawartości w surowcu. 60

61 12.9. Metody analityczne Suchą masę oznaczano metodą suszarkową susząc materiał do stałej masy w temp. 105 C. Popiół oznaczano metodą wagową, polegającą na spaleniu próbki w porcelanowych tyglach na palniku, a następnie jej mineralizacji do uzyskania stałej masy w piecu muflowym w temp. 600 o C. Zawartość azotu ogółem oznaczano metoda Kjeldahla wg PN-75/A Stosowano przelicznik azotu na białko równy 6,25 wg Rogackiej (2000). Zawartość białka w hydrolizatach oznaczono metodą Lowry ego (Lowry i inni, 1951). Hydroksyprolinę oznaczano kolorymetrycznie metodą zalecaną przez ISO (Anonimowo, 1978) po 6 h hydrolizie próby w roztworze 6 M kwasu solnego. Zastosowano przelicznik hydroksyproliny na kolagen równy 15,7, który ustalono w trakcie wykonywanych badań. Elektroforezę produktów enzymatycznej hydrolizy białek oraz kolagenu prowadzono wg Bollag i Edelstein (1999) w aparacie firmy Biometria stosując 5 % żel SDS-poliakryloamidowy zagęszczający i 15 % żel rozdzielający. Na żel nanoszono 10 μl próby o stężeniu od 10 do 30 μg/μl. Rozdział prowadzono przez ok. 0,5 h przy napięciu 70 mv i następnie przez ok. 1 h przy napięciu 150 mv. Próby były termostatowane przez 5 min w temp. 60 C w buforze Tris-HCl o ph 6,8. Rozdzielone produkty enzymatycznej hydrolizy w żelu poliakryloamidowym barwiono w Coomassine Brilliant Blue R 250, przez 0,5 h. Żele odbarwiano wg Webera i Osborna (1969). Stosowano wzorce masy białek firmy Fermentas o masach: 66,2 kda (surowica albuminy wołowej plazmy); 45,0 kda (owoalbumina z białka kurzego jaja); 35,0 kda (dehydrogenaza laktozowa z mięśni); 25,0 kda (E. coli RE Bsp981); 18,4 kda (β-laktoglobulina z mleka krowiego); 14,4 kda (lizozym z białka jaja kurzego) Analiza statystyczna Wyniki przedstawione w tabelach i na wykresach są średnią z trzech do sześciu oddzielnych doświadczeń ± odchylenie standardowe. Istotność różnic (P < 0,05) pomiędzy próbami określano testem Duncana. 61

62 13. Wyniki i dyskusja wyników Skład podstawowy kręgosłupów dorsza bałtyckiego Udział poszczególnych składników (tab. 8) jest podobny do składu podstawowego kręgosłupów dorsza przedstawionego przez Gildberg a i innych (2002). Stosowali oni jako surowiec rozdrobnione kręgosłupy dorsza i uzyskali następujące wyniki: białko ogółem 15,3 %, popiół 6,3 % i sucha masa 22,1 %. Zawartość kolagenu w badanych kręgosłupach jest przybliżona do wyników uzyskanych przez Szynalewską (2000). Tabela 8. Skład podstawowy kręgosłupów dorsza Składnik Zawartość [%]* białko ogółem (N og x 6,25) kolagen (Hyp x 15,7) 16,7 ± 0,97 5,5 ± 0,26 popiół 6,2 ± 0,28 sucha masa 22,0 ± 0,28 * - wyniki przedstawione w tabeli stanowią wartość średnią z sześciu oznaczeń ± odchylenie standardowe Ekstrakcja białek mięśniowych z kręgosłupów nieorganicznymi rozpuszczalnikami Wpływ parametrów ekstrakcji na rozpuszczalność białek mięśniowych Stosunek surowca do rozpuszczalnika w badanym zakresie nie ma wpływu na wydajność ekstrakcji białek 5 % roztworem NaCl oraz roztworami 5 % NaCl i/lub 0,1 M NaOH (rys. 16, 17, 18). Niewielkie różnice w ilości wyekstrahowanych białek mieszczą się w granicy błędu oznaczeń. W przypadku dwukrotnej ekstrakcji roztworem 0,1 M NaOH spadek rozpuszczalności białek mięśniowych przy stosunkach 1 : 8, 1 : 10 i 1 : 12 podczas drugiej ekstrakcji wynika ze zmian denaturacyjnych białek. Zmiany te zaszły w trakcie ośmiomiesięcznego przechowywania zamrażalniczego surowca (rys. 18). 62

63 % wyekstrahowanego białka % wyekstrahowanego białka : 2 1 : 4 1 : 6 1 : 8 1 : 10 1 : 12 stosunek surowiec : rozpuszczalnik (w : v) Rysunek 16. Wpływ krotności ekstrakcji oraz stosunku surowca do rozpuszczalnika na wydajność ekstrakcji białek mięśniowych; - pierwsza ekstrakcja 24 h; 5 % roztwór NaCl, - druga ekstrakcja 24 h; 5 % roztwór NaCl : 2 1 : 4 1 : 6 1 : 8 1 : 10 1 : 12 stosunek surowiec : rozpuszczalnik (w : v) Rysunek 17. Wpływ krotności ekstrakcji oraz stosunku surowca do rozpuszczalnika na wydajność ekstrakcji białek mięśniowych; - pierwsza ekstrakcja 24 h; 5 % roztwór NaCl, - druga ekstrakcja 24 h; 0,1 M roztwór NaOH 63

64 % wyekstrahowanego białka : 2 1 : 4 1 : 6 1 : 8 1 : 10 1 : 12 stosunek surowiec : rozpuszczalnik (w : v) Rysunek 18. Wpływ krotności ekstrakcji oraz stosunku surowca do rozpuszczalnika na wydajność ekstrakcji białek mięśniowych; - pierwsza ekstrakcja 24 h; 0,1 M roztwór NaOH, - druga ekstrakcja 24 h; 0,1 M roztwór NaOH Krotność ekstrakcji wpływa na ilość wyizolowanych białek. W procesie, gdzie surowiec traktowano wyłącznie 5 % roztworem NaCl (rys. 16), w czasie 24 h wyekstrahowano ok. 25 % białek mięśniowych, natomiast podczas drugiej ekstrakcji jedynie 5 %. Natomiast w wariancie, w którym podczas pierwszych 24 h ekstrahowano białka 5 % roztworem NaCl, a następnie uzyskany osad poddawano działaniu 0,1 M NaOH (rys. 17), lepszą wydajność uzyskano podczas drugiej ekstrakcji. Spowodowane jest to tym, że 0,1 M roztwór NaOH jest lepszym rozpuszczalnikiem białek mięśniowych (Boles i inni, 2000; Sadowska i inni, 2003). W wariancie, w którym białka niekolagenowe ekstrahowano 0,1 M roztworem NaOH (rys. 18), efektywniejsza była pierwsza ekstrakcja, lecz druga ekstrakcja pozwoliła również uzyskać dość dużą ilość białek (od 13 do 29 %). Wpływ rodzaju rozpuszczalnika na rozpuszczalność białek niekolagenowych Lepszym rozpuszczalnikiem białek mięśniowych jest 0,1 M roztwór NaOH (rys. 19). Prowadząc dwukrotną 24 h ekstrakcję maksymalnie zdołano odzyskać 90 % białek niekolagenowych z kręgosłupów dorsza bałtyckiego. Prowadząc proces dwukrotnie przez 24 h w 5 % NaCl zdołano wyizolować zaledwie 30 % białek mięśniowych. Białka z rozdrobnionej skóry kalmara w 5 % roztworze NaCl, w temp. 0 o C rozpuszczają się z podobną bo 35 % wydajnością (Kołodziejska i inni, 1999). W wariancie z użyciem zarówno zasady, jak i roztworu soli, wyekstrahowano ok. 60 % białka. Straty kolagenu były minimalne 64

65 % wyekstrhowanego białka w przypadku każdego z procesów i nie przekraczały 0,4 %, przy czym więcej kolagenu rozpuszczało się w 0,1 M roztworze NaOH (tab. 9) x NaCl NaCl i NaOH 2 x NaOH Rysunek 19. Wpływ rodzaju rozpuszczalnika na wydajność ekstrakcji białek mięśniowych z kręgosłupów; stosunek surowca do rozpuszczalnika 1 : 2 (w : v) - pierwsza ekstrakcja 24 h, - druga ekstrakcja 24 h Tabela 9. Straty kolagenu podczas ekstrakcji białek mięśniowych Stosunek surowiec : roztwór Rozpuszczalność kolagenu* (B/A x100), [%] 2 x 5% NaCl 5% NaCl; 0,1 M NaOH 2 x 0,1 M NaOH 1 : 2 0,15 ± 0,032 0,20 ± 0,040 0,17 ± 0,010 1 : 4 0,15 ± 0,034 0,17 ± 0,041 0,19 ± 0,016 1 : 6 0,14 ± 0,008 0,20 ± 0,010 0,23 ± 0,020 1 : 8 0,17 ± 0,018 0,31 ± 0,026 0,40 ± 0,017 1 : 10 0,16 ± 0,033 0,34 ± 0,046 0,36 ± 0,002 1 : 12 0,18 ± 0,038 0,38 ± 0,070 0,37 ± 0,002 * - wyniki przedstawione w tabeli stanowią wartość średnią ± odchylenie standardowe - A zawartość kolagenu w kręgosłupach; B zawartość kolagenu w ekstraktach Wpływ przechowywania zamrażalniczego na wydajność ekstrakcji białek mięśniowych Podczas przechowywania w temp. 18 o C maleje rozpuszczalność białek, w wyniku ich zmian denaturacyjnych (rys. 20, 21 i 22). Rozpuszczalność białek w 5 % roztworze NaCl zmniejszyła się o ok. 40 % i wynosiła po 5-ciu miesiącach przechowywania zamrażalniczego ok. 30 %, czyli osiągnęła wartość określaną przez Sikorskiego (1992, 1994) jako graniczną. W wyniku zmian denaturacyjnych białka miofibrylarne utraciły rozpuszczalność w 5 % 65

66 % wyekstrahowanego białka % wyekstrahowanego białka roztworze NaCl. Do roztworu przechodzą jedynie białka frakcji sarkoplazamtycznej, które stanowią ok. 30 % ogólnej zawartości białek tkanki mięśniowej. Natomiast w przypadku ekstrakcji 5 % roztworem NaCl i 0,1 M roztworem NaOH rozpuszczalność białek obniżyła się o ok. 30 %. Najmniejsze zmiany w rozpuszczalności białek mięśniowych zaobserwowano po zastosowaniu dwukrotnej ekstrakcji 0,1 M roztworem NaOH (rys. 22), w tym przypadku różnica w wydajności ekstrakcji białek wynosiła ok. 10 % świeży mrożony Rysunek 20. Wpływ przechowywania kręgosłupów dorsza bałtyckiego w temp. 18 o C na rozpuszczalność białek mięśniowych; - pierwsza ekstrakcja 24 h; 5 % roztwór NaCl - druga ekstrakcja 24 h; 5 % roztwór NaCl świeży mrożony Rysunek 21. Wpływ przechowywania kręgosłupów dorsza bałtyckiego w temp. 18 o C na rozpuszczalność białek mięśniowych; - pierwsza ekstrakcja 24 h; 5 % roztwór NaCl - druga ekstrakcja 24 h; 0,1 M roztwór NaOH 66

67 % wyekstrahowanego białka świeży mrożony Rysunek 22. Wpływ przechowywania kręgosłupów dorsza bałtyckiego w temp. 18 o C na rozpuszczalność białek mięśniowych; - pierwsza ekstrakcja 24 h; 0,1 M roztwór NaOH, - druga ekstrakcja 24 h; 0,1 M roztwór NaOH Roztwór wodorotlenku sodu jest lepszym rozpuszczalnikiem białek częściowo zdenaturowanych niż 5 % roztwór NaCl. Potwierdzają to wyniki uzyskane przez Sadowską i innych (2003), gdzie uzyskano całkowitą rozpuszczalność białek niekolagenowych z rozdrobnionej skóry dorsza bałtyckiego poprzez ekstrakcję 0,01 M NaOH i wodą, natomiast 0,45 M NaCl okazał się mniej efektywnym rozpuszczalnikiem białek mrożonych skór. Wpływ mieszania na wydajność ekstrakcji białek mięśniowych Czas ekstrakcji białek mięśniowych z kręgosłupów dorsza bałtyckiego w 0,1 M roztworze NaOH można znacznie skrócić przez zastosowanie mieszania (rys. 23). Mieszając próby przez 15 min rozpuszczono ok. 75 % białek zawartych w surowcu. Po wydłużeniu procesu do 30 min wyekstrahowano dodatkowo zaledwie ok. 10 % białek. Zatem bardziej racjonalne jest zastosowanie dwukrotnej ekstrakcji surowca każdorazowo z nową porcją rozpuszczalnika. Stosując dwukrotne 15 min mieszanie kręgosłupów rozpuszczono całkowicie białka mięśniowe. Sumaryczna wydajność ekstrakcji nieco powyżej 100 % spowodowana jest tym, iż część białek rozpuszczonych podczas pierwszej ekstrakcji jest pułapkowana w osadzie a tym samym zwiększa stężenie białek w drugim supernatancie. Rozpuszczalność białek zmniejsza się ze wzrostem udziału rozpuszczalnika w układzie. Zwiększając udział rozpuszczalnika dwukrotnie (z 1 : 2 do 1 : 4) rozpuszczono 20 % białek mniej. Dalszy wzrost ilości zasady (stosunek 1 : 8) spowodował zmniejszenie ilości odzyskanych białek do 60 %. Wzrost ilości wyekstrahowanych białek wraz ze zmniejszającym się udziałem 67

68 % wyekstrahowanego białka % wyekstrahowanego białka rozpuszczalnika do surowca związany jest ze wzrostem lepkości układu. Próby przygotowane przez zmieszanie surowca i rozpuszczalnika w stosunku 1 : 2 charakteryzowały się znacznie większą lepkością w porównaniu z próbami o dwukrotnie i trzykrotnie większym udziale rozpuszczalnika. Większa lepkość układu sprzyja dalszemu rozdrobnieniu surowca podczas mieszania co powoduje większą wydajność ekstrakcji białek w porównaniu z próbami o stosunku surowca do rozpuszczalnika 1 : 4 oraz 1 : 8. a) : 2 1 : 4 1 : 8 stosunek surowiec : rozpuszczalnik (w : v) b) : 2 1 : 4 1 : 8 stosunek surowiec : rozpuszczalnik (w : v) Rysunek 23. Wydajność ekstrakcji białek mięśniowych 0,1 M NaOH. a) próby mieszane przez 15 min, b) próby mieszane przez 30 min; - pierwsza ekstrakcja, - druga ekstrakcja 68

69 stopieo ekstrakcji [%] Metoda enzymatyczna wydzielania białek mięśniowych Wydajność enzymatycznej hydrolizy białek w zależności od czasu i stężenia enzymów Wraz ze wzrostem stężenia trypsyny i alkalazy w zakresie odpowiednio od 2,5 do 20 mg/g surowca i od 2,5 do 10 mg/g surowca wydajność hydrolizy białek wzrasta (rys. 24, 25 i 26). Zwiększanie stężenia trypsyny powyżej 20 mg/g surowca i alkalazy powyżej 10 mg/g surowca nie jest celowe, gdyż nie powoduje istotnego wzrostu wydajności reakcji. Stosując trypsynę lub alkalazę w stężeniu 2,5 mg/g surowca z kręgosłupów dorsza bałtyckiego można wydzielić odpowiednio ok.: 20 % i 30 % białek mięśniowych, natomiast przy stężeniu 20 mg/g surowca o 40 % więcej w przypadku trypsyny i o ok. 30 % więcej w przypadku alkalazy. Traktując kręgosłupy dorsza bałtyckiego trypsyną lub alkalazą można maksymalnie zhydrolizować odpowiednio ok.: 60 % i 55 % białek mięśniowych. Stopień hydrolizy białka w temp. 4 C nie zależy od czasu trwania reakcji i jest taki sam zarówno po 24 h jak i po 48 h stężenie eznymu [mg/g surowca] Rysunek 24. Wydajność enzymatycznej hydrolizy białek w zależności od czasu i stężenia enzymu, stosunek surowca do rozpuszczalnika 1 : 2 (w : v); - 24 h enzymatyczna hydroliza białek trypsyną, - 48 h enzymatyczna hydroliza białek trypsyną, - 24 h enzymatyczna hydroliza białek alkalazą, - 48 h enzymatyczna hydroliza białek alkalazą 69

70 stopieo ekstrakcji [%] stopieo ekstrakcji % stężenie enzymu [mg/g surowca] Rysunek 25. Wydajność enzymatycznej hydrolizy białek w zależności od czasu i stężenia enzymu, stosunek surowca do rozpuszczalnika 1 : 6 (w : v); - 24 h enzymatyczna hydroliza białek trypsyną, - 48 h enzymatyczna hydroliza białek trypsyną, - 24 h enzymatyczna hydroliza białek alkalazą, - 48 h enzymatyczna hydroliza białek alkalazą stężenie enzymu [mg/g surowca] Rysunek 26. Wydajność enzymatycznej hydrolizy białek w zależności od czasu i stężenia enzymu, stosunek surowca do rozpuszczalnika 1 : 10 (w : v); - 24 h enzymatyczna hydroliza białek trypsyną, - 48 h enzymatyczna hydroliza białek trypsyną, - 24 h enzymatyczna hydroliza białek alkalazą, - 48 h enzymatyczna hydroliza białek alkalazą Stosunek surowca do rozpuszczalnika w przypadku trawienia trypsyną nie ma wpływu na wydajność ekstrakcji. Prowadząc hydrolizę enzymatyczną alkalazą można uzyskać ok. 15 % zwiększenie wydajności procesu przez zwiększenie udziału rozpuszczalnika w stosunku do surowca z 2 : 1 do 10 : 1 (v : w). Działanie takie jednak nie jest celowe gdyż uzyskuje się 70

71 w ten sposób bardzo rozcieńczone roztwory hydrolizatu białka przy stosunkowo nieznacznym wzroście rozpuszczalności białek (rys. 24, 25, 26). Podczas hydrolizy kręgosłupów dorsza trypsyną lub alkalazą rozpuszcza się bardzo mało kolagenu od 0,05 do 0,16 %. Można zatem uznać, że w stosowanych warunkach kolagen jest praktycznie nierozpuszczalny i pozostaje w elementach kostnych (tab. 10, 11). Tabela 10. Straty kolagenu, podczas hydrolizy białek trypsyną Stosunek surowca do rozpu szczalnika czas [h] Rozpuszczalność kolagenu a,b [%] Stężenie enzymu [mg/g surowca] 2, : ,07±0,004 0,08±0,005 0,07±0,004 0,05±0,042 0,08±0,012 0,08±0,011 0,09±0,009 0,13±0,013 0,10±0,016 0,10±0,013 poniżej progu oznaczalności 0,10±0,011 0,09±0,019 1 : ,05±0,003 0,06±0,005 0,05±0,005 0,06±0,004 0,06±0,002 0,07±0,009 0,05±0,004 0,07±0,007 0,07±0,003 0,08±0,009 0,02±0,011 0,09±0,002 0,07±0,004 0,07±0,004 1 : ,11±0,001 0,11±0,004 0,11±0,002 0,11±0,000 0,12±0,001 0,12±0,001 0,13±0,002 0,13±0,003 0,15±0,002 0,14±0,003 0,16±0,002 0,13±0,017 a - Rozpuszczalność kolagenu = A / A 0 x 100 [%] gdzie: A 0 zawartość kolagenu w kręgosłupach A zawartość kolagenu w supernatancie b wyniki są średnią z trzech oddzielnych doświadczeń i trzech powtórzeń ± odchylenie standardowe 0,16±0,005 0,16±0,003 Tabela 11. Straty kolagenu, podczas hydrolizy białek alkalazą Stosunek surowca do rozpu szczalnika czas [h] Rozpuszczalność kolagenu a,b [%] Stężenie enzymu [mg/g surowca] 2, : poniżej progu oznaczalności poniżej progu oznaczalności poniżej progu oznaczalności poniżej progu oznaczalności poniżej progu oznaczalności poniżej progu oznaczalności poniżej progu oznaczalności 1 : ,066±0,004 0,077±0,009 0,070±0,003 0,072±0,010 0,062±0,005 0,071±0,001 0,061±0,005 0,080±0,004 0,095±0,003 0,085±0,002 0,106±0,046 0,101±0,010 0,088±0,002 0,1090,003 1 : ,056±0,016 0,071±0,006 0,073±0,003 0,074±0,004 0,075±0,004 0,073±0,003 0,074±0,008 0,079±0,008 0,079±0,003 0,072±0,007-0,105±0,005 a - Rozpuszczalność kolagenu = A / A 0 x 100 [%] gdzie: A 0 zawartość kolagenu w kręgosłupach A zawartość kolagenu w supernatancie b wyniki są średnią z trzech oddzielnych doświadczeń i trzech powtórzeń ± odchylenie standardowe 0,085±0,011 0,113±0,005 71

72 stopieo ekstrakcji [%] stopieo ekstrakcji [%] Wpływ temperatury i czasu na stopień hydrolizy białek Celem doświadczenia było zbadanie działania enzymów trypsyny i alkalazy w trzech różnych temp. (rys. 27 i 28) czas [h] Rysunek 27. Wydajność ekstrakcji białek mięśniowych trypsyną w zależności od temp. 4 C, 10 C, 36 C czas [h] Rysunek 28. Wydajność ekstrakcji białek mięśniowych alkalazą w zależności od temp., 4 C, 10 C, 36 C Najefektywniej enzymy działały w temp. 36 C. Jest to temp. optymalna dla trypsyny. Optymalna temp. działania alkalazy wynosi 50 C (Shahidi i inni, 1995). Podwyższenie temp. z 4 C do 10 C nie wpływa na wydajność procesu. Stopień hydrolizy białek trypsyną i alkalazą po 3 h jest tylko o ok. 10 % niższy w porównaniu z 24 h hydrolizą. Możliwe, że 72

73 taki sam stopień hydrolizy, który osiągnięto po 24 h można uzyskać w krótszym czasie, lecz dłuższym niż 3 h. Wszystkie badania prowadzono w temp. 4 C. Trypsyna i alkalaza są enzymami nieswoistymi dla kolagenu i działają jedynie na jego formę zdenaturowaną. Kolagen ulega denaturacji w temp. nieco powyżej 10 C, dlatego też była zastosowana tak niska temp. aby otrzymać z kręgosłupów natywne białko. Elektroforetyczna charakterystyka hydrolizatów białkowych Celem przeprowadzenia charakterystyki elektroforetycznej było sprawdzenie skuteczności hydrolizy enzymatycznej białek. Równocześnie przygotowano próbę odniesienia, homogenizując surowiec przez 2 min z wodą destylowaną. Masy cząsteczkowe i ilość produktów hydrolizy enzymatycznej nie zależą od czasu reakcji i są takie same po 24 i 48 h zarówno dla trypsyny jak i alkalazy (rys. 29). 66,2 kda 45,0 kda 35,0 kda 25,0 kda 18,4 kda 14,4 kda M Rysunek 29. Elektroforetyczna charakterystyka uzyskanych hydrolizatów białkowych M wzorce masy białek; 1 48 h hydroliza alkalazą, 40 mg enzymu/g surowca, 2 24 h hydroliza alkalazą, 40 mg enzymu/g surowca, 3 48 h hydroliza alkalazą, 2,5 mg enzymu/g surowca, 4 24 h hydroliza alkalazą, 2,5 mg enzymu/g surowca, 5 48 h hydroliza trypsyną, 40 mg enzymu/g surowca, 6 24 h hydroliza trypsyną, 40 mg enzymu/g surowca, 7 48 h hydroliza trypsyną, 2,5 mg enzymu/g surowca, 8 24 h hydroliza trypsyną, 2,5 mg enzymu/g surowca, 9 próba odniesienia Stosując trypsynę w stężeniu 2,5 mg/g surowca można wyekstrahować jedynie frakcję białek sarkoplazmatycznych. Po zastosowaniu alkalazy o tym samym stężeniu w hydrolizacie znajdują się głównie produkty hydrolizy białek o masie cząsteczkowej mniejszej niż 35 kda. Trudno się jednak ustosunkować czy są to już produkty hydrolizy białek sarkoplazmatycznych czy/i miofibrylarnych, ponieważ masy cząsteczkowe tych białek 73

74 mieszczą się w szerokim zakresie od 18 do 2800 kda (Sikorski, 1980). Ze wzrostem stężenia enzymów maleje wielkość produktów i zwiększa się ilość produktów hydrolizy. Wzrost stężenia trypsyny do 40 mg/g surowca powoduje zwiększenie udziału produktów o masie cząsteczkowej poniżej 45 kda i 14,4 kda. Po zastosowaniu alkalazy o tym samym stężeniu, w hydrolizacie znajdują się tylko produkty o masie cząsteczkowej poniżej 14,0 kda. Różnice stopnia hydrolizy białek spowodowane są różną częstotliwością występowania w białkach miejsc restrykcyjnych specyficznych dla alkalazy i trypsyny. Wielkość produktów hydrolizy enzymatycznej można zatem regulować stężeniem i rodzajem zastosowanego enzymu. Efektywność usuwania tkanki mięśniowej z kręgosłupów dorsza bałtyckiego 0,1 M roztworem NaOH Po wyekstrahowaniu białek tkanki mięśniowej zawartość białka ogółem w suchej masie kręgosłupów oraz zawartość kolagenu są do siebie zbliżone, co świadczy o prawie 100 % skuteczności procesu rozpuszczania białek niekolagenowych w 0,1 M roztworze NaOH (tab. 12). Zawartość popiołu w suchej masie surowca wynosi ok. 28 %, natomiast w wyniku odbiałczania ilość ta wzrasta do ok. 41 %. Tabela 12. Skład podstawowy kręgosłupów dorsza bałtyckiego po wydzieleniu tkanki mięśniowej Składnik Udział w suchej masie [%]* Białko (N og x 6,25) 63 4,9 Popiół 41 3,6 Kolagen (Hyp x 15,7) 59 6,2 *Wyniki zawarte w tabeli stanowią wartość średnią z pięciu oznaczeń odchylenie standardowe. 74

75 wydajnośd demineralizacji [%] Ustalenie optymalnych parametrów demineralizacji kręgosłupów Demineralizacja EDTA Wpływ stężenia EDTA i czasu demineralizacji na zawartość soli mineralnych w kręgosłupach Stosując 0,5 M roztwór EDTA do demineralizacji osiągnięto znacznie większą rozpuszczalność związków mineralnych niż po ekstrakcji 0,1 M roztworze EDTA (rys 30). Największy wzrost rozpuszczalności związków mineralnych w 0,5 M EDTA odnotowano podczas 3 krotnego 24 h procesu. W tym czasie wyekstrahowano 68 % minerałów. Wydłużenie czasu demineralizacji o kolejne 24 h z nową porcją rozpuszczalnika powoduje wzrost rozpuszczalności zaledwie o 4 %. Prowadząc demineralizację 0,1 M EDTA po trzech 24 h cyklach rozpuszczono dwukrotnie mniej soli mineralnych niż po zastosowaniu czterech cykli. Po 4 krotnej 24 h ekstrakcji w 0,1 i 0,5 M roztworze EDTA rozpuszczono odpowiednio 58 i 72 % związków mineralnych. Wydajność procesu prowadzonego w warunkach ciągłych przez 48 h była zbliżona do wydajności 24 h demineralizacji (rys. 30), zarówno dla 0,1 M jak i 0,5 M roztworu EDTA. Większe wydajności demineralizacji kręgosłupów uzyskuje się stosując proces, w którym roztwór EDTA jest wymieniany co 24 h. Stosowanie demineralizacji za pomocą EDTA na skalę przemysłową nie wydaje się korzystne ze względu na czasochłonność procesu i niezadowalający stopień usunięcia soli mineralnych i koszt EDTA (2 x 24) 72 (3 x 24) 96 (4 x 24) czas [h] Rysunek 30. Wpływ czasu demineralizacji oraz stężenia EDTA na wydajność demineralizacji - 0,1 M roztwór, -0,5 M roztwór 75

76 0,5 M roztworem EDTA z odbiałczanych kręgosłupów różownika karaibskiego (Priacanthus tayenus) po 5-krotniej 8 h ekstrakcji przy stosunku surowca do rozpuszczalnika 1 : 10 (w : v) można wyekstrahować 85 % związków mineralnych (Kittiphattanabawon i inni, 2005). Natomiast z kości tuńczyka po 5 krotnej 24 h demineralizacji w 0,5 M roztworze EDTA można całkowicie usunąć związki mineralne (Nagai i Suzuki, 2000). Prawdopodobnie w przypadku kręgosłupów dorsza bałtyckiego nawet po przedłużeniu procesu o piątą dobę nie zdołano by osiągnąć wydajności na podobnym poziomie gdyż już między 3 a 4 cyklem procesu obserwuje się tylko niewielki przyrost ilości rozpuszczonych minerałów. Z kręgosłupów japońskiej ryby z rodziny lucjanowatych (ang. Yellowtail) można usunąć 39 % związków nieorganicznych już po 8 h wstrząsania surowca w 0,5 M roztworze EDTA (Morimura i inni, 2002). Taką wydajność w przypadku dorsza bałtyckiego uzyskano dopiero po trzeciej dobie procesu. Jednak w przypadku badanego surowca nie zastosowano wstrząsania, co ma zapewne znaczy wpływ na wydajność demineralizacji. Trudno, zatem jednoznacznie określić przyczynę różnic w rozpuszczalności substancji nieorganicznych z wymienionych surowców. Podczas demineralizacji za pomocą EDTA nie obserwuje się tak dużych odchyleń od wartości średniej zawartości popiołu w osadzie po demineralizacji (rys. 30), jak to ma miejsce w przypadku stosowania kwasu solnego (rys. 31). Jest to spowodowane tym, że surowiec nie ulega pęcznieniu i zawartość suchej masy nie ulega tak znaczącym zmianom (tab. 13). Zawartość suchej masy po użyciu 0,1 M roztworu EDTA zmniejszyła się o ok. 1 % w stosunku do surowca, natomiast po zastosowaniu 0,5 M roztworu EDTA jej zawartość wzrosła o ok. 5 %. Niewielkie zmiany w zawartości wody w kręgosłupach nie powodują trudności z filtracją, które obserwuje się przy stosowaniu 0,1 M roztworu kwasu solnego. Tabela 13. Zawartość suchej masy w kręgosłupach po demineralizacji EDTA Stężenie EDTA Zawartość suchej masy [%] po: 24 h * 48 h * 48 (2 x 24) h ** 72 (3 x 24) h ** 96 (4 x 24) h ** 0,1 M 26,6 ± 0,96a 27,0 ± 1,10a 25,1 ± 1,44a 25,4 ± 2,39a 25,7 ± 1,16a 0,5 M 31,0 ± 1,10a 30,2 ± 0,98a 30,3 ± 1,02a 32,3 ± 0,69a 31,4 ± 0,86a Wyniki zawarte w tabeli stanowią wartość średnią z * pięciu i ** sześciu oznaczeń odchylenie standardowe. Wartości w kolumnach oznaczone różnymi literami różnią się istotnie (P < 0,05). 76

77 Wpływ stężenia EDTA i czasu demineralizacji kręgosłupów na rozpuszczalność kolagenu Zaletą EDTA jako czynnika służącego do demineralizacji kręgosłupów jest to, że nie powoduje strat kolagenu w surowcu podczas trwania procesu. Zawartość kolagenu w supernatancie po demineralizacji mieści się poniżej progu oznaczalności. W tab. 14. przedstawiono ph roztworów przed i po 24 h demineralizacji. Nierozpuszczalność kolagenu wynika z tego, że proces odbywał się w lekko alkalicznym środowisku, którego ph zbliżone jest do punktu izoelektrycznego kolagenu. Tabela 14. Wartość ph roztworów przed i po 24 h demineralizacji Stężenie EDTA przed ph po 24 h 0,1 M 7,5 7,8 0,5 M 7,5 7, Demineralizacja HCl Wpływ stężenia kwasu solnego i czasu demineralizacji na zawartość soli mineralnych w kręgosłupach Stężenie kwasu solnego ma znaczący wpływ na efektywność procesu demineralizacji (rys. 31). Traktując kręgosłupy dorsza bałtyckiego 0,1 M roztworem kwasu solnego przez 24 h nie odnotowano istotnych zmian w zawartości związków mineralnych. Natomiast po 72 h rozpuszcza się zaledwie ok. 44 % związków mineralnych zawartych w surowcu. Najwięcej soli mineralnych rozpuszcza się w 1,0 M roztworze HCl, którym po dwóch dobach można usunąć ponad 97 % związków mineralnych, a po trzech dobach ponad 99 %. Proces demineralizacji przy użyciu 0,5 M roztworu kwasu solnego zachodził z podobną wydajnością jak dla kwasu o stężeniu 1,0 M i po trzech dobach rozpuszczono ok. 96 % związków mineralnych. 77

78 wydajnośd demineralizacji [%] h 48h 48 (2 x 24) 72 (3 x 24) czas [h] Rysunek 31. Wpływ czasu demineralizacji oraz stężenia HCl na wydajność demineralizacji; - 0,1 M roztwór, -0,5 M roztwór, - 1,0 M roztwór Wydłużenie czasu demineralizacji 0,5 i 1,0 M roztworem HCl powyżej 24 h nie zwiększa jej wydajności (rys. 31). Zmieniając 0,5 i 1,0 M roztwór HCl co 24 h po 48 h procesu można rozpuścić odpowiednio więcej o 20 i 10 % związków mineralnych zawartych w surowcu w porównaniu z ekstrakcją prowadzoną przez 48 h w sposób ciągły. Z ręcznie odmięśnionych oraz odtłuszczonych kości okonia nilowego (Lates niloticus) 0,82 M roztworem HCl można usunąć po 12 dniach całkowicie związki mineralne. Reakcję prowadzono wymieniając roztwór kwasu co 3 dni w temp ºC (Muyonga i inni, 2004b). Jest to jednak za długi czas do stosowania na skalę przemysłową. Powodem tak długiego czasu demineralizacji mogła być za mała częstotliwość wymiany roztworu kwasu. Z badań przeprowadzonych na kręgosłupach dorsza wiadomo, iż po 24 h rozpuszczalność związków mineralnych zmienia się nieznacznie, zatem przedłużanie procesu nie jest celowe. Powodem dużych odchyleń od wartości średniej (rys. 31), zwłaszcza podczas demineralizacji 1,0 i 0,5 M roztworem kwasu solnego może być bardzo mała zawartość związków mineralnych w suchej masie oseiny. W konsekwencji powoduje to trudności w precyzyjnym oznaczeniu popiołu w próbach. Wpływ stężenia kwasu solnego i czasu demineralizacji kręgosłupów na rozpuszczalność kolagenu Podczas demineralizacji kwasem solnym rozpuściła się część kolagenu zawartego w kręgosłupach (tab. 15). Największe straty kolagenu odnotowano w przypadku 0,1 M roztworu kwasu solnego ok. 14 %, którego ph wynosiło ok. 4 po 24 h (tab. 16). Kolagen 78

79 z kości tropikalnej ryby, różownika karaibskiego (Priacanthus tayenus) w temp. 4 C ma największą rozpuszczalność (ponad 90%) w ph w zakresie ok. 2 5 (Kittiphattanabawon i inni, 2005). W takim środowisku kolagen pęcznieje i pewna jego cześć przechodzi do roztworu. Wzrost udziału mokrej masy (tab. 17) podczas demineralizacji w 0,1 oraz 0,5 M roztworze HCl powoduje dodatkowo trudności w oddzieleniu oseiny od roztworu. Tabela 15. Sumaryczne straty kolagenu w kręgosłupach po 72 h demineralizacji Stężenie kwasu solnego Straty kolagenu [%] 0,1 M 8,3 13,9 0,5 M 2,3 9,1 1,0 M 0,2 3,2 Tabela 16. Wartość ph roztworów przed i po 24 h demineralizacji Stężenie kwasu solnego przed ph po 24 h 0,1 M 1,0 4,3 0,5 M 0,3 1,6 1,0 M 0,0 1,1 Tabela 17. Zawartość suchej masy w kręgosłupach po demineralizacji kwasem solnym Stężenie kwasu solnego Zawartość suchej masy [%] po: 24 h * 48 h * 48 (2 x 24) h ** 72 (3 x 24) h ** 0,1 M 15,3 2,92a 18,1 5,58a 12,3 2,77a 10,0 2,48a 0,5 M 18,2 3,68a 17,2 2,60a 14,3 1,50ab 11,2 1,26a 1,0 M 25,2 7,13a 26,2 5,56a 27,7 2,84b 23,2 1,33b Wyniki zawarte w tabeli stanowią wartość średnią z * pięciu i ** sześciu oznaczeń odchylenie standardowe. Wartości w kolumnach oznaczone różnymi literami różnią się istotnie (P < 0,05). Znacznie mniejsze ubytki kolagenu powodował kwas solny o stężeniu 1,0 M. W wyniku jego działania odnotowano maksymalne straty do 3,2 %. Kolagen posiada największą zdolność pęcznienia przy ph w zakresie 3 4. Przy niższym ph jak to ma miejsce 79

80 wydajnośd demineralizacji [%] w przypadku kręgosłupów demineralizowanych w 1,0 M HCl (tab. 16) zdolność wiązania wody jest znacznie mniejsza (tab. 17). Fibryle kolagenowe kurczą się i rozpuszczalność kolagenu zmniejsza się gdyż pomiędzy cząsteczkami jest mniej miejsca na wodę. Zastosowanie 0,1 M roztworu kwasu solnego jest niekorzystne dla procesu demineralizacji ze względu na duże straty kolagenu i małą rozpuszczalność związków mineralnych. Roztwór 0,5 M kwasu solnego w porównaniu z 0,1 M powoduje mniejsze straty kolagenu, ale najlepszym rozpuszczalnikiem soli mineralnych jest kwas solny o stężeniu 1,0 M. Wpływ stosunku surowca do rozpuszczalnika na wydajność demineralizacji kręgosłupów Demineralizacja najefektywniej przebiegała w 1,0 M roztworze HCl. Dla tego stężenia kwasu postanowiono zbadać wpływ stosunku surowca do rozpuszczalnika na wydajność ekstrakcji związków mineralnych. W badanym zakresie ma on nieznaczny wpływ na wydajność demineralizacji (rys. 32). Wzrost udziału kwasu w stosunku do surowca z 3 : 1 do 7 : 1, w próbie inkubowanej przez 24 h, powoduje wzrost wydajności procesu zaledwie o 7 %. Zwiększenie krotności demineralizacji sprawia, iż ilość zastosowanego kwasu w stosunku do kości nie ma wpływu na rozpuszczalność związków mineralnych. Po trzykrotnej 24 h demineralizacji kręgosłupów w 1,0 M roztworze HCl niezależnie od ilości zastosowanego kwasu rozpuszczono całkowicie sole mineralne w nich zawarte h 48h 48 (2 x 24) 72 (3 x 24) Rysunek 32. Wpływ stosunku kwasu solnego do surowca na wydajność demineralizacji; stosunek: i-1 : 3, - 1 : 5, - 1 : 7 czas [h] 80

81 wydajnośd demineralizacji [%] Wpływ mieszania na wydajność demineralizacji kręgosłupów dorsza bałtyckiego Wpływ mieszania na wydajność demineralizacji kręgosłupów określono dla prób inkubowanych w 1,0 M roztworze HCl przy stosunku surowca do rozpuszczalnika 1 : 3 (w : v). Jest to najlepsze stężenie kwasu i minimalna ilość rozpuszczalnika, niezbędna do całkowitego rozpuszczenia soli mineralnych z kręgosłupów, ustalona na podstawie wcześniej przeprowadzonych badań. Uzyskano znaczne skrócenie czasu demineralizacji rozdrobnionych kręgosłupów dorsza w roztworze HCl przez zastosowanie mieszania. Już po dwukrotnym 0,5 h mieszaniu można rozpuścić 100 % związków mineralnych zawartych w surowcu (rys. 33). Mieszając kręgosłupy przez 0,5 h wydzielono z kości ok. 85 % związków mineralnych. Pozostałą cześć soli przeszła do roztworu w trakcie drugiego mieszania próby z nową porcją kwasu. Bez zastosowania mieszania dopiero po dwukrotnej 24 h ekstrakcji usunięto 95 % soli mineralnych. Dalsze wydłużenie czasu mieszania nie jest celowe gdyż nie powoduje wzrostu rozpuszczalności soli mineralnych , czas [h] Rysunek 33. Wpływ czasu i krotności mieszania na wydajność demineralizacji - I mieszanie, - II mieszanie. Po trzykrotnej wymianie 0,6 M roztworu HCl co 24 h w kręgosłupach dorsza atlantyckiego pozostają jedynie resztkowe ilości wapnia związanego ze strukturą białkową (Gildberg i inni, 2002). Proces podobnie jak w przypadku dorsza bałtyckiego prowadzono z mieszaniem i w temp. 4 ºC. Natomiast rozdrobnionych, odtłuszczonych kręgosłupów ryb lucjanowatych (ang. Yellowtail) w temp. pokojowej po dwukrotnej 8 h demineralizacji ze wstrząsaniem, w 0,01 M oraz 0,6 M HCl można usunąć odpowiednio 50 i 81 % związków mineralnych. Po 24 h procesu w 0,6 M roztworze HCl 5 % związków nieorganicznych nadal była obecna. Dopiero po dwukrotnej 24 h ekstrakcji zdołano całkowicie usunąć sole 81

82 rozpuszczalnośd [%] mineralne z surowca (Morimura i inni, 2002). Prawdopodobnie taki sam efekt można by osiągnąć w znacznie krótszym czasie, jednak autorzy wymienionych publikacji nie przeprowadzili takich doświadczeń Otrzymywanie preparatu białkowego Najmniejszą rozpuszczalność mieszaniny białek sarkoplazmatycznych i miofibrylarnych uzyskano przy ph w zakresie 4,0 5,0 z minimum przy ph 4,5 (rys. 34). Punkt izoelektryczny białek sarkoplazmatycznych przypada w zakresie ph 4,0 8,5 (Bai i Radola za Sikorskim, 1980), natomiast punkty izoelektryczne głównych białek miofibrylarnych, miozyny i aktyny wynoszą odpowiednio 5,4 i 4,7 (Sikorski, 1980). Zmiana ph ekstraktu białek mięśniowych 1 M roztworem HCl do wartości 4,0; 4,5; 5,0 pozwala strącić z roztworu większość białek, bo odpowiednio 88,1 %, 94 % i 88 %. Po modyfikacji ph ekstraktu białek 1 M roztworem HCl obserwowano zmiany barwy i klarowności (tab. 18). Wyjściowy ekstrakt białek mięśniowych dorsza bałtyckiego, o ph 10 11, charakteryzował się dużą mętnością i szarobrunatną barwą. Barwa ekstraktu wynika z obecności w kręgosłupach pozostałości krwi. Hemoglobina obecna w krwi zostaje wraz z innymi białkami sarkoplazmatycznymi oraz miofibrylarnymi wyekstrahowana i przechodzi w formę utlenioną, brązową methemoglobinę. Największą klarownością i najjaśniejszą barwą charakteryzował się supernatant uzyskany po strąceniu białek przez doprowadzenie ph do wartości punktu izoelektrycznego ph Rysunek 34. Wpływ ph na rozpuszczalność mieszaniny białek mięśniowych otrzymanych na drodze ekstrakcji kręgosłupów dorsza bałtyckiego 82

83 Tabela 18. Wpływ ph na barwę i klarowność roztworu po odwirowaniu strąconych białek (ocena wizualna) ph Barwa Wygląd supernatantu Klarowność 2,01 żółtobrązowy mętny 2,80 ciemnożółty mętny 3,40 żółty półprzezroczysty 3,94 żółty klarowny, przezroczysty 4,60 jasnożółty klarowny, przezroczysty 4,90 jasnożółty półprzezroczysty 5,60 żółty mętny 6,00 słomkowożółty mętny 6,70 szarobrunatny mętny (wyjściowy) szarobrunatny mętny, lepki Właściwości funkcjonalne preparatu białkowego W celach porównawczych wykonano oznaczenia właściwości funkcjonalnych otrzymanego preparatu białek mięśniowych oraz preparatu białek wieprzowych stosowanego w przemyśle o nazwie handlowej Gelexcel DI 95 wyprodukowanego przez Kerry Polska sp. z o.o. Skład podstawowy Sucha masa obu badanych preparatów mięśniowych jest podobna i kształtuje się na poziomie bliskim 95 % (tab. 19). Należy się zatem spodziewać dużej trwałości preparatów pod względem mikrobiologicznym. Stężenie związków mineralnych jest również zbliżone i kształtuje się na poziomie ok. 2 %. Zawartość białka ogółem w badanych preparatach również jest bardzo zbliżona. Jednak w przypadku preparatu białek wieprzowych na białko ogółem składa się głównie kolagen. Zawartość tego białka w suchej masie preparatu wynosi 62,3 %. Kolagen jest białkiem niepełnowartościowym i ubogim w aminokwasy siarkowe oraz nie zawiera tryptofanu dlatego obniża on wartość żywieniową przetworów z jego udziałem. Białka wyizolowane z kręgosłupów dorsza bałtyckiego zawierają śladowe ilości kolagenu w porównaniu z preparatem białek wieprzowych (tab. 19). Pomimo alkalicznego traktowania 83

84 skład aminokwasowy jest podobny do natywnych białek mięśniowych (tab. 20). Te warunki ekstrakcji nie powodują negatywnych zmian w białkach. Niebezpieczne zmiany takie jak degradacja reszt argininy do ornityny, zniszczenie reszt niektórych wrażliwych aminokwasów, racemizacja oraz tworzenie nowych nietypowych dla białek reszt aminokwasowych i powstawanie wiązań sieciujących zachodzą, gdy ekstrakcja prowadzona jest w mniej łagodnych warunkach, w temp. powyżej 30 ºC i ph 13. Stosując ph poniżej 11 i temp. pokojową można otrzymać izolat białkowy wolny od lizynoalaniny i innych toksycznych aminokwasów, który posiada wartość odżywczą porównywalną z mięsem (Palka i inni, 1985; Shahidi i inni, 1995). Tabela 19. Porównanie składu podstawowego preparatu z dorsza i preparatu białek wieprzowych [%] Preparat Sucha masa Białko ogółem Kolagen Popiół białek mięśniowych z dorsza bałtyckiego 94 ± 1,2 83 ± 1,7 0,294 ± 0,0044 2,7 ± 0,48 białek wieprzowych 96 ± 1,3 82 ± 1,8 62,3 ± 0,061 2,0 ± 0,75 Tabela 20. Skład aminokwasowy preparatu z dorsza bałtyckiego 1 Aminokwasy niezbędne [% w białku] Surowiec Phe + Tyr Ile Leu Lys Met + Cys Thr Trp Val preparat białka 7,8 4,5 7,7 7,1 3,5 3,9 1,0 5,1 Dorsz 7,0 5,5 8,1 8,5 4,0 4,5 0,9 5,6 Wpływ ph i siły jonowej na rozpuszczalność białek mięśniowych Najmniejsza rozpuszczalność białek występuje przy wartości ph 4,5 dla białek dorsza zaś dla preparatu białek wieprzowych przy 7,35, co wynika z obecności w nim dużej ilości kolagenu (rys. 35). Białka otrzymane z kręgosłupów dorsza bałtyckiego wykazują znacznie 1 Na zlecenie Katedry Chemii, Technologii i Biotechnologii Żywności Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej w Gdańsku analiza składu aminokwasowego została wykonana przez mgr Annę Bednarską, Katedra Żywienia Zwierząt i Paszoznawstwa, Wydział Bioinżynierii Zwierząt, Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie. 84

85 rozpuszczalnośd białka [%] rozpuszczalnośd białka [%] większą rozpuszczalność w zakresie ph od 8 do 12 od komercyjnego preparatu i wynoszą one od ok. 28 % do 100 %, przy czym w tych samych warunkach białko wieprzowe rozpuszcza się w ok. 11 % i 24 %. Możliwe, że preparat białka wieprzowego został otrzymany w warunkach, w których białka głównie kolagen uległy przemianom, które bardzo obniżyły ich rozpuszczalność. a) b) ph ph Rysunek 35. Wykres zależności rozpuszczalności białek mięśniowych od ph ( - siła jonowa 0; - siła jonowa 0,35; - siła jonowa 0,7). a) białka dorsza bałtyckiego, b) preparat białek wieprzowych. Wzrost siły jonowej w przypadku białek z dorsza spowodował spadek ich rozpuszczalności. Natomiast w przypadku białek wieprzowych dodatek NaCl w środowisku obojętnym i zasadowym spowodował niewielki wzrost rozpuszczalności białek tym wyższy im wyższa była siła jonowa. Białka wieprzowe najlepiej się rozpuszczają się przy ph 12 i sile 85

86 jonowej 0,7. Mimo, że wzrost siły jonowej obniżył rozpuszczalność białek z dorsza to nadal jest ona większa niemal o połowę w porównaniu z preparatem wieprzowym (rys 35). Duża rozpuszczalność białek mięśniowych dorsza w alkalicznym zakresie ph, podobnie jak białek soi, polega prawdopodobnie na rozwinięciu cząsteczek białek i dysocjacji. Odsłonięcie zjonizowanych grup kwasowych łańcuchów białkowych zwiększa uwodnienie białka i przez to jego rozpuszczenie (Rutkowski i Kozłowska, 1981). Natomiast przebieg zależności rozpuszczalności preparatu białek wieprzowych od kwasowości środowiska (rys. 35 b) jest typowy dla kolagenu a obecność soli w roztworze powyżej 0,1 M powoduje, że kolagen nie pęcznieje i stąd tak mała rozpuszczalność. Natomiast takie białka jak keratyna i fibroina nie pęcznieją w zakresie ph od 2 do 12 (Reich, 1970). Wpływ ph i siły jonowej na zdolność pienienia białek mięśniowych Zdolność białek obu preparatów do pienienia zależy od ph. Białko wyizolowane z dorsza bałtyckiego wykazuje najmniejszą zdolność pienia przy ph 4 i wynosi ona ok. 50 %. Jest to związane z najmniejszą rozpuszczalnością białek w tym ph. Poniżej i powyżej tego ph zdolność pienienia znacznie wzrasta osiągając maksymalną wartość w ph 12 (178 %) (rys. 36). Duża zdolność pienienia w silnie alkalicznym ph jest spowodowana wzrostem ładunku elektrycznego na powierzchni białka, co osłabia oddziaływania hydrofobowe ale powoduje wzrost elastyczności białka. Dzięki temu białko może szybciej dyfundować do granicy faz powietrze woda by szczelnie otoczyć pęcherzyki powietrza i przyspieszyć tworzenie piany (Aluko i Yada, 1995). Białka z rośliny strączkowej Vigna unguiculata charakteryzują się podobną zależnością zdolności pienienia od ph (Ragab i inni, 2004; Lawal i inni, 2005). Białka z tej rośliny wykazały najniższą zdolność pienienia przy ph 5 (0 %) a najwyższą przy ph 10 (90 %) natomiast przy ph 2 wartość ta wyniosła 76 %. Nieco inne wyniki otrzymano dla odtłuszczonej mąki z ziaren rośliny Parkia biglobossa, gdzie najmniejsza wartość zdolności pienienia wynosiła 43 % przy ph 4 a najwyższa 75 % przy ph 10 i była podobna przy ph 2 (Lawal i inni, 2005). Po przeliczeniu wyników zdolności pienienia badanych preparatów z zastosowaniem wzorów użytych przez Ragab a i wsp. (2004) oraz Lawal a i wsp. (2005) otrzymano następujące wartości: przy ph 4 31 % - najniższa wartość, przy ph % - najwyższa wartość a 75 % przy ph 2. Z porównania tych danych wynika, że preparat białka z dorsza bałtyckiego wykazuje podobną zdolność pienienia. Preparat białka wieprzowego ma znacznie mniejszą zdolność tworzenia piany w porównaniu z białkiem z dorsza bałtyckiego. Minimalna zdolność pienienia wynosi 6,7 % przy ph 12 a wartość maksymalną (44 %) osiąga przy ph 8 (rys. 36 b). Niewielka zdolność 86

87 zdolnośd pienienia [%] zdolnośd pienienia [%] pienienia białek wieprzowych wiąże się prawdopodobnie z małą rozpuszczalnością tych białek. a) siła jonowa 0,7 siła jonowa 0,35 siła jonowa 0 ph b) siła jonowa 0,7 siła jonowa 0,35 siła jonowa 0 ph Rysunek 36. Zależność zdolności pienienia roztworu białka wieprzowego od ph i siły jonowej; a) białka dorsza bałtyckiego, b) preparat białek wieprzowych Obecność soli spowodowała wzrost zdolności tworzenia piany w obojętnym i alkalicznym środowisku w przypadku białek dorsza oraz w kwaśnym i obojętnym w przypadku preparatu białek wieprzowych. Im wyższa siła jonowa (w badanym zakresie) tym większa zdolność pienienia. NaCl prawdopodobnie wpływa na konformację białka, powodując jego rozfałdowanie i dzięki temu mniejsza ilość białek może być zaangażowana w tworzenie błonki dokoła pęcherzyka powietrza. W obecności NaCl rozpuszczalność 87

88 preparatu białek z dorsza jest mniejsza niż w roztworze bez dodatku soli, ale w tworzeniu błonek mogą uczestniczyć białka zdyspergowane (Sikorski, 2002). Wpływ ph i siły jonowej na stabilność piany Duży wpływ na stabilność piany w obu preparatach białkowych ma ph środowiska. Piana otrzymana z białek mięśniowych dorsza bałtyckiego bez udziału NaCl jest najmniej stabilna w ph 4 a najbardziej stabilna w ph 2 (rys. 37). Zdolność do utrzymywania wody w białkowym filmie otaczającym cząsteczki powietrza oraz obecność elektrostatycznego odpychania są bardzo ważne dla stabilności piany (Kinsella i inni oraz Myers Chavan i inni, 2001). Niedostateczne elektrostatyczne odpychanie powoduje nadmierne oddziaływania białko-białko i tworzenie agregatów, co zmniejsza pienienie (Chavan i inni, 2001). Największy spadek stabilności piany następuje po pierwszych 10 minutach od momentu utworzenia piany, niezależnie od ph i siły jonowej mieszaniny. Natomiast po 20 i 30 minutach spadek stabilności jest już nieznaczny. Porównując wykresy stabilności piany w zależności od ph i siły jonowej (rys. 38 i 39) białek z dorsza i białek wieprzowych, można zaobserwować efekt obniżenia stabilności piany lecz dla różnych zakresów ph: kwaśnego dla białek z dorsza oraz alkalicznego dla białek wieprzowego. Najwyższy spadek stabilności dla białek z dorsza wystąpił w ph 2 a dla białek wieprzowych w ph 12. Może to wynikać z odmiennej konformacji białek otrzymanych z dorsza i białek wieprzowych. Spadek stabilności piany w obecności soli może być związany z obniżeniem aktywności powierzchniowej białek. 88

89 stabilnośd piany [%] stabilnośd piany [%] a) min 20 min 30 min ph b) min 20 min 30 min ph Rysunek 37. Zależność stabilności piany z białek mięśniowych od ph (siła jonowa 0); a) białka dorsza bałtyckiego, b) preparat białek wieprzowych 89