ROZMIESZCZENIE ENDOGENNEGO śelaza W TKANKACH KRÓLIKÓW PO DOśYLNYM PODANIU DIETYLODITIOKARBAMINIANU SODOWEGO

Transkrypt

1 Medicina Veterinaria 1(2) 2002, ROZMIESZCZENIE ENDOGENNEGO śelaza W TKANKACH KRÓLIKÓW PO DOśYLNYM PODANIU DIETYLODITIOKARBAMINIANU SODOWEGO Ewa Kucharczak, Józef Dębowy, Zdzisław Jopek Streszczenie. Celem pracy było określenie zmian w rozmieszczeniu endogennego Ŝelaza w tkankach i płynach ustrojowych królików po podaniu dietyloditiokarbaminianu sodowego (DTC). Badania przeprowadzono na królikach mieszańcach, klinicznie zdrowych. Dwóm grupom podano doŝylnie dietyloditiokarbaminian sodowy w dawce niskiej immunostymulującej 20 mg /kg m.c. lub wysokiej 200 mg /kg m.c. Kontrolę stanowiły zwierzęta, którym podano roztwór fizjologiczny chlorku sodowego. Po eutanazji zwierząt, tj. 72 godz. od podania DTC pobrano próbki: wątroby, nerek, mózgu, mięśni szkieletowych, tłuszczu okołonerkowego, moczu i krwi, które mineralizowano na sucho w piecu muflowym w temperaturze C. śelazo oznaczano bezpośrednio w mineralizacie metodą spektrofotometrii atomowej na aparacie SP-9 firmy Pye-Unicam. Otrzymane wyniki badań poddano analizie statystycznej testem t-studenta. U królików, którym podano DTC w dawce niskiej, zaobserwowano istotny statystycznie spadek poziomu endogennego Ŝelaza w tkance tłuszczowej, moczu i osoczu, a nieistotny w wątrobie, mięśniach oraz krwi. Po zastosowaniu wysokiej dawki DTC (200 mg /kg) poziom Ŝelaza wzrósł istotnie w nerkach, a nieistotnie w mózgowiu, wątrobie, moczu i osoczu. Równocześnie w tkance tłuszczowej nastąpił dalszy spadek jego zawartości. Uzyskane wyniki badań wskazują, Ŝe DTC podany doŝylnie w obydwu dawkach prowadzi do znacznego przemieszczania się Ŝelaza w tkankach i płynach ustrojowych królików. Słowa kluczowe: króliki, dietyloditiokarbaminian sodowy, endogenne Ŝelazo, rozmieszczenie w tkankach WSTĘP Wśród wielu związków, które mogą mieć decydujący wpływ na redystrybucję metali w tkankach obok substancji chelatujących o właściwościach hydrofilnych istnieje grupa związków tworzących z jonami metali kompleksy lipofilne. Dzięki takim połączeniom ułatwiony jest transport pierwiastków przez błony biologiczne, co z kolei przyczynić się moŝe do zmian w rozmieszczeniu i stęŝeniu metali w poszczególnych tkankach, jak równieŝ oddziaływać na procesy ich retencji. Do ligandów o takich właściwościach naleŝą ditiokarbaminiany, stosowane powszechnie w rolnictwie i leśnictwie

2 60 E. Kucharczak i in. jako fungicydy i insektycydy, jak równieŝ w wielu gałęziach przemysłu: metalurgii, w przemyśle gumowym i celulozowym. Przedstawicielem tej grupy chelatów jest dietyloditiokarbaminian sodowy (DTC) uŝywany m.in. do produkcji pestycydów tiokarbaminianowych, a w małych dawkach stosowany jako syntetyczny lek immunomodulujący. Wprowadzony do lecznictwa medycznego w latach osiemdziesiątych, zaliczony został do syntetycznych immunomodulatorów, a w lecznictwie weterynaryjnym stosowany doświadczalnie w celu poprawy kondycji zwierząt naraŝonych na immunosupresyjne wpływy środowiska, wpływając korzystnie na ich zdrowotność i zmniejszając zachorowalność [Obmińska-Domoradzka 1992, Obmińska-Domoradzka i in. 1995]. Związek ten dzięki moŝliwościom tworzenia lipofilnych połączeń DTC metal moŝe równieŝ w istotny sposób wpływać na zmiany w rozmieszczeniu poszczególnych pierwiastków. W przypadku metali typowo toksycznych: ołowiu, kadmu czy rtęci moŝe to doprowadzać do przekroczenia w niektórych organach ich stęŝeń tolerowanych i w konsekwencji do wystąpienia efektów toksycznych [Aaseth i in. 1981]. Natomiast zmiany w rozmieszczeniu mikroelementów takich jak miedź, cynk czy mangan mogą powodować przede wszystkim zaburzenia podstawowych procesów metabolicznych [Lakomaa i in. 1982]. śelazo jest pierwiastkiem niezbędnym dla prawidłowego funkcjonowania kaŝdego organizmu. Jego metabolizm w organizmach zwierząt i ludzi przebiega w układzie zamkniętym, a gospodarka tym metalem, głównie na skutek nieznacznego wydalania, jest bardzo oszczędna. Zwłaszcza Ŝelazo hemowe spełnia istotną rolę w procesie krwiotworzenia. Pierwiastek ten, głównie w postaci jonu Fe +2, wchodzi równieŝ w skład szeregu enzymów oksydoredukcyjnych, jak na przykład cytochromu c, peroksydazy, czy katalazy, biorąc udział w procesach utlenienia biologicznego. Związki zapasowe Ŝelaza to: ferrytyna i hemosyderyna, występujące w wątrobie, śledzionie, szpiku kostnym i nerkach [Abdel-Mageed i in. 1990, Ewy 1977, Pawelski 1990, Ruszczyc 1983]. Z uwagi na pełnione funkcje zaburzenia w metabolizmie Ŝelaza wywoływane przez niektóre ksenobiotyki, zwłaszcza w trakcie jego dystrybucji, prowadzić mogą do upośledzenia funkcji Ŝyciowych organizmu związanych głównie z układem krwiotwórczym. Celem badań było określenie jak DTC, podany doŝylnie królikom w dawkach 20 lub 200 mg/kg m.c., wpłynie na rozmieszczenie endogennego Ŝelaza w tkankach i płynach ustrojowych. MATERIAŁ I METODY Badania przeprowadzono na królikach mieszańcach obu płci, klinicznie zdrowych, 2,5 3,5 kg masie ciała, w wieku około 8 miesięcy, pochodzących z rejonu Wrocławia. Zwierzęta podzielono na 3 grupy doświadczalne, w poszczególnych grupach było od 8 10 zwierząt. Króliki trzymano w wiwarium w temperaturze około 20 0 C, Ŝywione były mieszanką ziarna zbóŝ i sianem łąkowym oraz pojone wodą ad libitum. Dwóm grupom podano doŝylnie, jednorazowo DTC w dawce 20 lub 200 mg/kg m.c. DTC (POCH-subst.cz.d.a.), oczyszczony i rekrystalizowany w Zakładzie Chemii Farmaceutycznej Akademii Medycznej we Wrocławiu, rozpuszczono ex temp. w sterylnym 0,9% roztworze NaCl. Kontrolę stanowiły zwierzęta, którym podano doŝylnie roztwór fizjo- Acta Sci. Pol.

3 Rozmieszczenie endogennego Ŝelaza logiczny chlorku sodowego. Wszystkie króliki poddano eutanazji po 72 godzinach. Na prowadzenie badań w tym zakresie uzyskano akceptację Lokalnej Komisji Etycznej. Do badań pobrano: wątrobę (płat prawy i lewy), obie nerki, mózgowie, mięsień szkieletowy, tłuszcz okołonerkowy, mocz i krew. Próbki tkanek, moczu i krwi mineralizowano na sucho w piecu muflowym w temperaturze C. śelazo oznaczano bezpośrednio w mineralizacie metodą spektrofotometrii atomowo-absorpcyjnej na aparacie SP-9 firmy Pye-Unicam. Stosowane procedury analityczne sprawdzane są na bieŝąco w badaniach wewnątrzlaboratoryjnych i międzylaboratoryjnych, z uŝyciem próbek kontrolnych wzmocnionych zróŝnicowanymi stęŝeniami metali, a takŝe certyfikowanych materiałów referencyjnych (CRM). Otrzymane wyniki badań poddano analizie statystycznej testem t-studenta, sprawdzając istotność róŝnic średnich zawartości Ŝelaza u królików, którym podano DTC w porównaniu do zwierząt z grupy kontrolnej. WYNIKI BADAŃ Zawartość Ŝelaza w tkankach i płynach ustrojowych królikow przedstawiono w tabeli 1. W grupie zwierząt kontrolnych najwyŝszy poziom Ŝelaza stwierdzono w wątrobie 65,92 mg Fe/kg m.c. oraz nerkach 32,38 mg Fe/kg m.c. W mózgowiu, osoczu, tkance tłuszczowej i krwi zawartości te wynosiły odpowiednio: 23,75 mg Fe/kg m.c.,8,36 mg Fe/l, 6,63 mg Fe/kg m.c. i 6,49 mg Fe/l. NajniŜszy poziom Ŝelaza stwierdzono w moczu i wynosił on 1,40 mg /l. Tabela 1. Zawartość Ŝelaza w narządach (mg/kg), krwi i osoczu (mg/l) 72 godz. po podaniu dietyloditiokarbaminianu sodowego (DTC), x±sd, n = 8 Table 1. The content of iron in organs (mg/kg b.w.) and body fluids (mg/l b.w.) 72 hours after the administration of ditiocarb sodium (DTC), x ± SD, n = 8 animals Próbki Samples Mózgowie Brain Tłuszcz Fat Mięśnie Muscle Wątroba Liver Nerki Kidneys Mocz Urine Krew Blood Osocze Plasma Kontrola Control DTC 20 mg/kg 200 mg/kg ± ± ± ± ±1.65* 2.77±1.85 * 6.26± ± ± ± ± ± ± ± ±11.57 * 1.40± ±0.36 * 1.94± ± ± ± ± ±1.97 * * róŝnice statystycznie istotne dla p< 0.05 w porównaniu z kontrolą * significantly different relative to control at p< ±2.18 Medicina Veterinaria 1(2) 2002

4 62 E. Kucharczak i in. U królików, u których zastosowano DTC w dawce 20 mg/kg m.c., zaobserwowano przede wszystkim istotny, w porównaniu do grupy kontrolnej, spadek poziomu Ŝelaza: 2.4-krotny w moczu, 1.8-krotny w osoczu i 1.6-krotny w tkance tłuszczowej. RównieŜ w wątrobie, tkance mięśniowej i krwi wykazano spadek poziomu tego metalu, lecz zmiany te nie miały cech istotności. W nerkach poziom tego pierwiastka nie uległ zmianie, a obserwowany nieznaczny jego wzrost w mózgowiu nie był istotny. U królików, którym podano DTC w dawce 10-krotnie wyŝszej (200 mg/kg m.c.), stwierdzono dalsze pogłębienie spadku poziomu Ŝelaza w tkance tłuszczowej (2.4-krotne) oraz znaczny jego wzrost w nerkach (1.8-krotny). Zmiany te w porównaniu z grupą kontrolną były istotne. Równolegle w grupie tej obserwowano wzrost poziomów Ŝelaza w mózgowiu, wątrobie, moczu i osoczu. Zmiany te jednak nie wykazywały cech istotności. Natomiast we krwi zawartości tego pierwiastka były nieznacznie obniŝone, a w tkance mięśniowej nie uległy zmianie. DYSKUSJA W dostępnym piśmiennictwie, dotyczącym rozmieszczenia metali w tkankach zwierząt domowych, dziko Ŝyjących, hodowlanych czy laboratoryjnych znajdują się przede wszystkim dane dotyczące metali typowo toksycznych: ołowiu, kadmu, rtęci czy arsenu [Krupa 1997, Monkiewicz 1988, Szkoda i in. 2001]. Niewielu autorów zajmowało się natomiast badaniom zawartości pierwiastków śladowych, zaliczanych do mikroelementów, niezbędnych dla organizmów Ŝywych, w tkankach i płynach ustrojowych zwierząt. Jednym z najwaŝniejszych metali tej grupy jest Ŝelazo. Badania zawartości tego pierwiastka w tkankach zwierząt hodowlanych: bydła, koni, świń oraz zwierząt dziko Ŝyjących wykazały, iŝ narządami, w których dochodzi do najwyŝszej koncentracji tego metalu, są nerki i wątroba [śmudzki i in. 1991, Sołtysiak i in. 1997]. Jak wykazały prace prowadzone przez śmudzkiego, pierwiastek ten dodatkowo odkłada się w duŝych ilościach w sierści [śmudzki 1978]. Natomiast najniŝsze jego poziomy spotykano w tkance mięśniowej. Podobne wyniki uzyskano w badaniach zawartości Ŝelaza w tkankach zwierząt łownych: dzików, saren i jeleni, a stwierdzane średnie stęŝenia nie róŝniły się w sposób istotny od zawartości w tkankach zwierząt hodowlanych [Michalska i in. 1992, Szkoda i in. 2001]. W badaniach własnych równieŝ wykazano, iŝ narządami, w których występuje najwyŝszy poziom Ŝelaza, są: wątroba i nerki. Dodatkowo wysokie poziomy tego metalu stwierdzono w mózgowiu. Natomiast najniŝsze w: moczu, mięśniach, krwi i tłuszczu. Większość dotychczas wykonywanych prac dotyczyła wpływu DTC na zmiany rozmieszczenia niektórych metali u zwierząt laboratoryjnych i ryb, którym podawano róŝnymi drogami sole ołowiu, kadmu, rtęci, niklu i manganu [Aaseth i in. 1981, Gottofrey 1990, Oskarsson i in. 1985]. Wykazano, iŝ prawdopodobnie na skutek tworzenia lipofilnych kompleksów tiokarbaminianu z tymi metalami dochodzi do ich przemieszczania się i koncentracji w tkankach o duŝej lipofilności. Niewiele jest natomiast prac dotyczących wpływu DTC na rozmieszczenie metali juŝ zdeponowanych ( endogennych ) w tkankach posiadających właściwości toksyczne, jak np. ołów czy typowych mikroelementów, jak np. cynk, miedź, mangan czy Ŝelazo [Aaseth i in. 1981, Kargacin i in. 1991, Kucharczak i in. 2001a, Kucharczak i in. 2001b, Torronen i in. 1978]. We wcześniej przeprowadzonych i opublikowanych własnych pracach podawano królikom jednorazowo, doŝylnie DTC w dawkach 20 lub 200 mg/kg m.c. i badano po Acta Sci. Pol.

5 Rozmieszczenie endogennego Ŝelaza godz ekspozycji poziom endogennego ołowiu, miedzi i cynku [Kucharczak i in. 2001a, Kucharczak i in. 2001b]. W badaniach tych stwierdzono, Ŝe po zastosowaniu karbaminianu w obydwu dawkach nastąpił wzrost zawartości endogennych metali: ołowiu w wątrobie, nerkach i moczu, a cynku w tkance tłuszczowej. Natomiast poziom miedzi obniŝył się w wątrobie, nerkach, mózgowiu, tłuszczu i krwi. Jedynie w mięśniach, po zastosowaniu 200 mg DTC/ kg, zawartość tego pierwiastka była wyŝsza w porównaniu z grupą kontrolną. U królików, u których zastosowano DTC w wysokiej dawce, zauwaŝono wzrost poziomu endogennego ołowiu w mózgowiu i mięśniach, a cynku w nerkach, mózgowiu, mięśniach i krwi. W innych pracach, w których karbaminiany podawano róŝnymi drogami i w róŝnych dawkach, równieŝ uzyskano wyniki wskazujące na to, Ŝe związki te są zdolne wpływać na poziomy metali zdeponowanych w organizmie. Dotyczy to pierwiastków typowo toksycznych, jak równieŝ mikroelementów. Wzrost zawartości ołowiu zaobserwowano w mózgowiu i krwi po 4-krotnym dootrzewnowym podaniu szczurom karbaminianu w dawce dziennej 86 mg/kg [Oskarsson i in. 1985]. Podanie 7-krotne paszy zawierającej 0,1% tiuramu, pochodnej ditiokarbaminianu, spowodowało wzrost poziomu cynku w wątrobie i mózgowiu tych zwierząt [Aaseth i in. 1981]. WyŜsze zawartości tego metalu w mózgowiu wykazano równieŝ u szczurów po podaniu dootrzewnowym DTC w dawce 250 mg/kg [Lakomaa i in. 1982]. Z piśmiennictwa wynika, Ŝe po karbaminianach stwierdzono wzrost zawartości miedzi w wątrobie i tkance mózgowej szczurów zarówno po ich podaniu doustnym, jak i dootrzewnowym [Aaseth i in. 1981, Lakomaa i in. 1982]. Wzrost zawartości miedzi wykazano równieŝ w nerkach królików, po iniekcji dootrzewnowej DTC w dawce 330 mg/kg [Edington i in. 1966]. Jedynie Torronen stwierdził istotny spadek poziomu endogennej miedzi w wątrobie szczurów, którym podawał przez 4 dni doustnie 300 mg DTC /kg m.c. [Toronnen i in. 1978]. Istnieje niewiele prac dotyczących wpływu karbaminianów na poziom endogennego Ŝelaza w tkankach zwierząt doświadczalnych. Badaniem poziomu tego metalu w wątrobie i nerkach szczurów, po 10-krotnym podaniu dootrzewnowym róŝnych karbaminianów w dawce dziennej 0,5 mmol/ kg, zajmował się Kargacin i in. [1991] wykazując nieistotny wzrost poziomu tego pierwiastka w obydwu badanych narządach miąŝszowych. Rezultaty badań własnych wskazują równieŝ na niewątpliwy wpływ DTC, podanego doŝylnie królikom, rozmieszczenie endogennego Ŝelaza. Podobnie jak w przypadku ołowiu czy cynku zaobserwowano po podaniu 200 mg DTC/ kg bardzo wysoki wzrost poziomu tego metalu w nerkach i podwyŝszenie jego zawartości w wątrobie, mózgowiu, moczu i osoczu, a bardzo wysoki spadek w tkance tłuszczowej oraz nieznaczny we krwi. Wprowadzenie DTC w niskiej dawce 20 mg/ kg m.c. spowodowało istotny spadek poziomu Ŝelaza w tłuszczu, moczu i osoczu, a nieistotny w mięśniach, wątrobie i krwi. WNIOSKI 1. Dietyloditiokarbaminian sodowy podany w dawce niskiej (20 mg/ kg m.c.) powoduje istotne obniŝenie stęŝeńŝelaza w płynach ustrojowych, głównie w moczu, osoczu oraz w tkance tłuszczowej, przy równoczesnych tendencjach spadkowych w tkance wątrobowej, mięśniach i krwi. Medicina Veterinaria 1(2) 2002

6 64 E. Kucharczak i in. 2. Podanie wysokiej dawki DTC (200 mg/kg) prowadzi do przemieszczania tego pierwiastka z tkanki tłuszczowej do nerek, przy równoczesnych tendencjach wzrostu poziomów w mózgowiu, moczu i osoczu. PIŚMIENNICTWO Aaseth J., Alexander J., Wannag A., Effect of thiocarbamate derivatives on copper, zinc, and mercury distribution in rats and mice. Arch. Toxicol. 48, Abdel-Mageed A.B., Oehme F.W., A review of the biochemical roles, toxicity and interactions of zinc, copper and iron : III.Iron. Vet. Hum. Toxicol. 32(4), Ewy Z., Zarys fizjologii zwierząt. PWN, Warszawa. Edington N., Howell J. McC Changes in the nervous system of rabbits following the administration of sodium diethyldithiocarbamate. Nature 4, Gottofrey J., The disposition of cadmium, nickel, mercury and methylmercury in fish and effects of lipophilic metal chelation. Swedish University of Agricultural Sciences. Uppsala Kargacin B., Blanusa M., Arezina R., Kostial K., Singh P. K., Jones M., Effect of cadmium-mobilizing dithiocarbamates on essential trace metal metabolism in rats. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 47, Krupa J., Badania bioakumulacji toksycznych metali cięŝkich w mięśniach i narządach wewnętrznych zwierząt gospodarskich z południowo-wschodniego makroregionu Polski. Zesz. Nauk. AR Krak., 220. Kucharczak E., Dębowy J., Jopek Z., 2001a. Distribution of endogenic lead in rabbit tissue after intravenous administration of sodium diethyldithiocarbamate. Acta Poloniae Toxicologica. 9(1), Kucharczak E., Jopek Z., Monkiewicz J., 2001b. Endogenic zinc and copper contents in tissues of rabbits after ditiocarb sodium intravenous injection. Polish Journal of Environmental Studies Lakomaa E.L., Sato S., Goldberg A.M., Frazier J.M., The effect of sodium diethyldithiocarbamate treatment on copper and zinc concentrations in rat brain.toxicol. Appl. Pharmacol. 65, Michalska K., śmudzki J., Zawartość metali w tkankach dzików, saren i jeleni w regionie wielkopolskim. Med. Wet. 48(4), Monkiewicz J., Analiza skutków oddziaływania Legnicko-Głogowskiego okręgu miedziowego na organizm i uŝytkowość krów. 73, Zesz. Nauk. AR Wroc. Obmińska-Domoradzka B., Immunomodulujące właściwości dwuetylodwutiokarbaminianu sodowego w warunkach pobudzenia i supresji układu odpornościowego. Rozpr. hab. Zesz. Nauk. AR Wroc., 105. Obmińska-Domoradzka B., Dębowy J., Madej J.A., Wpływ DTC i TFX na odpowiedź komórkową i humoralną myszy poddanych stresowi unieruchomienia. Med. Wet. 51(11), Oskarsson A., Lind B., Increased lead levels in brain after long-term treatment with lead and dithiocarbamate or thiuram derivatives in rats. Acta Pharmacol. Toxicol. 56, Pawelski S Diagnostyka laboratoryjna w hematologii. Państwowy Zakład Wydawnictw Lekarskich, Warszawa. Ruszczyc Z., śywienie zwierząt i paszoznawstwo. Państwowe Wydawnictwo Rolnicze i Leśne, Warszawa. Acta Sci. Pol.

7 Rozmieszczenie endogennego Ŝelaza Sołtysiak Z., Michalska Z., Milian A., Zawartość metali cięŝkich w narządach wewnętrznych kotów miejskich. Med. Wet. 53(6), Szkoda J., śmudzki J , Pierwiastki toksyczne w tkankach zwierząt łownych. Med. Wet. 57(12), Torronen R., Marselos M., Changes in the hepatic copper content after treatment with foreign compounds. Arch. Toxicol. Suppl. 1, śmudzki J., Zawartość ołowiu, kadmu, cynku, miedzi i Ŝelaza w tkankach zwierząt domowych ze szczególnym uwzględnieniem regionów typowo rolniczych przemysłowych. Praca doktorska. Puławy. śmudzki J., Juszkiewicz T., Szkoda J., Szprengier-Juszkiewicz T., Ołów, rtęć, cynk, miedź i Ŝelazo w tkankach koni w Polsce. Med. Wet. 47(5), DISTRIBUTION OF ENDOGENIC IRON IN RABBITS AFTER INTRAVENOUS ADMINISTRATION OF DITIOCARB SODIUM Abstract. The purpose of the study was to determine the changes in the distribution of endogenic iron in rabbit tissue and body fluids after the administration of ditiocarb sodium (DTC).The study was conducted on clinically healthy mongrel rabbits. Two groups were administered DTC intravenously: the first one at the low dose of 20 mg/kg b.w. and the latter at the high dose of 200 mg/kg b.w. The control group was animals administered saline solution ( sodium chloride). After euthanasia,in 72 nd hour after injection of DTC samples of liver, kidneys, brain, skeletal muscles, perirenal fat, urine and blood were taken and mineralised dry in a muffle furnace at C. Iron was determined directly in mineralisate by the atomic spectrophotometry on a Pye Unicam SP-9 apparatus. The results obtained were subjected to statistical analysis by the Student t-test. Animals given low dose of DTC were having statistically related decrease of iron in fat, urine and plasma,and unrelated in liver,muscle and blood. After the administration of high doses of DTC (200 mg/kg b.w.) endogennic iron level were having statistically related increase in kidneys and unrelated in brain,liver, urine and plasma. In addition, it has been found, statistically relevant,decrease iron level in adipose. The results of the study indicate that DTC administered intravenously in rabbits at the dose of 20 or 200 mg/kg b.w. leads to the substantial redistribution of iron in tissues and body fluids. Key words: rabbits, ditiocarb sodium, endogennic iron, redistribution in tissues Ewa Kucharczak, Józef Dębowy, Zdzisław Jopek, Katedra Biochemii,Farmakologii i Toksykologii, Akademia Rolnicza we Wrocławiu, ul.c.k. Norwida 31, Wrocław Medicina Veterinaria 1(2) 2002