Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Wydział Medycyny Weterynaryjnej Katedra Rozrodu z Kliniką Zwierząt Gospodarskich. lek. wet. Natalia Mikołajewska

Transkrypt

1 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Wydział Medycyny Weterynaryjnej Katedra Rozrodu z Kliniką Zwierząt Gospodarskich lek. wet. Natalia Mikołajewska The effect of vitrification on the developmental competence of domestic cat oocytes Wpływ witryfikacji na kompetencję rozwojową komórek jajowych kota domowego AUTOREFERAT PRACY DOKTORSKIEJ Promotorzy: prof. Katarina Jewgenow, Leibniz Institute for Zoo and Wildlife Research w Berlinie dr hab. Wojciech Niżański, prof. UPW Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Recenzenci: prof. dr hab. Anna Chełmońska-Soyta, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu dr hab. Anna Maria Duszewska, prof. SGGW Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie

2

3 1. Wstęp Techniki wspomaganego rozrodu (ang. Assisted Reproductive Technologies, ART) od wielu lat pełnią kluczową rolę w leczeniu niepłodności u kobiet, przyspieszaniu postępu hodowlanego zwierząt gospodarskich oraz programach ratowania zagrożonych gatunków dzikich zwierząt. Wszystkie z 36 gatunków dzikich kotowatych, są sklasyfikowane w Czerwonej Księdze Gatunków Zagrożonych publikowanej przez Międzynarodową Unię Ochrony Przyrody i Jej Zasobów (IUCN). Kriokonserwacja komórek jajowych jest istotną częścią technik wspomaganego rozrodu, gdyż pozwala na czasowe rozdzielenie procesu pobierania gamet od procesu zapłodnienia. W przypadku dzikich kotowatych wiarygodna metoda kriokonserwacji komórek jajowych pozwoliłaby na zwiększenie populacji zwierząt żyjących na wolności oraz umożliwiła urozmaicenie ich puli genetycznej. Dobrym i łatwo dostępnym biomedycznym modelem do badań nad dzikimi kotowatymi jest kot domowy (Felis catus). Dowiedziono, że protokoły ART opracowane na modelu kota domowego mogą być z powodzeniem stosowane w przypadku dzikich kotowatych. Pomimo dynamicznego rozwoju ART zwierząt kotowatych, mającego miejsce w ostatnich latach, wiele zagadnień dotyczących tej dziedziny pozostaje nadal niewyjaśnionych. Kluczowym przykładem jest brak wiarygodnej i powtarzalnej metody kriokonserwacji komórek jajowych i zarodków. Komórki jajowe kota domowego mają wysoką zawartość lipidów w cytoplazmie, stąd ich przepuszczalność dla substancji krioochronnych jest zmniejszona. Prowadzi to do wysokiej wrażliwości tych komórek na uszkodzenia w czasie procesu kriokonserwacji. Ponadto, mimo 15 lat badań nie ma jasnej odpowiedzi na pytanie dotyczącej najbardziej odpowiedniego 3

4 stadium dojrzałości jądrowej komórek jajowych poddawanych kriokonserwacji. Wątpliwy pozostaje także efekt kriokonserwacji na integralność struktur subkomórkowych oraz na kompetencje rozwojową komórek jajowych. 2. Cele pracy (1) Opracowania skutecznego protokołu kriokonserwacji w oparciu o kompleksowe badania. (2) Porównanie kriokonserwacji niedojrzałych i dojrzałych komórek jajowych kota w celu wskazania najbardziej odpowiedniego stadium dojrzałości jądrowej do kriokonserwacji. (3) Opracowanie wzorców morfologicznych dla struktur cytoszkieletu oraz rozmieszczenia i agregacji mitochondriów. (4) Ocenia wpływu procesu kriokonserwacji na i. żywotność komórek ii. organizację cytoszkieletu i konfiguracji jądrowej iii. rozmieszczenie, agregację i aktywność mitochondriów iv. kompetencję mejotyczną i rozwojową niedojrzałych i dojrzałych komórek jajowych kota. 3. Materiał i metody Niniejsze badanie składało się z badań wstępnych i badań głównych. Badania przeprowadzono na 1230 komórkach jajowych kota domowego. Niedojrzałe komórki jajowe pozyskiwano z jajników kota domowego po rutynowej owariektomii. Tylko komórki jajowe o ciemnej, homogennej cytoplazmie otoczone kilkunastoma warstwami komórek wzgórka jajonośnego selekcjonowane były do doświadczeń. Badania zostały przeprowadzone za zgodą Lokalnej Komisji Etycznej (Uchwała z dnia o numerze 24/2011). Istnieją obecnie dwie techniki kriokonserwacji komórek jajowych ssaków wolne mrożenie programowane oraz 4

5 witryfikacja. Na podstawie danych z literatury oraz ze względu na wyższą przydatność do pracy w warunkach terenowych ( nie laboratoryjnych ) wybrano witryfikację jako metodę kriokonserwacji zastosowaną w niniejszym badaniu. W doświadczeniach zastosowano 2 przyrządy witryfikacyjne cryoloop i cryotop. Badania wstępne przeprowadzono w 3 etapach i miały na celu opracowanie protokołu witryfikacyjnego komórek jajowych kota domowego. W pierwszym etapie przetestowano 36 różnych roztworów witryfikacyjnych w celu oceny ich krystalizacji w temperaturach -196 C i -80 C. W kolejnym etapie obserwowano zmiany objętości komórek jajowych pod wpływem wybranych roztworów witryfikacyjnych w celu określenia czasu poszczególnych etapów procesu kriokonserwacji. W ostatnim etapie przetestowano toksyczność wybranego roztworu witryfikacyjnego. W toku badań głównych przeprowadzono 4 doświadczenia mające na celu ocenę wpływu opracowanej w badaniach wstępnych procedury witryfikacyjnej na struktury subkomórkowe i kompetencję rozwojową komórek jajowych kota. W doświadczeniach zastosowano rozwór witryfikacyjny składający się z 20% EG, 20% DMSO, 20% FCS, 1.5 M trehalozy i 10% Ficoll PM-70. 5

6 Ryc. 1 Schemat badań głównych W doświadczeniu numer 1, w celu oceny żywotności komórek jajowych poddanych witryfikacji, po ogrzaniu komórki barwiono dioctanem fluoresceiny (FDA, 10 µg/ml) i jodkiem propidyny (PI, 200 µg/ml). W doświadczeniu numer 2, w celu oceny organizacji cytoszkieletu i konfiguracji jądrowej komórek jajowych poddanych witryfikacji, po ogrzaniu komórki analizowano przy użyciu trójkolorowego barwienia fluorescencyjnego składającego się z monoklonalnego przeciwciała anty-α-tubulina koniugowanego z FITC (1:50), falloidyny znaczonej TRITC (3 µg/ml) oraz barwnika DAPI (1 µg/ml). W doświadczeniu numer 3, w celu wizualizacji mitochondriów komórek jajowych poddanych witryfikacji, po podgrzaniu komórki jajowe barwiono przy użyciu barwnika MitoTracker Red CMXRos (0.2 µm/ml). W doświadczeniu numer 4, w celu oceny kompetencji mejotycznej i rozwojowej komórek jajowych poddanych 6

7 witryfikacji, po ogrzaniu niedojrzałe komórki jajowe poddano dojrzewaniu in vitro, a następnie wszystkie komórki dojrzałe zapłodniono poprzez do-cytoplazmatyczną iniekcję plemnika (ang. intracytoplasmic sperm injection, ICSI) z użyciem świeżego nasienia pozyskanego z najądrzy kota. Wszystkie doświadczenia były przeprowadzane na co najmniej trzech pulach komórek jajowych w różnym czasie. Dane nieparametryczne porównano za pomocą testu chi-kwadrat. Dane parametryczne za pomocą ednokierunkowej analizy wariancji (jednokierunkowa ANOVA) (Statistica dla Windows, Stat Soft Inc, Tulsa, OK, USA). Poziom istotności ustalono na wartość 0, Wyniki Badania wstępne W badaniach wstępnych opracowano roztwór witryfikacyjny składający się z 20% EG, 20% DMSO, 20% FCS, 1.5 M trehalozy i 10% Ficoll PM-70. Doświadczenie 1 41% (27/65) niedojrzałych i 52% (32/65) dojrzałych komórek jajowych zachowało żywotność po procesie witryfikacji z użyciem przyrządu cryoloop. 51% (33/65) dojrzałych komórek jajowych zachowało żywotność po procesie witryfikacji z użyciem przyrządu cryotop. Nie wykazano różnicy statystycznej (p > 0.05) w przeżywalności komórek w poszczególnych grupach badawczych. Żywotność witryfikowanych komórek była natomiast istotnie niższa (p < 0.05) niż komórek świeżych, w przypadku których wyniosła 81% (52/64) i 72% (78/109), odpowiednio dla komórek niedojrzałych i dojrzałych. Uzyskane wyniki nie wykazały większej przydatności, któregokolwiek stopnia dojrzałości jądrowej i zastosowanego urządzenia, do procedury witryfikacji. Wyniki 7

8 wykazały spadek żywotności komórek jajowych pod wpływem witryfikacji. Doświadczenie 2 Normalna struktura mikrotubul została zachowana u 26% (10/39) niedojrzałych i 32% (14/44) dojrzałych komórek jajowych. Normalna struktura mikrofilamentów została zachowana przez 18% (7/39) niedojrzałych i 36% (16/44) dojrzałych komórek jajowych. Normalna konfiguracja jądrowa została zachowana przez 28% (11/39) niedojrzałych i 18% (8/44) dojrzałych komórek jajowych. Otrzymane wyniki wykazały istotne statystycznie (p < 0.05) zmiany w organizacji cytoszkieletu i konfiguracji jądrowej pomiędzy witryfikowanymi, a świeżymi komórkami i zmiany te zostały uznane za prawdopodobną przyczynę obniżenia kompetencji rozwojowej witryfikowanych komórek. Uzyskane wyniki nie wykazały jednakże większej przydatności któregokolwiek stopnia dojrzałości jądrowej do procedury witryfikacji. Doświadczenie 3 Wyniki nie wykazały zmian w rozmieszczeniu mitochondriów pod wpływem dojrzewania oraz witryfikacji. Proces witryfikacji znacząco zwiększył (p < 0.05) agregację mitochondriów, nie mając jednocześnie wpływu na aktywność mitochondriów. Wykazano istotny wzrost (p < 0.05) aktywności mitochondriów podczas dojrzewania in vitro. Uzyskane wyniki wskazują, że zwiększona agregacja mitochondriów wywołana witryfikacją może mieć negatywny wpływ na kompetencję rozwojową kriokonserwowanych komórek jajowych. Doświadczenie 4 W celu oceny kompetencji mejotycznej i rozwojowej komórek jajowych poddanych witryfikacji, po ogrzaniu niedojrzałe komórki jajowe poddano dojrzewaniu in vitro, a następnie wszystkie 8

9 komórki dojrzałe zapłodniono poprzez do-cytoplazmatyczną iniekcję plemnika (ICSI) z użyciem świeżego nasienia pozyskanego z najądrzy kota. Uzyskane wyniki wykazały znaczący spadek (p < 0.05) kompetencji mejotycznej komórek jajowych poddawanych witryfikacji w porównaniu do komórek świeżych, wyrażony poprzez współczynnik dojrzewania, wynoszący odpowiednio 14,9% (23/154) i 51,5% (120/233). W wyniku zapłodnienia metodą ICSI udało się uzyskać 25 zarodków (4 i 21, odpowiednio z komórek witryfikowanych jako niedojrzałe i dojrzałe), z których 8 (1 i 7 odpowiednio z komórek witryfikowanych jako niedojrzałe i dojrzałe) osiągnęło stadium moruli. Uzyskane wyniki wykazały znacząco niższą przydatność do zapłodnienia ICSI komórek jajowych poddawanych witryfikacji przed dojrzewaniem in vitro. Na podstawie przedstawionych wyników stwierdzono, że witryfikacja dojrzałych komórek jajowych kota pozwala na uzyskanie większej liczby zarodków, po zapłodnieniu metodą ICSI, niż witryfikacja komórek niedojrzałych, wskazując tym samym na większą przydatność tego stadium dojrzewania do kriokonserwacji. 5. Dyskusja Poprawa jakości technik służących do długoterminowego przechowywania oocytów jest bardzo istotna dla zachowania materiału genetycznego ginących gatunków dzikich kotowatych. W niniejszej pracy przeanalizowano różne czynniki mogące wpłynąć na kompetencje rozwojową oocytów kota domowego po witryfikacji. Głównym założeniem badań było dokładne zbadanie skutków witryfikacji w celu uzyskania szczegółowej wiedzy na temat wpływu tej techniki na struktury wewnątrzkomórkowe i zdolność do zapłodnienia w zależności od stopnia dojrzałości jądrowej w czasie wykonywania witryfikacji. Katalizatorem dla przeprowadzenia niniejszych doświadczeń była seria artykułów naukowych wykazująca, że po witryfikacji 9

10 morfologicznie prawidłowe oocyty, nie były w stanie wznowić mejozy, wykazując, że morfologia nie jest idealnym parametrem do oceny skutków kriokonserwacji. Zgodnie z wiedzą autora dotychczas nie zostało przeprowadzone tak kompleksowe i wnikliwe badanie skutków procesu witryfikacji w komórkach jajowych kota domowego, choć potrzeba tego typu badań była wielokrotnie wyrażana. Podczas rozważania przydatności komórek jajowych, znajdujących się w różnych stadiach dojrzałości jądrowej, do procesu witryfikacji należy wziąć pod uwagę różne czynniki. Niedojrzałe i dojrzałe oocyty kota domowego są bardzo podobne, mają takie same wymiary i podobny skład biochemiczny tym ich zawartości lipidów. Niemniej jednak niedojrzałe komórki jajowe są otoczone kilkoma warstwami komórek wzgórka jajonośnego, które mogą stanowić fizyczną barierę dla przenikających substancji krioochronnych i być przeszkodą dla odprowadzenia wody z komórki. Jednocześnie obecność komórek wzgórka jajonośnego chroni przed zbyt szybkim przenikaniem substancji krioochronnych i może fizycznie chronić oocyty podczas ekspozycji na niskie temperatury. Warto podkreślić, że dostępność do badań niedojrzałych komórek jajowych jest znacznie większa niż komórek dojrzałych. Niedojrzałe komórki jajowe (znajdujące się na etapie pęcherzyka zarodkowego) mogą być pobierane z jajnika każdej zdrowiej samicy, bez względu a etap cyklu, podczas gdy w celu otrzymania komórek dojrzałych (znajdujących się na etapie metafazy drugiego podziału mejotycznego) niezbędny jest wpływ hormonów tak in vitro, jak i in vivo. Wyniki pierwszego doświadczenia nie wykazały żadnych statystycznie istotnych różnic w przeżywalności pomiędzy niedojrzałymi (41%) i dojrzałymi (52%) komórkami jajowymi po procesie witryfikacji. Wyniki te korespondują z danymi wcześniej 10

11 publikowanymi przez innych autorów. Cocchia i wsp. (2010) wykazali 45,3% przeżywalności, podczas gdy Murakami i wsp. (2004) wykazali 48,7% przeżywalności wśród komórek niedojrzałych. W badaniu Merlo i wsp. (2008) wykazali przeżywalność procesu witryfikacji na poziomie 50,2% w grupie komórek dojrzałych. Żadne z cytowanych badań nie porównywało przeżywalności pomiędzy komórkami niedojrzałymi i dojrzałymi. Prawidłowa struktura cytoszkieletu jest kluczowa dla procesu dojrzewania oraz zapłodnienia. Proces kriokonserwacji może spowodować zaburzenia w organizacji cytoszkieletu. Autorzy prac z dziedziny technik wspomaganego rozrodu zwierząt kotowatych wielokrotnie wskazywali, że uszkodzenia struktury mikrotubul lub mikrofilamentów wywołane przez witryfikację może skutkować zaburzeniami dojrzewania i zapłodnienia. Na podstawie danych z piśmiennictwa dotyczących komórek jajowych bydła, koni oraz świń opracowano trzy wzorce (A - prawidłowy, B - nieznacznie uszkodzony, C - uszkodzony) poszczególnych struktur cytoszkieletu zarówno dla komórek dojrzałych jak i niedojrzałych. Niedojrzałe komórki jajowe posiadają zdekondensowaną chromatynę i relatywnie duży pęcherzyk zarodkowy, co sprawia, że proces ich kriokonserwacji jest utrudniony. Z drugiej jednak strony, w komórkach dojrzałych chromosomy zlokalizowane są na wrzecionie podziałowym, które jest strukturą o dużej wrażliwości na temperaturę. Wyniki niniejszego badania wykazały, że wśród komórek niedojrzałych 28% zachowało prawidłową konfiguracje jądrową w czasie gdy odsetek ten wśród komórek dojrzałych wynosił 18%. Jednocześnie jednak struktura mikrofilamentów pozostała nieuszkodzona w 18% komórek niedojrzałych i 36% komórek dojrzałych. Największy odsetek komórek wykazywał nieznacznie uszkodzenia cytoszkieletu i konfiguracji jądrowej. 11

12 Zmiany te, według danych z literatury dotyczącej innych gatunków zwierząt, mogą być odwracalne. Należy także zwrócić uwagę, że duży odsetek komórek z grupy kontrolnej (komórki nie poddawane witryfikacji) charakteryzowało się nieznacznie uszkodzoną strukturą jądra, co mogło by także sugerować, że wzorzec morfologiczny dotyczący konfiguracji jądrowej zaczerpnięty od innych gatunków, nie jest w pełni odpowiedni dla komórek kota. Analiza poszczególnych struktur wykazała, że około jednej trzecia witryfikowanych oocytów zachowały normalną strukturę cytoszkieletu i konfiguracji jądrowej. Zmiany w budowie cytoszkieletu oraz konfiguracji jądrowej mogą być jedna z przyczyn obniżenia kompetencji mejotycznej i rozwojowej. W doświadczeniu 3 przeprowadzono analizę zmian rozmieszczenia mitochondriów w czasie dojrzewania i pod wpływem witryfikacji. Wyniki wykazały, że zarówno dojrzewanie, jak i proces witryfikacji nie mają wpływu na rozmieszczenie mitochondriów. U wieku gatunków zwierząt w tym bydła, świń, myszy w czasie dojrzewania dochodzi do zmiany w rozmieszczeniu mitochondriów z peryferyjnych obszarów komórki do wnętrza komórki. Sytuacja zaobserwowana w niniejszym doświadczeniu (brak zmiany w rozmieszczeniu mitochondriów) była już opisywana np. u chomika, szczura oraz małpy rezus. U powyższych gatunków do zmiany w rozmieszczeniu mitochondriów dochodzi w czasie zapłodnienia. Na podstawie przeprowadzonych badań nie możemy potwierdzić tej hipotezy w przypadku kota domowego, jest to jednak bardzo interesujący temat wymagający potwierdzenia w kolejnych badaniach. Niezależnie od braku zmian rozmieszczenia mitochondriów, w czasie dojrzewania komórek jajowych kota domowego dochodzi do wzrostu ich aktywności. Świadczy to prawdopodobnie o zwiększonym zapotrzebowaniu energetycznym ze strony komórki 12

13 dojrzałej. Wyniki niniejszego badanie wskazują, że proces witryfikacji nie ma wpływu na aktywność mitochondriów. W toku doświadczenia 3 wykazano, że witryfikacja wywiera wpływ na wzrost agregacji mitochondriów. Pewien stopień agregacji mitochondriów jest konieczny do prawidłowego funkcjonowania komórki, w badaniach prowadzonych z użyciem komórek jajowych innych gatunków zwierząt wykazano, że nadmierna agregacja mitochondriów może być przyczyną zaburzeń w przebiegu procesów wewnątrzkomórkowych. Na podstawie otrzymanych w niniejszej pracy wyników można stwierdzić, że wzrost agregacji mitochondriów może być jedna z przyczyn obniżenia kompetencji mejotycznej i rozwojowej komórek jajowych kota domowego poddawanych witryfikacji. Wysoka przeżywalność komórek poddawanych witryfikacji, niewielkiego stopnia uszkodzenia cytoszkieletu, konfiguracji jądrowej oraz mitochondriów są istotnymi wskaźnikami subkomórkowych konsekwencji tego procesu. Niemniej jednak najistotniejszym celem kriokonserwacji jest możliwość zachowania ciągłości genetycznej populacji. Wyłączając klonowanie, ciągłość genetyczna populacji może być osiągnięta jedynie poprzez proces zapłodnienia. W niniejszym badaniu do zapłodnienia in vitro zastosowano technikę ICSI. Technika ta przynosi od wielu lat bardzo korzystne wyniki w badaniach nad rozrodem wspomaganym tak ludzi jak i zwierząt. W niniejszym badaniu udało się dokonać skutecznego zapłodnienia komórek jajowych poddawanych witryfikacji zarówno w stadium niedojrzałości jak i dojrzałości. Współczynnik zapłodnienia pomiędzy tymi dwoma grupami doświadczalnymi nie różnił się istotnie, wynosząc 25% i 21,9% odpowiednio dla komórek niedojrzałych i dojrzałych. Należy jednak zaznaczyć bezwzględna liczba zarodków powstałych z komórek jajowych 13

14 poddawanych witryfikacji w stadium dojrzałości jądrowej była istotnie wyższa. W celu wymiernego przedstawienia danych obliczono dla każdej z grup współczynnik skuteczności witryfikacji biorący pod uwagę stosunek komórek jajowych pozyskanych do otrzymanych zarodków i tak w przypadku komórek poddawanych witryfikacji w stadium niedojrzałości wynosi on 2,6%, a w przypadku komórek witryfikowanych w stadium dojrzałości 6,9%. Tak wielka różnica wynika prawdopodobnie z tego, że kluczowym etapem w procesie wytworzenia zarodka jest etap dojrzewania in vitro. Na podstawie uzyskanych wyników możemy stwierdzić, że proces witryfikacji wpływa zdecydowanie obniża kompetencję mejotyczną komórek jajowych kota, co pośrednio wpływa na zmniejszenie liczby powstałych zarodków. Konkludując można stwierdzić, że proces witryfikacji komórek dojrzałych pozwala na otrzymanie większej liczby zarodków. Nie należy jednak zapominać, że ze względu na większą dostępność komórek niedojrzałych proces witryfikacji na tym etapie rozwoju może stanowić ważne narzędzie w programach ratowania ginących gatunków dzikich kotowatych. 6. Wnioski (1) Witryfikacja komórek jajowych przy użyciu opracowanej w niniejszym doświadczeniu procedury pozwala na uzyskanie: i. żywych komórek jajowych ii. komórek jajowych o prawidłowej budowie cytoszkieletu i konfiguracji jądrowej iii. komórek jajowych o prawidłowej dystrybucji, agregacji i aktywności mitochondriów iv. komórek jajowych kompetentnych mejotycznie i rozwojowo. (2) Stopnień dojrzałości jądrowej nie ma wpływu na żywotność komórek jajowych po procesie witryfikacji. 14

15 (3) Żywotność komórek jajowych po procesie witryfikacji jest niezależna od użytego przyrządu. (4) Struktura jądra komórek dojrzałych wykazuje większą wrażliwość na uszkodzenia niż komórek niedojrzałych, natomiast cytoszkielet podlega pod uszkodzeniom w podobnym stopniu. (5) Pomimo braku zmian w rozkładzie i agregacji mitochondriów w czasie dojrzewania komórek jajowych kota domowego, następuje znaczący wzrost ich aktywności. Witryfikacja nie ma wpływu na rozkład i aktywność mitochondriów, ale powoduje wzrost agregacji mitochondriów. (6) Witryfikacja znacząco obniża kompetencję mejotyczną i rozwojową komórek jajowych kota domowego. (7) Spadek kompetencji mejotycznej i rozwojowej jest spowodowany przez zmiany w cytoszkielecie i wzrost agregacji mitochondriów. (8) Witryfikacja dojrzałych komórek jajowych pozwala na uzyskanie większej liczby zarodków po zapłodnieniu metodą docytoplazmatycznej iniekcji plemnika, wskazując na większą przydatność komórek dojrzałych do procesu witryfikacji. (9) Metody oceny komórek jajowych kota domowego takie jak ocena i. żywotności ii. struktury cytoszkieletu i konfiguracji jądrowej iii. właściwości mitochondriów oraz wzorce morfologiczne opracowane w niniejszym badaniu oprócz walorów poznawczych mogą być pomocnym narzędziem przydatnym do dalszych badań w dziedzinie technik rozrodu wspomaganego zwierząt kotowatych. 15

16 7. Summary For many years, Assisted Reproductive Technologies (ART) have played a key role in the treatment of female infertility, livestock breeding management and wild animal rescue programs. All of 36 the wild cat species are classified on the Red List of Threatened Species of International Union for Conservation of Nature. Cryopreservation of female gametes is a crucial part of ART because it eliminates the obstacles of time and distance between gamete collection and fertilization. In the case of nondomestic cats, a reliable method of oocyte cryopreservation would help to increase the number of individuals living in the wild and the genetic diversity of their populations. A suitable and easily obtained biomedical model for wild felids is the domestic cat (Felis catus). Many ART protocols established on the domestic cat model have already proven successful in wild cat rescue programs. Despite the dynamic development of feline ART in recent years, refinements of the techniques are still needed. A leading example is the lack of a reliable and repeatable method of oocyte and embryo cryopreservation. Cat oocytes have a high lipid content. Thus, their permeability to cryoprotectant solutions is reduced, making these cells particularly sensitive to cyrodamage. Moreover, despite 15 years of research, there is no clear answer to the question of the most appropriate nuclear maturations stage for cryopreservation. The effect of cryopreservation on subcellular structures and developmental competence also remains unclear. By conducting a comprehensive and critical analysis of the effect of cryopreservation, the present study aimed to established an effective cryopreservation protocol and answer these questions. The main objectives of this study were to compare the cryopreservation of immature and mature cat oocytes in order to elicit the most 16

17 appropriate maturation stage for cat oocyte cryopreservation. Furthermore, the study assessed the effect of cryopreservation on (1) cell viability, (2) cytoskeleton organization and nuclear configuration, (3) mitochondria distribution, aggregation and activity and (4) meiotic and developmental competence of immature and mature cat oocytes. Two methods of mammalian oocyte cryopreservation are available: slow freezing and vitrification. Based on research on the cryopreservation of cats and other mammals, and guided by its higher suitability for field work, vitrification was the chosen cryopreservation method. The present study consists of the preliminary studies and the main studies. In both studies, immature oocytes were collected from the ovaries of domestic cats after a routine ovariectomy. Only oocytes with dark, homogenous cytoplasm, surrounded by several layers of compacted cumulus cells were selected for the experiments. The preliminary studies consisted of 3 steps and were performed in order to establish the vitrification protocol. In the course of the first step, crystallization of 36 defined vitrification solutions was tested at -196 C and -80 C. Subsequently, observations were made of changes in oocyte volume under the influence of a selected vitrification solution in order to determine the time needed for each step of the procedure. Finally, the toxicity of the chosen vitrification solution was tested. The main studies consisted of 4 experiments and were performed in order to determine the effect of the established vitrification procedure on subcellular structures and the developmental competence of cat oocytes. Based on the results of preliminary studies, a vitrification solution composed of 20% EG, 20% DMSO, 20% FCS, 1.5 M trehalose, 10% Ficoll PM-70 was 17

18 chosen. Two different vitrification devices were used in the study: the cryoloop and the cryotop. In Experiment 1, in order to assess cell viability in vitrified oocytes, upon warming, oocytes were stained with fluorescein diacetate (FDA) and propidium iodide (PI). When the cryoloop was used 41% of immature and 52% of mature oocytes remained viable after vitrification. When the cryotop was used, 51% of mature oocytes remained viable after vitrification with the. Viability did not differ statistically (p > 0.05) between groups of vitrified oocytes. Viability of vitrified oocytes was, however, significantly lower (p < 0.05) than viability of fresh oocytes (81% and 72% in immature and mature oocytes, respectively). The results obtained did not demonstrate the superiority of any nuclear maturation stage or vitrification device in terms of viability, but demonstrated a decrease of viability influenced by vitrification. In Experiment 2, in order to assess the cytoskeleton organization and nuclear configuration of vitrified oocytes, upon warming, oocytes were analyzed by three-color fluorescent staining composed of FITC-anti-α-tubulin monoclonal antibody, TRITClabeled phalloidin and DAPI. Normal microtubules structure was preserved by 26% and 32% of immature and mature oocytes, respectively, and normal microfilaments structure was preserved by 18% and 36% of immature and mature oocytes, respectively. Normal nuclear configuration was preserved by 28% and 18%, in immature and mature oocytes, respectively. The results demonstrated a significant difference (p < 0.05) in the organization of the cytoskeleton and nuclear configuration between vitrified and fresh oocytes, which were considered to be the probable cause of the decline of developmental competence after vitrification, not indicating, however, the superiority of any maturation stage. In Experiment 3, in order to observe the mitochondria of vitrified oocytes, upon warming, oocytes were stained with a 18

19 MitoTracker Red CMXRos solution. No changes in mitochondria distribution between fresh and cryopreserved oocytes, in either the immature or the mature group, were observed in the present study. Vitrification significantly increased mitochondria aggregation, while having no effect on their activity. A significant increase (p < 0.05) in mitochondria activity during in vitro maturation was demonstrated. The results suggest that the increased aggregation of mitochondria induced by vitrification might have a negative impact on further developmental competence of cryopreserved oocytes. In Experiment 4, in order to assess the meiotic and developmental competence of vitrified oocytes, upon warming, immature oocytes were matured in vitro and subsequently mature oocytes were fertilized by ICSI with the use of fresh epididymal cat sperm. The results demonstrated a significant decrease (p < 0.05) in the meiotic competence of oocytes subjected to vitrification when compared to fresh oocytes, expressed by 14.9% and 51.5% maturation rates in vitrified and fresh oocytes, respectively. As a result of ICSI, 25 embryos were developed (4 and 21 from oocytes vitrified as immature and mature, respectively). Out of them 8 developed until the morula stage (1 and 7 from oocytes vitrified as immature and mature, respectively). Further results demonstrated significantly lower (p < 0.05) usefulness for vitrification of immature oocytes compared to mature oocytes. In conclusion, it can be stated that vitrification of mature cat oocytes can result in a greater number of embryos after fertilization by the ICSI method, indicating a definite greater practical utility of mature cat oocytes for vitrification. Taking into account all the results obtained, it can be concluded that the vitrification protocol established by this study allows both immature and mature oocytes to be preserved with their normal subcellular structure, and to mature in vitro, to be fertilized and to develop to the morula stage. At the same time, it must be 19

20 emphasized that vitrification, by inducing cytoskeleton organization changes and enhancing mitochondria aggregation, reduce meiotic and developmental competence of cat oocytes. The morphological patterns and assessment methods established in the present study are an advance in the knowledge and development of assisted reproduction techniques in cats. These patterns and methods should be especially useful for further research on vitrification. The knowledge about the subcellular alterations induced by vitrification allows further researchers to be more powerful in the struggle to find a reliable method of domestic and non-domestic cats oocytes cryopreservation. 20