A N N A L E S U N I V E R S I T A T I S M A R I A E C U R I E - S K Ł O D O W S K A L U B L I N P O L O N I A

Transkrypt

1 A N N A L E S U N I V E R S I T A T I S M A R I A E C U R I E - S K Ł O D O W S K A L U B L I N P O L O N I A VOL. XV SECTIO EEE 2005 Katedra Genetyki i Hodowli Rolin Ogrodniczych Akademii Rolniczej w Lublinie ELBIETA KACZMARSKA Ocena zrónicowania genetycznego potomstwa Fragaria moschata x Potentilla fruticosa przy uyciu markerów RAPD Estimation of Genetic Differentiation of Progenies Fragaria moschata x Potentilla fruticosa by RAPD Markers Synopsis. Jednym ze sposobów poszerzania zmiennoci genetycznej u rolin jest krzyowanie odległych taksonów, dlatego w wielu programach hodowlanych wykonywane s krzyowania midzygatunkowe a nawet midzyrodzajowe. W niniejszej pracy badano zrónicowanie genetyczne potomstwa F 1 pochodzcego z krzyowania midzyrodzajowego: Fragaria moschata x Potentilla fruticosa. Oba gatunki nale do rodziny Rosaceae o podstawowej liczbie chromosomów x = 7. Obliczony na podstawie analizy markerów RAPD współczynnik podobiestwa wg Dice a dla form rodzicielskich wynosił tylko 0,13. Analiza markerów molekularnych wykazała wiksze podobiestwo mieszaców do formy matecznej F. moschata. redni współczynnik podobiestwa genetycznego wynosił w tym przypadku 0,717, natomiast do formy ojcowskiej P. fruticosa 0,442. Słowa kluczowe key words: krzyowanie midzyrodzajowe intergeneric crossing, markery molekularne molecular markers, mieszace hybrids WSTP W wielu programach hodowlanych krzyowanie oddalone stosuje si, aby uzyska roliny o nowych korzystnych cechach i zwikszy zmienno genetyczn. Próby krzyowania gatunków z rodzaju Fragaria i Potentilla były uzasadnione ze wzgldu na do bliskie pokrewiestwo obu rodzajów (nale one do rodziny Rosaceae o podstawowej liczbie chromomów x = 7). Rodzaj Fragaria obejmuje gatunki zielne, trwałe, rozmnaajce si przez nasiona lub wegetatywnie. Jedn z cech odróniajcych gatunki z rodzaju Fragaria od gatunków z rodzaju Potentilla jest przekształcanie dna kwiatowego w misisty owoc.

2 146 ELBIETA KACZMARSKA Autorzy wielu prac (Ellis, 1962; Szangin-Berezowskij, 1963; Asker, 1971; Niemirowicz-Szczytt, 1985) obserwowali, e roliny potomne pochodzce z krzyowania rodzajów Fragaria i Potentilla s fenotypowo bardzo podobne do formy matecznej, co okrela si jako dziedziczenie matroklinalne. Matroklinalno oznacza, e potomstwo powstało apomiktycznie, a wic w tym wypadku bez udziału formy zapylajcej (Niemirowicz-Szczytt, 1980). Tylko u niektórych rolin obserwowano cechy typowe dla ojcowskiego gatunku Potentilla. Najczciej cechami markerowymi wskazujcymi na mieszacowy charakter rolin było ółte lub kremowe zabarwienie kwiatów typowe dla gatunków Potentilla. Metod, która w ostatnim czasie zdobyła uznanie dla identyfikacji mieszaców, jest stosowanie markerów molekularnych, uzyskanych na drodze losowej amplifikacji polimorficznego DNA technik RAPD (Karp, 2000). W ten sposób potwierdzono m. in. mieszacowo rolin otrzymanych w wyniku krzyowa: Hydrangea macrophylla x H. arborescens (Kudo i Niimi, 1999) oraz Lilium nobilissimum x L. regale (Obata i wsp., 2000). Markery RAPD były równie stosowane do potwierdzenia obecnoci genomów obydwu partnerów w mieszacach oddalonych Brassica oleracea x Camelina sativa (Hansen, 1998). Okrelenie mieszacowego charakteru rolin F 1 jest szczególnie potrzebne tam, gdzie potomstwo jest fenotypowo bardzo podobne do roliny matecznej. Jak podaje Kowalska i in. (2001) w przypadku krzyowa Fragaria x Potentilla mateczny wygld rolin F 1 jest bardzo czstym zjawiskiem. Celem podjtych w niniejszej pracy bada było okrelenie zrónicowania genetycznego w potomstwie F 1 powstałym z krzyowania midzyrodzajowego Fragaria moschata z Potentilla fruticosa przy uyciu markerów RAPD. MATERIAŁ I METODA Materiałem dowiadczalnym były roliny F 1 uzyskane z kontrolowanego krzyowania midzyrodzajowego pomidzy heksaploidaln Fragaria moschata (Duch.) (liczba chromosomów: 2n = 6x = 42) jako forma mateczna i diploidaln Potentilla fruticosa (L.)(o 2n = 2x = 14 chromosomach) jako dawca pyłku. F. moschata jest bylin dorastajc do 0,4 m, u nasady krótkich pdów nadziemnych wyrastaj 3-listkowe licie, tworzc gst rozetk. Z któw lici wyrastaj wici, zwane rozłogami, na których tworz si młode roliny. Badane osobniki miały kwiaty mskosterylne, małe, o białych płatkach korony (Fot. 1.A). Po zapyleniu, z rozronitego dna kwiatowego powstaje misisty owoc rzekomy o korzennym smaku. Charakterystyczne cechy fenotypowe P. fruticosa to: zdrewniałe pdy, wysoki wzrost (ok. 1 m), krzewiasty pokrój, ółta barwa kwiatów i bardzo obfite kwitnienie kilkaset lub wicej kwiatów na rolinie; rolina ta nie tworzy rozłogów (Fot. 1.B). adna z analizowanych rolin F 1 nie posiadała w/w cech formy ojcowskiej. Kształt lici u potomstwa był zbliony do F. moschata, lecz były one znacznie mniejsze. Wród rolin F 1 wystpiły formy o pokroju zwartym i krótkich kwiatostanach lub lunym pokroju z długimi ogonkami liciowymi, wysokich kwiatostanach i mał liczb lici w rozecie. Najbardziej zmienn cech mierzaln była liczba rozłogów; niektóre roliny nie posiadały rozłogów, a inne tworzyły ich bardzo duo. Wszystkie roliny F 1 wytwarzały kwiatostany (Fot. 1.C), jednake ok. 30% potomstwa było bezpłodne. Wikszo rolin tworzyła kwiaty mskie z bardzo słabo wykształconym dnem kwiatowym, podobnie jak u P. fruticosa.

3 OCENA ZRÓNICOWANIA GENETYCZNEGO POTOMSTWA A B C Fot. 1. Kwitnce roliny F. moschata (A), P. fruticosa (B) i mieszaca F 1 Flowering plants F. moschata (A), P. fruticosa (B) and F 1 hybrid

4 148 ELBIETA KACZMARSKA Analizowano czterdzieci pi rolin potomnych i obie populacje rodzicielskie reprezentowane przez 10 rolin stanowicych klon. Pobieranie materiału do analizy RAPD przeprowadzono w czerwcu 2002 roku. Izolacj komórkowego DNA wykonano w oparciu o procedur opracowan przez Doyle & Doyle i zmodyfikowan przez Rowland i Nauyen (1993). Stenie uzyskanego DNA mierzono na spektrofotometrze Gene Quandt i rozcieczono steryln wod do stenia 40 mg µl -1. DNA amplifikowano technik PCR-RAPD stosujc 10 starterów o nastpujcej sekwencji nukleotydów: Symbol Sekwencja nukleotydowa 5-3 J13 J19 D16 H17 T4 T2B G01 G02 G09 G10 -CCACACTACC- -GGACACCACT- -AGGGCGTAAG- -CACTCTCCTC- -GTCCTCAACG- -CTACACAGGC- -GGGAATTCGG- -TGCTGCAGGT- -TCGCGACCGC- -CCGATATCCC- Reakcje zostały przeprowadzone w termocyklerze firmy Perkin Elmer DNA Thermal Cycler 480. Zastosowano nastpujce cykle termiczne: wstpna denaturacja przez 2 min w 95 o C; 45 cykli: 94 o C 45 sekund, 37 o C 45 sekund, 72 o C 45 sekund, z kocow inkubacj w 72 o C przez 10 minut. Uzyskane w reakcji produkty rozdzielano w 1,5% elu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny (0,01%) przez 1,5 godziny przy napiciu 80V. Analiz elektroforogramów przeprowadzono przy uyciu programu Scion Image. Analiz skupie przeprowadzono metod UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic averages) w oparciu o wartoci podobiestw (F) liczonych według wzoru Dice a: F = 2 x N xy /((2 x N xy ) + N x +N y ) (za Nei i Li 1979), gdzie N xy jest liczb prków wspólnych dla genotypów X i Y, N x i N y to całkowite liczby prków uzyskanych dla genotypu X i Y. Nastpnie, pokrewiestwa pomidzy badanymi genotypami zostały przedstawione na dendrogramie (ryc. 1). WYNIKI Analizowano tylko powtarzalne produkty amplifikacji, do intensywne i rónice si wielkoci od fragmentów ssiednich. Liczba fragmentów amplifikowanych przez jeden starter wahała si od 3 do 9 (tab. 1). Pierwszym etapem poszukiwania markerów do testowania mieszacowoci było znalezienie polimorfizmu w genotypach partnerów. W wyniku reakcji przeprowadzonych na DNA form rodzicielskich uzyskano łcznie 56 prków,

5 OCENA ZRÓNICOWANIA GENETYCZNEGO POTOMSTWA Współczynnik Coefficient Ryc. 1. Dendrogram UPGMA uzyskany na podstawie podobiestw Dice a Dendrogram generated by UPGMA clustering of the similarity matrix Pot Fra tru2 tru9 tru3 tru4 tru5 tru6 tru11 tru12 tru33 tru21 tru29 tru31 tru19 tru23 tru28 tru26 tru27 tru22 tru24 tru30 tru20 tru25 tru32 tru39 tru18 tru7 tru8 tru15 tru40 tru43 tru35 tru38 tru44 tru45 tru34 tru36 trus37 tru41 tru42 tru10 tru13 tru14 tru17 tru16 trus1 z czego a 52 (tj. 92,85%) to produkty polimorficzne, a tylko 4 to prki wspólne. Wyniki te wiadcz o duym zrónicowaniu genetycznym gatunków rodzicielskich F. moschata i P. fruticosa, co potwierdza take bardzo niski współczynnik podobiestwa wg Dice a wynoszcy tylko 0,13. Sporód łcznej liczby 61 obserwowanych u rolin F 1 markerów RAPD-33 (53,20%) pochodziło od matecznej F. moschata a 19 (31,14%) pochodziło od ojcowskiej P. fruticosa.

6 Lp. No Tab. 1. Zestawienie produktów RAPD uzyskanych przy uyciu 10 starterów i obserwowanych u rolin F 1 i form rodzicielskich The statement of RAPD products obtained by 10 primers and characteristic for F 1 plants and parental genotypes Starter Primer Liczba prków ogółem total number of bands wspólnych dla obu rodziców common for both parents Liczba prków Number of bands matecznej maternal F. m. ojcowskiej paternal P. f. F 1 mateczne maternal % rolin F 1 posiadajcych prki % F 1 plants with bands ojcowskie paternal wspólne common 1. H ,67 51,11 15,56 2. T2B ,11 77,78 3. G ,78 64,45 4. G ,07 72,22 5. G ,33 4,44 6. G ,78 62,22 75,55 7. T ,37 61,11 26,60 8. J ,26 73,33 71,11 9. J ,45 57, D ,88 82,22 77,77 82,00 Razem liczba prków Total number of bands % prków % bands rednio Mean 100,00 6,56 54,09 31,15 8,2 78,87 59,30 73,30 50,00 F 1

7 OCENA ZRÓNICOWANIA GENETYCZNEGO POTOMSTWA L P F Fot. 2. Obraz elektroforetyczny, uzyskany w wyniku reakcji RAPD przy uyciu startera G 09 na DNA rodzicielskim i rolin F 1. Kolejno profili: marker masy czsteczkowej (L), P. fruticosa (P), F. moschata (F), 17 rolin F 1 w górnym rzdzie, 17 rolin F 1 w dolnym rzdzie. Strzałk zaznaczono prek rónicujcy 830 pz wystpujcy wyłcznie w F 1 RAPD pattern obtained with primer G 09 on parental DNA end F 1 plants. Patterns: molecular weight marker (L), P. fruticosa (P), F. moschata (F), 17 F 1 plants in high line, 17 F 1 plants in down line. The arrow indicates polymorphic band 830 bp occuring only in F 1 plants L F P Fot. 3. Obraz elektroforetyczny, uzyskany w wyniku reakcji RAPD przy uyciu startera D 16 na DNA rodzicielskim i rolin F 1. Kolejno profili: marker masy czsteczkowej (L), F.moschata (F), P. fruticosa (P), 17 rolin F 1 w górnym rzdzie, 17 rolin F 1 w dolnym rzdzie. Strzałk zaznaczono prek ojcowski 960 pz obecny u 82,2% potomstwa RAPD pattern obtained with primer D 16 on parental DNA end F 1 plants. Patterns: molecular weight marker (L), F. moschata (F), P. fruticosa (P), 17 F 1 plants in high line, 17 F 1 plants in down line. The arrow indicates paternal band 960 bp occuring in 82.2% of progenies

8 152 ELBIETA KACZMARSKA Tab. 2. Zestawienie współczynników podobiestwa rolin F 1 do matecznej F. moschata i ojcowskiej P. fruticosa The statement of genetic pairwise similarities between F 1 plants and maternal F. moschata and paternal P. fruticosa Numer roliny Number of plants Współczynnik podobiestwa do: Similarity coefficient to: F. moschata P. futicosa 1 0,667 0, ,605 0, ,718 0, ,684 0, ,692 0, ,720 0, ,741 0, ,703 0, ,723 0, ,730 0, ,725 0, ,747 0, ,685 0, ,658 0, ,707 0, ,639 0, ,667 0, ,789 0, ,747 0, ,725 0, ,658 0, ,700 0, ,753 0, ,734 0, ,750 0, ,786 0, ,756 0, ,765 0, ,750 0, ,734 0, ,658 0, ,750 0, ,707 0, ,753 0, ,701 0, ,732 0, ,750 0, ,738 0, ,756 0, ,769 0, ,692 0, ,701 0, ,684 0, ,675 0, ,716 0,448 redni Mean 0,717 0,442 Maksymalny Maximum 0,789 0,556 Minimalny Minimum 0,605 0,313

9 OCENA ZRÓNICOWANIA GENETYCZNEGO POTOMSTWA Stwierdzono take 5 produktów (8,20%), które nie wystpowały u adnej z form rodzicielskich ale pojawiły si u rolin F 1. Tylko 2 prki z 19 charakterystycznych dla ojcowskiej P. fruticosa wystpiły u wszystkich rolin potomnych. Obecno tych markerów u rolin F 1 wskazuje na udział obu form rodzicielskich w powstawaniu potomstwa, a markery te mona uzna za rónicujce. Pozostałe prki ojcowskie stwierdzono u znacznie mniejszej liczby potomstwa, bo rednio u 59,3% rolin. Na podstawie uzyskanych profili RAPD dla rolin potomnych i obu form rodzicielskich wyliczono współczynniki podobiestwa genetycznego. Ich warto- ci zamieszczono w tabeli 2. Ponad 90% rolin F 1 charakteryzowała si stosunkowo niskim współczynnikiem podobiestwa do ojcowskiej P. fruticosa wynoszcym rednio 0,44, a tylko u 8,89% potomstwa współczynnik ten był nieco wyszy i wynosił 0,51 0,56. Współczynniki podobiestwa rolin F 1 do matecznej F. moschata były znacznie wysze ni do formy ojcowskiej i wynosiły rednio 0,72. A 95,5% potomstwa charakteryzowało si stosunkowo wysokimi współczynnikami podobiestwa do formy matecznej zawierajcymi si w przedziale 0,66 0,80. U pozostałych 4,5% rolin F 1 współczynnik ten wynosił: 0,61 0,65. DYSKUSJA Uzyskane profile RAPD wskazuj, e udział obu rodziców w potomstwie F 1 jest nierówny. Krzyowane gatunki s heterozygotyczne i maj rón liczb genomów. Mateczna F. moschata jest heksaploidem, wic moe przekaza potomstwu 3 genomy, a diploidalna P. fruticosa tylko 1 genom. Dlatego te roliny F 1 mog mie inn liczb genomów ni formy rodzicielskie lub zrónicowan liczb genomów. Jak podaje Tarkowski (1974), mieszace midzyrodzajowe w pierwszym pokoleniu czsto s podobne fenotypowo do jednego z rodziców. Na ogół podobiestwo jest tym wiksze, im wicej chromosomów wnosi forma rodzicielska. Poza tym w pokoleniu F 1 ujawniaj si cechy dominujce i dopiero w pokoleniu drugim nastpuje ich rozszczepienie. Pojawiaj si wówczas róne fenotypy zblione mniej lub bardziej do jednego z rodziców (najczciej eskiego) oraz formy porednie. Wiele bada dotyczcych moliwoci uzyskania mieszaców oddalonych przeprowadziła K. Niemirowicz-Szczytt (1980, 1982, 1985). Krzyowania wykonane przez autork midzy matecznymi F. virginiana i F. ananassa oraz sze- cioma gatunkami piciorników doprowadziły do powstania szeciu dojrzałych rolin mieszacowych przypominajcych eskiego rodzica. W innej pracy (1982) zapylono dziesi odmian truskawki pyłkiem dziewitnastu gatunków Potentilla. Wród uzyskanego potomstwa nie zaobserwowano podobiestwa do piciorników pod wzgldem adnej z badanych cech morfologicznych i okrelono to potomstwo jako matroklinalne. Mc Farlane-Smith i Jones (1985) oraz

10 154 ELBIETA KACZMARSKA Kowalska (1999, 2001) w swoich pracach sugeruj taki sposób powstawania potomstwa w przypadku krzyowania rolin z rodzaju Fragaria i Potentilla. Obserwowana w uzyskanym potomstwie segregacja cech morfologicznych wskazuje na wystpujc wród tych rolin zmienno, co moe oznacza, e jest to potomstwo mieszacowe. Z przedstawionych wyników bada wynika, e potomstwo powstałe z krzyowania midzyrodzajowego F. moschata x P. fruticosa było bardziej podobne do formy matecznej ni do ojcowskiej. WNIOSKI 1. Uzyskane markery RAPD wskazuj na znaczny polimorfizm obu krzyowanych gatunków rodzicielskich. Współczynnik podobiestwa genetycznego midzy nimi wynosił 0, redni współczynnik podobiestwa rolin F 1 do formy matecznej wynosił 0,717, natomiast do formy ojcowskiej był niszy 0, Obecno u wszystkich rolin F 1 prków H i T4-280 charakterystycznych dla P. fruticosa moe wskazywa na ich mieszacowy charakter. 4. Uycie starterów: H17, T4, T2B, G09, G10, J19, J13, D16 pozwoliło na uzyskanie markerów rónicujcych badany materiał rolinny. PIMIENNICTWO A s k e r S., Some viewpoints on Fragaria x Potentilla intergeneric hybridization. Hereditas. 67: E l l i s J. R., Fragaria Potentilla intergeneric hybridization and evolution in Fragaria. Proc. Linn. Soc. 173: H a n s e n L. N., Intertribal somatic hybridization between rapid cycling Brassica oleracea L. and Camelina sativa (L.) Cranz. Euphytica. 104: K a r p A., Molecular tools for detecting genetic diversity. Acta Hort., 530: K o w a l s k a B., Mieszace midzyrodzajowe Fragaria x Potentilla. Mat. Ogólnopol. Konf. Nauk., pt. Genetyka i Taksonomia Rolin. Pozna: 21. K o w a l s k a B., T y r k a M., H o r t y s k i J.A., Phenotypic and molecular characters of Fragaria and Potentilla hybrids. XVI th Eucarpia Congress Plant Breeding: Sustaining the Future. Edinburgh. Book of Abstracts: 47. K u d o N., N i i m i Y., Production of interspecific hybrid plants through cotyledonary segment culture of embryos derived from crosses between Hydrangea macrophylla f. hortensia (Lam.) Rehd. and H. arborescens L. J. Japan. Soc. Hort. Sci. 68: M c F a r l a n e - S m i t h W. H., J o n e s J. K., Intergeneric crosses with Fragaria and Potentilla. Crosses between Fragaria moschata and Potentilla fruticosa. Euphytica. 34: N e i M., L i W.H., Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: N i e m i r o w i c z - S z c z y t t K., Osignicia w zakresie krzyowania rodzajów Fragaria Potentilla. Wiad. Bot., 24 4: N i e m i r o w i c z - S z c z y t t K., Apomiksja w rodzinie róowatych. Wiad. Bot., 26:

11 OCENA ZRÓNICOWANIA GENETYCZNEGO POTOMSTWA N i e m i r o w i c z S z c z y t t K., Results of intergeneric Fragaria and Potentilla ssp. crosses. Acta Hort., 159: O b a t a Y., N i i m i Y., N a k a n o M., O k a z a k i K., M i y a j i m a I., Interspecific hybrids between Lilium nobilissimum and L. regale produced via ovules with with placenta tissue culture. Sci. Hort. 84: R o w l a n d L. J., N g u y e n B., Use of PEG for purification of DNA from leaf tissue of woody plants. BioTechniques 14: S z a n g i n - B e r e z o w s k i j G. N., Distant hybridization in strawberries. Trudy Inst. Genet. 30: T a r k o w s k i C., Genetyka. Hodowla rolin. Nasiennictwo. PWN. Warszawa. SUMMARY One method of extension genetic variability in plants is crossing between distant taxons. In many breeding programs interspecies and intergeneric crossing are realized. Genetic differentiation in the F 1 progeny of Fragaria moschata x Potentilla fruticosa was studied in the experiment. Both of these species belong to the Rosaceae family with basic chromosome number x = 7. Genetic similarity by Dice obtained by RAPD markers was very low 0,13. Molecular markers analysis proved, that hybrids were more similar to mother s F. moschata. An average genetic similarity in this case was 0.717, whereas to father s form P. fruticosa