WPŁYW CZYNNIKÓW FIZYKO-CHEMICZNYCH ORAZ

Transkrypt

1 WPŁYW CZYIKÓW FIZYKO-CHEMICZYCH ORAZ WARUKÓW PRZECHOWYWAIA A WŁAŚCIWOŚCI PRZECIWUTLEIAJĄCE WYBRAYCH PRODUKTÓW ŻYWOŚCIOWYCH Cel ćwiczenia 1. Określenie wpływu warunków przechowywania, zamrażania, ogrzewania, promieniowania mikrofalowego na zawartość polifenoli i aktywność antyoksydacyjną wybranych owoców i warzyw. 2. Ocena aktywności antyoksydacyjnej przygotowanych produktów metodą ABTS i DPPH. 3. Oznaczanie ogólnej zawartości polifenoli metodą kolorymetryczną z odczynnikiem Folin-Ciocalteu. Przygotowanie prób (dzień 1) 1. Pokroić wybrany surowiec (kapusta biała, kapusta czerwona, brokuły lub brukselka) na drobne kawałki (< 0,5 cm) i dokładnie wymieszać w celu ujednolicenia próby. 2. Przygotować 2 plastikowe tacki, 4 pojemniczki plastikowe zakręcane (podpisać nr 2-5) i 3 zlewki (podpisać nr 6-8). 3. Przenieść do naczyniek rozdrobniony surowiec w ilości do 2/3 wysokości pojemnika plastikowego. Opisać surowiec i proces obróbki. 4. Porcje surowca poddać działaniu odpowiednich czynników zgodnie z tabelą poniżej. Próbka Czynnik Czas działania 1-80 C (kontrola) 2 doby (na tacce!) 2 Zamrażarka -20 C 2 doby 3 Lodówka +4 C 2 doby 4 Temperatura pokojowa (pojemnik przykryć lekko 2 doby podziurkowaną folią spożywczą lub papierem) 5 Temperatura pokojowa (zamknąć w pojemniku 2 doby próżniowym) 6 Mikrofale o max mocy (kuchenka ROMIX, 5 min gotować mikrofalowo w wodzie) 7 Mikrofale o min mocy (kuchenka ROMIX, 15 min gotować mikrofalowo w wodzie) 8 Gotowanie w wodzie (nad palnikiem gazowym, mieszając) 20 min 5. W przypadku próbek nr 6-8 po gotowaniu należy osączyć warzywa z wody. Monitorować gotowanie, żeby warzywa nie wykipiały. 1

2 6. Przygotować na 2 tackach przegrodę z folii aluminiowej, dzielącą tacę na pół. a każdą połowę (opisaną z boku lub od spodu) przełożyć całą odsączoną zawartość ze zlewek nr 6-8. Materiał rozłożyć na dnie równomierną warstwą za pomocą łyżeczki lub bagietki, nie ubijać, przykryć folią aluminiową i zamrozić w temp. -80 C. a pustą połówkę tacki nałożyć kontrolę (próbka nr 1). 7. Zliofilizować zawartość wszystkich pojemniczków (wykonuje prowadzący). Przygotowanie ekstraktów (dzień 2) 1. Zliofilizowane warzywa rozetrzeć w moździerzu. 2. Do suchej i czystej kolby stożkowej (100 ml) ze szlifem odważyć po dokładnie 0,250 g rozdrobnionego liofilizatu i natychmiast zalać 50 ml 80% metanolu. 3. Do kolby włożyć mieszadełko, zatkać korkiem i pozostawić na 2 h na mieszadle magnetycznym (500 rpm). 4. Przesączyć całość przez sączek do czystej kolbki miarowej na 50 ml, dopełnić do kreski metanolem (po doprowadzeniu do temp. pokojowej), przelać do probówki wirowniczej i zwirować (3000 obr/min, 5 minut, 20 C). 5. adsącz zebrać do czystej, zakręcanej probówki na 50 ml. Podpisać. 6. Do czasu analizy przechowywać w zamrażarce. Analiza aktywności antyoksydacyjnej metodą z rodnikiem ABTS (dzień 3) Roztwór podstawowy ABTS* (7 mm ABTS, 2.45 mm K 2 S 2 O 8 ) 1. Przygotowanie 4,9 mm roztworu nadsiarczanu potasu K 2 S 2 O 8 : odważyć 0,132 g (dokładnie!) K 2 S 2 O 8 przenieść ilościowo do kolbki miarowej na 100 ml dopełnić do kreski wodą redestylowaną dokładnie wymieszać, aż do całkowitego rozpuszczenia (30 minut na mieszadle magnetycznym) roztwór jest stabilny 1 dzień. 2. Przygotowanie PBS, ph 7,4: do czystej butelki 500 ml wsypać 2 tabletki PBS dopełnić do około 400 ml wodą redestylowaną, co jakiś czas mieszać, aż do całkowitego rozpuszczenia (około 2-3 godzin). 3. Przygotowanie ABTS* do zakręcanej probówki na 15 ml odmierzyć pipetą automatyczną 1,3 ml 4,9 mm roztworu K 2 S 2 O 8, dodać 1 tabletkę ABTS (2,2 -azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) nie dotykać palcami!!! dodać 1,3 ml wody podwójnie destylowanej, zakręcić probówkę, dokładnie wymieszać, owinąć szczelnie folią aluminiową, 2

3 odstawić na 16 h w temperaturze pokojowej, w ciemnym miejscu. Roztwór podstawowy ma mieć kolor ciemnozielony. Przechowywać w lodówce, nie zamrażać! Roztwór roboczy ABTS (ABTS 0.7 ) Rozcieńczyć za pomocą PBS roztwór ABTS* tak, by jego absorbancja przy 734 nm wynosiła A = 0,7 ± 0,02 (najlepiej gdy A jest bliższe 0,72). Przygotować taką ilość roztworu ABTS 0,7 by wystarczyła do analizy wszystkich próbek i wykonania krzywej standardowej (licząc po 1 ml na każdy punkt pomiarowy). Gotowy roztwór przechowywać w butelce z ciemnego szkła ze szlifem. Metoda ta pozwala na ilościową ocenę zmiatania wolnych rodników na podstawie zdolności składnika do wygaszania stabilnego rodnika ABTS. Kwas 2,2 -azyno-bis (3-etylenobenzotiazolinowy) (rys. 1.) jest syntetycznym kationorodnikiem, rozpuszczalnym w wodnych i organicznych roztworach, pozwalającym na pomiar przeciwutleniaczy zarówno hydrofilowych, jak i hydrofobowych. Jest on wrażliwy na światło i musi być przetrzymywany w ciemności. W przeciwieństwie do DPPH rodnik ten nie jest dostępny w formie aktywnej. W handlu występuje pod postacią nieaktywnej soli dwuamonowej i generuje się go albo poprzez reakcję chemiczną (np. z dwutlenkiem manganu, nadsiarczanem potasu, ABAP) lub enzymatyczną (z peroksydazą, mioglobiną, hemoglobiną). HO 3 S Rys. 1. Budowa chemiczna rodnika ABTS Et S S Et SO 3 H Krzywa standardowa Troloxu dla ABTS 1. W probówkach typu Eppendorf przygotować rozcieńczenia 1 mm roztworu Troloxu w PBS zgodnie z poniższą tabelą Lp Stężenie końcowe standardu [mg/100 ml] Objętość PBS [μl] Objętość 1mM Troloxu [μl] , , , Do 7 kuwet odmierzyć po 1 ml ABTS 0.7 3

4 3. Ustawić spektrofotometr: Single Component Analysis; liczba standardów 6, wpisać kolejno stężenia standardów (wg tabeli powyżej); długość fali 734 nm; zero, nonintercept; czas pomiaru 0,2 sek; liczba powtórzeń: 3 4. Ustawić blank w aparacie: PBS 5. Dodać do pierwszej kuwety 100 l roztworu Troloxu z probówki nr 1 i równocześnie włączyć stoper, dokładnie wymieszać (przepipetować) zawartość kuwety (uważać, żeby nie powstały żadne pęcherzyki powietrza!) 6. Po 30 sekundach dodać do kolejnej kuwety 100 l roztworu z probówki nr 2 itd. 7. W chwili, kiedy stoper pokaże dokładnie 6 minut odczytać absorbancję pierwszej kuwety (należy 3-krotnie kliknąć w pole standardu żeby spektrofotometr przeczytał absorbancję 3 razy i wyciągnął średnią). 8. Po 30 sekundach (na stoperze 6:30) odczytać w analogiczny sposób absorbancję roztworu w następnej kuwecie itd. 9. Po odczytaniu A wszystkich roztworów Troloxu wykreślić krzywą wzorcową. Pomiar próbek metodą ABTS 1. W probówkach typu Eppendorf przygotować kolejne rozcieńczenia (dwu-, pięcio- i dziesięciokrotne) przygotowanych na poprzednich zajęciach ekstraktów w buforze PBS. 2. Do kuwet odmierzyć po 1 ml ABTS Ustawić blank w aparacie: PBS. 4. Dodać do pierwszej kuwety 100 l pierwszego badanego ekstraktu i równocześnie włączyć stoper, dokładnie wymieszać (przepipetować) zawartość kuwety (uważać, żeby nie powstały żadne pęcherzyki powietrza). 5. Zmierzyć absorbancję próbek (w 6. minucie), na podstawie krzywej wyliczyć aktywność przeciwutleniającą badanych ekstraktów (w mg Troloxu/100 ml ekstraktu). Uzyskane wyniki przeliczyć na mg Troloxu/g s.s., wyciągnąć wnioski i zamieścić je w sprawozdaniu. Analiza aktywności antyoksydacyjnej metodą z rodnikiem DPPH Przygotowanie roztworu 1. Odważyć 0,012 g DPPH w naczyńku wagowym, przenieść ilościowo do kolby miarowej na 100 ml uwaga: DPPH słabo się rozpuszcza, kryształki mogą zatykać końcówkę pipety i powodować jej zalanie! 2. Dopełnić do kreski czystym etanolem (do 100 ml) 3. Odstawić na mieszadło magnetyczne na co najmniej 1 godzinę 4. Po całkowitym rozpuszczeniu DPPH przenieść roztwór do butelki z ciemnego szkła. Roztwór ma kolor ciemno fioletowy! W oznaczeniu metodą DPPH przeciwutleniacze obecne w badanej próbce redukują stabilny rodnik azotowy 2,2-difenylo-1-pikrylohydrazyl (DPPH) powodując spadek absorbancji mierzonej przy długości fali 517 nm (rys.2.). Roztwór aktywnego rodnika ma 4

5 barwę purpurową, a jego odbarwienie świadczy o tym, że niesparowany dotąd elektron został sparowany.. + RH H + R. O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 Rys. 2. Reakcja redukcji rodnika DPPH przez antyutleniacz Krzywa standardowa Troloxu dla DPPH 1. W probówkach typu Eppendorf przygotować rozcieńczenia 1 mm roztworu Troloxu w etanolu zgodnie z poniższą tabelą: Lp Stężenie końcowe Objętość Objętość standardu [mg/100ml] EtOH [ l] 1 mm Troloxu [µl] , , , , , Do 6 kuwet odmierzyć po 0,6 ml EtOH. 3. Do każdej z kuwet dodać po 0,2 ml przygotowanego roztworu DPPH nie dotykając końcówką do etanolu, po nałożeniu do wszystkich kuwet przepipetować tą końcówką zawartość wszystkich kuwet. 4. Ustawić spektrofotometr: Single Component Analysis; liczba standardów 6, wpisać kolejno stężenia standardów (wg tabeli powyżej); długość fali 517 nm; zero, nonintercept; czas pomiaru 0,2 sek; liczba powtórzeń: Ustawić w aparacie blank: EtOH. 5

6 6. Dodać do pierwszej kuwety 200 l roztworu Troloxu z probówki nr 1 i równocześnie włączyć stoper, dokładnie wymieszać (przepipetować) zawartość kuwety (uważać, żeby nie powstały żadne pęcherzyki powietrza). 7. Po 30 sekundach dodać do kolejnej kuwety 200 l roztworu z probówki nr 2 itd. 8. W chwili, kiedy stoper pokaże dokładnie 10 minut odczytać absorbancję roztworu z pierwszej kuwety (należy 3-krotnie kliknąć w pole standardu żeby spektrofotometr zmierzył absorbancję 3 razy i wyciągnął średnią). 9. Po 30 sekundach (na stoperze 10:30) odczytać w analogiczny sposób A roztworu w następnej kuwecie itd. 10. Po odczytaniu A wszystkich roztworów Troloxu wykreślić krzywą wzorcową. Pomiar próbek metodą DPPH 1. W probówkach typu Eppendorf przygotować kolejne rozcieńczenia (dwu-, pięcio- i dziesięciokrotne) badanych ekstraktów w wodzie redestylowanej. 2. Przygotować mieszaninę 0,6 ml EtOH i 0,2 ml DPPH w kuwecie, dokładnie przepipetować, żeby kolor był jednolity UWAGA: Dla ułatwienia i przyspieszenia pracy można przygotować sobie rozcieńczenie DPPH. W tym celu: odmierzyć w suchej, czystej kolbie miarowej dokładnie 25 ml roztworu DPPH, przelać ilościowo do kolby miarowej na 100 ml (wypłukiwać kolbę etanolem, aż etanol będzie całkiem bezbarwny), dopełnić kolbę do kreski etanolem (czyli do 100 ml). Wymieszać, aż kolor roztworu będzie jednolity. Przelać zawartość do 2 butelek z ciemnego szkła na 50 ml. Tak rozcieńczony roztwór dodajemy do kuwet w ilości 0,8 ml! 3. Odczytać blank: EtOH 4. Dodać do pierwszej kuwety 0,2 ml rozcieńczonego pierwszego badanego ekstraktu (ekstrakt nr 1) i równocześnie włączyć stoper, dokładnie wymieszać (przepipetować) zawartość kuwety (uważać, żeby nie powstały pęcherzyki powietrza!). Po 30 sekundach do drugiej kuwety dodać 0,2 ml kolejnego rozcieńczenia ekstraktu nr 1, po kolejnych 30 sekundach, do następnej kuwety, dodać 0,2 ml następnego rozcieńczenia itd. 5. Pomiar absorbancji roztworu w kuwecie wykonać dokładnie w 10 minut od dodania ekstraktu do kuwety, na podstawie krzywej wyliczyć aktywność przeciwutleniającą badanych ekstraktów (w mg Troloxu/ 100 ml ekstraktu). Przeliczyć na mg Troloxu/g s.s. warzywa. Wyciągnąć wnioski i zamieścić je w sprawozdaniu. Oznaczenie zawartości polifenoli ogółem metodą Folin-Ciocalteu Wykonanie krzywej wzorcowej 1. Z roztworu standardowego (+)katechiny o stężeniu 50 mg/100 cm 3 (w 80% metanolu) przygotować rozcieńczenia do krzywej wzorcowej. 2. W tym celu do kolby miarowej na 25 cm 3 dodać: 0,5; 1,25; 2,5; 3,75; 5,0 cm 3 standardowego roztworu katechiny i dopełnić metanolem do kreski. 3. astępnie z każdej kolby pobrać 2,5 cm 3 do kolb miarowych na 25 cm 3 i dopełnić wodą redestylowaną. 6

7 4. Z tak przygotowanych roztworów do kolb stożkowych przenieść po 5 cm 3 roztworu, dodać 0,25 cm 3 odczynnika Folina-Ciocalteu (rozcieńczonego wcześniej wodą redestylowaną w stosunku 1:1 v/v) oraz 0,5 cm 3 7% roztworu a 2 CO 3. Zamieszać i pozostawić w ciemności na 30 min. 5. Po tym czasie zmierzyć absorbancję w spektrofotometrze przy długości fali λ = 760 nm (blank = metanol). Wykreślić krzywą wzorcową. Badanie właściwe 1. Przygotować rozcieńczenia (w 80% metanolu) ekstraktów. 2. Z tak przygotowanych roztworów pobrać do kolb miarowych na 25 cm 3 po 2,5 cm 3 i dopełnić wodą. 3. Pobrać 5 cm 3 tak rozcieńczonego ekstraktu, dodać 0,25 cm 3 odczynnika Folina Ciocalteu (1:1) oraz 0,5 cm 3 7% a 2 CO 3. Wymieszać i pozostawić na 30 min w ciemności. 4. Zmierzyć absorbancję w spektrofotometrze przy długości fali λ = 760 nm (blank = metanol). 5. Z krzywej wzorcowej odczytać zawartość polifenoli ogółem wyrażoną w mg katechiny/100 ml ekstraktu. 6. Wyciągnąć wnioski i zamieścić je wraz z wynikami w sprawozdaniu. Piśmiennictwo 1. Apak R., Güclü K.G., Özyürek M., Karademir S.E.: ovel total antioxidant capacity index for dietary polyphenols and vitamins C and E, using their cupric iron reducing capability in the presence of neocuproine: CUPRAC method, J. Argic. Food Chem. 2004, 52, Arnao M.B.: Some methodological problems in the determination of antioxidant activity using chromogen radicals: a practical case, Trends Food Sci. Technol. 2000, 11, Arts M.J.T.J., Haenen G.R.M.M., Voss H.P., Bast A.: Antioxidant capacity of reaction products limits the applicability of the Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) assay, Food Chem. Toxicol. 2004, 42, Bartosz G.: Druga twarz tlenu. Wydawnictwo naukowe PW, Warszawa, Grajek W. (praca zbiorowa) Przeciwutleniacze w żywności. Aspekty zdrowotne, technologiczne, molekularne i analityczne. WT, Warszawa, Korotkova E.I., Karbainov A.Y., Shevchuk A.V.: Study of antioxidant properties by voltammetry, J. Electroanal. Chem. 2002, 518, Miller.J., Rice-Evans C.A., Davies M.J., Gopinathan V., Milner A.: A novel method for measuring the antioxidant capacity, 1993, 84, Miller.J., Rice-Evans C.A.: Factors influencing the antioxidant activity determined by the ABTS + radical cation assay, Free Radical Res. 1997, 26, Prior R. L., Wu X., Schaich K.: Standarized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. J. Agric. Food Chem. 2005, 53, Re R., Pellegrini., Porteggente A., Pannala A., Yang M., Rice-Evans C.: Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radic. Res., 1999, 26 (9/10), Sanchez-Moreno C.: Review: Methods used to evaluate the free radical scavenging activity in foods and biological systems, Food Sci. Tech. Int. 2002, 8 (3), Schlesier K., Harwat M., Böhm V., Bitsch R.: Assessment of antioxidant activity by using different in vitro methods. Free Radic. Res., 2002, 36 (20), Swain T., Hillis W.E.: The phenolic constituents of Prunus domestica. I. The quantitative analysis of phenolic constituents; J. Sci. Food. Agric. 1959, 10;