Ocena ekspresji markerów apoptozy w ziarninie w przewlekłym

Transkrypt

1 147 Ocena ekspresji markerów apoptozy w ziarninie w przewlekłym zapaleniu ucha środkowego Evaluation of apoptosis expression in granulation tissue in chronic otitis media Anna Pajor, Marian Danilewicz¹, Tomasz Durko, Andrzej Jankowski SUMMARY Introduction: There is a growing evidence that molecular and cellular mechanisms may play a role in pathogenesis in chronic otitis media. The aim of the study: was to determine the intensity of apoptosis in granulation tissue in chronic otitis media. Material and method: Fifty four patients with chronic otitis media, who underwent surgical treatment, were enrolled into the study. The apoptosis was measured in paraffin-embedded granulation tissue specimens by an immunohistochemical methods, by staining with a monoclonal antibody against apo-1/fas/cd95 and P53 protein. The bacteriological evaluation of middle ear discharges were also done. Results: It was found statistically significant difference in expression of apo-1/fas antigen between the groups with good clinical course (good healing and without recurrence) than those in the group with poor healing and recurrence (mean percentage of immunopositive cells 1,52 vs 3,34 respectively, p<0,001). The activity of apo-1/fas antigen was more intense in tissue samples from the group with bacterial infection caused by Pseudomonas aeruginosa/proteus sp/staphyloccocus MRSA than those in the group without this infection (mean percentage of immunopositive cells 3,78 vs 1,75 respectively, p<0,001). The differences were also observed for P53 protein expression between the same groups, however they were not significant. There was no differences between the groups of patients with granulomatous and cholesteatomatous chronic otitis media. The signifi cant negative correlation was found between expression of apo-1/fas antigen and expression of P53 protein (r= - 0,64, p<0,001). Conclusions: In granulation tissue in chronic otitis media different expression of apo-1/fas antigen was found in relationship to clinical course of disease and bacterial infection caused by Pseudomonas aeruginosa/proteus sp/staphyloccocus MRSA. It may suggest that apoptosis mediated by apo-1/fas mechanism may contribute to pathogenesis of chronic otitis media. Hasła indeksowe: przewlekłe zapalenie ucha środkowego, ziarnina, apoptoza Key words: chronic otitis media, granulation tissue, apoptosis Wstęp Przebieg kliniczny i niepowodzenie w leczeniu chirurgicznym przewlekłego zapalenia ucha środkowego (p.z.u.śr.) zależą od wielu czynników, wśród których wymienia się postać zapalenia, czas trwania choroby, rodzaj towarzyszącej infekcji bakteryjnej i sposób leczenia [1]. Istotnym problemem są nawracające zaostrzenia procesu zapalnego, które prowadzą do stopniowego pogarszania się stanu słuchu. W wyniku stanu zapalnego w jamach ucha środkowego powstaje ziarnina, która złożona jest z naczyń i tkanki łącznej i wraz z naciekiem zapalnym stanowi najbardziej typowy wykładnik p.z.u.śr. Da Costa i wsp. [2] stwierdzili jej występowanie w ponad 95% kości skroniowych u chorych z przewlekłym zapaleniem ucha środkowego. W rozwoju przewlekłego zapalenia ucha środkowego podkreśla się ostatnio znaczenie molekularnych i komórkowych procesów patofizjologicznych, zwłaszcza rolę procesów apoptozy i proliferacji. W coraz liczniejszych pracach oceniano ekspresję różnych substancji bioaktywnych, zarówno w perlaku jak i w innych postaciach przewlekłego zapalenia ucha środkowego, ale wyniki tych badań są niejednoznaczne [3-13]. Apoptoza jest aktywnym procesem prowadzącym do śmierci komórki, w którym usuwane są komórki uszkodzone, zużyte i niepotrzebne. Bierze udział w wielu procesach fizjologicznych i patologicznych w organizmie, w embriogenezie, onkogenezie, funkcjonowaniu komórek układu immunologicznego, zakażeniach wirusowych, w rozwoju chorób autoimmunologicznych i neurodegeneracyjnych [14]. Apoptoza może być aktywowana przez dwa podstawowe mechanizmy: zewnętrzny, receptorowy (szlak Fas/FasL) i wewnętrzny, mitochondrialny (szlak zależny od białka P53), ale poznano również inne drogi indukcji poprzez szlak pseudoreceptorowy z udziałem perforyny i granzymu B, szlak sfingomielinowo-ceramidowy i szlak indukowany stresem związany z siateczką cytoplazmatyczną [15 17]. W mechanizmie zewnątrzkomórkowym sygnał apoptozy przekazywany jest przez receptory śmierci Otolaryngol Pol 2009; 63 (2): by Towarzystwo Otorynolaryngologów Chirurgów Głowy i Szyi Otrzymano/Received: Zaakceptowano do druku/accepted: I Katedra Otolaryngologii UM w Łodzi, Uniwersytecki Szpital Kliniczny nr 1 im. N. Barlickiego Kierownik: prof. dr hab. med. Tomasz Durko Pracownia Morfometrii Zakładu Nefropatologii U.M. w Łodzi¹ Kierownik: prof. dr hab. med. Marian Danilewicz Praca finansowana w ramach projektu badawczego Uniwersytetu Medycznego w Łodzi, nr tematu Wkład pracy autorów/ Authors contribution: według kolejności Konflikt interesu/ Conflicts of interest: Autorzy pracy nie zgłaszają konfliktu interesów. Adres do korespondencji/ Address for correspondence: imię i nazwisko: Anna Pajor adres pocztowy: I Katedra Otolaryngologii UM w Łodzi Uniwersytecki Szpital Kliniczny nr 1 im. N. Barlickiego ul. Kopcińskiego Łódź tel. (42) fax grappa@csk.umed. lodz.pl

2 148 PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS (apo-1/fas/cd95, TNF-R1, TRAMP (TNF related apoptosis mediating protein /DR3, TRAIL-R1 (TNF related apoptosis inducing ligand)/dr4, TRAIL-R2/DR5, DR6) należące do rodziny receptorów czynnika martwicy guza TNFR (tumor necrosis factor receptor) [14, 18-20]. W części cytoplazmatycznej receptora mają one domenę śmierci (DD death domain), dzięki której rekrutują cząsteczki adaptorowe. Najlepiej poznanym z receptorów śmierci jest receptor Fas (CD95, apo-1), będący proteiną błonową typu I o ciężarze cząsteczkowym 47-kDa. Przekazuje on sygnał apoptozy do komórki poprzez swój ligand FasL, który jest proteiną błonową typu II o ciężarze cząsteczkowym 37-kDa należącą do rodziny czynnika martwicy guza TNF (tumor necrosis factor) [20]. Po połączeniu receptora Fas z FasL, do Fas przyłącza się białko adaptorowe FADD domena śmierci związana z Fas (Fas-associated death domain), a do niego przez jego domenę efektorową śmierci (DED death effector domain) prokaspaza 8 lub 10, nieaktywna forma kaspazy 8 lub 10. Receptor Fas, FADD oraz prokaspaza 8 lub 10 tworzą kompleks inicjujący apoptozę (DISC death-inducing signaling complex). Zaktywowana kaspaza 8 albo 10 uruchamia kaskadę kaspaz i prowadzi do śmierci komórki [21]. W mechanizmie wewnątrzkomórkowym mitochondrialnym indukcji apoptozy dochodzi do uwolnienia z mitochondrium do cytoplazmy cytochromu c. Łączy się on tam z białkiem Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1) i razem z prokaspazą -9 tworzą apoptosom, a następnie aktywując kaspazę -9 inicjują kaskadę kaspaz. W mechanizmie tym dużą rolę odgrywa białko P53. Jest ono produktem genu p53 i reguluje wiele szlaków molekularnych jak cykl komórkowy, syntezę DNA, apoptozę. Uważane jest też za jeden z najbardziej istotnych elementów kancerogenezy. Białko P53 wpływa na zwiększenie uwalniania cytochromu c, poprzez indukcję ekspresji genów proapoptotycznych białek zależnych od p53, takich jak Puma, Bax, Apaf-1 czy Noxa lub hamowanie ekspresji białek antyapoptotycznych, do których należą m.in. Bcl-2 i surwiwina [17, 22]. Oba szlaki apoptozy wewnątrz- i zewnątrzkomórkowy mogą łączyć się przez skrzyżowanie ścieżek (crosstalk) za pośrednictwem białka Bid (BH3 interacting domain death agonist), białka proapoptotycznego z rodziny Bcl-2 i mającego tylko domenę BH3. Może ono ulec proteolizie dzięki działaniu kaspazy 8, której aktywacja przez kompleks inicjujący apoptozę (DISC) jest elementem szlaku zewnątrzkomórkowego. Białko to w postaci skróconej tbid (truncated Bid) łączy się z białkiem Bax i może wpływać na uwalnianie cytochromu c z mitochondrium, co stanowi składową szlaku wewnątrzkomórkowego [17, 23]. Celem pracy jest ocena ekspresji markerów apoptozy (receptora apo-1fas/cd95 i białka P53) w ziarninie w przewlekłym zapaleniu ucha środkowego w zależności od przebiegu klinicznego choroby, zakażenia bakteryjnego i postaci p.z.u.śr. Materiał i metoda Badania przeprowadzono u 54 chorych w wieku od 19 do 77 lat (średnia 46,4±15,6 lat), 33 mężczyzn i 21 kobiet, z przewlekłym zapaleniem ucha środkowego poddanych leczeniu chirurgicznemu (operacja radykalna i radykalna zmodyfikowana). Badania przeprowadzono w porównawczych grupach chorych zróżnicowanych ze względu na: przebieg kliniczny choroby (grupa N przebieg kliniczny choroby był pomyślny, tj. proces gojenia pooperacyjnego przebiegał prawidłowo i nie stwierdzono nawrotu choroby i grupa R przebieg kliniczny choroby był niekorzystny, tj. proces gojenia był przedłużony i powikłany nawrotem procesu zapalnego); Tabela I. Charakterystyka badanych grup chorych z przewlekłym zapaleniem ucha środkowego: grupa N przebieg kliniczny choroby pomyślny, grupa R - przebieg kliniczny niekorzystny; grupa B1 ze współistniejącym zakażeniem Pseudomonas aeruginosa/proteus sp/staphyloccocus MRSA, grupa NB1 bez współistniejącego zakażenia bakteryjnego lub z zakażeniem bakteryjnym innym niż w grupie B1; grupa Z - zapalenie ziarninowe bez perlaka, grupa P - zapalenie z perlakiem. Cecha Grupa N Grupa R Grupa B1 Grupa NB1 Grupa Z Grupa P Liczba osób Wiek: zakres średnia(sd) ,8±17, ,7±12, ,8±13, ,8±16, ,8±15, ,6±16,0 Płeć: K/M 0,44 0,34 0,4 0,38 0,42 0,31 Zakażenie bakteryjne(+), w tym P.aerug./ Prot./ Staph. MRSA (+) 68% 79,3% 100%* 58,8%* 65,8%* 93,8%* 16%* 55,2%* 100%* 0%* 31,6% 50,0% Istotność statystyczna między grupami: * p< 0,05

3 149 Przyjęto, że przebieg kliniczny był pomyślny, jeżeli do 3 miesięcy po zabiegu operacyjnym ucho uległo wygojeniu, a w okresie 3-letniej obserwacji nie było wycieków z ucha i nawrotów stanu zapalnego. współistnienie i rodzaj zakażenia bakteryjnego (grupa B - ze współistniejącym zakażeniem bakteryjnym i grupa NB bez współistniejącego zakażenia bakteryjnego; dodatkowo ze względu na patogenność bakterii i trudności w ich eradykacji wyróżniono grupę B1 ze współistniejącym zakażeniem Pseudomonas aeruginosa/proteus sp/staphyloccocus MRSA i grupę NB1 bez współistniejącego zakażenia bakteryjnego lub z zakażeniem bakteryjnym innym niż w grupie B1); W grupie chorych B u 20 osób wyhodowano bakterie Pseudomonas aeruginosa, Proteus sp. i/lub Staphylococcus aureus MRSA, u pozostałych 20 osób stwierdzono zakażenie następującymi drobnoustrojami: Dyphteroides spp. u 5 osób (współistniejące z Escherichia coli ESBL (-) u 2 osób), Staphylococcus epidermidis u 4 osób, Staphylococcus aureus u 10 osób (współistniejące z Streptococcus pneumoniae u 1 osoby) i Escherichia coli ESBL (-) u 1 osoby. Zakażenie grzybicze Candida parapsilosis występowało u dwóch chorych jako współistniejące z zakażeniem bakteryjnym, u jednego chorego ze Staphylococcus aureus, u drugiego z Pseudomonas aeruginosa i Stahylococcus aureus. postać przewlekłego zapalenia ucha środkowego (grupa Z - zapalenie ziarninowe bez perlaka i grupa P zapalenie z perlakiem). W grupie chorych o niekorzystnym przebiegu klinicznym p.z.u.śr. średnia wieku była niższa niż w grupie chorych o pomyślnym przebiegu choroby (42,7 vs 50,8 lat, p=0,057) i częściej występowało u nich zakażenie Pseudomonas aeruginosa/proteus sp/staphyloccocus MRSA (55,2% vs 16%, p=0,002). Ponadto, współistniejące zakażenie bakteryjne częściej stwierdzono w grupie chorych z perlakiem w porównaniu z grupą chorych bez perlaka (93,8% vs 65,8%, p=0,003). Charakterystykę grup badanych przedstawiono w tabeli I. Badaniom poddano ziarninę usuwaną z jamy bębenkowej. Przeprowadzono analizę wybranych markerów apoptozy za pomocą oceny ekspresji w skrawkach parafinowych metodą immunohistochemiczną antygenu apo-1/fas i białka P53. Badania immunohistochemiczne Skrawki parafinowe o grubości 4 mikrometrów nałożone na szkiełka Superfrost odparafinowano w szeregu ksylenów i odwodniono w szeregu alkoholi. Następnie skrawki płukano w dwóch zmianach wody destylowanej. W celu odzyskania antygenowości tkanek skrawki gotowano w 0,01 M buforze cytrynianowym o ph 6,0 (DAKO, Target Retrieval Solution) w kuchence mikrofalowej przy następujących poziomach mocy 360 W (2 x 3 minuty), 180 W (2 x 5 minut), 90 W (2 x 5 minut). Po wystudzeniu, skrawki płukano dwukrotnie w 0,05 M buforze TRIS (TBS, DAKO) o ph 7,6, przez 5 minut i inkubowano przez 10 minut w 3% roztworze nadtlenku wodoru (H2O2) w celu zablokowania aktywności endogennej peroksydazy. Następnie poddano je całonocnej inkubacji z właściwymi pierwotnymi przeciwciałami rozcieńczonymi w rozcieńczalniku zawierającym komponent blokujący tło (DAKO; Antibody Diluent with Background Reducing Components). Zastosowano następujące przeciwciała: mysie antyludzkie przeciwciało monoklonalne apo-1/fas (Monoclonal Mouse Anti-Human CD-95, APO-1/Fas, DX2 DAKO, Glostrup, Denmark, rozcieńczenie 1:25) oraz mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiemu białku P53 (Monoclonal Mouse Anti-Human p53 Protein, DAKO, Glostrup, Denmark, rozcieńczenie 1:50). Inkubację przeprowadzono w komorze wilgotnej w temperaturze 4 C. Po inkubacji, skrawki dwukrotnie płukano w buforze TBS, a następnie, aby uwidocznić reakcje antygen-przeciwciało, stosowano system wizualizacyjny EnVision/HRP/DAB+ firmy DAKO Cytomation. Po 30-minutowej inkubacji skrawków z użyciem wtórnych przeciwciał znakowanych peroksydazą Ryc. 1. Komórki apo-1/fas pozytywne w ziarninie w przewlekłym zapaleniu ucha środkowego. Pow. 400x. Ryc. 2. Komórki P53 pozytywne w ziarninie w przewlekłym zapaleniu ucha środkowego. Pow. 400x.

4 150 PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS chrzanową przeprowadzano reakcję enzymatyczną, stosując substrat dla peroksydazy tetrachlorek 3,3 diaminobenzydyny (DAB). Po zakończeniu reakcji immunohistochemicznej jądra komórkowe podbarwiano hematoksyliną wg Meyera (2 min), a następnie odwadniano w szeregu alkoholi o rosnących stężeniach, przeprowadzano przez szereg ksylenów i zaklejano DPX. Kontrolę negatywną stanowiły skrawki, w których pierwotne przeciwciało zastąpiono buforem TBS, stosując powyżej opisaną procedurę immunohistochemiczną. Morfometria Badania morfometryczne wykonano używając komputerowego systemu do analizy obrazu. W skład systemu wchodził komputer PC wyposażony w kartę digitalizacji obrazu firmy Indeo (Taiwan), współpracujący z kolorową kamerą telewizyjną firmy Panasonic sprzężoną z mikroskopem badawczym Jenaval (Carl Zeiss Jena). Jako element wskaźnikowy systemu posłużyła mysz optyczna wchodząca w skład tabletu graficznego (Pentagram). System pracował pod kontrolą programu MultiScan wersja 8.08 wyprodukowanego przez firmę Computer Scanning Systems (Warszawa). Wykorzystano funkcję systemu służącą do zliczania obiektów metodą półautomatyczną. Odsetek komórek apo-1/fas+ i P53+ oceniano przez zliczenie 100 komórek w pięciu polach ekranu monitora (0.029 mm 2 każde), znacząc kursorem myszy komórki immunopozytywne tak, że w każdym przypadku analizowano 500 komórek. Przykład ekspresji antygenu apo-1/fas i białka P53 przedstawiono na ryc. 1 i 2. Ponadto, u wszystkich chorych przed operacją pobrano wymaz z ucha na badania bakteriologiczne w kierunku bakterii tlenowych i grzybów. Przeprowadzano także testy wykrywające fenotypy i mechanizmy oporności wyizolowanych drobnoustrojów (MRSA, ESBL, HLAR, MLSB, MBL, VISA/VRSA). Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą testu t-studenta i U Manna-Whitneya, korelacje wyników indywidualnych między ocenianymi markerami określono współczynnikiem korelacji Pearsona. Za wartość istotną statystycznie przyjęto p<0,05. Wyniki Stwierdzono istotne statystycznie różnice w średnich wartościach antygenu apo-1/fas między grupami chorych o dobrym i nawrotowym przebiegu klinicznym przewlekłego zapalenia ucha środkowego (1,52 vs 3,34 odpowiednio, p<0,001) (tab. II). Nie wykazano różnic w średnich wartościach antygenu apo-1/fas między grupami chorych bez i z zakażeniem bakteryjnym (1,89 vs 2,72 odpowiednio, p=0,19). Obserwowano istotnie wyższą średnią wartość antygenu apo-1/fas w grupie osób ze współistniejącym zakażeniem bakteryjnym Pseudomonas aeruginosa/proteus sp./staphyloccocus MRSA w porównaniu z grupą chorych bez tego zakażenia (3,78 vs 1,75 odpowiednio, p<0,001) (tab. II). Różnice stwierdzono również dla białka P53 między powyższymi grupami chorych, jednak były one nieistotne statystycznie (tab. III). Nie wykazano natomiast istotnych różnic w ekspresji ocenianych markerów apoptozy, zarówno antygenu apo-1/fas, jak i białka P53 między grupami chorych z ziarniną i z perlakiem (tab. II i III). Stwierdzono istotną ujemną korelację między nasileniem ekspresji antygenu apo-1/fas a białka P53 w całej badanej grupie chorych (r= - 0,64, p<0,001). Korelacje te są znamienne statystycznie we wszystkich analizowanych grupach, ale najwyższe wartości współczynnika korelacji obserwowano w grupie R o niekorzystnym przebiegu klinicznym choroby (r= - 0,68, p<0,001), w grupie B z zakażeniem bakteryjnym (r= - 0,68, p<0,001), w grupie B1 ze współistniejącym zakażeniem Pseudomonas aeruginosa/proteus sp./staphyloccocus MRSA (r= - 0,67, p<0,002) i w grupie P z perlakiem (r= - 0,65, p<0,001) (tab. IV). Omówienie W badaniach własnych oceniano nasilenie procesu apoptozy w ziarninie w przewlekłym zapaleniu ucha środkowego w zależności od przebiegu klinicznego choroby, rodzaju współistniejącego zakażenia bakteryjnego i postaci p.z.u.śr. Do oceny wybrano markery dwóch głównych szlaków apoptozy: antygen apo-1/fas i białko P53. Stwierdzono znamiennie wyższą ekspresję antygenu apo-1/fas w grupie chorych o nawrotowym przebiegu klinicznym p.z.u.śr. oraz u chorych z zakażeniem bakteryjnym trudnym do eradykacji (Pseudomonas aeruginosa/proteus sp./staphyloccocus MRSA), natomiast nie wykazano różnic w zależności od postaci choroby. Nie obserwowano również różnic istotnych statystycznie dla drugiego z ocenianych markerów apoptozy, białka P53, w żadnej z badanych grup. Stwierdzono wysoką ujemną korelację między nasileniem antygenu apo-1/fas i białka P53. Rola apoptozy w patomechanizmie przewlekłego zapalenia ucha środkowego nie została wyjaśniona. Dotychczas znaczenie jej badano przede wszystkim w perlaku, stosując różne metody oceny, co może wpływać na rozbieżność wyników. Motamed i wsp. [9] obserwowali małą ekspresję P53 w perlaku i nie wykazali różnic między nim a skórą przewodu słuchowego zewnętrznego. Podobnie Bayazit i wsp. [4] zanotowali niską aktywność P53 i nie obserwowali różnic ze względu na lokalizację perlaka. Odmiennie, Albino i wsp. [3] wykazali 9- do 20- krotne zwiększenie aktywności białka P53 w perlaku, ale nie zauważyli różnic w zależności od jego typu. Huisman i wsp. [6] stwierdzili zwiększony odsetek Ki67,

5 151 Tabela II. Wartości nasilenia apoptozy oceniane na podstawie ekspresji antygenu apo-1/fas (% komórek immunopozytywnych) w ziarninie w różnych grupach chorych z przewlekłym zapaleniem ucha środkowego Apo-1/Fas (%) Zakres (min-max) Średnia ± SD p Cała grupa badana (n=54) 0,2 6,8 2,50 ± 2,05 Grupa N (n=25) 0,2 5,0 1,52 ± 1,46 <0,001 Grupa R (n=29) 0,2 6,8 3,34 ± 2,12 Grupa B (n=40) 0,2 6,8 2,72±2,2 0,19 Grupa NB (n=14) 0,2 5,0 1,89±1,39 Grupa B1 (n=20) 0,2 6,8 3,78 ± 2,37 <0,0002 Grupa NB1 (n=34) 0,2 5,0 1,75± 1,39 Grupa Z (n=38) 0,2 6,8 2,43 ± 2,01 0,69 Grupa P (n=16) 0,2 6,6 2,68± 2,19 Grupa N przebieg kliniczny choroby pomyślny; grupa R - przebieg kliniczny niekorzystny; grupa B ze współistniejącym zakażeniem bakteryjnym; grupa NB bez współistniejącego zakażenia bakteryjnego; grupa B1 ze współistniejącym zakażeniem Pseudomonas aeruginosa/proteus sp/staphyloccocus MRSA, grupa NB1 bez współistniejącego zakażenia bakteryjnego lub z zakażeniem bakteryjnym innym niż w grupie B1; grupa Z zapalenie ziarninowe bez perlaka; grupa P - zapalenie z perlakiem. Tabela III. Wartości nasilenia apoptozy oceniane na podstawie ekspresji białka P53 (% komórek immunopozytywnych) w ziarninie w różnych grupach chorych z przewlekłym zapaleniem ucha środkowego Białko P53 (%) Zakres (min-max) Średnia ± SD P Cała grupa badana (n=54) 0,0 19,0 9,99 ± 4,89 Grupa N (n=25) 4,4 18,6 11,1 ± 3,91 0,12 Grupa R (n=29) 0,0 19,0 9,03 ± 5,49 Grupa B (n=40) 0,0 19,0 9,66 ± 5,02 0,40 Grupa NB (n=14) 4,4 17,4 10,94 ± 4,53 Grupa B1 (n=20) 0,0 19,0 8,34 ± 5,37 0,057 Grupa NB1 (n=34) 4,4 18,6 10,96 ± 4,38 Grupa Z (n=38) 2,0 17,4 9,75± 4,25 0,59 Grupa P (n=16) 0,0 19,0 10,55 ± 6,29 Grupa N przebieg kliniczny choroby pomyślny; grupa R - przebieg kliniczny niekorzystny; grupa B ze współistniejącym zakażeniem bakteryjnym; grupa NB bez współistniejącego zakażenia bakteryjnego; grupa B1 ze współistniejącym zakażeniem Pseudomonas aeruginosa/proteus sp/staphyloccocus MRSA, grupa NB1 bez współistniejącego zakażenia bakteryjnego lub z zakażeniem bakteryjnym innym niż w grupie B1; grupa Z zapalenie ziarninowe bez perlaka; grupa P - zapalenie z perlakiem. P21 i P53 pozytywnych komórek w nabłonku perlaka, natomiast ekspresja innych markerów apoptozy (oceniana na podstawie aktywności kaspazy-3 i fragmentacji DNA metodą TUNEL) była minimalna. Inni autorzy obserwowali nasilenie apoptozy w perlaku sugerując, że proces ten miałby doprowadzić do nagromadzenia debris keratyny i wzrostu perlaka [7, 10 12]. Miyao i wsp. [24] stwierdzili w warstwach perlaka rozmieszczenie kaspaz 8 i 3, które biorą udział w mechanizmie apoptozy indukowanej przez receptory śmierci, natomiast nie obserwowali aktywności transkrypcyjnego czynnika jądrowego NF-κB, będącego inhibitorem apoptozy. Z kolei Sheikoleshlam i wsp. [25] wykazali dodatnią korelację między apoptozą a poziomem galektyny-3, mającej działanie antyapoptotyczne, co autorzy interpretują jako mechanizm obronny przeciwko nadmiernej apoptozie. Zwiększoną apoptozę obserwowano w perlaku w porównaniu z rakiem płaskonabłonkowym ucha sugerując, że ma ona równoważyć nadmierną proliferację [13, 26]. Choufani

6 152 PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS Tabela IV. Wartości współczynnika korelacji Pearsona r między ekspresją antygenu apo-1/fas i białka P53 w ziarninie w różnych grupach chorych z przewlekłym zapaleniem ucha środkowego Apo-1/Fas a P53 Wartość współczynnika korelacji r p Cała grupa badana - 0,64 < 0,001 Grupa N - 0,50 < 0,05 Grupa R - 0,68 < 0,001 Grupa B - 0,68 < 0,001 Grupa NB - 0,44 0,113 Grupa B1-0,67 < 0,002 Grupa NB1-0,56 < 0,001 Grupa Z - 0,65 < 0,001 Grupa P - 0,67 < 0,005 Grupa N przebieg kliniczny choroby pomyślny; grupa R - przebieg kliniczny niekorzystny; grupa B ze współistniejącym zakażeniem bakteryjnym; grupa NB bez współistniejącego zakażenia bakteryjnego; grupa B1 ze współistniejącym zakażeniem Pseudomonas aeruginosa/proteus sp/staphyloccocus MRSA, grupa NB1 bez współistniejącego zakażenia bakteryjnego lub z zakażeniem bakteryjnym innym niż w grupie B1; grupa Z zapalenie ziarninowe bez perlaka; grupa P - zapalenie z perlakiem. i wsp. [5] wykazali, że nawrotowe perlaki mają wysoki indeks apoptozy, inny sposób rozmieszczenia komórek apoptotycznych i niską ekspresję kalcykliny, natomiast wartości markera proliferacyjnego antygenu Ki-67 i białka P53 nie odgrywają istotnej roli w procesach wznowy perlaka. Podobnie w badaniach własnych stwierdzono w p.z.u.śr. o niekorzystnym przebiegu klinicznym wyższą apoptozę indukowaną przez układ Fas/FasL, natomiast różnic tych nie wykazano dla białka P53. Interesujące są doniesienia Rivkina i wsp. [27], którzy przeprowadzali badania doświadczalne nad przebiegiem zapalenia ucha środkowego indukowanego podaniem endotoksyny bakteryjnej Salmonella typhi u kilku szczepów myszy, w tym u szczepu z mutacją genu dla Fas MRL-lpr/lpr, u którego rozwijają się zaburzenia układu immunologicznego i jest podatny na rozwój tocznia układowego [21]. Autorzy stwierdzili, że reakcja zapalna błony śluzowej była bardziej nasilona i trwała dłużej u szczepu myszy pozbawionego antygenu Fas niż u pozostałych szczepów [27]. Ponadto, w innych badaniach doświadczalnych stwierdzili oni zwiększoną ekspresję antygenu Fas i liganda FasL w błonie śluzowej ucha u szczurów, u których rozwinęło się zapalenie ucha środkowego po wszczepieniu Haemophilus influenzae [27]. W naszych badaniach również obserwowano większą aktywność apo-1/fas u chorych z zakażeniem bakteryjnym wywołanym przez Pseudomonas aeruginosa/proteus sp./staphyloccocus MRSA. Badania własne mogą wskazywać na rolę mechanizmu apoptozy indukowanego przede wszystkim szlakiem apo-1/fas w p.z.u.śr. nawrotowym i bakteryjnym, natomiast mniejsze znaczenie szlaku zależnego od białka P53. Wnioski W ziarninie w przewlekłym zapaleniu ucha środkowego stwierdzono różną ekspresję antygenu apo-1/fas w zależności od przebiegu klinicznego choroby i obecności zakażenia bakteryjnego spowodowanego przez Pseudomonas aeruginosa/proteus sp/staphyloccocus MRSA. PIŚMIENNICTWO 1. Panda NK, Sreedharan S, Mann SB, Sharma SC. Prognostic factors in complicated and uncomplicated chronic otitis media. Am J Otolaryngol. 1996; 17: Da Costa SS, Paparella MM, Schachern PA, Yoon TH, Kimberley BP. Temporal bone histopathology in chronically infected ears with intact and perforated tympanic membranes. Laryngoscope 1992;102: Albino AP, Reed JA, Bogdany JK, Sassoon J, Desloge RB, Parisier SC. Expression of p53 protein in human middle ear cholesteatomas: pathogenetic implications. Am J Otol. 1998;19: Bayazit YA, Bakir K, Kanlikama M, Ozer E, Mumbuc S, Disikirik I, Ucak R. Expression of the p53 and nm23 genes in cholesteatoma. Acta Otolaryngol.(Stockh.) 2002;122: Choufani G, Mahillon V, Decaestecker C, Lequeux T, Danguy A, Salmon I, Gabius H-J, Hassid S, Kiss R. Determination of the levels of expression of sarcolectin and calcyclin and of the percentages of apoptotic but not proliferating cells to enable distinction between recurrent and nonrecurrent cholesteatomas. Laryngoscope 1999;109:

7 Huisman MA, De Heer E, Grote JJ. Cholesteatoma epithelium is characterized by increased expression of Ki-67, p53 and p21, with minimal apoptosis. Acta Otolaryngol.(Stockh.) 2003;123: Kojima H, Tanaka Y, Tanaka T, Miyazaki H, Shiwa M, Kamide Y, Moriyama H. Cell proliferation and apoptosis in human middle ear cholesteatoma. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 1998;124: Kuczkowski J, Pawelczyk T, Bąkowska A, Narożny W, Mikaszewski B. Expression patterns of Ki-67 and telomerase activity in middle ear cholesteatoma Otol Neurotol 2007;28: Motamed M, Powe D, Kendall C, Birchall JP, Banerjee AR. p53 Expression and keratinocyte hyperproliferation in middle ear cholesteatoma. Clin Otolaryngol Allied Sci. 2002;27: Olszewska E, Chodynicki S, Chyczewski L. Apoptosis in the pathogenesis of cholesteatoma in adults. Eur Arch Otorhinolaryngol. 2006;263: Park HJ, Park K. Expression of Fas/APO-1 and apoptosis of keratinocytes in human cholesteatoma. Laryngoscope. 1999;109: Shinoda H, Huang CC. Expression of c-jun and p53 proteins in human middle ear cholesteatoma: relationship to keratinocyte proliferation, differentiation, and programmed cell death. Laryngoscope 1995;105: Watabe-Rudolph M, Rudolph KL, Averbeck T, Buhr T, Lenarz T, Stöver T. Telomerase activity, telomere length, and apoptosis: a comparison between acquired cholesteatoma and squamous cell carcinoma. Otol Neurotol. 2002;23: Drewa T, Olszewska O, Wożniak A. Znaczenie zaprogramowanej śmierci komórki w patogenezie chorób człowieka. Pol Merk Lek. 2002, 70: Adams MJ. Ways of dying: multiple pathways to apoptosis. Genes Dev. 2003; 17: Czarnecka AM, Golik P, Bartnik E. Mitochondria jako integratory apoptozy. Post Biol Kom. 2006; 33: Stępień A, Izdebska M, Grzanka A. Rodzaje śmierci komórki. Post Hig Med Dośw. online, 2007; 61: HehlgansT, Pfeffer K. The intriguing biology of the tumour necrosis factor/tumour necrosis factor receptor superfamily: players, rules and the games. Immunology. 2005; 115: Ashkenazi A, Dixit VM. Apoptosis control by death and decoy receptors. Curr Opin Cell Biol. 1999;11: Nagata S, Goldstein P. The Fas death factor. Science 1995; 267: Droździk M, Białecka M. Kliniczne znaczenie układu Fas/ ligand Fas. Pol Arch Med Wewn. 1999; 101: Yu J, Zhang L. The transcriptional targets of p53 in apoptosis control. Biochem Biophys Res Commun. 2005; 331: Li H, Zhu H, Xu CJ, Yuan J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell, 1998; 94: Miyao M, Shinoda H, Takahashi S. Caspase-3, caspase-8, and nuclear factor-kappab expression in human cholesteatoma. Otol Neurotol. 2006;27: Sheikholeslam Zadeh R, Decaestecker C, Delbrouck C, Danguy A, Salmon I, Zick Y i wsp. The levels of expression of galectin-3, but not of galectin-1 and galectin-8, correlate with apoptosis in human cholesteatomas. Laryngoscope 2001;111(6): Ergün S, Carlsöö B, Zheng X. Apoptosis in meatal skin, cholesteatoma and squamous cell carcinoma of the ear. Clin Otolaryngol Allied Sci. 1999;24: Rivkin AZ, Palacios SD, Pak K, Bennett T, Ryan AF. The role of Fas-mediated apoptosis in otitis media: observations in the lpr/lpr mouse. Hear Res. 2005; 207: