GIN ONKOL 2007, 5 (2), p

Transkrypt

1 Joanna Joñska-Gmyrek 1, Anna Nasierowska-Guttmejer 2, Mariusz Bidziñski 1, Anna Dañska-Bidziñska 1 Gin Onkol 2007, 5 (2), p Received: Accepted: Published: Determination of diagnostic value of selected immunohistochemical tests in patients with uterine corpus sarcoma and their therapeutic and prognostic usefulness Okreœlenie wartoœci diagnostycznej wybranych badañ immunohistochemicznych u chorych na miêsaki macicy w aspekcie ich przydatnoœci terapeutycznej i prognostycznej Определение диагностической величины избранных иммуногистохимических исследований больных страдающих саркомой матки в отношении их терапевтической и прогностической пригодности 1 Klinika Nowotworów Narz¹dów P³ciowych Kobiecych, Centrum Onkologii Instytut im Marii Sk³odowskiej-Curie w Warszawie. Kierownik Kliniki: doc. dr hab. n. med. Mariusz Bidziñski 2 Zak³ad Patomorfologii CSK MSWiA w Warszawie Correspondence to: Klinika Nowotworów Narz¹dów P³ciowych Kobiecych, Centrum Onkologii Instytut im. M. Sk³odowskiej-Curie w Warszawie, ul. Roentgena 5, Warszawa, jonska@wp.pl Praca finansowana przez Komitet Badañ Naukowych w ramach projektu badawczego nr 2PO5E Summary Uterine sarcomas represent a rare and heterogenous group of tumours, sometimes demonstrating multidirectional differentiation. Histological type of the sarcoma influences the choice of therapeutic modality. Aim of paper: Determination of diagnostic value of selected immunohistochemical studies (MIB1, caldesmon, desmin, SMA, SrMa, CKAE1/3) in the definition of histological type of tumour. Assessment of expression of the protein c-kit (CD117) MIB1 and inhibin and their prognostic role. Material and method: Study material consisted of a group of patients with uterine sarcoma, treated at the Center of Oncology in Warsaw, Poland, since 1999 thru 2006, from whom surgical specimens and paraffin blocks were obtained. Of 120 eligible patients, complete clinical data and specimens suitable for foreseen studies were available in 66 cases and this group became the subject of further analyses. Immunohistochemical (IHC) tests were performed using a panel of antibodies (SMA, SrMa, desmin, h-caldesmon, CD10, CKAE, MIB1, inhibin and CD117). Diagnostic value of IHC studies was assessed by descriptive statistical tests. Original histopathological findings were confronted with the results of validated IHC tests. Survival was assessed based on Kaplan-Meier curves and follow-up time by an inverse Kaplan-Meier curve. Prognostic factors were analysed by the Cox method. Threshold of statistical significance has been set at p=0.05. Results: Original microscopic findings have had to be modified as to histological type of sarcoma in about 1/3 of the cases. Histological diagnosis was an independent prognostic factor, influencing both overall survival rate and time to tumour recurrence. Prognostic factors influencing recurrence-free survival were: invasion of perivascular lymph space (lymph space invasion, LSI), proliferative index (MB1) and severity of tumour cell necrosis. Conclusions: Application of a panel of suitable IHC tests contributes to a more precise determination of tumour type, assisting in an optimal choice of adjuvant treatment modality and thus in improvement of the patients prognosis. Streszczenie Key words: corpus uteri sarcoma, diagnosis, markers, immunohistochemistry, treatment Miêsaki macicy stanowi¹ rzadko wystêpuj¹c¹, heterogenn¹ grupê nowotworów, wykazuj¹c¹ niekiedy wielokierunkowe ró nicowanie. Typ histopatologiczny miêsaka ma wp³yw na wybór metody leczenia. Cel: Okreœlenie przydatnoœci diagnostycznej wybranych badañ immunohistochemicznych (MIB1, kaldesmon, desmina, SMA, SrMa, CKAE1/3) w ocenie typu histopatologicznego. Ocena ekspresji bia³ka c-kit (CD117), 75

2 MIB1, oraz inhibiny w aspekcie przydatnoœci prognostycznej. Materia³ i metoda: Materia³ badawczy stanowi³a grupa chorych na miêsaki macicy leczonych w Centrum Onkologii Instytucie im. Marii Sk³odowskiej- -Curie w Warszawie w latach , od których uzyskano preparaty i bloczki parafinowe. Spoœród 120 chorych pe³ne dane kliniczne i preparaty nadaj¹ce siê do zastosowania badañ uzyskano od 66 chorych, która to grupa sta³a siê przedmiotem analizy. Wykonano badania immunohistochemiczne z u yciem panelu przeciwcia³: SMA, SrMa, desmina, h-kaldesmon, CD10, CKAE, MIB1, inhibina oraz CD117. Do oceny wartoœci diagnostycznej badañ immunohistochemicznych (IHC) zastosowano statystykê opisow¹. Zestawiono wynik pierwotnego badania histopatologicznego z wynikiem zweryfikowanym badaniami IHC. Do oceny prze ycia zastosowano krzyw¹ Kaplana-Meiera, czas obserwacji mierzono odwrotn¹ metod¹ Kaplana-Meiera. Do analizy czynników predykcyjnych zastosowano metodê Coksa. Istotnoœæ statystyczn¹ okreœlono na poziomie p=0,05. Wyniki: W stosunku do rozpoznania pierwotnego typ histopatologiczny miêsaków zosta³ zmieniony w oko³o 1/3 przypadków. Rozpoznanie histopatologiczne okaza³o siê niezale nym czynnikiem rokowniczym maj¹cym wp³yw zarówno na prze ycie ogólne, jak i czas do nawrotu choroby. Czynnikami rokowniczymi w aspekcie prze ycia bez nawrotu choroby okaza³y siê: zajêcie naczyniowej przestrzeni ch³onnej (LSI), indeks proliferacyjny (MIB1), oraz stopieñ martwicy w komórkach guza. Wnioski: Zastosowanie panelu odpowiednich badañ immunohistochemicznych ma wp³yw na precyzyjne okreœlenie charakteru guza, co niesie za sob¹ wybór odpowiedniej metody leczenia uzupe³niaj¹cego, a tym samym, byæ mo e poprawê rokowania. S³owa kluczowe: miêsaki macicy, diagnostyka, markery, immunohistochemia, leczenie C,.. : ( Ӏ 1, -,,,, 1/3). - - ( 117), Ӏ 1, Ӏ -. : Ӏ, Ӏ ,. Ӏ 120,, 66. Ӏ. :,,, -, Ӏ 10,, Ӏ 1, Ӏ, , =0,05. : -., -,,. - :, - ( Ӏ 1),. :, -,. :,,,, 76 INTRODUCTION Corpus uteri sarcoma constitute about 1-2% of all gynecological malignancies. This is a highly heterogenous group of tumours of mesenchymal origin, associated with a variable clinical course and differing in diagnostic criteria from other soft-tissue sar- WSTÊP Miêsaki trzonu macicy stanowi¹ oko³o 1-2% wszystkich nowotworów ginekologicznych. Tworz¹ one niejednolit¹ grupê nowotworów pochodzenia mezenchymalnego, która charakteryzuje siê odmiennym przebiegiem klinicznym i kryteriami dia-

3 comas. They may demonstrate mono- or multidirectional differentiation towards uterine or extrauterine tissue types. On histogenetic grounds, they may be subdivided into 3 principal subgroups: 1) tumours originating in endometrial stroma (uterine mucosa), 2) tumours originating in myometrium (uterine smooth muscle) and 3) mixed tumours containing both epithelial and mesenchymal component. Due to low incidence rate and heterogeneity of this nosologic entity, it constitutes a difficult clinical problem, because collection of an adequate number of patients presenting with this condition and their complete diagnostic work-up is extremely difficult. To-date, no optimal diagnostic and therapeutic management guidelines have been developed and overall prognosis in corpus uteri sarcoma is grim. From the clinical point of view, determination of histological type and degree of maturity of mesenchymal tumours in this location is of paramount importance. Muscular and stromal tumours of endometrial origin presenting a typical morphological appearance usually do not pose diagnostic problems and their histological evaluation is usually based on routine hematoxilin-eosin staining (HE). Nevertheless, there are cases with an equivocal microscopic appearance, which require implementation of additional techniques to determine their histogenesis. Problematic tumours of muscular origin include myoma variants and the so-called SarcomaTrunci Uteri of Uncertain Malignant Potential (STUMP). Lack of cellular atypia and coagulation necrosis, even with elevated (up to 20) mitotic figures per high-power field, is consistent with a benign tumour type. Additional molecular studies of suppressor genes (p21, p16, TP53, NM23) or immunohistochemical tests (MIB1, TP53 and progesterone receptors) are useful in the differentiation of these tumour types. Difficult problems are tumours with an atypical microscopic appearance, which require differentiation among tumours of muscular, stromal and endometrial origin. They include stromal tumours presenting features of smooth muscle or striated muscle metaplasia, foci of adipose tissue, bizarre cells and areas of hyaline degeneration. Another example of diagnostic problems is to differentiate a benign stromal tumour and epithelioid myoma or non-differentiated stromal sarcoma and highly malignant myosarcoma. Such cases require implementation of immunohistochemical studies using a panel of antibodies, typical for muscular differentiation, e.g. smooth muscle actin, desmin, sarcomeric myoglobin, h-caldesmon and CD10, a marker of stromal endometrial cells. Clinically useful is the assessment of tumour proliferative activity, expressed by its mitotic index Ki-67, determined by immunohistochemical technique using MIB1 antibodies. Histological type of a mesenchymal tumour of corpus uteri, confirmed by molecular studies and assessment of cellular immunohistochemical markers is an impor- gnostycznymi ni miêsaki tkanek miêkkich. Mog¹ one wykazywaæ ró nicowanie jedno- lub wielokierunkowe z tkanek typowych dla narz¹du lub wystêpuj¹cych poza nim. Pod wzglêdem histogenezy dziel¹ siê na trzy podstawowe grupy: 1) nowotwory z podœcieliska b³ony œluzowej trzonu macicy, 2) guzy z miêœni g³adkich, 3) nowotwory o mieszanej budowie z³o onej z komponenty nab³onkowej i mezenchymalnej. Ze wzglêdu na nisk¹ zachorowalnoœæ oraz heterogennoœæ grupy stanowi¹ trudny problem kliniczny, poniewa zebranie odpowiedniej liczby chorych z tym typem nowotworu oraz przeprowadzenie badania klinicznego jest niezwykle trudne. Do tej pory nie opracowano optymalnej metody postêpowania diagnostycznego i terapeutycznego, dlatego rokowanie w miêsakach macicy pozostaje niekorzystne. Z klinicznego punktu widzenia bardzo istotne jest okreœlenie typu histologicznego i stopnia dojrza³oœci nowotworu mezenchymalnego trzonu macicy. Guzy pochodzenia miêœniowego i podœcieliskowego, wywodz¹ce siê z endometrium o typowym obrazie morfologicznym, nie sprawiaj¹ problemów diagnostycznych, a ich rozpoznanie histopatologiczne zwykle opiera siê na rutynowym barwieniu hematoksylin¹ i eozyn¹. Istniej¹ jednak przypadki o niejednoznacznym utkaniu mikroskopowym, wymagaj¹ce zastosowania dodatkowych metod umo liwiaj¹cych okreœlenie ich histogenezy. Do problematycznych guzów pochodzenia miêœniowego nale ¹ histologiczne warianty miêœniaków oraz miêœniaki o nieokreœlonym potencjale z³oœliwoœci (STUMP). Brak atypii komórkowej i martwicy skrzepowej, nawet przy wzroœcie liczby figur podzia³u do 20 w polu widzenia, przemawia za ³agodnym charakterem guza. Dodatkowe badania molekularne genów supresorowych, takich jak p21, p16, TP53, NM23, lub immunohistochemiczne MIB1, TP53 i receptorów progesteronowych przydatne s¹ w ró nicowaniu wymienionych typów nowotworów. Inn¹ grup¹ s¹ guzy o nietypowym obrazie mikroskopowym wymagaj¹ce ró nicowania miêdzy nowotworami pochodzenia miêœniowego i podœcieliskowego z endometrium. Zalicza siê do nich nowotwory podœcieliskowe z obecnoœci¹ metaplazji g³adko- lub pr¹ kowano-miêœniowej, wystêpowaniem ognisk tkanki t³uszczowej, komórek monstrualnych (bizzare) lub pól szkliwienia. Kolejnym przyk³adem trudnoœci diagnostycznych jest odró nienie ³agodnego guzka podœcieliskowego od miêœniaka epitelioidnego lub niezró nicowanego miêsaka podœcieliskowego od wysoko z³oœliwego miêœniakomiêsaka. W tych przypadkach zalecane jest wykonanie badañ immunohistochemicznych z u yciem panelu przeciwcia³, typowych dla ró nicowania miêœniowego, takich jak aktyna miêœni g³adkich, desmina, mioglobina sarkomeryczna, h-kaldesmon, oraz CD10, marker komórek guzów podœcieliskowych endometrium macicy. Przydatna klinicznie ocena aktywnoœci proliferacyjnej guza (wyra- ona indeksem mitotycznym Ki-67) jest badana metod¹ immunohistochemiczn¹ z u yciem przeciwcia³a MIB1. 77

4 78 tant prognostic factor, enabling classification of patients in particular groups depending on expected survival and selection of treatment modality. Techniques of molecular studies introduced in the recent years have made it possible to determine several factors, which may prove extremely useful in the determination of risk groups for recurrence of uterine sarcoma. This in turn may help to develop a suitable algorithm, assisting in qualification of patients for supplementing surgical treatment. MATERIAL Study material consisted of 79 out of 120 patients with uterine sarcomas, treated at the M. Curie-Sk³odowska Institute of Oncology in Warsaw, Poland, since 1999 thru 2006, who provided surgical specimens and paraffin blocks. Due to lack of complete clinical data or limitations associated with inability to perform a particular immunohistochemical study because of damaged paraffin block or incorrect fixation technique used, final analysis encompassed 66 preparations. Analysed were histological preparations stained with hematoxilin-eosin of primary tumours and, in the case of dissemination or recurrence, also preparations of metastatic foci. Immunohistochemical studies were performed using a panel of antibodies SMA (smooth muscle actin), SrMa (sarcomeric actin), desmin, h-caldesmon (assessing muscular component) and CKAE1/3 (assessing epithelial component), as well as MIB1 (assessing proliferative activity) and CD10 (assessing muscular and epithelial component combined), inhibin and CD117. Faced with a subjectivism bias of assessment of microvessels density as high in a few cases only, where smoothmuscle actin stained vessel walls, later in the course of the study this staining technique was abandoned. We relied on studies considered more objective and thus representing a greater diagnostic value. Microscopic appearance and immunohistochemical studies enabled a precise determination of tumour type. Histopathological diagnoses included: 1. Tumours of muscular origin were encountered in 18 cases: epithelioid or myxoid myoma (n=4) and myosarcoma (n=14). Initial study revealed 1 case of myoma and 38 cases of leiomyosarcoma. 2. Tumours of endometrial stromal origin were diagnosed in 14 cases: low-grade stromal sarcomas (n=8) and non-differentiated sarcomas (n=6). Initial study revealed low-grade stromal sarcomas (n=14), which have been confirmed later, while non-differentiated sarcomas have not been confirmed. 3. Mixed tumours were diagnosed in 34 cases: 24 myosarcomas/stromal tumours and 10 malignant mixed mesodermal tumours. At first microscopic study, malignant mixed mesodermal tumours were diagnosed in 13 cases. Typ histologiczny guza mezenchymalnego trzonu macicy poparty badaniami molekularnymi oraz immunohistochemicznymi markerów komórkowych jest czynnikiem rokowniczym, który pozwala przeprowadziæ podzia³ chorych na grupy w zale noœci od prognozowanego prze- ycia i wyboru metody leczenia. Zastosowane w ostatnich latach metody badañ molekularnych stworzy³y perspektywê oznaczania wielu czynników, których ocena mo e byæ bardzo przydatna dla opracowania grup ryzyka nawrotu miêsaków macicy. To z kolei pomo e wypracowaæ w³aœciwy algorytm, na podstawie którego chore bêd¹ kwalifikowane do leczenia uzupe³niaj¹cego chirurgiê. MATERIA Materia³ badawczy stanowi³a grupa 79 ze 120 chorych na miêsaki macicy, leczonych w Centrum Onkologii Instytucie im. Marii Sk³odowskiej-Curie w Warszawie w latach , od których otrzymano preparaty i bloczki parafinowe. Ze wzglêdu na braki w dostêpnoœci do pe³nych danych klinicznych lub ograniczenia wynikaj¹ce z braku mo liwoœci przeprowadzenia okreœlonego badania immunohistochemicznego z powodu uszkodzenia bloczka parafinowego czy niepoprawne utrwalenie, ostatecznej analizie poddano 66 preparatów. Oceniono preparaty histopatologiczne zabarwione hematoksylin¹ i eozyn¹ guzów pierwotnych, a w przypadkach rozsiewu lub wznów, równie preparaty z ich guzów przerzutowych. Wykonano badania immunohistochemiczne z u yciem nastêpuj¹cego panelu przeciwcia³: SMA (aktyna miêœni g³adkich), SrMa (aktyna sarkomeryczna), desmina, h-kaldesmon, oceniaj¹cych komponent miêœniowy, CKAE1/3, oceniaj¹cych komponent nab³onkowy, jak równie MIB-1, w celu oceny aktywnoœci proliferacyjnej, CD10 dla oceny komponentu miêœniowego i nab³onkowego, oraz inhibina i CD117. Wobec subiektywizmu wyników badania gêstoœci mikronaczyñ, od kontynuacji jej oznaczania odst¹piono, aby unikn¹æ b³êdów w interpretacji. Oparto siê na badaniach uznanych za bardziej obiektywne, a tym samym prezentuj¹cych wy sz¹ wartoœæ diagnostyczn¹. Obraz mikroskopowy wraz z badaniami immunohistochemicznymi pozwoli³ na ustalenie dok³adnego rozpoznania typów nowotworów. Wœród rozpoznañ histopatologicznych by³y nastêpuj¹ce utkania: 1. Guzy pochodzenia miêœniowego stwierdzono w 18 przypadkach (4 miêœniaki epitelioidne lub myksoidne, oraz 14 miêsakomiêœniaków). W badaniu pierwotnym 1 przypadek miêœniaka i 38 przypadków miêsakomiêœniaka. 2. Guzy pochodz¹ce z podœcieliska endometrium potwierdzono w 14 przypadkach: 8 miêsaków podœcieliskowych o niskiej z³oœliwoœci oraz 6 miêsaków niezró nicowanych. W badaniu pierwotnym miêsaki podœcieliskowe o niskiej z³oœliwoœci potwier-

5 In all cases, the diagnosis of muscular tumours was confirmed by a strong and uniformly distributed positive reaction to h-caldesmon, SMA, desmin, while reaction to CD10 was negative in 16 cases and weakly and focally positive in 2 cases. Among stromal tumours, positive reaction to CD10 and negative reaction to the other markers has been confirmed in 8 cases. Focal muscular differentiation was noticed in 3 cases and a differentiation towards germinal cord was noticed in 1 case. In the remaining 3 cases, all stromal and muscular markers were negative and final diagnosis was made based on microscopic appearance. A comparison of original results of microscopic studies with those verified by IHC tests is presented in the table 1. Presented data indicate, that original diagnosis of leiomyoma has been confirmed by IHC tests. When the original diagnosis was carcinosarcoma, subsequent IHC studies confirmed this in 69.2%, while in 30.8% original diagnosis was modified to leiomyosarcom/sarcoma stromale. Also in the case of leiomyosarcoma, original diagnosis was confirmed in 32.1% of cases, while the remaining were changed to leiomyoma (5.3%), sarcoma non-differentiatum (10.5%), leiomyosarcoma stromale (42.1%) and sarcoma stromale (7.9%). Primary dzono w 14 przypadkach, miêsaków niezró nicowanych nie potwierdzono. 3. Guzy mieszane rozpoznano w 34 przypadkach: 24 miesakomiêœniaki/guzy podœcieliskowe oraz 10 z³oœliwych guzów mieszanych mezodermalnych. Pierwotnie z³oœliwe guzy mieszane mezodermalne rozpoznano w 13 przypadkach. Rozpoznanie guzów miêœniowych we wszystkich przypadkach potwierdzi³y silna i jednolicie rozlana reakcja dodatnia na h-kaldesmon, SMA, desminê oraz ujemna reakcja na CD10 w 16 przypadkach, s³aba i ogniskowo dodatnia reakcja na CD10 w 2 przypadkach. Wœród guzów podœcieliskowych dodatkowa reakcja na CD10 przy ujemnej na pozosta³e markery stwierdzona by³a w 8 przypadkach. W kolejnych 3 przypadkach stwierdzono ogniskowe ró - nicowanie miêœniowe, a w 1 w kierunku guzów sznurów p³ciowych. W pozosta³ych 3 przypadkach wszystkie markery podœcieliskowe i miêœniowe by³y ujemne, a o rozpoznaniu zadecydowa³ obraz mikroskopowy. Zestawienie pierwotnego badania histopatologicznego z wynikiem zweryfikowanym badaniami IHC przedstawia tabela 1. Jak wynika z przedstawionych danych, pierwotne rozpoznanie leiomyoma potwierdzi³o siê w trakcie przeprowadzania badañ IHC. Original histopathologic result of microscopic study Pierwotny wynik badania histopatologicznego Verified histopathologic diagnosis Total Zweryfikowany wynik Sarcoma stromale Leiomyosarcoma Leiomyoma Carcinosarcoma Razem badania histopatologicznego Sarcoma stromale 35.7% 7.9% 12.1% Leiomyosarcoma 7.1% 34.2% 21.2% Leiomyoma 7.1% 5.3% 100.0% 6.1% Sarcoma non-differentiatum 14.3% 10.5% 9.1% Carcinosarcoma 7.1% 69.2% 15.2% Leiomyosarcoma/ 28.6% 42.1% 30.8% 36.4% sarcoma stromale Total Razem 100.0% 100.0% 100.0% 100.0% 100.0% Table 1. Comparison of results of original histopathological diagnoses based in microscopic findings with results verified by IHC studies Tabela 1. Porównanie pierwotnego wyniku badania histopatologicznego z wynikiem zweryfikowanym badaniami IHC 79

6 80 diagnosis of sarcoma stromale was confirmed by IHC studies in 35.7%, while in 14.3% the tests revealed sarcoma non-differentiatum and in 28.6% leiomyosarcoma/sarcoma non-differentiatum. Upon performance of IHC studies, original diagnosis of histological type of sarcoma was changed in about 1/3 of cases, which might have influenced the type of therapy and prognosis. STATISTICAL ANALYSIS Diagnostic value of IHC studies has been evaluated using descriptive statistics. Results of original microscopic studies were compared with those verified by IHC studies. Microscopic appearance and IHC studies enabled a precise determination of tumour type. Prognostic value of IHC studies was evaluated based on survival curves and time to disease recurrence. Survival time was calculated from surgery to death of whatever cause. Recurrence-free survival was calculated from surgery to first recurrence or death. Survival was assessed using the Kaplan-Meier curves (1) and follow-up time using the inverse Kaplan-Meier technique (2). Due to small sample size, analysis of prognostic factors was performed by stages. In the first stage, univariate analysis was performed, using the log-rank test. Analysis included the following potential prognostic factors: SMA, h-caldesmon, desmin, SrMa, CKAE1/3, MIB1, CD10, CD117, necrosis. In the second stage, the Cox proportional hazards model (3) was adjusted based on selected prognostic factors, e.g. FIGO clinical stage, histological grade, number of mitoses, presence of necrotic foci and lymphatic space invasion (LSI). The model was adjusted by stepwise elimination of variables, adopting p=0.05 and p=0.1 as inclusion and exclusion values, respectively. After adjustment, the model was used for analysis of predictive independence of value of variables, whose predictive value has been first confirmed by unidimensional analysis. Assumptions about proportional risk functions were verified by graphic method. For all tests performed, the threshold of statistical significance was set at p=0.05. RESULTS Median follow-up time was 58 months. Curves of overall survival and recurrence-free survival are presented at tables 1 and 2. Calculated 5-years and 10-years survival rates were 42% and 36%, respectively. Recurrencefree survival for the entire patient population analysed is presented in the fig. 2. Results of univariate and multivariate analysis of predictive factors are presented in table 2. Risk of death associated with the diagnosis of carcinosarcoma turned out to be 5-fold higher than the W przypadku pierwotnego rozpoznania carcinosarcoma w trakcie przeprowadzonych badañ IHC wyniki te potwierdzi³y siê w 69,2% przypadków, w 30,8% przypadków rozpoznanie pierwotne zmieniono na leiomyosarcoma/sarcoma stromale. Równie w przypadku rozpoznania leiomyosarcoma wyniki pierwotne potwierdzi³y siê w 32,1% przypadków, pozosta³e zosta³y zmienione na leiomyoma (5,3%), sarcoma non-differentiatum (10,5%), leiomyosarcoma/sarcoma stromale (42,1%), sarcoma stromale (7,9%). Pierwotne rozpoznanie sarcoma stromale potwierdzono w trakcie badañ IHC w 35,7%, w 14,3% potwierdzono sarcoma non-differentiatum, w 28,6% leiomyosarcoma/sarcoma non-differentiatum. Po przeprowadzeniu badañ immunohistochemicznych pierwotne rozpoznanie typu histologicznego miêsaka uleg³o zmianie w oko³o 1/3 przypadków, co mog³o mieæ wp³yw na rodzaj zastosowanej terapii i rokowanie. METODY STATYSTYCZNE Do oceny wartoœci diagnostycznej badañ immunohistochemicznych (IHC) zastosowano statystykê opisow¹. Zestawiono wynik pierwotnego badania histopatologicznego z wynikiem zweryfikowanym badaniami IHC. Obraz mikroskopowy wraz z badaniami immunohistochemicznymi pozwoli³ na ustalenie dok³adnego rozpoznania typów nowotworów. Dla oceny wartoœci predykcyjnej badañ IHC zastosowano analizê prze ycia oraz prze ycia do nawrotu choroby. Czas prze ycia liczono od operacji do zgonu z jakiegokolwiek powodu. Czas prze ycia bez nawrotu choroby mierzono od operacji do pierwszego nawrotu lub zgonu. Czas prze ycia oceniono metod¹ Kaplana- -Meiera (1), a czas obserwacji odwrotn¹ metod¹ Kaplana-Meiera (2). Ze wzglêdu na ma³¹ liczebnoœæ grupy analizê czynników predykcyjnych przeprowadzono etapowo. W pierwszym etapie przeprowadzono analizê jednoczynnikow¹, w której pos³u ono siê testem log-rank. Do analizy w³¹czono nastêpuj¹ce potencjalne czynniki predykcyjne: SMA, h-kaldesmon, desmina, SrMa, CKAE1/3, MIB-1, CD10, CD117, martwica. W drugim etapie dopasowano model proporcjonalnego ryzyka Coksa (3) w oparciu o wybrane czynniki prognostyczne, takie jak stopieñ klinicznego zaawansowania FIGO, typ histopatologiczny, liczba mitoz, wystêpowanie pól martwicy oraz LSI (inwazja przestrzeni ch³onnej). Model dopasowano metod¹ krokowej eliminacji zmiennych, dla warunku w³¹czenia i wy³¹czenia odpowiednio: p=0,05 i p=0,1. Po dopasowaniu model pos³u y³ do analizy niezale noœci predykcyjnej wartoœci zmiennych, których wartoœæ predykcyjn¹ stwierdzono na podstawie analizy jednowymiarowej. Za³o enie o proporcjonalnoœci funkcji ryzyka weryfikowano metod¹ graficzn¹. Dla wszystkich testów przyjêto poziom istotnoœci statystycznej równy 0,05.

7 equivalent mean risk for other histological types. Nevertheless, it appears that in view of dichotomic subdivision of diagnoses in two groups (carcinosarcoma vs. others), this results may be somewhat biased, as the sarcoma heading includes three very different groups of sarcomas. This kind of analysis would require a greater number of patients. Survival curves depicting these relationships are presented in the figures 3 and 4. Multivariate analysis revealed a significant correlation between risk of death and a positive reaction to h-caldesmon and CD117, and between risk of recurrence (and death) and a positive reaction to h-caldesmon and CKAE1/3. Positive result of IHC test for h-caldesmon was associated with a 5-fold higher risk of death, directly proportional to intensity of reaction. In the case of CD117, relative risk for lack of reaction was 5-fold lower than for it s presence. Also, a statistically significant influence on overall survival and recurrence-free survival, both in univariate and in multivariate analysis, was found for CKAE1/3. For the CKAE1/3 test, relative risk for lack of reaction was 9-fold higher than for it s occurrence. Positive reaction to MIB1 is an expression of proliferative activity and in most cases is associated with an unfavourable prognosis. An analysis of the present material revealed statistical significance of MIB1 only WYNIKI Mediana czasu obserwacji wynosi³a 58 miesiêcy. Krzywe prze ycia i prze ycia bez nawrotu choroby przedstawiono na rysunkach 1 i 2. Odpowiednie piêcioletnie i dziesiêcioletnie prze ycie wynios³o odpowiednio 42% i 36%. Podobnie prze ycie bez nawrotu choroby wynios³o 31% i 18%. Prze ycie bez nawrotu choroby dla ca- ³ej grupy przedstawia rysunek 2. Wyniki jednowariantowej i wielowariantowej analizy czynników predykcyjnych zawarte s¹ w tabeli 2. Ryzyko zgonu dla rozpoznania histopatologicznego carcinosarcoma okaza³o siê piêciokrotnie wy sze ni odpowiednie œrednie ryzyko dla innych typów histopatologicznych. Jednak wydaje siê, e wobec podzia³u rozpoznañ na dwie grupy (carcinosarcoma i inne) wynik mo e byæ nieco zafa³szowany, poniewa w przypadku miêsaków wyró nia siê trzy odmienne grupy tych nowotworów. Przeprowadzenie tej analizy wymaga nieco wiêkszych grup badanych. Krzywe prze ycia prezentuj¹ce powy sze zale noœci zawarte s¹ na rysunkach 3 i 4. W analizie wieloczynnikowej istotny wp³yw na ryzyko zgonu stwierdzono dla przypadków, w których wykazano reakcjê na h-kaldesmon i CD117, a na ryzyko nawrotu (lub zgonu) dla przypadków, w których wykazano reakcjê na h-kaldesmonu i CKAE1/3. Variable Overall survival Recurrence-free survival Zmienna Prze ycie Prze ycie bez nawrotu log-rank Cox log-rank Cox FIGO n.s. n.s n.s. Histopathologic finding carcinosarcoma < n.s. Histopatologia carcinosarcoma Invasion of lymphatic vessels n.s. n.s Inwazja przestrzeni naczyñ ch³onnych SMA n.s h-caldesmon h-kaldesmon CKAE1/3 <0.001 n.s. < MIB1 n.s n.s. CD117 < n.s. Tumour cell necrosis n.s n.s. Obecnoœæ martwicy n.s. non-significant n.s. brak istotnoœci statystycznej Table 2. Analysis of prognostic factors Tabela 2. Analiza czynników predykcyjnych 81

8 Fig. 1. Probability of overall survival for the entire group Rys. 1. Prawdopodobieñstwo prze ycia ca³kowitego dla ca- ³ej grupy Fig. 2. Probability of recurrence-free survival for the entire group Rys. 2. Prawdopodobieñstwo prze ycia do nawrotu choroby dla ca³ej grupy at univariate analysis related to recurrence-free survival (log-rank test 0.014) (fig. 3). In the present material, tumour necrosis turned out to statistically significant only at univariate analysis, both related to overall survival (log-rank test 0.015) and recurrence-free survival (log-rank test 0.005). The above-mentioned correlations are presented in figures 6 and 7. Invasion of perivascular lymphatic space (LSI) turned out a prognostically significant factor worth mentioning. An analysis of the present material revealed a statistically significant influence on recurrence-free survival, but not on overall survival, what might have fundamental clinical implications in the aspect of choice of adjuvant therapy. This correlation is presented in figure 8. Dla badania IHC na h-kaldesmon wykazano piêciokrotny wzrost ryzyka zgonu wraz ze wzrostem reakcji. W przypadku badania na CD117 ryzyko wzglêdne braku reakcji jest piêciokrotnie ni sze ni ryzyko wzglêdne wyst¹pienia reakcji. Równie istotny statystycznie wp³yw na prze ycie ca³kowite i bez nawrotu choroby zarówno w analizie jedno-, jak i wielowariantowej wykaza³a reakcja na CKAE1/3. Dla badania CKAE1/3 ryzyko wzglêdne dla braku reakcji jest a dziewiêciokrotnie ni sze ni dla wyst¹pienia reakcji. Dodatnia reakcja na MIB1 jest wyrazem aktywnoœci proliferacyjnej i w wiêkszoœci przypadków rokuje niekorzystnie. W wyniku analizy obecnego materia³u istotnoœæ statystyczna MIB1 zosta³a wykazana jedynie w analizie jednoczynnikowej w aspekcie czasu wolnego od nawrotu choroby (test log-rank 0,014) (rys. 3). W obecnie analizowanym materiale martwica guza okaza³a siê istotna statystycznie jedynie w wyniku ana- 82 Fig. 3. Overall survival curve for the histopathological type carcinosarcoma Rys. 3. Krzywa prze ycia ca³kowitego dla typu histopatologicznego carcinosarcoma Fig. 4. Survival curve for recurrence-free survival for the histopathological type carcinosarcoma Rys. 4. Krzywa prze ycia bez nawrotu choroby dla typu histopatologicznego carcinosarcoma

9 Fig. 5. Recurrence-free survival curves depending on MIB1 reaction Rys. 5. Krzywe prze ycia bez nawrotu choroby w zale noœci od reakcji na MIB1 Fig. 6. Recurrence-free survival curve depending on presence of necrosis in tumour cells Rys. 6. Krzywa prze ycia do nawrotu choroby w zale noœci od martwicy stwierdzanej w komórkach guza SUMMARY OF RESULTS 1. Additional IHC studies resulted in modification of original microscopic diagnosis of histological type of tumour in about 30% of cases. 2. Tumour type carcinosarcoma turned out a highly significant independent and unfavourable prognostic factor (p=0.001). 3. Presence of tumour cell necrosis is an unfavourable prognostic factor, although in the present material this was confirmed by univariate analysis only. 4. Lymphatic space invasion is a significant prognostic factor in the aspect of time to disease recurrence. DISCUSSION Uterine sarcomas are rarely occurring malignancies. They constitute about 1-3% of all gynaecological neoplasms (4,5). Due to heterogeneity of the group and low lizy jednowariantowej zarówno w aspekcie wp³ywu na prze ycie ca³kowite (test log-rank 0,015), jak i na prze- ycie bez nawrotu choroby (test log-rank 0,005). Ilustracje powy szej zale noœci przedstawiaj¹ rysunki 6 i 7. Istotnym czynnikiem rokowniczym, na który nale y zwróciæ uwagê, jest inwazja naczyniowej przestrzeni ch³onnej. W obecnie analizowanej pracy wykaza³a ona istotny statystycznie wp³yw na prze ycie bez nawrotu choroby, natomiast nie na prze ycie ca³kowite, co mo e mieæ istotne znaczenie kliniczne w aspekcie doboru leczenia uzupe³niaj¹cego. Powy sz¹ zale noœæ przedstawia rysunek 8. PODSUMOWANIE WYNIKÓW 1. Po przeprowadzeniu dodatkowych badan immunohistochemicznych rozpoznanie typu histopatologicznego guza uleg³o zmianie w oko³o 30% przypadków. Fig. 7. Overall survival curve depending on presence of necrosis in tumour cells Rys. 7. Krzywa prze ycia ca³kowitego w zale noœci od martwicy stwierdzanej w komórkach guza Fig. 8. Recurrence-free survival depending on invasion of lymphatic perivascular space by tumour cells Rys. 8. Krzywa prze ycia do nawrotu choroby w zale noœci od inwazji ch³onnej przestrzeni naczyniowej stwierdzanej w komórkach guza 83

10 84 incidence, they constitute a difficult clinical problem in the aspect of development of appropriate protocols of therapeutic management. These tumours are still associated with a very unfavourable prognosis (4,6-9), therefore every effort should be made to improve survival in this patient population. From the clinical point of view, a key issue is determination of histological type and degree of maturity of a mesenchymal tumour of corpus uteri. Endrometrial tumours of muscular and stromal origin with a typical morphological appearance, do not pose diagnostic problem and determination of their histopathological type is usually based on a routine hematoxilin-eosin staining. However, there are cases presenting an ambiguous microscopic appearance, which require additional methods to establish their histogenesis (6,10-18). Concerning uterine sarcomas, the main problem is that without additional studies histopathological diagnosis may be incorrect, consequently leading to implementation of treatment modality inadequate for the particular tumour type. Upon additional ICH studies, original histopathologic diagnosis has had to be modified in about 30% of the cases. The dimension of this issue is fundamental; therefore one of main aims of the present study was to try to develop an algorithm of IHC studies necessary for a precise histopathological diagnosis. In most cases, tumours have a complex structure; we focused our attention on additional prognostic factors, which should be taken into account when choosing a protocol of a surgery-supplementing adjuvant treatment (5,8,9,12,19). In our material, one of the key unfavourable factors turned out to be histopathological type of tumour. Histopathological types were subdivided into 2 groups: proper sarcomas and sarcomas with an admixture of epithelial component. Analysis revealed that cases where a malignant mixted mesodermal tumour were associated with a least favourable prognosis. This is confirmed by the results of other authors (7,8,20). In the paper by Chauveinc et al. (4), the authors conclude that the least favourable are leiomyosarcoma cases. This indicated the necessity to include much more patients in the analysis and further studies to fully elucidate the issue. A statistically significant prognostic factor influencing recurrence-free survival is invasion of lymphatic vessels. Published papers (7) frequently quote this prognostic factor, also associated with overall survival. In our material, such a correlation did not occur. Neither was seen any such correlation in the paper by Randi et al. (18) Degree of local invasion is also quoted as one of the key prognostic factors (7). In our material, faced with other analysed factors associated with recurrence-free survival, this was statistically significant in univariate analysis only. There are papers putting in doubt this correlation (18). Due to sample size, patients have been subdivided into 2 subgroups: early clinical stage (I+II) and late clinical stage (III+IV). Presence of necrosis in the material analysed 2. Typ histologiczny carcinosarcoma okaza³ siê niezale nym, niekorzystnym czynnikiem rokowniczym (p=0,001). 3. Obecnoœæ martwicy w komórkach guza jest niekorzystnym czynnikiem rokowniczym, chocia w obecnym materiale zosta³a potwierdzona jedynie w wyniku analizy jednowariantowej. 4. Istotnym czynnikiem rokowniczym okaza³a siê inwazja ch³onnej przestrzeni naczyniowej w aspekcie czasu do nawrotu choroby. OMÓWIENIE Miêsaki macicy s¹ nowotworami wystêpuj¹cymi rzadko. Stanowi¹ oko³o 1-3% wszystkich nowotworów ginekologicznych (4,5). Ze wzglêdu na heterogennoœæ grupy oraz nisk¹ zachorowalnoœæ stanowi¹ trudny problem kliniczny w aspekcie opracowania odpowiednich schematów postêpowania terapeutycznego. S¹ to nowotwory, których rokowanie w dalszym ci¹gu pozostaje niekorzystne (4,6-9), dlatego nale y do³o yæ wszelkich starañ, by uzyskaæ poprawê prze yæ w tym typie nowotworu. Z klinicznego punktu widzenia bardzo istotne jest okreœlenie typu histologicznego i stopnia dojrza³oœci nowotworu mezenchymalnego trzonu macicy. Guzy pochodzenia miêœniowego i podœcieliskowego, wywodz¹ce siê z endometrium o typowym obrazie morfologicznym, nie sprawiaj¹ problemów diagnostycznych, a ich rozpoznanie histopatologiczne zwykle opiera siê na rutynowym barwieniu hematoksylin¹ i eozyn¹. Istniej¹ jednak przypadki o niejednoznacznym utkaniu mikroskopowym, wymagaj¹ce zastosowania dodatkowych metod umo liwiaj¹cych okreœlenie ich histogenezy (6,10-18). G³ównym problemem przy rozpoznaniu histopatologicznym miêsaków macicy jest fakt, e bez przeprowadzenia dodatkowych badañ mo e byæ ono nieprawid³owe, czego konsekwencj¹ jest zastosowanie leczenia nieadekwatnego do danego typu histopatologicznego. Po przeprowadzeniu dodatkowych badañ immunohistochemicznych w analizowanej obecnie grupie pierwotne rozpoznanie histopatologiczne zmieniono w oko³o 30% przypadków. Jest to olbrzymia skala problemu, dlatego jednym z g³ównych celów obecnego badania by³a próba opracowania algorytmu badañ immunohistochemicznych niezbêdnych do postawienia precyzyjnego rozpoznania histopatologicznego. Poniewa guzy w wiêkszoœci przypadków maj¹ budowê z³o on¹, zwrócono równie uwagê na istnienie dodatkowych czynników rokowniczych, które nale y uwzglêdniaæ przy doborze schematu leczenia uzupe³niaj¹cego chirurgiê (5,8,9,12,19). W obecnie analizowanym materiale jednym z g³ównych niekorzystnych czynników okaza³ siê rodzaj utkania histopatologicznego guza. Typy histopatologiczne zosta³y podzielone na dwie grupy: miêsaki w³aœciwe i miêsaki z domieszk¹ utkania nab³onkowego. W wyniku tej analizy okaza³o siê, e przypadki, w których rozpoznano z³oœliwego mieszanego guza

11 was an unfavourable prognostic factor only in univariate analysis in the aspect of both overall survival and recurrence-free survival. This factor is of paramount importance in smooth-muscle tumours. Reported are cases of tumours with no evident necrosis but with an utterly aggressive course (20). Independent on prognostic factors, an issue specially emphasized in the literature is the necessity to implement adequately chosen IHC studies in differential diagnosis of difficult mesenchymal tumours, where routine hematoxilin-eosin staining proved insufficient (6,10,11,13-15,17,18). Precise histopathological diagnosis enables a choice of an optimal therapeutic modality (4,5,18). This is particularly important, as adjuvant treatment of sarcomas is still a matter of debate. Ineffective treatment, which may result in severe and frequent adverse effects, is unacceptable according to the principles of clinical oncology. Therefore, precise definition of histopathological type of the tumour is a fundamental issue. CONCLUSIONS 1. Implementation of IHC studies resulted in a change of histopathological diagnosis in about 30% of the cases. 2. In our material, the worst prognosis was associated with mixed mesodermal tumour (carcinosarcoma). 3. Among prognostic factors studied, statistical significance has been demonstrated in association with lymphatic vessel invasion, tumour cell necrosis and positive h-caldesmon reaction. BIBLIOGRAPHY: PIŒMIENNICTWO: 1. Kaplan F.L., Meier P.: Nonparametric estimation from incomplete observations. J. Am. Stat. Assoc. 1958; 52: Schemper M., Smith T.L.: A note on quantifying followup in studies of failure time. Control. Clin. Trials 1996; 17: Cox D.R.: Regression models and life tables. J. R. Stat. Soc. B 1972; 34: Chauveinc L., Deniaud E., Plancher C. i wsp.: Uterine sarcomas: the Curie Institut experience. Prognosis factors and adjuvant treatments. Gynecol. Oncol. 1999; 72: Bodner K., Bodner-Adler B., Obermair A. i wsp.: Prognostic parameters in endometrial stromal sarcoma: a clinicopathologic study in 31 patients. Gynecol. Oncol. 2001; 81: Al-Nafussi A.: Uterine smooth-muscle tumours: practical approach to diagnosis. Current Diagnostic Pathology 2004; 10: Hoskins W., Perez C.A., Young R.H. (red.): Principles and Practice of Gynecologic Oncology. Corpus: Mesenchymal Tumors. Wyd. 4, Lippincott Williams & Wilkins, 2005: Vaidya A.P., Horowitz N.S., Oliva E. i wsp.: Uterine malignant mixed mullerian tumors should not be included in mezodermalnego, rokowa³y najmniej korzystnie. Potwierdzaj¹ to równie prace innych autorów (7,8,20). Chauveinc i wsp. (4) stwierdzili zaœ, e najmniej korzystnie rokuj¹ przypadki miêsaka g³adkokomórkowego. Wi¹ e siê to z potrzeb¹ w³¹czenia do analizy wiêkszej liczby chorych, co jest przewidziane w kolejnych badaniach. Statystycznie istotnym czynnikiem rokowniczym okaza³a siê obecnoœæ inwazji naczyñ ch³onnych w aspekcie wp³ywu na czas wolny od nawrotu choroby. W publikacjach (7) jest to czêsto wymieniany czynnik rokowniczy, tak e w aspekcie wp³ywu na czas na prze ycie ca³kowite. W naszej pracy takiej zale noœci nie wykazano. W pracy Chauveinc i wsp. (4) równie nie stwierdzono takiej zale - noœci. Stopieñ zaawansowania nowotworu wymieniany jest jako jeden z g³ównych czynników rokowniczych (7). W opracowanym przez nas materiale, wobec innych analizowanych czynników dotycz¹cych prze ycia bez nawrotu choroby, stopieñ zaawansowania wykaza³ istotnoœæ statystyczn¹ wy³¹cznie w analizie jednowariantowej. Istniej¹ prace kwestionuj¹ce powy sz¹ zale noœæ (18). Ze wzglêdu na liczebnoœæ grupy przypadki podzielono na dwie podgrupy: zaawansowanie wczesne (I+II) oraz póÿne (III+IV). Obecnoœæ martwicy w badanym materiale okaza³a siê czynnikiem niekorzystnym rokowniczo, jednak tylko w analizie jednowariantowej w aspekcie zarówno prze- ycia ca³kowitego, jak i czasu wolnego od nawrotu choroby. Czynnik ten ma istotne znaczenie w ocenie guzów z miêœni g³adkich. Opisywane s¹ tak e przypadki guzów bez stwierdzonej martwicy o bardzo agresywnym przebiegu (20). Niezale nie od czynników rokowniczych w literaturze szczególnie podkreœlana jest koniecznoœæ stosowania odpowiednio dobranych badañ immunohistochemicznych w diagnostyce ró nicowej trudnych przypadków guzów mezenchymalnych, w których barwienie eozyn¹ i hematoksylin¹ jest niewystarczaj¹ce (6,10,11,13-15,17,18). Precyzyjne rozpoznanie histopatologiczne pozwoli na wybór optymalnej metody terapeutycznej (4,5,18). Jest to szczególnie istotne, gdy leczenie uzupe³niaj¹ce miêsaków jest przedmiotem dyskusji. Leczenie nieskuteczne, mog¹ce powodowaæ liczne efekty uboczne, jest z punktu widzenia regu³ onkologicznych niedozwolone. St¹d tak du e znaczenie maj¹ dok³adne badania pozwalaj¹ce precyzyjnie okreœliæ typ histologiczny miêsaka. WNIOSKI 1. Wykazano, e w przypadku badañ IHC pierwotne rozpoznanie histopatologiczne zmieniono w oko³o 30% przypadków. 2. W analizowanej grupie najgorzej rokuj¹cym typem miêsaka by³ mieszany z³oœliwy guz mezodermalny (carcinosarcoma). 3. Spoœród badanych czynników predykcyjnych statystycznie istotne znaczenie wykazano w przypadkach 85

12 studies of endometrial carcinoma. Gynecol. Oncol. 2006; 103: Nordal R.R., Kristensen G.B., Stenwig A.E. i wsp.: An evaluation of prognostic factors in uterine carcinosarcoma. Gynecol. Oncol. 1997; 67: Tse G.M., Tan P.H., Lui P.C. i wsp.: The role of immunohistochemistry for smooth-muscle actin, p63, CD10 and cytokeratin 14 in the differential diagnosis of papillary lesions of the breast. J. Clin. Pathol. 2007; 60: Baker P., Oliva E.: Endometrial stromal tumours of the uterus: a practical approach using conventional morphology an ancillary techniques. J. Clin. Pathol. 2007; 60: Kempson R.L., Hendrickson M.R.: Smooth muscle, endometrial stromal, and mixed Müllerian tumors of the uterus. Mod. Pathol. 2000; 13: Chu P.G., Arber D.A., Weiss L.M., Chang K.L.: Utility of CD10 in distinguishing between endometrial stromal sarcoma and uterine smooth muscle tumors: an immunohistochemical comparison of 34 cases. Mod. Pathol. 2001; 14: Mikami Y., Hata S., Kiyokawa T., Manabe T.: Expression of CD10 in malignant müllerian mixed tumors and adenosarcomas: an immunohistochemical study. Mod. Pathol. 2002; 15: Nucci M.R., O Connell J.T., Huettner P.C. i wsp.: h-caldesmon expression effectively distinguishes endometrial stromal tumors from uterine smooth muscle tumors. Am. J. Surg. Pathol. 2001; 25: inwazji naczyñ ch³onnych, obecnoœci martwicy w komórkach guza, reakcji na h-kaldesmon. 16. Kir G., Cetiner H., Karateke A. i wsp.: Utility of MIB-1 and estrogen and progesterone receptor in distinguishing between endometrial stromal sarcomas and endometrial stromal nodules, highly cellular leiomyomas. Int. J. Gynecol. Cancer 2005; 15: Simpson K.W., Albores-Saavedra J.: HMB-45 reactivity in conventional uterine leiomyosarcomas. Am. J. Surg. Pathol. 2007; 31: Dorfman D.M., Bui M.M., Tubbs R.R. i wsp.: The CD117 immunohistochemistry tissue microarray survey for quality assurance and interlaboratory comparison: a College of American Pathologists Cell Markers Committee Study. Arch. Pathol. Lab. Med. 2006; 130: Gerszten K., Faul C., Kounelis S. i wsp.: The impact of adjuvant radiotherapy on carcinosarcoma of the uterus. Gynecol. Oncol. 1998; 68: Esposito N.N., Hunt J.L., Bakker A., Jones M.W.: Analysis of allelic loss as an adjuvant tool in evaluation of malignancy in uterine smooth muscle tumors. Am. J. Surg. Pathol. 2006; 30: