cobas Cdiff Test Do stosowania w diagnostyce in vitro do u ytku z systemem cobas 4800 cobas 4800 System Sample Preparation Kit

Transkrypt

1 do u ytku z systemem cobas 4800 Do stosowania w diagnostyce in vitro cobas 4800 System Sample Preparation Kit cobas 4800 System Lysis Kit 1 cobas 4800 System Wash Buffer Kit 240 Tests 960 Tests 240 Tests 960 Tests 240 Tests 960 Tests P/N: P/N: P/N: P/N: P/N: P/N: cobas 4800 System Internal Control Kit 1 20 Runs P/N: cobas 4800 Cdiff Amplification/Detection Kit 80 Tests 240 Tests P/N: P/N: cobas 4800 Cdiff Controls and Cofactor Kit 10 Runs P/N:

2 SPIS TRE CI Zastosowanie Podsumowanie i obja nienie testu/zasady procedury Informacje podstawowe: badanie przesiewowe pod k tem bakterii C. difficile... 4 Obja nienie testu... 5 Zasady procedury... 5 Przygotowanie próbek... 5 Amplifikacja w reakcji PCR i detekcja metod TaqMan... 6 Amplifikacja wybiórcza... 6 Materia y, odczynniki i próbki Dostarczane materia y i odczynniki... 7 Przechowywanie i u ytkowanie odczynników Wymagane materia y dodatkowe Materia y opcjonalne Urz dzenia i oprogramowanie wymagane, lecz niedostarczane Wymagania dotycz ce rodków ostro no ci i u ytkowania Ostrze enia i rodki ostro no ci Dobra praktyka laboratoryjna Zanieczyszczenie Integralno Utylizacja Rozlanie p ynów i czyszczenie Pobieranie, transport i przechowywanie próbek Pobieranie próbek Przechowywanie i trwa o próbek podczas transportu Procedura testowa Wykonywanie oznaczenia Przebieg pracy Instrukcja u ytkowania Wyniki Kontrola jako ci i wa no wyników Kontrola dodatnia Kontrola ujemna Doc. Rev

3 Kontrola wewn trzna Interpretacja wyników Ograniczenia metody Ocena skuteczno ci w badaniach nieklinicznych Czu o analityczna Detekcja genotypów bakterii C. difficile Precyzja Swoisto analityczna Substancje wp ywaj ce na wynik testu Korelacja Dodatkowe informacje Najwa niejsze cechy oznaczenia Oznaczenia Producent i dystrybutorzy Znaki towarowe i patenty Copyright Pi miennictwo Wersja dokumentu Doc. Rev

4 Zastosowanie Test cobas Cdiff do stosowania z systemem cobas 4800 to zautomatyzowany, jako ciowy test diagnostyczny in vitro, wykorzystuj cy a cuchow reakcj polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym do bezpo redniego wykrywania genu toksyny B (tcdb) szczepów toksynogennych Clostridium difficile (C. difficile) w próbkach (p ynnych lub mi kkich) nieuformowanego stolca pozyskanych od pacjentów, u których podejrzewa si zaka enie bakteriami C. difficile (CDI). Test cobas Cdiff jest przeznaczony do stosowania jako wsparcie podczas diagnozowania zaka e CDI u ludzi z uwzgl dnieniem klinicznych i epidemiologicznych czynników ryzyka. Podsumowanie i obja nienie testu/zasady procedury Informacje podstawowe: badanie przesiewowe pod k tem bakterii C. difficile C. difficile to Gram-dodatnie, beztlenowe, przetrwalnikuj ce laseczki, zidentyfikowane w pó nych latach 70. jako czynnik etiologiczny rzekomob oniastego zapalenia jelit zwi zanego z antybiotykoterapi 1,2. Uwa a si, e odpowiadaj one za 15 20% przypadków biegunki wywo anej antybiotykoterapi oraz za praktycznie wszystkie przypadki rzekomob oniastego zapalenia jelit zwi zanego z przyjmowaniem antybiotyków 3. W ci gu ostatniej dekady obserwowano sta y wzrost cz sto ci przypadków zaka e wywo ywanych przez bakterie C. difficile (CDI), które obecnie stanowi istotny problem kliniczny w krajach rozwini tych. Podczas gdy wska niki zachorowalno ci wynosi y przypadków w populacji szpitali specjalizuj cych si w leczeniu ostrych przypadków na terenie Stanów Zjednoczonych, cz sto wyst powania wzros a do ponad 80 przypadków na osób w 2005 r. 4. Opisywano ju wyst powanie epidemii zaka e CDI 5. Bezpo redni koszt zwi zany z zaka eniami CDI wyniós 6326 USD na przypadek zachorowania na terenie Stanów Zjednoczonych 6. Za rosn c cz sto wyst powania odpowiada cz ciowo pojawienie si rzekomo hiperwirulentnego szczepu klasyfikowanego jako rybotyp 027/Ameryka Pó nocna, pulsotyp 1 (NAP1) i toksynotyp III. Toksynogenne szczepy C. difficile zwykle wytwarzaj dwa rodzaje toksyn: toksyn A (enterotoksyn ) i toksyn B (cytotoksyn ) 7. Niewielki odsetek szczepów wytwarza wy cznie toksyn B 8. W ostatnich czasach opisywano rosn c wirulencj szczepów wytwarzaj cych inn toksyn, okre lan mianem toksyny binarnej, i obci onych delecj w genie negatywnego regulatora tcdc 9,10. Zg aszano, e te ostatnie szczepy cechuje wi ksza wirulencja in vitro i wy sza zachorowalno oraz umieralno u ludzi 11,12. Po kolonizacji toksynogennym szczepem C. difficile pacjenci mog pozostawa bezobjawowymi nosicielami lub zachorowa na chorob jelit. Cechy kliniczne zaka enia CDI mog przyjmowa posta od agodnej biegunki do zagra aj cego yciu rzekomob oniastego zapalenia jelit, któremu towarzyszy ból brzucha, silna biegunka i objawy ogólnoustrojowe, takie jak gor czka, jad owstr t, nudno ci i z e samopoczucie. Doc. Rev

5 Rozpoznanie zaka enia CDI zwykle opiera si na wykazaniu obecno ci toksyny A i/lub B w próbkach stolca. Wykazanie wyst powania efektu cytopatycznego w monowarstwie komórek wynikaj cego z dzia ania toksyny B jest uznawane przez wiele osób za z oty standard 13, 14. Wykazanie efektu cytopatycznego mo na osi gn przez bezpo redni inkubacj supernatantu stolca z monowarstw komórek. Mo na równie prowadzi hodowl izolatów C. difficile w bulionie selektywnym, a uzyskany supernatant wykorzysta do inkubacji z monowarstw komórek (hodowla toksynogenna) 15. W przypadku obu technik ko cowy wynik uzyskuje si po co najmniej godzinach. Oznaczenia immunologiczne s powszechnie stosowane do detekcji toksyny A oraz B, poniewa umo liwiaj uzyskanie dodatniego wyniku w czasie krótszym ni 4 godziny. Jednak ich czu o jest znacz co ni sza w porównaniu z hodowl tkankow 16. W porównaniu z klinicznymi kryteriami potwierdzaj cymi wyst pienie zaka enia CDI reakcj PCR cechuje czu o, swoisto oraz warto ci predykcyjne wyników dodatnich i ujemnych wynosz ce odpowiednio 93,3%, 97,4%, 75,5% oraz 99,4% z czasem oczekiwania <4 godzin 15. Reakcja PCR jest uznawana za optymalny, szybki, pojedynczy test do wykrywania toksyny produkowanej przez bakterie C. difficile Mimo dramatycznego wzrostu cz sto ci zachorowa i nasilenia zaka e CDI metronidazol lub wankomycyna pozostaj leczeniem farmakologicznym z wyboru w przypadku epizodów ostrych i zaka e nawracaj cych 21. Do metod kontroli zaka e nale y rozwa ne stosowanie antybiotykoterapii, zapobieganie zaka eniom krzy owym oraz aktywny nadzór nad przypadkami zachorowa 22. Nie zaleca si powtarzania testu w celu potwierdzenia wyleczenia, poniewa toksyny mog by obecne w organizmie przez d u szy czas bez dawania objawów klinicznych. Z tego powodu istnieje wielka potrzeba wysoce czu ej i szybkiej, zautomatyzowanej metody detekcji bakterii C. difficile. Metody molekularne oferuj potencja istotnego skrócenia czasu wykrywania, umo liwiaj c przez to szybkie rozpocz cie leczenia przeciwbakteryjnego oraz wczesne wdro enie metod kontroli zaka e Obja nienie testu Test cobas Cdiff obejmuje dwa g ówne procesy: (1) zautomatyzowane przygotowanie próbek w celu izolacji kwasów nukleinowych z próbek nieuformowanego stolca; (2) amplifikacj docelowych sekwencji DNA w reakcji PCR z wykorzystaniem swoistych dla szczepów C. difficile primerów, a tak e detekcj w czasie rzeczywistym wyznakowanych fluorescencyjnie, rozszczepionych detekcyjnych sond oligonukleotydowych swoistych dla bakterii C. difficile. Przed rozpocz ciem zautomatyzowanego procesu przygotowania do wszystkich próbek dodawana jest kontrola wewn trzna, zawieraj ca niepowi zan, losow sekwencj DNA, poddawana amplifikacji i detekcji jednocze nie z ka d próbk w celu umo liwienia kontroli ca ego procesu. Zasady procedury Przygotowanie próbek Przygotowanie próbek do testu cobas Cdiff jest zautomatyzowane za pomoc aparatu cobas x 480. Mikroorganizmy s poddawane lizie z u yciem czynnika chaotropowego, proteinazy K oraz odczynnika SDS. Uwolnione kwasy nukleinowe, wraz z dodanym DNA stanowi cym kontrol wewn trzn, s wi zane z cz steczkami magnetycznymi. S one przep ukiwane, a nast pnie poddawane elucji w ma ej obj to ci buforu. Nast pnie aparat pobiera porcj materia u poddanego elucji i przygotowuje reakcj PCR z u yciem aktywowanego odczynnika Master Mix. Doc. Rev

6 Amplifikacja w reakcji PCR i detekcja metod TaqMan Etapy cykli reakcji PCR oraz detekcja docelowego sygna u zachodz w analizatorze cobas z 480. Odczynnik Master Mix zawiera pary primerów i sondy swoiste dla dwóch elementów docelowych: toksyny B oraz kontroli wewn trznej. Je li docelowe sekwencje kwasu nukleinowego s obecne, dojdzie do amplifikacji z u yciem odpowiednich primerów oraz termostabilnej polimerazy DNA, co b dzie skutkowa o utworzeniem produktów reakcji PCR (amplikonu). Te produkty s wykrywane przez swoiste sondy TaqMan zawieraj ce barwnik fluorescencyjny oraz wygaszacz. W stanie wyj ciowym wygaszacz t umi fluorescencj barwnika. Jednak w przypadku obecno ci produktu PCR sonda z nim hybrydyzuje i ulega rozszczepieniu na skutek dzia ania polimerazy, która wykazuje aktywno nukleazy w kierunku od ko ca 5' do ko ca 3'. Ta reakcja umo liwia emisj fluorescencji z barwnika, a sygna jest rejestrowany w czasie rzeczywistym w trakcie ka dego cyklu reakcji PCR przez analizator cobas z 480. Sygna jest interpretowany przez oprogramowanie systemu cobas 4800 i przedstawiany w postaci ko cowych wyników. Amplifikacja wybiórcza Amplifikacj wybiórcz badanego kwasu nukleinowego z próbki klinicznej przy u yciu testu cobas Cdiff uzyskuje si dzi ki zastosowaniu enzymu AmpErase (uracylo-n-glikozylazy) i trójfosforanu dezoksyurydyny (dutp). Enzym AmpErase rozpoznaje i katalizuje niszczenie nici DNA zawieraj cych dezoksyurydyn 23, lecz nie DNA zawieraj cego dezoksytymidyn. Dezoksyurydyny nie stwierdza si w wyst puj cym naturalnie DNA, natomiast jest ona zawsze obecna w amplikonie z uwagi na stosowanie trójfosforanu dezoksyurydyny zamiast trójfosforanu tymidyny jako jednego spo ród dntps w odczynniku Master Mix; dlatego te jedynie amplikon zawiera dezoksyurydyn. Dezoksyurydyna powoduje wra liwo zanieczyszczaj cego amplikonu na rozk ad przez enzym AmpErase przed amplifikacj docelowego DNA. Zawarty w odczynniku Master Mix enzym AmpErase katalizuje rozszczepienie DNA zawieraj cego dezoksyurydyn w miejscu reszt dezoksyurydynowych przez otwarcie pier cienia dezoksyrybozy w pozycji C1. Podczas ogrzewania w pierwszym cyklu termicznym w ph zasadowym odczynnika Master Mix a cuch amplikonu DNA p ka w pozycji dezoksyurydyny, w ten sposób wykluczaj c dalsz amplifikacj DNA. Enzym AmpErase jest nieczynny w temperaturach powy ej 55 C, tj. w czasie trwania ca ego cyklu termicznego, dlatego te nie niszczy on amplikonu docelowego. Wykazano, e test cobas Cdiff dezaktywuje na ka d reakcj PCR co najmniej 1000 kopii zawieraj cego dezoksyurydyn amplikonu C. difficile. Doc. Rev

7 Materia y, odczynniki i próbki Dostarczane materia y i odczynniki Zestaw/kasety Elementy i sk adniki odczynników Ilo na test Symbol bezpiecze stwa i ostrze enie cobas 4800 System Sample Preparation Kit (Zestaw do przygotowywania próbek w systemie cobas 4800) 240 testów (P/N: ) MGP (Szklane cz stki o w a ciwo ciach magnetycznych systemu cobas 4800) Szklane cz stki o w a ciwo ciach magnetycznych 93% izopropanolu 10 x 4,5 ml Niebezpiecze stwo H225 Wysoce atwopalna ciecz i pary. H319 Dzia a dra ni co na oczy. H336 Mo e wywo ywa uczucie senno ci lub zawroty g owy. P210 Przechowywa z dala od róde ciep a, gor cych powierzchni, róde iskrzenia, otwartego ognia i innych róde zap onu. Nie pali. P233 Przechowywa pojemnik szczelnie zamkni ty. P261 Unika wdychania py u/dymu/gazu/ mg y/par/rozpylonej cieczy. P280 Stosowa r kawice ochronne/ ochron oczu/ochron twarzy. P303 + P361 + P353 W PRZYPADKU KONTAKTU ZE SKÓR (lub z w osami): Natychmiast zdj ca zanieczyszczon odzie. Sp uka skór pod strumieniem wody/prysznicem. P370 + P378 W przypadku po aru: U y suchego piasku, proszku chemicznego lub rodka pianotwórczego odpornego na dzia anie alkoholi do gaszenia. EB (Bufor do elucji systemu cobas 4800) Bufor Tris-HCl 0,09% azydku sodu 10 x 18 ml Nie dotyczy Doc. Rev

8 Zestaw/kasety Elementy i sk adniki odczynników Ilo na test Symbol bezpiecze stwa i ostrze enie cobas 4800 System Sample Preparation Kit (Zestaw do przygotowywania próbek w systemie cobas 4800) 960 testów (P/N: ) MGP (Szklane cz stki o w a ciwo ciach magnetycznych systemu cobas 4800) Szklane cz stki o w a ciwo ciach magnetycznych 93% izopropanolu 10 x 13,5 ml Niebezpiecze stwo H225 Wysoce atwopalna ciecz i pary. H319 Dzia a dra ni co na oczy. H336 Mo e wywo ywa uczucie senno ci lub zawroty g owy. P210 Przechowywa z dala od róde ciep a, gor cych powierzchni, róde iskrzenia, otwartego ognia i innych róde zap onu. Nie pali. P233 Przechowywa pojemnik szczelnie zamkni ty. P261 Unika wdychania py u/dymu/gazu/ mg y/par/rozpylonej cieczy. P280 Stosowa r kawice ochronne/ ochron oczu/ochron twarzy. P303 + P361 + P353 W PRZYPADKU KONTAKTU ZE SKÓR (lub z w osami): Natychmiast zdj ca zanieczyszczon odzie. Sp uka skór pod strumieniem wody/prysznicem. P370 + P378 W przypadku po aru: U y suchego piasku, proszku chemicznego lub rodka pianotwórczego odpornego na dzia anie alkoholi do gaszenia. EB (Bufor do elucji systemu cobas 4800) Bufor Tris-HCl 0,09% azydku sodu 10 x 18 ml Nie dotyczy Doc. Rev

9 Zestaw/kasety Elementy i sk adniki odczynników Ilo na test Symbol bezpiecze stwa i ostrze enie cobas 4800 System Lysis Kit 1 (Zestaw do lizy 1 w systemie cobas 4800) 240 testów (P/N: ) LYS-1 (Bufor do lizy 1 w systemie cobas 4800) Cytrynian sodu 5% polidokanol 42,6% tiocyjanianu guanidyny Ditiotreitol PK (Proteinaza K systemu cobas 4800) Bufor Tris EDTA Chlorek wapnia Octan wapnia < 2,0% proteinazy K Gliceryna SDS (Odczynnik SDS systemu cobas 4800) Bufor Tris-HCl Dodecylosiarczanu sodu 0,09% azydku sodu 10 x 24 testy 10 x 0,9 ml 10 x 3 ml Niebezpiecze stwo H302 + H332 Dzia a szkodliwie po po kni ciu i w nast pstwie wdychania. H317 Mo e powodowa reakcj alergiczn skóry. H318 Powoduje powa ne uszkodzenie oczu. H334 Mo e powodowa objawy alergii lub astmy lub trudno ci w oddychaniu w nast pstwie wdychania. H412 Dzia a szkodliwie na organizmy wodne, powoduj c d ugotrwa e skutki. EUH032 W kontakcie z kwasami uwalnia bardzo toksyczne gazy. P261 Unika wdychania py u/dymu/gazu/ mg y/par/rozpylonej cieczy. P280 Stosowa r kawice ochronne/ ochron oczu/ochron twarzy. P284 Stosowa indywidualne rodki ochrony dróg oddechowych. P304 + P340 + P312 W PRZYPADKU DOSTANIA SI DO DRÓG ODDECHOWYCH: Wyprowadzi lub wynie poszkodowanego na wie e powietrze i zapewni mu warunki do swobodnego oddychania. W przypadku z ego samopoczucia skontaktowa si z O RODKIEM ZATRU lub z lekarzem. P305 + P351 + P338 + P310 W PRZYPADKU DOSTANIA SI DO OCZU: Ostro nie p uka wod przez kilka minut. Wyj soczewki kontaktowe, je eli s i mo na je atwo usun. Nadal p uka. Natychmiast skontaktowa si z O RODKIEM ZATRU /lekarzem. P342 + P311 W przypadku wyst pienia objawów ze strony uk adu oddechowego: Skontaktowa si z O RODKIEM ZATRU /lekarzem. Doc. Rev

10 Zestaw/kasety Elementy i sk adniki odczynników Ilo na test Symbol bezpiecze stwa i ostrze enie cobas 4800 System Lysis Kit 1 (Zestaw do lizy 1 w systemie cobas 4800) 960 testów (P/N: ) LYS-1 (Bufor do lizy 1 w systemie cobas 4800) Cytrynian sodu 5% polidokanol 42,6% tiocyjanianu guanidyny Ditiotreitol PK (Proteinaza K systemu cobas 4800) Bufor Tris EDTA Chlorek wapnia Octan wapnia < 2,0% proteinazy K Gliceryna SDS (Odczynnik SDS systemu cobas 4800) Bufor Tris-HCl Dodecylosiarczanu sodu 0,09% azydku sodu 10 x 96 testów 20 1,2 ml 10 9 ml Niebezpiecze stwo H302 + H332 Dzia a szkodliwie po po kni ciu i w nast pstwie wdychania. H317 Mo e powodowa reakcj alergiczn skóry. H318 Powoduje powa ne uszkodzenie oczu. H334 Mo e powodowa objawy alergii lub astmy lub trudno ci w oddychaniu w nast pstwie wdychania. H412 Dzia a szkodliwie na organizmy wodne, powoduj c d ugotrwa e skutki. EUH032 W kontakcie z kwasami uwalnia bardzo toksyczne gazy. P261 Unika wdychania py u/dymu/gazu/ mg y/par/rozpylonej cieczy. P280 Stosowa r kawice ochronne/ ochron oczu/ochron twarzy. P284 Stosowa indywidualne rodki ochrony dróg oddechowych. P304 + P340 + P312 W PRZYPADKU DOSTANIA SI DO DRÓG ODDECHOWYCH: Wyprowadzi lub wynie poszkodowanego na wie e powietrze i zapewni mu warunki do swobodnego oddychania. W przypadku z ego samopoczucia skontaktowa si z O RODKIEM ZATRU lub z lekarzem. P305 + P351 + P338 + P310 W PRZYPADKU DOSTANIA SI DO OCZU: Ostro nie p uka wod przez kilka minut. Wyj soczewki kontaktowe, je eli s i mo na je atwo usun. Nadal p uka. Natychmiast skontaktowa si z O RODKIEM ZATRU /lekarzem. P342 + P311 W przypadku wyst pienia objawów ze strony uk adu oddechowego: Skontaktowa si z O RODKIEM ZATRU /lekarzem. Doc. Rev

11 Zestaw/kasety Elementy i sk adniki odczynników Ilo na test Symbol bezpiecze stwa i ostrze enie cobas 4800 System Wash Buffer Kit (Zestaw buforu p ucz cego do systemu cobas 4800) 240 testów (P/N: ) WB (Bufor p ucz cy systemu cobas 4800) Cytrynian sodu dwuwodny 0,05% N-metyloizotiazolonu HCl 10 x 55 ml Nie dotyczy cobas 4800 System Wash Buffer Kit (Zestaw buforu p ucz cego do systemu cobas 4800) 960 testów (P/N: ) WB (Bufor p ucz cy systemu cobas 4800) Cytrynian sodu dwuwodny 0,05% N-metyloizotiazolonu HCl 10 x 200 ml Nie dotyczy cobas 4800 System Internal Control Kit 1 (Zestaw kontroli wewn trznej 1 systemu cobas 4800) 20 przebiegów (P/N: ) IC-1 (Kontrola wewn trzna 1 systemu cobas 4800) Bufor Tris EDTA < 0,01% poli-ra RNA (syntetycznego) 0,05% azydku sodu < 0,01% niezaka nego, syntetycznego DNA do kontroli wewn trznej, op aszczonego bia kiem kapsydowym bakteriofaga lambda 20 przebiegów Nie dotyczy Doc. Rev

12 Zestaw/kasety Elementy i sk adniki odczynników Ilo na test Symbol bezpiecze stwa i ostrze enie cobas 4800 Cdiff Amplification/Detection Kit (Zestaw do amplifikacji/ detekcji systemu cobas 4800 Cdiff) 80 testów (P/N: ) Cdiff MMX (Odczynnik Master Mix cobas Cdiff) Bufor trycynowy EDTA DMSO Octan potasu Wodorotlenek potasu Tween 20 < 0,19% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,01% roztworu starterów sensownych i antysensownych dla C. difficile oraz kontroli wewn trznej < 0,01% roztworu znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym sond dla C. difficile oraz kontroli wewn trznej < 0,01% aptameru oligonukleotydowego < 0,01% polimerazy DNA Z05 (bakteryjnej) < 0,02% enzymu AmpErase (uracylo-n-glikozylazy) (bakteryjnej) 0,09% azydku sodu 10 x 8 testów Nie dotyczy cobas 4800 Cdiff Amplification/Detection Kit (Zestaw do amplifikacji/ detekcji systemu cobas 4800 Cdiff) 240 testów (P/N: ) Cdiff MMX (Odczynnik Master Mix cobas Cdiff) Bufor trycynowy EDTA DMSO Octan potasu Wodorotlenek potasu Tween 20 < 0,19% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,01% roztworu starterów sensownych i antysensownych dla C. difficile oraz kontroli wewn trznej < 0,01% roztworu znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym sond dla C. difficile oraz kontroli wewn trznej < 0,01% aptameru oligonukleotydowego < 0,01% polimerazy DNA Z05 (bakteryjnej) < 0,02% enzymu AmpErase (uracylo-n-glikozylazy) (bakteryjnej) 0,09% azydku sodu 10 x 24 testy Nie dotyczy Doc. Rev

13 Zestaw/kasety Elementy i sk adniki odczynników Ilo na test Symbol bezpiecze stwa i ostrze enie cobas 4800 Cdiff Controls and Cofactor Kit (Zestaw kontroli i kofaktora Cdiff systemu cobas 4800) 10 przebiegów (P/N: ) Cdiff (+) C (Kontrola dodatnia cobas Cdiff) Bufor Tris EDTA < 0,01% poli-ra RNA (syntetycznego) 0,05% azydku sodu < 0,01% niezaka nego plazmidu DNA (bakteryjnego) zawieraj cego sekwencj C. difficile ( ) C (Kontrola ujemna systemu cobas 4800) Bufor Tris EDTA 0,05% azydku sodu < 0,01% poli-ra RNA (syntetycznego) Cofactor-3 (Kofaktor-3 systemu cobas 4800) Octan manganu Octan magnezu Albumina surowicy bydl cej z osocza bydl cego, pozyskana w Stanach Zjednoczonych 0,09% azydku sodu 10 zestawów 10 zestawów 10 przebiegów Nie dotyczy Nie dotyczy Nie dotyczy Przechowywanie i u ytkowanie odczynników Odczynnik Temperatura przechowywania Czas przechowywania cobas 4800 System Sample Preparation Kit (Zestaw do przygotowywania próbek w systemie cobas 4800) cobas 4800 System Lysis Kit 1 (Zestaw do lizy 1 w systemie cobas 4800) cobas 4800 System Internal Control Kit 1 (Zestaw kontroli wewn trznej 1 systemu cobas 4800) cobas 4800 Cdiff Amplification/Detection Kit (Zestaw do amplifikacji/detekcji systemu cobas 4800 Cdiff) cobas 4800 Cdiff Controls and Cofactor Kit (Zestaw kontroli i kofaktora Cdiff systemu cobas 4800) cobas 4800 System Wash Buffer Kit (Zestaw buforu p ucz cego do systemu cobas 4800) Doc. Rev C 2 8 C 2 8 C 2 8 C 2 8 C C Zachowuje trwa o do momentu up ywu wskazanej daty wa no ci. Zachowuje trwa o do momentu up ywu wskazanej daty wa no ci. Zachowuje trwa o do momentu up ywu wskazanej daty wa no ci. Zachowuje trwa o do momentu up ywu wskazanej daty wa no ci. Zachowuje trwa o do momentu up ywu wskazanej daty wa no ci. Zachowuje trwa o do momentu up ywu wskazanej daty wa no ci. Uwaga: Nie nale y zamra a odczynników. Dat wa no ci odczynników okre lono w oparciu o skoordynowany czas uniwersalny (UTC). Lokalny czas wa no ci odczynników mo na okre li, dodaj c lub odejmuj c maksymalnie 12 godzin w zale no ci od czasu miejscowego w odniesieniu do czasu UTC.

14 Wymagane materia y dodatkowe Materia y Ko cówki CORE, 1000 µl, statyw zawieraj cy 96 sztuk Pojemnik na odczynnik 50 ml Pojemnik na odczynnik 200 ml P ytka (g bokodo kowa) do ekstrakcji w systemie cobas 4800 P ytka AD 0,3 ml (z mikrodo kami) i folia uszczelniaj ca systemu cobas Aplikator folii uszczelniaj cej No nik 24-pozycyjny Worek na odpady sta e Plastikowa zsuwnia Hamilton STAR cobas PCR Media and Swab Sample Kit (Zestaw do pobierania próbek zawieraj cy pod o e cobas PCR i wymazówk ) R kawice jednorazowe bezpudrowe Mieszad o wibracyjne (do mieszania jednej probówki) Wirówka laboratoryjna, wyposa ona w b ben wirówki o minimalnej warto ci RCF równej 1500 P/N (ma y) lub (du y) Akceptowalne s jakiekolwiek bezpudrowe r kawice jednorazowe. Akceptowalne jest dowolne mieszad o wibracyjne. Akceptowalna jest dowolna wirówka spe niaj ca te wymagania. W celu uzyskania dodatkowych informacji dotycz cych materia ów sprzedawanych oddzielnie prosimy o kontakt z miejscowym przedstawicielstwem firmy Roche. Materia y opcjonalne Materia y Maty zamykaj ce lub pokrywa p ytki g bokodo kowej Roche lub Hamilton Korki, bezbarwne (do ponownego zamykania przetworzonych próbek pierwotnych) P/N Roche P/N ; do ponownego zamykania przetworzonych próbek w okr g odennych probówkach 13 ml W celu uzyskania dodatkowych informacji dotycz cych materia ów opcjonalnych prosimy o kontakt z miejscowym przedstawicielstwem firmy Roche. Doc. Rev

15 Urz dzenia i oprogramowanie wymagane, lecz niedostarczane System cobas 4800 Wymagane urz dzenia i oprogramowanie, lecz niedostarczane Aparat cobas x 480 Analizator cobas z 480 Jednostka steruj ca Oprogramowanie cobas Cdiff AP systemu cobas 4800 w wersji lub nowsze Oprogramowanie aplikacyjne (podstawowe) systemu cobas 4800 w wersji lub nowsze W celu uzyskania dodatkowych informacji dotycz cych materia ów sprzedawanych oddzielnie prosimy o kontakt z miejscowym przedstawicielstwem firmy Roche. Wymagania dotycz ce rodków ostro no ci i u ytkowania Ostrze enia i rodki ostro no ci Podobnie jak w przypadku ka dej procedury testowej, dla prawid owego przeprowadzenia badania kluczowe znaczenie ma zachowanie zasad dobrej praktyki laboratoryjnej. Z uwagi na wysok czu o analityczn niniejszego testu nale y przedsi wzi wyj tkow ostro no, u ywaj c odczynników, próbek oraz mieszanin do amplifikacji, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Do stosowania wy cznie w diagnostyce in vitro. Nale y unika mikrobiologicznego i przez DNA zanieczyszczenia odczynników i próbek. Karty charakterystyki (Safety Data Sheet, SDS) s dost pne na danie w miejscowym przedstawicielstwie firmy Roche. Odczynnik LYS-1 zawiera tiocyjanian guanidyny. Nie dopu ci do bezpo redniego kontaktu mi dzy tiocyjanianem guanidyny i podchlorynem sodu (wybielacz) ani innymi wysoce reaktywnymi odczynnikami, takimi jak kwasy lub zasady. Takie mieszaniny mog wydziela truj ce gazy. Odczynnik MGP zawiera izopropanol i jest wysoce atwopalny. Nale y przechowywa go z dala od otwartego ognia i potencjalnych róde iskier. Nie wolno nara a odczynnika MGP na dzia anie róde pola magnetycznego. Odczynniki EB, Cdiff MMX, SDS, Cofactor-3, ( )C, Cdiff (+)C oraz IC-1 zawieraj azydek sodu. Dodatkowe ostrze enia, rodki ostro no ci oraz procedury maj ce na celu zredukowanie ryzyka zaka enia, dotycz ce aparatu cobas x 480 lub analizatora cobas z 480 mo na znale w odpowiednim Podr czniku systemu system cobas W przypadku podejrzenia wyst pienia zanieczyszczenia nale y przeprowadzi czyszczenie oraz konserwacj tygodniow zgodnie z opisem zamieszczonym w odpowiednim Podr czniku systemu system cobas Uwaga: Szczegó owe instrukcje zamieszczono w cz ci Pobieranie, transport i przechowywanie próbek. Doc. Rev

16 Dobra praktyka laboratoryjna Nie nale y pipetowa za pomoc ust. Nie wolno je, pi ani pali w obszarach roboczych laboratorium. Po zako czeniu pracy z próbkami i odczynnikami testowymi nale y dok adnie umy r ce. Podczas pracy z jakimikolwiek odczynnikami nale y u ywa os on na oczy oraz fartuchów laboratoryjnych i r kawic jednorazowych. Nale y unika kontaktu wymienionych materia ów ze skór, oczami i b onami luzowymi. Je eli dojdzie do kontaktu, miejsce jego wyst pienia nale y natychmiast sp uka du ilo ci wody. Je eli nie zostan podj te odpowiednie dzia ania lecznicze, mo e doj do oparze. W razie rozlania przed wytarciem nale y rozcie czy wod. Dok adnie oczy ci i odkazi wszystkie laboratoryjne powierzchnie robocze wie o przygotowanym roztworem 0,5% podchlorynu sodu w wodzie destylowanej lub dejonizowanej (rozcie czy domowy wybielacz w stosunku 1:10). Nast pnie nale y przetrze powierzchni 70% etanolem. Zanieczyszczenie W celu zapobie enia zanieczyszczeniu konieczne jest noszenie r kawic i ich zmiana pomi dzy prac z próbkami i odczynnikami testu cobas Cdiff. Podczas pracy z próbkami i kontrolami nale y unika zanieczyszczenia r kawic. Podczas obchodzenia si z próbkami i zestawem odczynników nale y nosi jednorazowe r kawice, fartuchy laboratoryjne oraz os on oczu. Nale y unika mikrobiologicznego i przez rybonukleazy zanieczyszczenia odczynników. Je eli w trakcie obchodzenia si z próbkami i ich przetwarzania nie jest mo liwa odpowiednia kontrola przeniesienia mi dzy próbkami, mo e doj do wyst pienia wyników fa szywie dodatnich. Z próbkami nale y obchodzi si tak jak z materia em zaka nym, stosuj c laboratoryjne procedury bezpiecze stwa, takie jak okre lone w dokumentach: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 24 oraz CLSI Document M29-A4 25. Integralno Nie wolno u ywa zestawów po up ywie daty wa no ci. Nie nale y poddawa odczynników pulowaniu. Nie wolno u ywa przedmiotów jednorazowego u ytku po up ywie daty wa no ci. Wszystkie przedmioty jednorazowego u ytku s przeznaczone do jednokrotnego u ycia. Nie wykorzystywa ponownie. Ca e wyposa enie powinno by odpowiednio konserwowane, zgodnie z instrukcjami producenta. Doc. Rev

17 Utylizacja Odczynniki systemu cobas 4800 oraz odczynniki swoiste dla testu cobas Cdiff zawieraj azydek sodu (patrz rozdzia Ostrze enia i rodki ostro no ci ). Azydek sodu mo e reagowa z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi wykonanymi z o owiu lub miedzi, tworz c silnie wybuchowe azydki metali. Usuwaj c roztwory zawieraj ce azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, nale y przep uka rury du ilo ci zimnej wody, aby zapobiec nagromadzeniu azydków. Nale y wyrzuci wszystkie nieu yte odczynniki, post puj c zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi. Uwaga: Informacje dotycz ce usuwania odpadów p ynnych zamieszczono w odpowiednim Podr czniku systemu system cobas Rozlanie p ynów i czyszczenie Odczynnik LYS-1 zawiera tiocyjanian guanidyny. Je li p yn zawieraj cy tiocyjanian guanidyny ulegnie rozlaniu, do czyszczenia nale y u ywa odpowiedniego detergentu laboratoryjnego i wody. Je li rozlany p yn zawiera potencjalne czynniki zaka ne, do czyszczenia nale y NAJPIERW u ywa detergentu laboratoryjnego i wody, a nast pnie 0,5% roztworu podchlorynu sodu. Je li do rozlania p ynu dojdzie na powierzchni aparatu cobas 4800, nale y post powa zgodnie z instrukcjami zamieszczonymi w odpowiednim Podr czniku systemu system cobas 4800 w celu przeprowadzenia czyszczenia. Do czyszczenia aparatu cobas x 480 lub analizatora cobas z 480 nie wolno u ywa roztworu podchlorynu sodu (wybielacz). Czyszczenia aparatu cobas x 480 lub analizatora cobas z 480 nale y dokonywa zgodnie z procedurami opisanymi w odpowiednim Podr czniku systemu system cobas Pobieranie, transport i przechowywanie próbek Uwaga: Ze wszystkimi próbkami nale y obchodzi si jak z materia em potencjalnie zaka nym. Pobieranie próbek Próbk nieuformowanego stolca nale y pobra do ja owego pojemnika. Próbki nale y pobiera zgodnie z procedur okre lon w standardowych procedurach roboczych placówki. Przechowywanie i trwa o próbek podczas transportu Próbki nieuformowanego stolca zachowuj trwa o w temperaturze 2 30 C przez 2 dni lub w temperaturze 2 8 C przez 7 dni b d 20 C przez 60 dni przed przeprowadzeniem oznaczenia w systemie cobas 4800 (wykazano to przez oznaczanie próbek po przechowywaniu kolejno w temp. 30 C ±1 C przez 2 dni, w temp. 2 8 C przez 5 dni, a nast pnie w temp. 20 C przez 60 dni). Próbki stolca wymieszane z pod o em PCR cobas zachowuj trwa o w temperaturze 2 8 C przez 60 dni lub w temperaturze 30 C przez 7 dni przed wykonaniem oznaczenia w systemie cobas Próbki bakterii C. difficile musz by transportowane zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi dotycz cymi transportu czynników etiologicznych. Doc. Rev

18 Procedura testowa Wykonywanie oznaczenia Przebieg pracy Rysunek 1: Przebieg pracy z u yciem testu cobas Cdiff 1 Uruchomienie systemu. 2 Wykonanie czynno ci konserwacyjnych w odniesieniu do aparatu. 3 Wyj cie próbek i odczynników z miejsca przechowywania. 4 Rozpocz cie przebiegu: Umieszczenie no ników z próbkami. 5 W przypadku korzystania z systemu LIS: potwierdzenie zlecenia pracy. W przypadku braku systemu LIS: utworzenie zlecenia pracy. 6 Umieszczenie materia ów eksploatacyjnych (p ytki g bokodo kowej, p ytki mikrodo kowej, statywów na ko cówki) i odczynników. 7 Rozpocz cie przebiegu przygotowania próbek. 8 Wyj cie i uszczelnienie p ytki mikrodo kowej. 9 Wyj cie próbek, zu ytych odczynników i p ytki g bokodo kowej. 10 Umieszczenie p ytki mikrodo kowej w analizatorze. 11 Przeanalizowanie wyników. 12 W przypadku korzystania z systemu LIS: przes anie wyników do systemu LIS. 13 Wyj cie p ytki z analizatora. Instrukcja u ytkowania Wszystkie odczynniki, poza odczynnikami Cdiff MMX i Cofactor-3, przed za adowaniem do aparatu cobas x 480 musz znajdowa si w temperaturze pokojowej. Odczynniki Cdiff MMX i Cofactor-3 mo na umieszcza w aparacie bezpo rednio z temperatury przechowywania 2 8 C, poniewa ich temperatura zostanie wyrównana do temperatury otoczenia wewn trz aparatu cobas x 480 podczas procesu przetwarzania. Uwaga: Szczegó owe instrukcje obs ugi mo na znale w odpowiednim Podr czniku u ytkownika systemu cobas 4800 dla testu cobas Cdiff. Doc. Rev

19 Wielko przebiegu W systemie cobas 4800 mo na prowadzi jednocze nie testy cobas MRSA/SA, cobas Cdiff oraz cobas HSV 1 i 2 w ramach po czenia ró nych partii w tym samym przebiegu. Ogólny zestaw do przygotowywania próbek w systemie cobas 4800, ogólny zestaw do lizy 1 w systemie cobas 4800 oraz ogólny zestaw buforu p ucz cego do systemu cobas 4800 s dost pne w dwóch wielko ciach, z których ka da wystarcza na 10 przebiegów zawieraj cych do 24 lub 96 próbek w czaj c kontrole i próbki dla wszystkich oznacze do przeprowadzenia. Zestaw do amplifikacji/detekcji Cdiff w systemie cobas 4800 jest dost pny w dwóch wielko ciach, z których ka da wystarcza do przeprowadzenia analizy maksymalnie 80 lub 240 próbek obejmuj cych kontrole Cdiff oraz próbki do oznaczenia. Zale nie od potrzeb w jednym przebiegu mo na wykorzysta kilka fiolek odczynnika cobas 4800 Cdiff Master Mix pod warunkiem, e pochodz one z zestawów o tym samym rozmiarze. Ogólny zestaw kontroli wewn trznej 1 systemu cobas 4800 oraz zestaw kontroli i kofaktora Cdiff systemu cobas 4800 s dost pne w zestawie o jednym rozmiarze, który mo e zosta wykorzystany we wszystkich konfiguracjach przebiegu. Na ka dy przebieg zawieraj cy próbki C. difficile nale y u y jedn dodatni kontrol Cdiff systemu cobas 4800 i jedn kontrol ujemn systemu cobas 4800 (patrz rozdzia Kontrola jako ci ). W przypadku przebiegu z jednym testem maksymalna dopuszczalna liczba próbek to 94 próbki pacjentów i 2 kontrole. Uwaga: Chocia nie stanowi to optymalnego u ycia odczynników, w przebiegu zawieraj cym cznie 1 22 próbek mo na u y odczynnika ogólnego zestawu 96 testów. Jednak nie mo na czy ze sob ró nych wielko ci zestawu buforu p ucz cego (WB) systemu cobas 4800, zestawu do przygotowywania próbek w systemie cobas 4800 oraz zestawu do lizy 1 w systemie cobas Przyk adowo, je li na pocz tku przebiegu skanowana jest butelka z odczynnikiem WB z zestawu 96 testów, nale y u y odczynników z pozosta ych dwóch zestawów równie o rozmiarze 96 testów. Uwaga: Chocia nie stanowi to optymalnego u ycia odczynników, w przebiegu zawieraj cym 1 6 próbek bakterii C. difficile mo na u y odczynnika MMX zestawu 24 testów Cdiff w systemie cobas Szczegó owe informacje dotycz ce zmiany wielko ci zestawu zamieszczono w odpowiednim Podr czniku u ytkownika systemu cobas 4800 dla testu cobas Cdiff oraz w rozdziale Wk adanie odczynników. Przebieg pracy Test cobas Cdiff to oznaczenie prowadzone z wykorzystaniem przebiegu pracy Full Workflow w ramach oprogramowania cobas Obejmuje on przygotowanie próbek w aparacie cobas x 480 oraz amplifikacj /detekcj w analizatorze cobas z 480. Przebieg mo e obejmowa tylko oznaczenie Cdiff lub dodatkowo testy cobas MRSA/SA i/lub cobas HSV 1 oraz 2 w ramach po czenia ró nych partii. Szczegó owe informacje zamieszczono w rozdziale Przeprowadzanie przebiegu pracy Full Workflow oraz w odpowiednim Podr czniku u ytkownika systemu cobas 4800 dla testu cobas Cdiff. Doc. Rev

20 Przenoszenie próbek do probówek z pod o em cobas PCR 1. U yj jednej poliestrowej wymazówki do przeniesienia stolca do probówki z pod o em cobas PCR. Wyrzu drug wymazówk znajduj c si w opakowaniu. Nie dotykaj c cianek pojemnika ze stolcem, zanurz ca kowicie ko cówk wymazówki w próbce stolca, a do ko ca sto kowej cz ci, a nast pnie szybko j wyjmij i umie wymazówk z inokulatem w probówce z pod o em cobas PCR. Nie nale y wykonywa oznaczenia, je li ilo próbki stolca nie umo liwia ca kowitego zanurzenia ko cówki wymazówki. 2. Przyciskaj c trzonek wymazówki do ciany probówki, prze am go w miejscu szarego oznaczenia naci cia. Zamknij probówk korkiem i zworteksuj przez co najmniej 5 sekund. Zdejmij korek i umie probówk (probówki) w 24-pozycyjnym no niku próbek w celu przetworzenia. Wyrzu korki. Uwaga: Test cobas Cdiff zosta zatwierdzony do stosowania w po czeniu z zestawem cobas PCR Media and Swab Sample Kit. Nie nale y korzysta z innych rodzajów urz dze i pod o y. Uwaga: Do przenoszenia stolca nale y korzysta wy cznie z jednej poliestrowej wymazówki. Przeniesienie do probówki z pod o em cobas PCR nadmiaru stolca mo e spowodowa powstanie grudek i/lub uzyskanie niewa nych wyników. Uwaga: Próbki stolca nale y przenie do probówek z pod o em cobas PCR oznakowanych odpowiednim kodem kreskowym umo liwiaj cym przetwarzanie w aparacie cobas x 480. W celu uzyskania informacji na temat procedur w a ciwego kodowania kreskowego nale y zapozna si z odpowiednim Podr cznikiem systemu system cobas 4800 oraz list kodów kreskowych dopuszczalnych w systemie cobas Uwaga: Aby unikn zanieczyszczenia krzy owego zawiesin próbek stolca w pod o u cobas PCR, do ponownego zamykania probówek po przetworzeniu nale y u ywa dodatkowych korków do pojemników na próbki w pod o u cobas PCR w innym kolorze (bezbarwnych; patrz rozdzia Materia y opcjonalne ). Uwaga: Obj to pod o a cobas PCR wystarcza do przeprowadzenia kilkukrotnych oznacze próbek zawiesiny stolca w systemie cobas Minimalna obj to zawiesiny stolca konieczna do przeprowadzenia przebiegu testu cobas Cdiff to 3 ml w probówce z po ywk cobas PCR. Wykonywanie testu cobas Cdiff Uwaga: Mo liwe jest przeprowadzenie testów cobas MRSA/SA oraz cobas Cdiff i/lub cobas HSV 1 oraz 2 w ramach po czenia ró nych partii w tym samym przebiegu. Wi cej informacji mo na znale w odpowiednim Podr czniku u ytkownika systemu cobas 4800 dla testu cobas Cdiff. 1. Uruchom system i wykonaj procedury konserwacyjne, post puj c zgodnie z instrukcjami zamieszczonymi w odpowiednim Podr czniku systemu system cobas 4800 w cz ci Konserwacja aparatu. 2. Zgromad wszystkie wymagane odczynniki i materia y eksploatacyjne. W momencie rozpocz cia przebiegu odczynniki, z wyj tkiem odczynników cobas Cdiff MMX oraz Cofactor-3, musz mie temperatur pokojow. Doc. Rev

21 Uwaga: Wszystkie odczynniki i pojemniki na odczynniki s opatrzone kodem kreskowym i s przeznaczone do jednokrotnego u ycia. Oprogramowanie cobas 4800 ledzi u ycie odczynników oraz pojemników na odczynniki i odrzuca wcze niej u ywane odczynniki lub pojemniki na odczynniki. 3. Rozpocznij nowy przebieg i zdefiniuj dla niego zlecenie pracy. Zlecenie pracy mo na utworzy na trzy sposoby: Korzystaj c z edytora próbki przed umieszczeniem statywu z próbkami w aparacie cobas x 480 (przycisk Editor po prawej stronie menu g ównego). Zlecenia pracy mo na zapisa, edytowa i wczyta ponownie w razie potrzeby. Przez skorzystanie z kreatora oprogramowania dla nowego przebiegu i umieszczenie próbek w aparacie cobas x 480 po wy wietleniu takiego polecenia. Kody kreskowe próbek zostan automatycznie zeskanowane i konieczne b dzie zdefiniowane danych wyników dla ka dej próbki. Przez skorzystanie z systemu LIS placówki. Wi cej szczegó ów mo na znale w odpowiednim Podr czniku u ytkownika systemu cobas 4800 dla testu cobas Cdiff. Podczas wybierania danych wyników nale y zaznaczy opcj Cdiff. 4. Umie próbki i zdefiniuj/wybierz zlecenie pracy lub skorzystaj z systemu LIS, zale nie od tego co b dzie w a ciwe. Domy lnie zaznaczona jest opcja Unload sample carriers after transferring to deep well plate. Umo liwia to operatorowi pozyskanie pozosta ych próbek zawiesiny stolca tak szybko jak to mo liwe po pobraniu z nich porcji na potrzeby przetwarzania w aparacie cobas x 480. Je li konieczne jest przechowywanie, pojemniki z zawiesin stolca nale y zamkn nowym korkiem (patrz rozdzia Materia y opcjonalne ). 5. Post puj zgodnie ze wskazówkami kreatora oprogramowania i za aduj materia y eksploatacyjne. Nie nale y umieszcza pojedynczych ko cówek ani ich wyjmowa z cz ciowo wykorzystanego statywu, gdy oprogramowanie ledzi liczb pozosta ych ko cówek. Je li liczba ko cówek b dzie niewystarczaj ca do przeprowadzenia przebiegu, oprogramowanie poinformuje o tym fakcie u ytkownika. 6. Za aduj odczynniki do przygotowywania próbek do pojemników na odczynniki opatrzonych kodem kreskowym. Pojemniki na odczynniki s dost pne w dwóch rozmiarach: 200 ml i 50 ml. Post puj zgodnie ze wskazówkami kreatora oprogramowania w celu wybrania pojemnika na odczynniki odpowiednich rozmiarów. Kody kreskowe pojemnika na odczynniki musz znajdowa si po prawej stronie no nika. Za aduj odczynniki do przygotowywania próbek, stosuj c metod zeskanuj, zeskanuj, w ó, umie : Zeskanuj kod kreskowy butelki odczynnika. Zeskanuj kod kreskowy pojemnika na odczynniki. W ó odczynnik do pojemnika. Umie wype niony pojemnik na odczynniki w przypisanej mu pozycji w no niku na odczynniki. Uwaga: System cobas 4800 ma wewn trzny zegar, kontroluj cy czas, przez jaki odczynniki znajduj si w systemie. Od momentu zeskanowania WB jest 1 godzina do zako czenia procesu adowania i klikni cia przycisku Start. Na zak adce Workplace wy wietlany jest zegar odliczaj cy czas. System nie zezwoli na rozpocz cie przebiegu, je eli czas wy wietlany przez zegar aparatu up yn. Doc. Rev

22 Uwaga: Aby zapewni w a ciwe przeniesienie odczynnika MGP, zworteksuj lub energicznie wstrz nij fiolk odczynnika MGP niezw ocznie przed umieszczeniem jej w pojemniku na odczynniki. 7. Umie odczynniki do amplifikacji/detekcji (Cdiff MMX oraz Cofactor-3), proteinaz K (PK) i kontrole [Cdiff (+) C, IC oraz ( ) C] bezpo rednio w no niku na odczynniki. W celu zapobie enia zanieczyszczeniu konieczna jest zmiana r kawiczek po pracy z kontrolami dodatnimi. Uwaga: Kreator oprogramowania obliczy optymaln ilo i wielko zestawu odczynnika MMX cobas Cdiff do u ycia. Zostanie to odzwierciedlone w kolumnie Kit size na ekranie umieszczania odczynników MMX i Cofactor. Aby u y odczynnika MMX cobas Cdiff z zestawu o innym rozmiarze, kliknij przycisk Change kit size. 8. Po pomy lnym przebiegu przygotowania próbek przyciski Sample Preparation results oraz Unload stan si dost pne. W razie potrzeby wybierz przycisk Sample Preparation results w celu przeanalizowania wyników, a nast pnie wybierz przycisk Unload, aby wy adowa no niki na p ytki. Mo na równie wybra przycisk Unload w celu wy adowania no nika na p ytki bez przegl dania wyników. Patrz odpowiedni Podr cznik u ytkownika systemu cobas 4800 dla testu cobas Cdiff. 9. Aby uszczelni p ytk mikrodo kow, przenie p ytk do analizatora cobas z 480 i rozpocz przebieg amplifikacji oraz detekcji, post puj zgodnie z instrukcjami zamieszczonymi w odpowiednim Podr czniku u ytkownika systemu cobas 4800 dla testu cobas Cdiff. Uwaga: System cobas 4800 ma wewn trzny zegar, kontroluj cy czas, jaki up ywa od momentu dodania przygotowanych próbek do aktywowanego odczynnika Master Mix. Amplifikacj i detekcj nale y rozpocz jak najszybciej, jednak nie pó niej ni 90 minut od zako czenia przebiegu w aparacie cobas x 480. Na zak adce Workplace wy wietlany jest zegar odliczaj cy czas. System przerwie przebieg, je eli ten czas zostanie przekroczony. 10. Po zako czeniu procesu amplifikacji i detekcji wy aduj p ytk mikrodo kow z analizatora cobas z Post puj zgodnie z instrukcjami zamieszczonymi w odpowiednim Podr czniku u ytkownika systemu cobas 4800 dla testu cobas Cdiff w celu przeanalizowania i zatwierdzenia wyników. Doc. Rev

23 Wyniki Kontrola jako ci i wa no wyników Ka dy przebieg obejmuje jeden zestaw kontroli dodatniej i ujemnej testu cobas Cdiff. W przypadku ka dego przebiegu, aby przez oprogramowanie cobas 4800 zosta y wy wietlone mo liwe do zaraportowania wyniki testu cobas Cdiff, musz zosta uzyskane wa ne wyniki zarówno dla kontroli dodatniej, jak i ujemnej. Kontrola dodatnia Kontrola dodatnia Cdiff (+) zawiera niezaka ny DNA plazmidowy bakterii C. difficile. U ycie kontroli Cdiff (+) umo liwia monitorowanie etapów izolacji kwasu nukleinowego, amplifikacji i detekcji w danym przebiegu. Wynik kontroli Cdiff (+) musi by oznaczony jako Valid. Je eli wyniki kontroli Cdiff (+) s stale niewa ne, skontaktuj si z miejscowym przedstawicielstwem firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej. Kontrola ujemna Wynik kontroli ( ) musi by oznaczony jako Valid. Je eli wyniki kontroli ( ) s stale niewa ne, skontaktuj si z miejscowym przedstawicielstwem firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej. Kontrola wewn trzna Kontrola wewn trzna to rekombinowany fag lambda zawieraj cy sekwencje losowe oraz docelowe dla swoistych dla kontroli wewn trznej primerów i sondy. Kontrola wewn trzna jest dodawana do wszystkich próbek oraz kontroli dodatniej i ujemnej podczas przygotowywania próbek w aparacie cobas x 480. U ycie kontroli wewn trznej umo liwia monitorowanie etapów izolacji kwasu nukleinowego, amplifikacji i detekcji dla danej próbki. Kontrola wewn trzna jest równie wymagana do okre lania wa no ci kontroli danego przebiegu. Interpretacja wyników Uwaga: Ca y proces walidacji testu i przebiegu jest realizowany przez oprogramowanie cobas Uwaga: Wa ny przebieg mo e obejmowa zarówno wa ne, jak i niewa ne wyniki próbek. W przypadku wa nego przebiegu wyniki badania próbek interpretuje si w sposób, który przedstawia Tabela 1. Doc. Rev

24 Tabela 1 Interpretacja wyników testu cobas Cdiff Test cobas Cdiff Raport wyniku i jego interpretacja POS Cdiff NEG Cdiff Invalid Failed Wynik dodatni dla Cdiff Wynik badania próbki na obecno DNA C. difficile jest dodatni. Wynik ujemny dla Cdiff* DNA C. difficile, je li jest obecne, mog o nie zosta wykryte. Wynik niewa ny Wynik testu jest niewa ny. W celu otrzymania wa nego wyniku ponownie przeprowad test oryginalnej próbki. Umie nowy korek na probówce z zawiesin stolca, w przypadku której uzyskano niewa ny wynik, i zworteksuj przez co najmniej 5 sekund. Dodaj 0,5 ml wymieszanej zawiesiny stolca do nowej probówki z po ywk cobas PCR. Zamknij probówk z rozcie czon zawiesin i zworteksuj przez co najmniej 5 sekund. Zdejmij korek i umie probówk z rozcie czon zawiesin w 24-pozycyjnym no niku próbek w celu przetworzenia. Brak wyników dla próbki Zapoznaj si z instrukcjami zamieszczonymi w odpowiednim Podr czniku u ytkownika systemu cobas 4800 dla testu cobas Cdiff dotycz cymi przegl dania oflagowa przebiegu i zalecanych czynno ci. W rzadkich przypadkach wyst pienia b du podczas pipetowania (np. z powodu grudki lub innej niedro no ci) nale y oryginaln probówk z zawiesin stolca zamkn nowym korkiem i umie ci w wirówce. Rozp d wirówk do 1800 RCF (lub 1800 x g) i zatrzymaj. Dopilnuj, aby probówka nie by a wstrz sana ani nie zosta a wymieszana po wirowaniu. Zdejmij korek i umie probówk z zawiesin w 24-pozycyjnym no niku próbek w celu przetworzenia. * Wynik ujemny nie wyklucza obecno ci DNA C. difficile, poniewa wyniki s zale ne od odpowiedniego pobrania próbki, braku inhibitorów oraz obecno ci DNA w ilo ci umo liwiaj cej wykrycie. Niewa ne wyniki mog zosta uzyskane, je li próbka zawiera nadmiar stolca lub substancje hamuj ce, które uniemo liwiaj izolacj docelowego kwasu nukleinowego i/lub amplifikacj oraz detekcj. Znane substancje wp ywaj ce na wynik testu zamieszczono w rozdziale Ograniczenia metody. Uwaga: Minimalna obj to zawiesiny stolca wymagana do przeprowadzenia testu cobas Cdiff to 3 ml. Ograniczenia metody 1. Test cobas Cdiff zosta zatwierdzony do u ycia wy cznie z próbkami nieuformowanego stolca przeniesionymi do pod o a cobas PCR zgodnie z informacjami zamieszczonymi w niniejszej instrukcji. 2. Uzyskanie wiarygodnych wyników zale y od w a ciwego pobrania próbki, transportu, przechowywania oraz przetwarzania. Nale y post powa zgodnie z procedurami opisanymi w niniejszej instrukcji (okre lanej równie mianem ulotki do czonej do opakowania) oraz w odpowiednim Podr czniku u ytkownika systemu cobas 4800 dla testu cobas Cdiff. 3. Mo liwo wykrycia DNA C. difficile zale y od liczby mikroorganizmów znajduj cych si w próbce i mog na ni wp ywa metody pobierania/przetwarzania próbek, hospitalizacje w wywiadzie, schemat antybiotykoterapii i szczepy C. difficile. Doc. Rev

25 4. Wyniki fa szywie ujemne lub niewa ne mog wynika z wp ywu ró nych substancji. Do testu cobas Cdiff do czona jest kontrola wewn trzna, aby pomóc w identyfikacji próbek zawieraj cych substancje mog ce zak óca izolacj kwasu nukleinowego i amplifikacj w trakcie reakcji PCR. Niektóre czynniki wp ywaj ce na wyniki testu s nast puj ce: Próbki zawieraj ce powy ej 25% (udzia wagowo-obj to ciowy) luzu mog dawa wyniki fa szywie ujemne. 5. Wynik dodatni wskazuje na obecno DNA C. difficile, jednak niekoniecznie potwierdza wyst powanie ywych mikroorganizmów. Z tego powodu wynik dodatni niekoniecznie musi wskazywa na niepowodzenie leczenia zaka enia. 6. Mutacje lub zmiany polimorficzne w obszarach wi zania primerów lub sond mog wp ywa na wykrywanie nowych lub nieznanych wariantów, co mo e skutkowa uzyskaniem fa szywie ujemnego wyniku testu cobas Cdiff. 7. Warto predykcyjna oznaczenia zale y do cz sto ci wyst powania choroby w danej populacji. 8. Dodanie do odczynnika Master Mix cobas 4800 Cdiff enzymu AmpErase umo liwia selektywn amplifikacj docelowego DNA; jednak aby unikn zanieczyszczenia odczynników i mieszanin amplifikacyjnych, konieczne jest stosowanie dobrej praktyki laboratoryjnej i dok adne przestrzeganie procedur wyszczególnionych w niniejszej instrukcji. 9. Tego produktu mog u ywa wy cznie osoby przeszkolone w zakresie technik PCR i u ywania systemu cobas Zatwierdzono u ycie tego produktu tylko z aparatem cobas x 480 i analizatorem cobas z 480. Z tym produktem nie mo na stosowa adnych innych urz dze do przygotowania próbek ani systemów do PCR. 11. Z uwagi na ró nice mi dzy technologiami zaleca si, aby przed rozpocz ciem korzystania z innej technologii u ytkownik przeprowadzi w laboratorium badania korelacji stosowanych metod w celu zidentyfikowania wyst puj cych mi dzy nimi ró nic technologicznych i sprawdzenia nowej procedury. 12. Zanieczyszczenie krzy owe próbek mo e spowodowa wyniki fa szywie dodatnie. System cobas 4800 to zautomatyzowany aparat do PCR w czasie rzeczywistym opracowany w celu minimalizacji ryzyka zanieczyszczenia krzy owego podczas przetwarzania próbki oraz ekstrakcji, amplifikacji i detekcji kwasu nukleinowego. W celu sprawdzenia niezawodno ci systemu przeprowadzono symulowane, niekliniczne badanie naprzemienne na panelu zawieraj cym spreparowane próbki wysoko dodatnie i ujemne, aby oceni teoretyczny wspó czynnik zanieczyszczenia krzy owego systemu. Próbki wysoko dodatnie mia y warto ci Ct ni sze ni obserwowane w przypadku 95% pacjentów zaka onych w grupie docelowej. Wspó czynnik zanieczyszczenia krzy owego w tym badaniu naprzemiennym zosta okre lony jako 0,24% (1/423). Wspó czynniki zanieczyszczenia krzy owego w warunkach klinicznych zale od odsetka próbek wysoko dodatnich oraz cz sto ci wyst powania choroby. Rutynowe kliniczne wspó czynniki zanieczyszczenia krzy owego powinny by znacznie ni sze ni obserwowane w tym badaniu i nale y je oceni w warunkach u ytkownika. Doc. Rev