Melatonina jako czynnik leczniczy względem wrzodów żołądka w warunkach eksperymentalnej cukrzycy

Transkrypt

1 PRACE ORYGINALNE Marcin Magierowski 1 Katarzyna Jasnos 1 Iwona Brzozowska 2 Danuta Drozdowicz 1 Zbigniew Śliwowski 1 Elżbieta Nawrot 1 Urszula Szczyrk 1 Sławomir Kwiecień 1 Melatonina jako czynnik leczniczy względem wrzodów żołądka w warunkach eksperymentalnej cukrzycy Melatonin as a therapeutic factor in gastric ulcer healing under experimental diabetes 1 Katedra Fizjologii Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medium, Kraków Kierownik Katedry: Prof. dr hab. Tomasz Brzozowski 2 Katedra Anatomii Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medium, Kraków Kierownik Katedry: Prof. dr hab. Jerzy A. Walocha Dodatkowe słowa kluczowe: melatonina cukrzyca wrzody żołądka peroksydacja lipidów Additional key words: melatonin diabetes mellitus gastric ulcers lipid peroxidation Adres do korespondencji: Marcin Magierowski Grzegórzecka Kraków tel. (12) m.magierowski@uj.edu.pl Melatonina (N-acetyl-5-metoksytryptamina) to hormon wydzielany głównie przez szyszynkę, który odpowiada za regulację rytmu okołodobowego organizmu. Co ciekawe, ta pochodna indolowa jest produkowana przez komórki enterochromatofilne (ECL) przewodu pokarmowego w ilości 400-krotnie większej niż przez komórki pinealocytów. Dotychczasowe badania eksperymentalne wskazują na korzystne działanie melatoniny względem tzw. ostrych uszkodzeń błony śluzowej żołądka indukowanych przez stres, etanol, aspirynę oraz ischemię z następującą po niej reperfuzją. Hiperglikemia towarzysząca cukrzycy prowadzi do dysfunkcji mitochondriów, co promuje powstawanie reaktywnych form tlenu (ROS). ROS wykazują wyższą reaktywność chemiczną niż tlen w stanie podstawowym, przez co powodują uszkodzenia białek, kwasów nukleinowych oraz utlenianie wielonienasyconych kwasów tłuszczowych błon komórkowych. W niniejszej pracy wykorzystano model doświadczalny cukrzycy, indukowanej aplikacją streptozocyny, przy współistniejących wrzodach żołądka. Badania przeprowadzono na szczurach rasy Wistar. Po wywołaniu wrzodów żołądka oraz cukrzycy odpowiednie grupy zwierząt były traktowane przez kolejne 9 dni solą fizjologiczną (grupa kontrolna) lub melatoniną (20 mg/kg i.g.). Po tym czasie, zwierzęta zostały uśpione w celu pomiaru żołądkowego przepływu krwi. Żołądki zostały usunięte do oceny rozmiaru uszkodzeń wrzodowych u poszczególnych zwierząt. Błona śluzowa została pobrana do oznaczeń biochemicznych. Zaobserwowano, że aplikacja melatoniny w znacznym stopniu przyspiesza gojenie się wrzodów żołądka, zarówno z, jak i bez współistniejącej cukrzycy. Zjawisku temu towarzyszył zwiększony żołądkowy przepływ krwi. Dodatkowo, zmierzono zwiększony poziom aktywności SOD oraz zmniejszenie zawartości produktów peroksydacji lipidów w śluzówce żołądka u zwierząt traktowanych melatoniną w porównaniu do grup kontrolnych. Melatonin (N-acetyl-5-methoxytryptamine) is a hormon secreted mostly by the pineal gland in the brain which maintains the body s circadian rhythm. Interestingly, this indol derivative is produced by enterochromaffinlike cells (ECL) in the gastrointestinal tract (GIT) in amount about 400 fold greater than detected in the pinealocytes. Previous studies revealed that melatonin exerts beneficial action against acute gastric damage induced by stress ethanol, aspirin and ischemiareperfusion. Hyperglycemia, which is the main symptom of diabetes mellitus, is known to induce mitochondrial dysfunction and endoplasmic reticulum stress, both promoting the generation of reactive oxygen species (ROS). ROS were shown to exhibit higher activity than molecular oxygen under basal conditions due to unpaired electron in its outermost shell of electrons. ROS lead to damage of cellular proteins, nucleic acids and membrane polyunsaturated fatty lipids. In this study, we induced diabetes mellitus by the application of streptozocin in presence of gastric ulcers. Male Wistar rats were used in this model. 9 days after gastric ulcers and diabetes mellitus induction, groups of rats were treated with saline or melatonin (20 mg/kg i.g.). At the termination of the experiment, rats were anesthetized, abdomen was opened and gastric blood flow (GBF) was measured. Stomachs were removed for determination of gastric ulcers area by planimetry. Tissue samples were collected for biochemical assays. We demonstrated that melatonin significantly accelerates gastric ulcers healing with and without coexistence of diabetes mellitus. This effect was accompanied by increase of GBF level. Moreover, we observed an increase in superoxide dismutase (SOD) activity and an decrease in lipid peroxidation products concentration within gastric tissue homogenates of animals treated with melatonin, as compared with control group. Melatonin application accelerates gastric ulcers healing with and without 942 M. Magierowski i wsp.

2 Wnioskuje się, że melatonina jest fizjologicznym czynnikiem, przyspieszającym gojenie się wrzodów żołądka, zarówno z, jak i bez współistniejącej cukrzycy. Mechanizm działania tego peptydu jest związany z regulacją aktywności enzymów antyoksydacyjnych oraz żołądkowego przepływu krwi. presence of diabetes mellitus. We conclude that melatonin can physiologically regulate anti-oxidative enzymes activity and increase GBF level. Wstęp Melatonina to endogenny regulator rytmiki okołodobowej, produkowany przez szyszynkę w procesie zależnym od warunków oświetlenia środowiska, z najwyższym stężeniem osiąganym we krwi między 2 a 4 w nocy. Przyjmuje się, że melatonina krążąca we krwi w ciągu dnia pochodzi z przewodu pokarmowego, gdzie zawartość tego hormonu jest 400-krotnie razy większa niż w szyszynce, a jej stężenie razy wyższe niż w osoczu [8]. Pochodna indolowa produkowana jest przez komórki enterochromatofilne (ECL) ścian przewodu pokarmowego, gdzie zlokalizowano enzymy kluczowe do jej biosyntezy: N- acetylotransferazę serotoniny (NAT) oraz transferazę hydroksyindolo-o-metylową (HIOMT) [26]. Korzystna rola melatoniny w układzie pokarmowym może być wynikiem jej wielokierunkowego działania, które dodatkowo zostaje usprawnione dzięki lipofilności tego hormonu i łatwości przechodzenia przez błony biologiczne. W odróżnieniu od melatoniny syntezowanej przez pinealocyty i uwalnianej do krwi, melatonina pochodzenia żołądkowo-jelitowego, oprócz działania endokrynnego, działa autokrynnie, parakrynnie oraz luminalnie, a w dodatku jej uwalnianie jest związane z przyjmowaniem pokarmu [8, 20]. Omawiana pochodna indolowa bezpośrednio oddziaływuje z receptorami melatoninowymi umiejscowionymi w błonie komórkowej. Można wyodrębnić dwie główne podklasy tych receptorów: związane z białkami G receptory ML1 oraz ich podtypy MT1 (Mel 1s), MT2 (Mel 1b) i Mel 1c, a także receptory związane z reduktazą chinonową ML2 znane także jako MT3. Obie klasy receptorów zostały zlokalizowane w przewodzie pokarmowym [10]. Melatonina, będąca naturalnym antagonistą serotoniny, działa rozkurczająco na mięśniówkę gładką, nie tylko w obrębie przewodu pokarmowego, ale również układu rozrodczego, oddechowego oraz krwionośnego [8]. Badania ostatnich lat dowodzą, że korzystne właściwości melatoniny oraz jej prekursora L-tryptofanu są wynikiem wzrostu żołądkowego przepływu krwi [6]. Istnieją dwa podstawowe mechanizmy zaangażowane w ten proces: wzmożone generowanie endogennych prostaglandyn na skutek pobudzenia aktywności cyklooksygenaz (COX) oraz wzrost aktywności syntazy tlenku azotu (NO), prowadzący do uwalniania dużych ilości NO o działaniu naczyniorozszerzającym [6, 18]. U podstaw ochronnego działania hormonu leży także hamowanie wydzielania kwasu żołądkowego co w rezultacie skutkuje uwolnieniem gastryny i cholecystokininy do krwi [16]. Badania na zwierzętach potwierdziły przeciwzapalne właściwości melatoniny na drodze ograniczania transkrypcji genów dla cytokin prozapalnych oraz wzrostu wytwarzania cytokin przeciwzapalnych [9]. Co więcej, wykazano, że długoterminowa suplementacja tej indoloaminy zmniejsza hiperlipidemię i hiperinsulinemię oraz przywraca zakłócone proporcje nienasyconych kwasów tłuszczowych w surowicy i tkankach zwierząt z eksperymentalnie wywołaną cukrzycą [23]. Hiperglikemia, towarzysząca cukrzycy, prowadzi do dysfunkcji mitochondriów, co promuje powstawanie reaktywnych form tlenu (z ang. reactive oxygen species, ROS) [11]. ROS wykazują wyższą reaktywność chemiczną niż tlen w stanie podstawowym, przez co powodują uszkodzenia białek, kwasów nukleinowych oraz utlenianie wielonienasyconych kwasów tłuszczowych błon komórkowych [2]. Powstający anionorodnik ponadtlenkowy (O 2.- ) to główny mediator uszkodzenia tkanek, który oprócz bezpośredniej inaktywacji kluczowych enzymów przeciwmiażdżycowych: śródbłonkowej syntazy NO oraz syntazy prostacykliny, powoduje zwiększenie generowania końcowych produktów glikacji (ang. advanced glycation end products, AGEs) i ekspresję receptorów AGEs [12]. Liczne badania dowodzą, że melatonina neutralizuje wolne rodniki, podobnie jak witaminy A, E lub C, ale również zwiększa aktywność enzymów antyoksydacyjnych: peroksydazy glutationowej (z j.ang. glutathione peroxidase, GPx), dysmutazy ponadtlenkowej (z j. ang. superoxide dysmutase, SOD) oraz katalazy [1, 13, 29]. Błony biologiczne komórek, ze względu na dużą zawartość nienasyconych kwasów tłuszczowych są szczególnie podatne na szkodliwe działanie ROS [5, 15]. Dodatkowo, wykazano protekcyjne właściwości melatoniny oraz jej prekursora L-tryptofanu, względem ostrych uszkodzeń błony śluzowej żołądka, indukowanych etanolem, aspiryną, stresem z unieruchomienia i oziębienia oraz ischemią z następującą reperfuzją [7]. W innych badaniach stwierdzono, że melatonina podawana egzogennie chroni błonę śluzową żołądka przed wrzodami żołądka indukowanymi indometacyną w zwierzęcym modelu cukrzycy [24]. Celem niniejszej pracy było określenie fizjologicznej roli melatoniny w regulacji szybkości gojenia się przewlekłych wrzodów żołądka, w doświadczalnym modelu cukrzycy indukowanej streptozocyną oraz zbadanie czy fizjologiczny mechanizm działania tego hormonu w tych stanach patologicznych jest związany z regulacją szkodliwego procesu peroksydacji lipidów błonowych. Materiał i metody Badania przeprowadzono na szczurach rasy Wistar, samcach o średniej masie 250 g. Streptozocyna jest związkiem szeroko wykorzystywanym do wywołania cukrzycy w modelach doświadczalnych, poprzez selektywną destrukcję komórek β trzustki [11]. Dlatego też, w naszym badaniu, cukrzycę wywołano poprzez jednorazowe, dootrzewnowe podanie streptozocyny w dawce 70 mg/kg m.c. zgodnie z metodyką szczegółowo opisaną uprzednio [22, 27]. Po 4 tygodniach od podania streptozocyny u każdego ze zwierząt z eksperymentalną cukrzycą oraz u zdrowych osobników wywołano wrzody żołądka według procedury opisanej wcześniej w pracy pochodzącej z Katedry Fizjologii UJ CM [19]. Uśpionym szczurom otworzono jamę brzuszną i wyłoniono żołądek. Następnie, po przyłożeniu do części surowicówkowej żołądka metalowej sztancy o powierzchni 28 mm 2, nakropiono do tej sztancy stężony kwas octowy na czas 25 sekund, wywołując w ten sposób uszkodzenie surowicówki. Ja wykazano wcześniej, po 3 dniach w miejscu przyłożenia rozwija się wrzód w błonie śluzowej żołądka, zlokalizowany na granicy przejścia trzonu w część antralną żołądka [19]. Następnie, zwierzęta z wywołanym uszkodzeniem żołądka podzielono na cztery grupy badawcze: 1) szczury bez wywołanej cukrzycy, 2) szczury z eksperymentalną cukrzycą, które raz dziennie, przez kolejne 9 dni otrzymywały dożołądkowo za pomocą metalowej sondy placebo w postaci soli fizjologicznej, 3) szczury bez wywołanej cukrzycy otrzymując melatoninę w dawce 20 mg/kg m.c. na dzień oraz 4) szczury z eksperymentalną cukrzycą, które również otrzymywały melatoninę w dawce 20 mg/kg m.c. Podawanie placebo oraz melatoniny trwało 9 dni od dnia zabiegu wywołania wrzodów żołądka. W ostatnim dniu eksperymentu zwierzęta zostały uśpione dootrzewnową aplikacją ketaminy (5-15 mg/kg). Żołądek wyłoniono w celu pomiaru żołądkowego przepływu krwi (z j. ang. gastric blood flow, GBF) przy użyciu przepływomierza laserowego Dopplera. Następnie, po wycięciu żołądka u każdego z osobników dokonano oceny powierzchni uszkodzenia wrzodowego metodą planimetryczną. W dalszej kolejności, pobrano błonę śluzową żołądka w celu oznaczenia poziomu wskaźników stresu oksydacyjnego, w tym malonylodialdehydu (MDA) i 4-hydroksynonenalu (4-HNE) oraz SOD jak opisano w poprzednich pracach [21]. W skrócie, pobrany materiał poddano homogenizacji i zamrożono w -80oC do momentu oznaczenia określonych parametrów. Pomiar wspomnianych parametrów został wykonany przy zastosowaniu metod spektrofotometrycznych bazujących na pomiarze absorbancji światła przechodzącego przez badany roztwór podczas reakcji barwnych N-methyl-2-fenyloindolu z MDA i 4-HNE oraz autooksydacji tetrahydrobenzofluorenu w przypadku oznaczenia poziomu SOD. Do analizy statystycznej otrzymanych wyników wykorzystano test t-studenta porównującego dwie grupy. Do porównania więcej niż dwóch grup zastosowano test ANOVA. Wyniki przedstawiono jako Przegląd Lekarski 2013 / 70 /

3 średnia±sem. Jako istotne statystycznie przyjęto p<0,05. Badania wykonano po uzyskaniu zgody dla wykonawców eksperymentu od Lokalnej Komisji Etycznej ds. Doświadczeń na Zwierzętach, działającej przy Uniwersytecie Jagiellońskim w Krakowie, zgodnie z międzynarodową konwencją Helsińską. Wyniki Rycina 1. przedstawia zmiany powierzchni wrzodu żołądka, wywołanego przez ekspozycję ściany żołądka na kwas octowy według procedury opisanej powyżej, po 9 dniach stosowania melatoniny i placebo (sól fizjologiczna) w poszczególnych grupach zwierząt. Wartość opisana jako dzień-0 to powierzchnia uszkodzenia w pierwszym dniu eksperymentu wynosząca 28 mm 2. W grupach kontrolnych, z eksperymentalną cukrzycą oraz bez cukrzycy, zaobserwowano znaczne zmniejszenie powierzchni wrzodu w stosunku do wartości z dnia-0. W grupie zwierząt z wywołaną eksperymentalnie cukrzycą, otrzymującej sól fizjologiczną, powierzchnia uszkodzenia była znamiennie statystycznie wyższa niż w grupie kontrolnej bez tej cukrzycy, czemu towarzyszył spadek GBF. W odrębnych grupach otrzymujących przez 9 dni, od dnia wywołania wrzodu żołądka, melatoninę zamiast soli fizjologicznej, zarówno wśród zwierząt z wywołaną cukrzycą jak i bez tej choroby, odnotowano znacznie mniejszą powierzchnię uszkodzenia wrzodowego niż w odpowiednich grupach kontrolnych nie otrzymujących tego peptydu. Dodatkowo, GBF był statystycznie istotnie wyższy w grupach otrzymujących melatoninę w stosunku do odpowiednich grup kontrolnych traktowanych tylko solą fizjologiczną. Ponadto, dokonano pomiaru stężenia MDA i 4-HNE w bioptatach błony śluzowej żołądka zwierząt z poszczególnych grup eksperymentalnych z wywołanym wrzodem żołądka (Ryc. 2.). Wartości otrzymane w tych grupach zostały porównane z poziomem stężenia MDA i 4-HNE w grupie zwierząt nie poddanej żadnym procedurom (z j. ang. intact). Grupa kontrolna z wywołaną cukrzycą osiągnęła znacznie wyższy poziom stężenia MDA i 4-HNE w porównaniu do grupy kontrolnej bez cukrzycy. W obydwu grupach poziom MDA i 4-HNE był istotnie wyższy niż w grupie intact. Jednakowoż, 9-dniowa aplikacja melatoniny spowodowała spadek poziomu MDA i 4-HNE do wartości otrzymanych w grupie zdrowych szczurów (intact) zarówno w grupie cukrzycowej jak i w grupie bez cukrzycy odwracając efekt uzyskany w odpowiadających im grupach kontrolnych. Rycina 3. ilustruje zmiany poziomu aktywności SOD w śluzówce żołądka w poszczególnych grupach zwierząt po 9 dniach od wywołania wrzodu żołądka. Wartością odniesienia był poziom aktywności SOD w grupie intact. Zaobserwowano, że w grupie kontrolnej z wywołaną cukrzycą, aktywność SOD była istotnie niższa niż w grupie kontrolnej bez cukrzycy. W obydwu grupach poziomy aktywności SOD były istotnie niższe niż w grupie intact. Odrębne grupy, zarówno z wywołaną eksperymentalnie cukrzycą jak i bez cukrzycy, otrzymujące przez 9 dni melatoninę, miały istotnie wyższy poziom aktywności SOD niż odpowiadające im kontrolne grupy porównawcze nie traktowane melatoniną. Wnioski Jak do tej pory niewiele jest danych wyjaśniających wpływ melatoniny na szybkość gojenia się wrzodów żołądka w warunkach eksperymentalnej cukrzycy. W świetle dostępnych danych naukowych, wiemy, że wrzody żołądka ulegają samoistnemu gojeniu po wyeliminowaniu czynnika uszkadzającego [6]. Nasze rezultaty potwierdzają, że uszkodzenia wrzodowe indukowane jednorazową ekspozycją na kwas octowy goją się samoistnie, co zaobserwowano w grupie kontrolnej traktowanej jedynie solą fizjologiczną. Interesujące jest, że proces ten jest w znacznym stopniu spowolniony przez współistniejącą cukrzycę. Zjawisko to jest związane ze zmniejszonym przepływem Rycina 1 Powierzchnia uszkodzenia wrzodowego oraz GBF u szczurów z i bez eksperymentalnej cukrzycy, po 9 dniach od ekspozycji błony śluzowej żołądka na kwas octowy. Zwierzęta z grupy kontrolnej, bez eksperymentalnej cukrzycy i w kontroli cukrzycowej, otrzymywały przez 9 dni sól fizjologiczną jako placebo. Odrębnym grupom zwierząt aplikowano równolegle do grup kontrolnych melatoninę. Dzień 0 odnosi się do powierzchni uszkodzenia wrzodowego w dniu rozpoczęcia całości eksperymentu wynoszącej 28 mm 2. Wyniki przedstawiają średnie ±SEM w grupach liczących 6-8 zwierząt każda. Gwiazdką (*) oznaczono istotną statystycznie (p<0,05) różnicę wartości powierzchni wrzodu żołądka oraz GBF pomiędzy grupą kontrolną, bez eksperymentalnej cukrzycy a grupą kontrolną cukrzycową, po 9 dniach od wywołania tego uszkodzenia. Krzyżykiem (+) oznaczono grupy, w których wartości mierzone były znamiennie różne niż w odpowiadających im grupach kontrolnych. Mean lesion area on the bar chart and GBF in rats with and without experimental diabetes, 9 days after exposure of rats gastric mucosa to acetic acid. Animals from control groups, with and without experimental diabetes were treated with placebo (saline) by 9 days. Separate groups of rats were administered with melatonin at the same time. Day-0 represents the value of acetic ulcer induced lesion area at the beginning of the experiment (28 mm 2 ). Results show mean ±SEM in groups consisted of 6-8 animals. Significant change (p<0,05) in lesion area and GBF between control groups with and without experimental diabetes was indicated by asterisk (*). Cross (+) was used to indicate significant changes comparing to the values obtained in respective control groups. Rycina 2 Stężenie MDA i 4-HNE w bioptatach błony śluzowej żołądka w grupach z uszkodzeniami wrzodowymi u szczurów z i bez eksperymentalnej cukrzycy po 9 dniach od ekspozycji błony śluzowej żołądka na kwas octowy. Zwierzęta z grupy kontrolnej bez eksperymentalnej cukrzycy i w kontroli cukrzycowej otrzymywały przez 9 dni sól fizjologiczną jako placebo. Odrębnym grupom zwierząt aplikowano równolegle do grup kontrolnych melatoninę. Intact odnosi się do wartości stężenia MDA+ 4-HNE zmierzonej w bioptacie błony śluzowej żołądka szczurów, które nie zostały poddane żadnym procedurom. Wyniki przedstawiają średnie ±SEM w grupach liczących 6-8 zwierząt każda. Gwiazdką (*) oznaczono istotną statystycznie (p<0,05) różnicę wartości stężenia MDA+ 4-HNE w porównaniu z grupą Intact. Krzyżykiem (+) oznaczono istotną różnicę w wartościach zmierzonych pomiędzy grupą kontrolną bez eksperymentalnej cukrzycy, a grupą kontrolną cukrzycową. Podwójny krzyżyk (++) oznacza istotną statystycznie różnicę w porównaniu do odpowiednich grup kontrolnych. MDA and 4-HNE concentration in gastric mucosa biopsies in groups with and without experimental diabetes 9 days after exposure of gastric mucosa to acetic acid. Animals from control groups with and without experimental diabetes were treated with saline by 9 days. Separate groups with and without diabetes were treated with melatonine. Intact referes to MDA+ 4-HNE concentration measured in gastric mucosa biopsy in rats without any experimental procedures. Results show mean ±SEM in groups consisted of 6-8 animals. Asterisk (*) indicates significant changes (p<0,05) in MDA + 4-HNE concentration in comparison to Intact. Cross (+) indicates significant changes between control diabetic group and control non-diabetic group. Double cross (++) indicates significant changes as compared with the control groups. 944 M. Magierowski i wsp.

4 krwi w mikrokrążeniu żołądkowym, który obserwowaliśmy w doświadczalnej cukrzycy w stosunku do analogicznych wartości tego przepływu u osobników bez tej choroby. W świetle otrzymanych przez nas wyników badań, doustna aplikacja egzogennej melatoniny przyspiesza gojenie tych wrzodów, zarówno u zwierząt bez, jak i u tych z doświadczalną cukrzycą, co jest skorelowane ze wzrostem żołądkowego przepływu krwi w obrębie niszy wrzodowej. Sugeruje to właściwości przekrwienne tej indoloaminy, które mogą wspomagać proces przyśpieszonego gojenia obserwowanego po 9-dniowym leczeniu tym preparatem. Ponadto, zaobserwowany przez nas wzrost stężenia produktów peroksydacji lipidów (MDA i 4-HNE) w błonie śluzowej żołądków zwierząt z wywołanymi uszkodzeniami wrzodowymi, wskazuje na uszkodzenie wolnorodnikowe. Na podstawie badań ostatnich lat, melatonina jest silnym stymulatorem aktywności enzymów antyoksydacyjnych takich jak SOD oraz GPx w warunkach eksperymentalnej cukrzycy [3, 25]. W badaniach Guvena i wsp. poziom MDA w homogenatach wątroby szczurów cukrzycowych był znacząco niższy w grupie otrzymującej melatoninę w porównaniu do grupy bez takiej suplementacji [14]. Winiarska i wsp. wykazała w badaniach na królikach z doświadczalną cukrzycą, że dootrzewnowa podaż melatoniny w dawce 1 mg/kg powoduje zwiększenie aktywności GPx, reduktazy glutationowej (GR), syntetazy γ-glutamylocysteinowej w wątrobie [28]. Z kolei w badaniach Baydas i wsp. melatonina podawana podskórnie szczurom cukrzycowym obniżyła poziom MDA w wątrobie, mózgu, nerkach oraz zwiększyła aktywność GPx w dwóch ostatnich wymienionych organach [4]. Klepac i wsp. wykazali, że jednorazowa dawka melatoniny obniża ilość O 2.- w surowicy szczurów, co może sugerować zdolność do bezpośredniej neutralizacji rodników [17]. Nasze wyniki, dotyczące zawartości MDA i 4-HNE oraz aktywności SOD w obrębie błony śluzowej żołądka są spójne z powyżej zacytowanymi badaniami. Melatonina zmniejszyła w znaczącym stopniu stężenie MDA i 4-HNE zarówno wśród zwierząt z, jak i bez współistniejącej z wrzodami żołądka cukrzycy. Dodatkowo, zaobserwowaliśmy, że aplikacja melatoniny przywróciła, obniżony wskutek obecności wrzodu oraz cukrzycy, poziom aktywności SOD do wartości obserwowanych u całkowicie zdrowych osobników. Dlatego też, stwierdza się, że w mechanizm hamowania szybkości gojenia się wrzodów żołądka są zaangażowane ROS. Aktywność SOD oraz stężenie MDA i 4-HNE różni się pomiędzy zdrowymi osobnikami, a tymi z wywołanymi uszkodzeniami wrzodowym, ponieważ współistniejąca z wrzodami cukrzyca powoduje zwiększenie stężenia MDA i 4-HNE oraz zmniejszenie aktywności SOD w obrębie błony śluzowej żołądka. Natomiast, leczenie melatoniną w znacznym stopniu przyspiesza gojenie uszkodzeń żołądka czemu towarzyszy wyższa aktywność SOD zarówno przy, jak i bez towarzyszącej cukrzycy. Dodatkowo, peptyd ten powoduje obniżenie poziomu MDA i 4-HNE w obydwu przypadkach. Rycina 3 Aktywność SOD w bioptatach błony śluzowej żołądka w grupach szczurów z uszkodzeniami wrzodowymi, u szczurów z i bez eksperymentalnej cukrzycy po 9 dniach od ekspozycji błony śluzowej żołądka na kwas octowy. Zwierzęta z grupy kontrolnej bez eksperymentalnej cukrzycy i w kontroli cukrzycowej otrzymywały przez 9 dni sól fizjologiczną jako placebo. Odrębnym grupom zwierząt aplikowano równolegle do grup kontrolnych melatoninę. Intact odnosi się do wartości stężenia SOD zmierzonej w bioptacie błony śluzowej żołądka szczurów, które nie zostały poddane żadnym procedurom. Wyniki przedstawiają średnie ±SEM w grupach liczących 6-8 zwierząt każda. Gwiazdką (*) oznaczono istotną statystycznie (p<0,05) różnicę wartości stężenia SOD w porównaniu z grupą Intact. Krzyżykiem (+) oznaczono istotną różnicę w wartościach zmierzonych pomiędzy grupą kontrolną bez eksperymentalnej cukrzycy a grupą kontrolną cukrzycową. Podwójny krzyżyk (++) oznacza istotną statystycznie różnicę w porównaniu do odpowiednich grup kontrolnych. SOD activity in gastric mucosa biopsies in control groups with and without experimental diabetes 9 days after exposure of gastric mucosa to acetic acid. Animals from control groups with and without experimental diabetes were treated with saline by 9 days. Separate groups with and without diabetes were treated with melatonin. Intact referes to SOD activity measured in gastric mucosa biopsy in rats without any experimental procedures. Results show mean ±SEM in groups consisted of 6-8 animals. Asterisk (*) indicates significant changes (p<0,05) in SOD activity in comparison to Intact. Cross (+) indicates significant changes between control diabetic group and control non-diabetic group. Double cross (++) indicates significant changes as compared with the control groups. Podsumowując, leczenie melatoniną podawaną egzogennie, przyspiesza proces gojenia się eksperymentalnych wrzodów żołądka, czemu towarzyszy wzrost żołądkowego przepływu krwi w obrębie wrzodu. W oparciu o powyższe wyniki badań stwierdza się, że fizjologiczny mechanizm działania melatoniny w obrębie błony śluzowej żołądka jest związany z redukcją stężenia szkodliwych dla tej tkanki ROS o działaniu uszkadzającym jej strukturę. Można stwierdzić, że żołądek dzięki antyoksydacyjnym właściwościom melatoniny jest w naturalny sposób chroniony przed działaniem czynników uszkadzających, a mechanizm ten jest związany z redukcją peroksydacji lipidów zależnej od ROS poprzez zwiększenie aktywności enzymów antyoksydacyjnych, w tym głównie SOD. Aby potwierdzić rezultaty naszych badań doświadczalnych w klinice i sprawdzić efekty działania melatoniny u chorych z wrzodem żołądka i współistniejącą cukrzycą, potrzebne są jednak badania kliniczne w tym kierunku. Piśmiennictwo: 1. Allegra M., Reiter R.J., Tan D.X., et al.: The chemistry of melatonin s interaction with reactive species. J. Pineal. Res. 2003, 34, Alfadda A.A., Sallam R.M.: Reactive oxygen species in health and disease. J. Biomed. Biotechnol. 2012, Aksoy N., Vural H., Sabuncu T., et al.: Effect of melatonin on oxidative antioxidative status of tissues in streptozotocin-induced diabetic rats. Cell Biochem. Funct. 2003, 21, Baydas G, Canatan H, Turkoglu A.: Comparative analysis of the protective effects of melatonin and vitamin E on streptozocin-induced diabetes mellitus. J. Pineal. Res. 2002, 32, Bergamini C.M., Gambetti S., Dondi A., et al.: Oxygen, Reactive Oxygen Species and Tissue Damage. Curr. Pharm. Design 2004, 10, Brzozowska I., Konturek P.C., Brzozowski T.: Role of prostaglandins, nitric oxide, sensory nerves and gastrin in acceleration of ulcer healing by melatonin and its precursor, L-tryptophan. J. Pineal. Res. 2002, 32, Brzozowski T., Konturek P.C., Konturek S.J., et al.: The role of melatonin and L-tryptophan in prevention of acute gastric lesions induced by stress, ethanol, ischemia, and aspirin. J. Pineal. Res. 1997, 23, Bubenik G.A.: Thirty four years since the discovery of gastrointestinal melatonin. J. Physiol. Pharmacol. 2008, 59, Carillo-Vico A., Lardone P.J., Naji L.: Beneficial pleiotropic actions of melatonin in an experimental model of septic shock in mice: regulation of pro-/ anti-inflammatory cytokine network, protection against oxidative damage and anti-apoptotic effects. J. Pineal. Res. 2005, 39, Danielczyk K., Dziegiel P.: MT1 melatonin receptors and their role in the oncostatic action of melatonin Postepy Hig. Med. Dosw. 2009, 63, Espino J., Pariente J.A., Rodríguez A.B.: Role of melatonin on diabetes-related metabolic disorders. World J. Diabetes 2011, 2, Giacco F., Brownlee M.: Oxidative Stress and Diabe- Przegląd Lekarski 2013 / 70 /

5 tic Complications. Circ. Res. 2010, 107, Gultekin F., Delibas N., Yasar S., et al.: In vivo changes in antioxidant systems and protective role of melatonin and a combination of vitamin C and vitamin E on oxidative damage in erythrocytes induced by chlorpyrifos-ethyl in rats. Arch. Toxicol. 2001, 75, Guven A., Yavuz O., Cam M., et al.: Effects of melatonin on streptozotocin-induced diabetic liver injury in rats. Acta Histochem. 2006, 108, Halliwell B.: Reactive oxygen species in living systems: Source, biochemistry, and role in human disease. Am. J. Med. 1991, 91, Jaworek J.: Melatonina hormon dotąd niewykorzystany. Gastroenterol. Pol. 2010, 17, Klepac N., Rudes Z., Klepac R.: Effects of melatonin on plasma oxidative stress in rats with streptozotocin induced diabetes. Biomed. Pharmacother. 2006, 60, Konturek S.J., Konturek P.C., Brzozowski T. et al.: Role of melatonin in upper gastrointestinal tract. J. Physiol. Pharmacol. 2007, 58, Konturek S.J., Stachura J., Radecki T., et al.: Cytoprotective and ulcer healing properties of prostaglandin E2, colloidal bismuth and sucralfate in rats. Digestion 1987, 38, Konturek S.J., Konturek P.C., Brzozowska I., et al.: Localization and biological activities of melatonin in intact and diseased gastrointestinal tract (GIT). J. Physiol. Pharmacol. 2007, 58, Kwiecień S, Konturek P.C., Śliwowski Z., et al.: Interaction between selective cyclooxygenase inhibitors and capsaicin-sensitive afferent sensory nerves in pathogenesis of stress-induced gastric lesions. Role of oxidative stress. J. Physiol. Pharmacol. 2012, 63, Kwiecień S., Śliwowski Z., Konturek P.C., et al.: Melatonin and its precursor, L-tryptophan, attenuate acute gastric lesions and counteract prolongation of ulcer healing in rats with experimental diabetes. J. Physiol. Pharmacol. 2007, 58(Suppl. 4), Nishida S.: Metabolic effects of melatonin on oxidative stress and diabetes mellitus. Endocrine 2005, 27, Pradeepkumar Singh L, Vivek Sharma A, Swarnakar S.: Upregulation of collagenase-1 and -3 in indomethacin-induced gastric ulcer in diabetic rats: role of melatonin. J. Pineal. Res. 2011, 51, Rodriguez C., Mayo J.C., Sainz R.M., et al.: Regulation of antioxidant enzymes: a significant role for melatonin. J. Pineal. Res. 2004, 36, Stefulj J., Hörtner M., Ghosh M., et al.: Gene expression of the key enzymes of melatonin synthesis in extrapineal tissues of the rat. J. Pineal. Res. 2001, 30, Tashima K, Korolkiewicz R, Kubomi M, Takeuchi K. Increased susceptibility of gastric mucosa to ulcerogenic stimulation in diabetic rats-role of capsaicin-sensitive sensory neurons. Br. J. Pharmacol. 1998, 124, Winiarka K., Fraczyk T., Malinska D., et al.: Melatonin attenuates diabetes-induced oxidative stress in rabbits. J. Pineal. Res. 2006, 40, Vural H., Sabuncu T., Arslan S.O. et al.: Effects of melatonin on oxidative-antioxidative status of tissues in streptozotocin-induced diabetic rats. Cell Biochem. Funct. 2003, 21, M. Magierowski i wsp.