Testujemy tanie polimerazy

Transkrypt

1 Testujemy tanie polimerazy Specjalnie dla Was postanowiliśmy w naszym laboratorium przetestować tanie polimerazy, których cena wynosi około 50 groszy za 1U. Ku naszemu zaskoczeniu tanie polimerazy sprawdzają się bardzo dobrze w rutynowych oznaczeniach wykonywanych metodą PCR. Postanowiliśmy przetestować jakość nowego enzymu zawartego w polimerazach DNA pochodzącego z gatunku Pyrococcus furiosus, w odróżnieniu od najczęściej stosowanych enzymów, izolowanych z bakterii Thermus aquaticus. W celu porównania wydajności reakcji PCR, użyto dwóch rodzajów zestawów enzymów służących do przeprowadzania reakcji PCR: Paq5000 DNA Polymerase (Agilent Technologies) oraz PfuPlus! DNA Polymerase (EURx). Jako matrycy użyto 3 próbek DNA izolowanego z krwi obwodowej. Powstałe produkty PCR w dalszej kolejności miały zostać poddane sekwencjonowaniu. Reakcje PCR prowadzono w końcowej objętości mieszaniny reakcyjnej 50ul (w tym 2ul DNA) zgodnie z rekomendacjami producentów, ponadto skład mieszaniny PCR-mix oraz profil termiczny reakcji prowadzono również ściśle wg zaleceń producentów. Stosowano ten sam zestaw starterów o stężeniu końcowym 0,5uM a w celu optymalizacji PCR, reakcje prowadzono w gradiencie temperatur (50 C, 55 C oraz 60 C) w tym samym termocyklerze (Biometra). Po zakończonej reakcji, próbki rozdzielano elektroforetycznie w żelu agarozowym. W wyniku przeprowadzonych analiz stwierdzono, że produkty PCR (rycina) odpowiadające szukanemu fragmentowi są zasadniczo tej samej intensywności po zastosowaniu polimerazy firmy Agilent Technologies oraz EURx. We wszystkich 3 amplifikowanych próbkach pojawił się produkt PCR w temperaturach 50 C, 55 C

2 i 60 C; w przypadku polimerazy Paq5000 DNA temperatura 50 C okazała się najbardziej optymalna, natomiast w przypadku PfuPlus!, zależności od próbki, temperatura 50 C lub 55 C wydaje się być optymalna wymaga to dopracowania warunków reakcji lub przeanalizowania większej liczby próbek. W pierwszej próbce amplifikowanej przy pomocy polimerazy PfuPlus! pojawiły się również ciężkie niespecyficzne produkty ich eliminacja jest możliwa po dopracowaniu warunków reakcji. Fotografia przedstawia wynik elektroforezy agarozowej próbek amplifikowanych przy pomocy 2 różnych rodzajów polimeraz. Możliwe różnice widoczne na rycinie wynikają z jakości zdjęcia żelu agarozowego. Magdalena Zawada, dr n med. diagnosta laboratoryjny, specjalista w zakresie genetyki

3 Bioinformatyka specjalizacja z przyszłości Kiedy przyjedziecie do Gliwic, wśród przedwojennych budynków kampusu Politechniki Śląskiej bez trudu zauważycie wysoki, odrapany, szary blok. Tak właśnie wygląda Wydział Automatyki, Informatyki i Elektroniki, przez studentów innych wydziałów uczelni ochrzczony mianem Wieży magów. To tu kształcą się przyszli inżynierowie bioinformatyki. Bioinformatyka na Politechnice Śląskiej jest jedną ze specjalizacji prowadzonych w ramach międzywydziałowych studiów biotechnologicznych. Przez pierwsze dwa lata studenci mogą czuć się niczyi ; nieco wyobcowani zarówno wśród chemików, jak i wśród informatyków. Wszystko się zmienia, kiedy przychodzi czas na wybór specjalizacji. Dumni ze swoich decyzji studenci zamykają się we własnych, hermetycznych środowiskach. Czym tak naprawdę jest bioinformatyka? Programowaniem, programowaniem i jeszcze raz programowaniem narzędzi dla biotechnologów innych specjalizacji. W czasie studiów będziecie mieli okazję poznać podstawy C, C++, Matlaba, R, Labview, Perla, Php i kilku innych języków programowania oraz aplikacji. Ich zawiłości nie zawsze są dokładnie tłumaczone na zajęciach. Czasami dostaje się gotowy skrypt w języku, który widzi się po raz pierwszy na oczy i trzeba z nim pracować. Nierzadko przez składnię należy przegryzać się o własnych siłach, jednak studenci nigdy nie są pozbawieni pomocy wykładowców. Sprawozdanie to zdecydowanie najczęściej używane słowo na tych studiach. Bioinformatykom zdarza się pisać ich po pięć, sześć z każdego tygodnia zajęć. Czasem trzeba przedstawić wpływ parametrów klasyfikatora nadzorowanych sieci

4 neuronowych, innym razem zamodelować strukturę przestrzenną anhydrazy albo zaproponować metodę poprawy kontrastu obrazu mikroskopowego. Bez względu na to co i w jakim języku się pisze, większość algorytmów trzeba wymyślić samemu. W ramach specjalizacji studenci poznają praktycznie wszystko z czym mogą się spotkać w przyszłej pracy, od klasycznych technik analizy DNA, poprzez specjalistyczną analizę rzeczywistych danych, skończywszy na tworzeniu systemów sterujących na przykład oczyszczalnią ścieków, a to i tak tylko ułamek tego, co oferuje uczelnia. Jeśli ma się pomysł albo znajdzie się odpowiedniego opiekuna na uczelni, już na trzecim roku można rozpocząć własną pracę badawczą. W ramach specjalizacji działa również, ostatnio nieco zaniedbane, Koło Naukowe Bioinformatyków. Reaktywacja planowana jest w październiku. Liczymy, że świeża krew zasili nasze szeregi i Koło ponownie stanie na nogi. Kreatywni studenci znajdą zatrudnienie w ośrodkach badawczych. Wiele osób rozpoczyna badania i analizy konkretnych zagadnień jeszcze w czasie studiów. Wydawać by się mogło, że programowanie to programowanie i nie ma w tym nic ciekawego. Wierzcie mi lub nie, ale nie ma nic piękniejszego, niż widok kompilującego się bez błędów skryptu, jeśli ma się przy okazji świadomość, że to co się stworzyło, może pomóc na przykład w wykrywaniu mutacji odpowiedzialnych za nowotwory. Napisany na zaliczenie program wprawdzie nie zbawi świata, ale przecież i Rzym nie od razu zbudowano. Jeśli komuś nie odpowiada kariera badacza, zawsze może wykorzystać zdobyte umiejętności w innej pracy. W wielu miejscach potrzeba programistów, zwłaszcza mających choćby blade pojęcie o biologii. Każdy szpital czy laboratorium generuje co dzień dane, które trzeba umiejętnie analizować i składować. Bioinformatyk, przynajmniej w założeniu, jest specjalistą w dwóch dziedzinach. Potrafi określić problem analizy jak biolog, po czym może sam sobie dobrać odpowiedni algorytm rozwiązujący jak informatyk. Problemem pozostaje obecnie sprzęt. Niektórym analizom nie potrafią podołać nawet najlepsze klastry, a tym bardziej zwykłe, studenckie komputery. Czasami na wyniki, które powinny być dostępne od razu, trzeba czekać i tydzień. Być może w przyszłości sprzęt dostosuje się do potrzeb i możliwości technik bioinformatycznych. Jeśli macie smykałkę do algorytmiki i nie boicie się nowych wyzwań, wybierzcie

5 się na bioinformatykę. Wieża magów przygarnie wszystkie, nawet najbardziej szalone indywidua i pokieruje ich dalszym rozwojem. Marta Danch Targi EuroLab i CrimeLab za nami 18. Międzynarodowe Targi Analityki i Technik Pomiarowych EuroLab oraz 5. Targi Techniki Kryminalistycznej CrimeLab już za nami. Oba wydarzenia z sukcesem łączyły świat nauki i przemysłu. Opinię taką wyrażali zarówno przedstawiciele branży z instytutów naukowych i jednostek badawczo-rozwojowych, wszelkiego typu laboratoriów oraz firm świadczących usługi na rzecz sektora. W tym roku zaprezentowało się 140 wystawców z 14 krajów, a na targi przybyło niemal branżowych gości. Wystawcy przekonywali odwiedzających o zaletach prezentowanej oferty, a jednostki naukowe i badawcze informowały o prowadzonych badaniach i swych dokonaniach. Przedstawiciele branży uczestniczyli także w wykładach i konferencjach, podczas których mogli poszerzyć wiedzę, jak również uzyskać punkty edukacyjne.

6 Podczas uroczystego otwarcia Targów EuroLab oraz CrimeLab prof. Leszek Sirko, podsekretarz stanu w Ministerstwie Nauki i Szkolnictwa Wyższego, podkreślał, że innowacyjność Polski powstaje poprzez współdziałanie naukowców z przemysłem, a oba wydarzenia targowe pomagają zacieśniać tę współpracę. Z kolei prof. Leszek Rafalski, przewodniczący Rady Głównej Instytutów Badawczych, zwrócił uwagę na synergię pomiędzy nauką i biznesem, gdyż to właśnie dobrze wyposażone laboratoria podnoszą jakość pracy naukowej. Nowoczesne laboratoria Dostępne na targach rozwiązania oraz nowości produktowe obejmowały

7 następujące sektory branży laboratoryjnej: analitykę, biotechnologię i Life Science, metrologię, medyczną diagnostykę laboratoryjną, nanotechnologię, materiałoznawstwo oraz kryminalistykę. Niezbędne do pracy informacje mogli pozyskać zarówno specjaliści działający w laboratoriach zlokalizowanych w instytucjach naukowych czy jednostkach badawczo-rozwojowych, jak i w różnych gałęziach gospodarki, m.in.: przemyśle, sektorze spożywczym, kosmetyce czy ochronie środowiska. W tym roku ofertę zaprezentowało 140 wystawców z 14 krajów, tj.: Chin, Czech, Danii, Francji, Hiszpanii, Holandii, Litwy, Niemiec, Polski, Szwajcarii, Ukrainy, USA, Wielkiej Brytanii i Włoch. Obejmowała ona meble, sprzęt, instrumenty i artykuły analityczne i laboratoryjne, materiały zużywalne, odczynniki chemiczne i materiały odniesienia. Nie zabrakło także rozwiązań informatycznych, oprogramowania czy technologii niezbędnych do prac badawczo-rozwojowych. Wiele produktów było prezentowanych szerszej publiczności po raz pierwszy. Na imponującym stoisku firmy Thermo Fisher Scientific, w części prezentującej markę IRtech, można było zapoznać się z nagrodzonym w konkursie o Grand Prix prezesa PAN analizatorem Gemini. To jedyne na świecie urządzenie służące do identyfikacji chemikaliów i materiałów wybuchowych, które łączy dwie niezależne techniki pomiarowe. Jak opowiadała Ewa Korbiel, przedstawiciel technicznohandlowy, spektroskopia Ramana technika z sondą światłowodową, pozwala na identyfikację nieznanej substancji chemicznej przez opakowanie, dzięki czemu operator nie jest narażony na kontakt z niebezpiecznym materiałem. Z kolei technika FTIR opiera się na podczerwieni. Analizator Gemini pozwala na szybką zmianę techniki pomiarowej, co znacznie rozszerza spektrum substancji możliwych do identyfikacji. Jednocześnie umożliwia operatorowi zabranie w teren mniejszej ilości sprzętu dodała. Firma Alchem zaprezentowała po raz pierwszy komorę laminarną BioTectum 1.2 II klasy bezpieczeństwa mikrobiologicznego, Biohazard, wykonanej zgodnie z normą EN Komora ta uzyskała wyróżnienie w konkursie o Grand Prix prezesa PAN. Ten innowacyjny produkt, będący efektem polskiej myśli technologicznej, wytwarzany jest w zakładach w Bielsku-Białej. Zainteresowanie produktem w trakcie tragów było duże, o czym świadczy fakt, że wystawiony egzemplarz znalazł nabywcę już drugiego dnia targów. Założenia konstrukcyjne dotyczące komory laminarnej BioTectum były jasno sformułowane Non progredi est regredi nie czynić postępów to cofać się. Naszą ambicją nie było stworzenie

8 komory technologicznie opartej na rozwiązaniach, które powoli są wypierane z ofert czołowych producentów. Chcieliśmy stworzyć komorę nowej generacji, taką, która spełni wymagania nowoczesnych laboratoriów powiedział Krzysztof Solich, kierownik oddziału Grupy Alchem. Z uczestnictwa w targach zadowolony był także Jacek Beuster, Country Manager Poland firmy Hach Lange, producenta aparatury kontrolno-pomiarowej stosowanej przy analizie wody oraz ścieków. Nasz sprzęt wykorzystywany jest w wodociągach, stacjach uzdatniania wody, a także laboratoriach przemysłowych, w tym spożywczych i chemicznych. Nasi klienci lubią przychodzić na targi, porozmawiać i zapoznać się z najnowszą ofertą. Na EuroLab jesteśmy od 10 lat, a w tym roku już pierwszego dnia otrzymaliśmy wiele zapytań podsumował. Współdziałanie świata nauki i firm Jak co roku odwiedzający licznie korzystali z konferencji i wykładów programu merytorycznego, nad którym czuwała Rada Programowa. Dzięki właściwemu doborowi tematyki sale wykładowe były pełne. Wiele osób skorzystało także z okazji, by uzyskać wiedzę premiowaną punktami edukacyjnymi. Ogromnym zainteresowaniem cieszyła się konferencja Nowelizacja normy ISO/IEC Ogólne wymagania dotyczące kompetencji laboratoriów badawczych i wzorcujących organizowana przez Polskie Centrum Akredytacji. Już na godzinę przed rozpoczęciem większość miejsc była zajęta. Jak powiedział po konferencji Tadeusz Matras, zastępca dyrektora PCA, tak wielkie

9 zainteresowanie wynika z faktu, iż zmiana normy dotyczy laboratoriów, a to one stanowią największą grupę akredytowanych jednostek oceniających zgodność. Dodał, że PCA obecnie nadzoruje blisko 1500 laboratoriów, z czego aż ponad 1300 to laboratoria badawcze. Wiedza o systemie zarządzania i wymaganiach opisujących kompetencje laboratoriów jest niezbędna, gdyż tylko dzięki niej można ujarzmić technikę i włączyć do działalności laboratoryjnej dającej miarodajne, a tym samym przydatne do zamierzonego zastosowania, wyniki badań i pomiarów podsumował. Podkreślił też, że PCA na spotkaniach w trakcie Targów EuroLab przekazuje wiedzę, którą pozyskuje podczas obowiązkowych spotkań gremiów międzynarodowych. Innym ważnym wydarzeniem była konferencja pt. Badanie laboratoryjne w medycynie zapobiegawczej organizowana przez Polskie Towarzystwo Diagnostyki Laboratoryjnej. Dr Sławomir Białek z Zakładu Laboratoryjnej Diagnostyki Medycznej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego oraz członek Zarządu Głównego Polskiego Towarzystwa Diagnostyki Laboratoryjnej, zwrócił uwagę na cele, których realizacja jest możliwa dzięki prowadzeniu konferencji na targach. Tutaj łączy się świat nauki ze światem przemysłu czy firm mających szeroką ofertę zarówno dla laboratoriów naukowych, jak i laboratoriów wykonujących oznaczenia rutynowe. Gdy mówimy o nowych odkryciach i dokonaniach edukujemy diagnostów laboratoryjnych realizując cel dydaktyczny. Z kolei nasze wykłady dla przedstawicieli firm mogą być inspiracją do rozszerzenia ich oferty. Ponadto spotkania na targach przedstawicieli nauki i przemysłu laboratoryjnego to znakomita okazja na poznanie się tych środowisk, to rozmowy o projektach naukowych, których produkty finalne mogą poszerzać oferty firm i jednocześnie być wykorzystywane w praktyce, tak aby zwiększać możliwości diagnostyki podkreślił. Z kolei przedstawicielka Uniwersytetu Gdańskiego, prof. dr hab. Joanna Jakóbkiewicz-Banecka, jedna z prelegentek konferencji Biologia molekularna w badaniach bio-medycznych, zwróciła uwagę na rolę targów, dzięki której pracownicy naukowi otwierają się na nowe obszary. Na EuroLab zetknęłam się z firmami z naszego regionu, które dotąd nie dotarły na naszą uczelnię. Targi umożliwiają nam dokonanie przeglądu oferty, dzięki czemu my jako naukowcy możemy proponować naszym uczelniom dobór najnowszych sprzętów do wyposażania laboratoriów powiedziała. Postęp kryminalistyki

10 Targi CrimeLab i towarzyszące im wydarzenia skierowane były do profesjonalistów techniki kryminalistycznej. Jak powiedział insp. dr Waldemar Krawczyk kryminalistyka to obecnie najszybciej rozwijająca się dziedzina wymiaru sprawiedliwości. Na każdym miejscu zdarzenia zostają ślady przestępcy, pozostaje jedynie kwestia czy potrafimy je wykryć i właściwie zinterpretować ich znaczenie podkreślił. Dodał także, że dzięki badaniom biologicznym można wykryć to, co jeszcze jakiś czas temu było niemożliwe. Zabezpieczone nawet dekadę temu dowody mogą zidentyfikować sprawcę, w czym pomaga najnowocześniejszy sprzęt, taki jak ten prezentowany na targach. Bardzo szerokie grono słuchaczy zgromadziła IV Międzynarodowa Konferencja Naukowa Miejsce zdarzenia organizowana przez Centralne Laboratorium Kryminalistyczne Policji Instytut Badawczy i Centrum Badawczo-Szkoleniowe Polskiego Towarzystwa Kryminalistycznego. Część teoretyczną konferencji uzupełniły pokazy pracy polskich i niemieckich techników kryminalistyki na zainscenizowanym miejscu zdarzenia. Wykorzystując najnowocześniejszy sprzęt i materiały technicy ujawnili i zabezpieczyli ślady kryminalistyczne, a eksperci dokonali porównań prac obu ekip.

11 Drugim wydarzeniem skierowanym do branży kryminalistycznej była konferencja na temat wyjaśniania okoliczności wypadków drogowych pt. Wypadek drogowy i co dalej organizowana przez Instytut Ekspertyz Sądowych im. Prof. dra Jana Sehna w Krakowie. Dr hab. Dariusz Zuba, zastępca dyrektora ds. naukowych, przybliżył obszar działania Instytutu. Podkreślił on rolę pracy zespołowej ekspertów z różnych dziedzin, którzy współpracują przy wyjaśnianiu okoliczności wypadku. Prelegenci zwrócili także uwagę na trudności, jakie niesie ze sobą rozwój motoryzacji. Coraz częściej po wypadku mamy do czynienia z tzw. clean accident, tj. zdarzeniem, po którym nie zostają ślady, co nakłada na śledczych nowe wyzwania w zakresie ustalenia faktycznego przebiegu wypadku. Nagrodzone produkty W konkursie dla wystawców na najlepszą ofertę 18. Międzynarodowych Targów Analityki i Technik Pomiarowych EuroLab 2016 Jury składające się z wybitnych przedstawicieli kadry naukowej polskich uczelni wyłoniło laureatów w trzech kategoriach W kategorii Laboratoryjna aparatura pomiarowa nagrodę otrzymała firma Spectro-Lab za spektrofotometr Nano Drop OneC, a wyróżnienia firmy: IKA POL Wojciech Byrski za kalorymetr IKA typ C 6000 global standards oraz Kendrolab za analizator wstrzykowo-przepływowy FIAlyzer-1000 (FIA). W kategorii Wyposażenie laboratorium nagroda powędrowała do firmy Enbio Technology za autoklaw mikrofalowy Microjet, a wyróżnienia przyznano: DANLAB Wyposażenie

12 laboratorium za system próżniowy model PC 3001 VARIOpro oraz FRITSCH Milling and Sizing za wysokoobrotowy młynek wirnikowy PULVERISETTE 14 premium line. Trzecia kategoria Wyposażenie medycznego laboratorium diagnostycznego wyłoniła firmę MPW MED. INSTRUMENTS Spółdzielnia Pracy za mikrowirówkę laboratoryjną z chłodzeniem MPW-150R. Wyróżnienia przyznano firmom: OPTA-TECH za czytnik mikromacierzy, seria C, Biovendor Instruments oraz WITKO za serię pipet automatycznych Acura manual XS 826. Na targach przyznano także Grand Prix Prezesa Polskiej Akademii Nauk będące wyróżnieniem dla innowacyjnych produktów i usług związanych z rynkiem medycznym i laboratoryjnym, które wspierają rozwój i konkurencyjność tej branży w Polsce. Nagrodę przyznano firmie IRtech Beata Kasprzycka za spektrometr Gemini, a wyróżnienie Grupie Alchem za Biotectum 1.2 komorę laminarną II kl. bezpieczeństwa mikrobiologicznego. Dodatkowo odbył się także konkurs na najbardziej oryginalne i profesjonalne stoisko targowe, w którym laureatem została firma Thermo Fisher Scientific, a wyróżnienie otrzymał OHAUS Europe. Patronaty Patronat honorowy nad Targami EuroLab 2016 i CrimeLab 2016 objęli: Stanisław Piotrowicz, Przewodniczący Sejmowej Komisji Sprawiedliwości i Praw Człowieka; Jarosław Gowin, Minister Nauki i Szkolnictwa Wyższego; Zbigniew Ziobro, Minister Sprawiedliwości; prof. Jerzy Duszyński, Prezes Polskiej Akademii Nauk, Komendant Główny Policji oraz Ministerstwo Rozwoju. Lista wystawców: A.G.A. Analytical Agnieszka Bielińska B16 A.P. Instruments B13 ABL&E-JASCO Polska Sp. z o.o. A10 AGED Sp. z o.o. A1 Air Liquide Polska Sp. z o.o. F4 Alchem Grupa Sp. z o.o. C7

13 Analityka ( wydawnictwo Malamut) D6 Analytik Jena AG E9 Anchem Sp. z o.o. Sp. k. B16 ANDY Sp. z o.o. E7 ANITEPO Sp. z o.o. B10 Anton Paar Poland Sp. z o.o. C2 Applied Biosystems B16 ARCTIKO C7 Ardigen S.A. B3 ARGENTA sp. z o.o. Sp. k. B16 asecos B20 Atest. Ochrona Pracy E10 Azbil Telstar Benelux B.V. A1 BART Sp. z o.o. E11 Berendsen Textile Service Sp. z o.o. E25 Binder GmbH C7 Bio-Tech Media Sp. z o.o. C17 Centralne Laboratorium Kryminalistyczne Policji A14 CENTRUM MIKROSKOPII Sowińscy s.c. D1 Centrum Nauk Biologiczno-Chemicznych Uniwersytetu Warszawskiego B24 Chemia i Biznes F3 CSMS C12 CYBID Sp. z o.o. sp.k. B23 Danlab Wyposażenie Laboratorium A1 EDVAC Sp. z o.o. technika próżniowa E8 EDWARDS Ltd E8 EKMA B21 Ekohigiena Aparatura Ryszard Putyra Sp. J. C1b ELMETRON Sp. J. A5

14 Enbio Technology Sp. z o.o. B12 Eppendorf AG E9 Eppendorf Poland Sp. z o.o. B19 Eprus urządzenia do badania skóry C5 Firma CHEMPUR D16 Flores Valles C14 Fritsch GmbH A6 Genore chromatografia dr Jacek Malinowski D12 Główny Urząd Miar E23 Haas Reaktory, Analiza Termicza & Powierzchniowa B1 Hach Lange Sp. z o.o. C8 HANNA INSTRUMENTS Sp. z o.o. E5 HIROX EUROPE E1 Hornik D9 Hydrolab Sp. z o.o. Sp. k. A1 IKA POL A8 INFICON E15 Institute of Analytical Control Methods D8 Instytut Chemii i Techniki Jądrowej D7 Instytut Przemysłu Organicznego E13 Invitrogen B16 IRtech B16 KAMIKA Instruments C1a Kendrolab Sp. z o.o. A4; B16 Keyence International (Belgium) NV, Polish Branch B14 Klub Polskich Laboratoriów Badawczych POLLAB C11 KNAUER POLSKA B18 KNAUER Wissenschaftliche Gerate GmbH B18 KNF Neuberger GmbH A7

15 Koettermann Sp. z o.o. D3 KrakChemia S.A. C4 LAB Laboratoria, Aparatura, Badania E19 LabCenter Polska Sp. z o.o. A9 LABCOLD A1 LAB-EL Elektronika Laboratoryjna B2 Labelmarket Sp. z o.o. B17 LABINDEX B8 LABO24 C1 Laboratoria.net C15 Laboratorium Przegląd Ogólnopolski D2 Labstore Polska Sp. z o.o. D18 Labtech s.r.o. E20 LGC Standards Sp. z o.o. C6 Medson s.c. C18 MEGA SYSTEM SRL E24 MEGAN s.c. C1 MERANCO Aparatura Kontrolno-Pomiarowa i Laboratoryjna Sp. z o.o. E9 Merazet SA B9 Messer Polska Sp. z o.o. D17 Miele Professional C7 MPW Med. Instruments A2 MS SPEKTRUM D18 NETZSCH B15 nlab Sp. z o.o. A11 OHAUS B5 OMC Envag Sp. z o.o. A3 Omnilab GmbH E9 OPTA-TECH Sp. z o.o. E3

16 PANalytical B.V. E12 PERLAN Technologies Polska Sp. z o.o. D18 Pixel Technology E22 PNEUMATECH-GAZ TECHNIKA Sp. z o.o. F2 Polskie Centrum Akredytacji E17 Polskie Towarzystwo Chemiczne B28 Polygen Sp. z o.o. B16 PRECYZJA-BIT PPHU Sp. z o.o. D4 Przemysł Chemiczny E10 PZ HTL S.A. B7 Radwag Wagi Elektroniczne D5 Renggli Systemy Mebli Laboratoryjnych A1 RHL-Service C9 Safran Morpho A14 Salvis Lab A1 SELMA IMPORT- EXPORT D14 SHIM-POL C3 SINEO C7 SNOL C7 SoftwareHut Sp. z o.o. D11 Solution4Labs Sp. z o.o. D11 Spectro-Lab B4; B16 Spektrino Sp. z o.o. C10 Steroglass S.r.l. A1 Swagelok Poland E2 SYL&ANT Instruments B11 TA Instruments A12 Tech-Lab.pl Projektowanie i Budowa Maszyn Laboratoryjnych E16 Tecom Analytical Systems-Poland Sp. z o.o E4

17 Thermo Fisher Scientific B16 Thermo Scientific B16 TPI Sp. z o.o. Rozwiązania Pomiarowe A13 TROX Austria GmbH Sp. z o.o. Oddział w Polsce E21 Tubes International Sp. z o.o. E6 Tusnovics Instruments Sp. z o.o. D10 Vacuubrand GmbH & Co.KG A1 WALDNER Laboreinrichtungen GmbH & Co. KG A7 Waters A12 Witko Sp. z o.o. A7 WPL Wytórnia Przyrządów Laboratoryjnych C1 Wyatt Technology Europe GMBH D15 Wydawnictwo Malamut D6 Wydział Chemii Uniwersytetu Warszawskiego B26 Wytwórnia Aparatury Medycznej i Laboratoryjnej WAMED B22 Zakład Sprzętu Laboratoryjnego ALPINA C13 Zwierzętarnia Wydziału Farmaceutycznego Uniwersytetu Medycznego w Łodzi C16

18 Katalogowanie próbek w erze cyfrowej: jak kody kreskowe mogą usprawnić nam życie Wciąż korzystasz z markera i papierowego zeszytu podczas katalogowania próbek? Klniesz pod nosem podpisując PCRówki? Przeżywasz koszmar gdy etanol kapnie na podpisane wieczko? Może zamiast o nowym termocyklerze warto pomyśleć o kupnie w ramach kolejnego grantu czegoś innego systemu, który pozwoli niesamowicie przyspieszyć i ułatwić katalogowanie próbek? Czytniki kodów kreskowych istnieją już od dawna, czasami spotyka się je także w laboratoriach klinicznych do tagowania próbek od pacjentów. Jednakże wciąż sporadycznie spotyka się w Polsce placówki, które zdecydowały się na wprowadzenie tego systemu w laboratoriach biologii molekularnej. Zapytacie pewnie, na ile takie rozwiązanie się sprawdza- eppendorf y się przecież mrozi i rozmraża, PCRówki są maleńkie, a odczynniki można z powodzeniem opisać markerem. Niby tak, ale gdy próbek przybywa, przybywa też kłopotów z ich składowaniem i opisywaniem- szczególnie jeśli ekipa w laboratorium często się zmienia (np. przychodzą praktykanci, magistranci, doktoranci) i każdy ma inny system opisywania. Jak efektywnie katalogować próbki? Katalogowanie próbek najlepiej prowadzić elektronicznie, niezależnie od tego czy mamy dodatkowo system tagowania i odczytywania kodów, czy nie. Poczciwy MS Excel lub OpenCalc spełnią swoje zadanie, bardziej biegli w sztukach informatycznych mogą spróbować z MS Access czy też bazami opartymi o MySQL. Takie bazy można zamówić u dobrego programisty i wcale nie jest to kosmicznie drogie, zważywszy na przyszłą wygodę i wydajniejszą organizację pracy. Powinniśmy także wprowadzić ogólne zasady składowania materiału, takie jak format próbówek i ich kolor (np: primery trzymamy w 0,5ml próbówkach, standardy do qrt w zakręcanych 2ml itd). Jeżeli uda nam się wprowadzić wśród

19 załogi laboratorium konsensus co do tego, jak numerować próbki, to jesteśmy na dobrej drodze do wprowadzenia całkiem sensownego systemu katalogowania. Teraz pozostaje już tylko wybór formatu etykiet samoprzylepnych, rodzaju drukarki, skanera i można kupować nowoczesny system archiwizacji! Co wchodzi w skład systemu nowoczesnego do katalogowania próbek? Podstawowe wyposażenie takiego systemu to czytnik kodów kreskowych (1D lub 2D, polecam te drugie), drukarka zdolna do wydruku etykiet o odpowiadającym nam formacie i na odpowiednim typie folii (np. folia wytrzymująca niskie lub wysokie temperatury lub rozpuszczalniki organiczne). Do tego zamawiamy odpowiednią ilość taśmy termosublimacyjnej do druku etykiet w pożądanym rozmiarze. Potrzebne nam też będzie oprogramowanie, które rozpozna kody i przyporządkuje je naszym próbkom. Takie zestawy urządzeń+oprogramowanie są oferowane przez firmy wraz z serwisem i pomocą techniczną. Ile to kosztuje? Najprostsze systemy dla laboratoriów kosztują kilka tys. zł. Warto jednak dobrze sprawdzić, czy wszystkie moduły do siebie pasują, czy firma wycina tak małe naklejki, które zmieszczą się na próbówkach Epp. oraz na PCRówkach. Sprawdźmy, czy oferowane taśmy do druku spełniają zadeklarowane przez nas parametry i przetestujmy oprogramowanie. Nie zawsze będzie ono wygodne w użytkowaniu i user friendly. Droższe systemy potrafią kosztować nawet kilkadziesiąt tys. zł, najczęściej z winy ładnego, przejrzystego i dostosowanego do potrzeb biologii molekularnej oprogramowania. Wybór systemu zależy głownie od funduszu, jakim dysponujemy i od tego, jaki materiał będziemy oklejać i archiwizować. Czy warto? Definitywnie warto. Ale żeby było warto, trzeba najpierw dostosować swój tryb pracy do możliwości systemu i gruntownie przemyśleć, na czym nam naprawdę zależy i w jaki sposób to osiągnąć. Trudno jest zarzucić system, który okaże się nieprzydatny, a z którego już zaczęliśmy korzystać! Dlatego dajmy sobie czas, by przemyśleć wszystko, przetestować i dopiero wtedy zdecydować się na zakup.

20 Paragraf pod lupą- zgoda na badania genetyczne W poprzednim artykule omówiliśmy niektóre zagrożenia związane z bezprawnym wykorzystaniem wyników badań genetycznych. Dziś postaramy się przybliżyć Państwu podstawy prawne, według których w naszym kraju powinno się uzyskiwać zgodę pacjenta na wykonywanie badań do celów medycznych. Zgoda świadoma i swobodna W Polsce kwestie wyrażenia zgody na badania genetyczne regulują te same akty normatywne, które dotyczą jakiejkolwiek zgody na wykonanie procedury medycznej. Mamy więc art. 41 ust. 1 Konstytucji RP [1], mówiący o prawie do wolności osobistej, mamy także tzw. Konwencję z Oviedo czyli Konwencja o prawach człowieka i biomedycynie [2], która podkreśla rolę swobodnej i świadomej zgody pacjenta na wykonanie procedury medycznej. W polskim prawodawstwie o świadomej zgodzie traktują także Kodeks Etyki Lekarskiej [3], Ustawa o Zawodzie lekarza i lekarza dentysty [4] oraz Ustawa o Prawach Pacjenta i Rzeczniku Praw Pacjenta [5]. Czymże więc jest ta swobodna i świadoma zgoda? W świetle Prawa pacjent musi zostać powiadomiony o procedurze medycznej oraz o wszystkich dających się przewidzieć konsekwencjach (korzyści, ryzyko, dalsze postępowanie terapeutyczne) w sposób dla niego zrozumiały i jasny. Pacjent

21 powinien mieć możliwość zapoznania się i podjęcia decyzji dotyczącej procedury w spokoju, bez nacisków i poganiania. Ważny jest też moment pacjent powinien być przytomny i świadomy (a więc nie pod narkozą ani cierpiący z powodu silnego bólu). W przypadku badań genetycznych pacjent powinien być także poinformowany o celu badania, jego ograniczeniach oraz o sposobie zabezpieczania materiału i jego utylizacji po wykonaniu testu. Oczywiście, pacjent może takiej zgody nie udzielić i odmówić wykonania badania. Taka decyzja nie po inna w żaden sposób stygmatyzować pacjenta i wciąż powinien on otrzymać pomoc medyczną w zakresie, na jaki pozwala brak jego zgody. Kto może wyrazić zgodę w imieniu pacjenta i w jakich przypadkach? W pewnych przypadkach możemy mieć trudność z uzyskaniem świadomej i swobodnej zgody od pacjenta. Może być on nieprzytomny lub ubezwłasnowolniony, w przypadku dziecka także zgodnie z prawem procedura się komplikuje. Zacznijmy od dzieci. W przypadku osoby małoletniej, zgodę w jej imieniu wyraża przedstawiciel ustawowy. Przedstawicielem ustawowym jest rodzic lub inny opiekun formalnie wyznaczony przez sąd opiekuńczy (np. rodzice zastępczy, dziadkowie lub inni bliscy krewni, posiadający pełną zdolność do czynności prawnych, bywa także że jest to kurator). Musimy być także świadomi, że małoletni powyżej 16 roku życia musi także wyrazić zgodę, a w przypadku rozdźwięku między wolą jego i jego opiekunów o zgodzie decyduje sąd opiekuńczy. W przypadku osób ubezwłasnowolnionych analogicznie zgodę może wyrazić opiekun ustawowy (zwykle jest nim małżonek lub rodzic), chociaż w tym przypadku także trzeba się liczyć z opinią samego ubezwłasnowolnionego. W przypadku braku opiekuna ustawowego przy osobie nieprzytomnej lub ubezwłasnowolnionej, decydować czasami może tzw. opiekun faktyczny. Jest to osoba sprawująca realną opiekę nad pacjentem, która nie jest opiekunem ustanowionym wskazanym na drodze prawnej. Taki opiekun może wyrazić w imieniu pacjenta zgodę na pewne nieinwazyjne zabiegi (np badania lekarskie). W przypadku zabiegów inwazyjnych, orzeka sąd opiekuńczy. Podwójny status badania genetycznego jako próbki i dokumentacji medycznej w świetle zapisów Ustawy o Prawach Pacjenta oraz Kodeksu Etyki Lekarskiej

22 pozwala na analizę za zgodą pacjenta lub opiekuna ustawowego. Wynik powinien być znany wyłącznie pacjentowi lub jego opiekunowi ustawowemu, oraz lekarzowi Art 29 KEL [4], Art 26 UoPPiRzPP [5]. Jest jednak zastrzeżenie, że badania genetyczne predyspozycji i nosicielstwa bezobjawowego (np. pojedynczy allel recesywny) nie powinny być w ogóle wykonywane u małoletnich na podstawie wyłącznie żądania nawet opiekuna ustawowego [6, 7]. Oczywiście na wniosek sądu lub z przyczyn medycznych takie badania oczywiście się wykonuje. Co powinien zawierać formularz świadomej zgody? W formularzu świadomej zgody powinny znaleźć się dane osobowe pacjenta lub jego opiekuna ustawowego (imię, nazwisko, PESEL) oraz oświadczenie pacjenta. Powinno być ono sformułowane w ten sposób, by pacjent osobno mógł zadeklarować zgodę lub jej brak na analizę materiału, jego późniejsze przechowywanie oraz ewentualne badania naukowego. Ponadto do formularza powinien zostać dołączony informator o celu badania. Na jakie badania musimy mieć zgodę pacjenta? Definicja badania genetycznego na całym świecie budzi liczne wątpliwości. Nie została ona klarownie sformułowana w żadnym kraju, co z jednej strony otwiera pole do nadużyć, z drugiej budzi obawy klinicystów, czy mogą konkretne badanie wykonać bez zgody, czy jednak jest ona konieczna. Problem dotyczy głównie diagnostyki chorób nowotworowych, w której pozyskiwany materiał jest materiałem unikatowym (a więc jego zniszczenie jest niekorzystne dla pacjenta pod kątem przyszłej analizy porównawczej rozwoju choroby). Ponadto tkanka guza różni się genetycznie od DNA wrodzonego np. aberracjami cytogenetycznymi, licznymi mutacjami itd. W tkankach nowotworowych często oceniamy nie DNA, ale profil ekspresji genów, mirna czy też profil metylacji. Trudno uznać takie badania za diagnostykę genetyczną, mimo że operujemy na kwasach nukleinowych, więc zgodnie z najostrzejszymi kryteriami powinniśmy taki materiał traktować na równi z DNA. Analogicznie jak w diagnostyce nowotworów, ten sam problem dotyczy diagnostyki mikrobiologicznej, w której analizujemy genomy drobnoustrojów, a

23 nie pacjenta. Osobiście proponuję, by zgoda na badania genetyczne funkcjonowała we wszystkich przypadkach, w których zamierzenie lub przez przypadek możemy wykryć klinicznie istotną zmianę wrodzoną. Dotyczy to więc wszystkich przypadków diagnostyki prenatalnej, poszukiwania predyspozycji i przyczyn dziedzicznych schorzeń, a także (uwaga!) każdej analizy katriotypu metodą prążkową (nawet w onkologii!), analizy mutacji metodą sekwencjonowania, czy też genotypowania (do celów sądowych lub medycznych). Analiza kariotypu, nawet onkologiczna, czasami pozwala odkryć wrodzone translokacje wzajemne i choroby genetyczne o łagodnej manifestacji fenotypowej (np. zespół Klinefeltera czy XYY). Nie zawsze pacjent życzy sobie tego, by poznać prawdę na temat swoich zaburzeń kariotypowych, które mogą rzutować na jego życie rodzinne i pożycie małżeńskie. Pacjent który ucierpi (w swoim odczuciu) z powodu ujawnienia wady może pozwać placówkę, która taki wynik wydaje bez jego zgody, choćby intencją badania była diagnostyka nowotworów. Analogicznie wyniki genotypowania lub analizy HLA u rodzeństwa przed transplantacją mogą wykazać zdradę małżeńską lub fakt adopcji donora materiału (a przecież nie był to cel wykonania badania!). Odkrycie tego faktu także może zmienić na zawsze ludzkie życie i o tym ryzyku osoba genotypowana powinna wiedzieć. Piśmiennictwo: 1. Konstytucja Rzeczpospolitej Polskiej 2. Konwencja o ochronie praw człowieka i godności istoty ludzkiej wobec zastosowań biologii i medycyny 3. Kodeks Etyki Lekarskiej 4. Ustawa o Zawodzie lekarza i lekarza dentysty 5. Ustawa o Prawach Pacjenta i Rzeczniku Praw Pacjenta 6. Kapelańska Pęgowska J. Prawe i bioetyczne aspekty testów genetycznych, LEX, 2011.

24 7. Florencio PS. Genetics, Parenting and Children s Rights in the Twenty-First Century, McGill Law Journal, System immunologiczny wirusów obroną przed innymi wirusami Zapewne część czytelników prześledzi wzrokiem ten nagłówek przynajmniej dwukrotnie, zastanawiając się przy tym czy nie zaszła jakaś pomyłka w konstrukcji zdania. Ale nie nie zaszła. Czy w takim razie mamy do czynienia z tytułem-przynętą, który efektownie ubarwia treść wiadomości? Nie tym razem. Według grupy naukowców związanych z AixMarseille Université wirusy z rodziny Mimiviridae bronią się przed wirofagami za pomocą narzędzi zbliżonych do systemu CRISPR-Cas, o proponowanej nazwie MIMIVIRE o czym informuje nas treść listu do Nature. Mimiviridae to rodzina dużych nukleoplazmatycznych DNA wirusów, infekujących ameby. Dużych zarówno pod względem genomów (ok. 1,2 miliona par zasad to więcej niż długość genomów u 30 różnych organizmów komórkowych. W genomie pojedynczego przedstawiciela Mimiviridae można znaleźć ponad 900 genów kodujących białka) jak i średnicy kapsydu (w zależności od źródeł: nm, co pozwala zaobserwować je pod mikroskopem optycznym). Mimiviridae padają ofiarą wirofagów satelitarnych wirusów koinfekujących, niezdolnych do samodzielnej replikacji w organizmie komórkowym bez obecności

25 innego, specyficznego wirusa (w tym przypadku obecności Acanthamoeba polyphaga mimivirus (APMV)). Wirofagi przejmują kontrolę nad obcymi strukturami wiroplazmy i za ich pomocą replikują się, upośledzając przy tym namnażanie wirusa od którego są zależne. Zainteresowanie badaczy wzbudziło to, że wirofag Zamilon (arab. sąsiad ) jest w stanie skutecznie zainfekować szczepy z linii rozwojowych (skupiających szczepy najbliżej spokrewnione) B i C u mimiwirusów, jednak linia A jest na niego odporna. Sformułowano hipotezę, że przedstawiciele APMV mogą posiadać mechanizm obronny zbliżony do systemu CRISPR-Cas, szeroko rozpowszechnionego u bakterii i archaea. CRISPR-Cas to systemy opierające się na wyspecjalizowanych enzymach Cas i transkrybowanym RNA, które skanują DNA gospodarza w poszukiwaniu obcego, np. wirusowego DNA, identyfikują je porównując z CRISPR biblioteką krótkich sekwencji DNA, pasujących do DNA intruza po czym rozwijają helisę i tną podejrzany fragment DNA na kawałki. Zakładając analogię do CRISPR-Cas, w genomach mimiwirusów spodziewano się znaleźć sekwencje umożliwiające systemowi rozpoznanie wirofaga. Przeszukano więc genomy 60 mimiwirusów pod kątem sekwencji specyficznych dla Zamilon (przy okazji wykonano sekwencjonowanie de novo 45 szczepów). U linii rozwojowej A (czyli wykazującej odporność), a także u jednego szczepu z linii C (Megavirus chilensis), znaleziono insercje powtórzonej sekwencji Zamilon, w obrębie operonu. Autorzy listu (Anthony Levasseur, Meriem Bekliz et al.) proponują dla tego regionu genomu nazwę MIMIVIRE, od mimivirus virophage resistance element. Według nich, analiza sąsiadujących sekwencji sugeruje, że locus przypomina właśnie mechanizm obronny pokrewny CRISPR-Cas a białka MIMIVIRE posiadają funkcje (nukleazy i helikazy) typowe dla uczestnictwa w degradacji obcych kwasów nukleinowych. Co najważniejsze: Wykazano, że wyciszenie regionu MIMIVIRE przywraca podatność mimiwirusa na skuteczną infekcję wirofagiem Zamilon. Dzięki temu wiemy, że mamy do czynienia ze specyficznym mechanizmem

26 obronnym. Na razie jednak nie wiadomo na ile w tym przypadku trafna jest robocza analogia do CRISPR-Cas. Ogólne zasady działania systemu o proponowanej nazwie MIMIVIRE i jego możliwe mechanizmy adaptacji immunologicznej nie są jeszcze znane pozostaje nam kibicować autorom listu i czekać na wyniki kolejnych badań. Michał Skawiński Piśmiennictwo: Levasseur A. et al. MIMIVIRE is a defence system in mimivirus that confers resistance to virophage. Nature, 2016; 531: Kontuzje i choroby zawodowe związane z pracą w laboratorium Czy pipetowanie może być groźne dla zdrowia? A analizowanie danych genomowych, albo klastrowanie hierarchiczne? Może się zdziwicie, ale odpowiedź brzmi tak! Jak pracować, by nie doprowadzić się do choroby zawodowej, która może nas nawet wykluczyć z pracy laboratoryjnej?!? Oto kilka praktycznych porad. Praca laboratoryjna wiąże się z pewnymi istotnymi obciążeniami zdrowotnymi, których powinniśmy być świadomi, by nie doprowadzić się do kontuzji i zwyrodnień, ani nie zniszczyć sobie wzroku. Pipetowanie obciąża nadgarstek, dbajmy więc o odpowiednią pozycję ręki podczas wykonywania tej czynności, o

27 dobry sprzęt (wygodna pipeta z atestami) i ograniczajmy maksymalnie ilość próbek, jaką musimy przepipetować dziennie. Spędzanie 300 godzin rocznie na pipetowaniu jest już groźne dla zdrowia. Warto pomyśleć o dozowniku lub multikanałówce by usprawnić sobie pracę, o pipetach automatycznych, a nawet o stacjach pipetujących, jeżeli laboratorium na to stać. Co nam grozi? Na początku mrowienie, następnie towarzyszące mu sztywnienie nadgarstka i ból. Po latach pracy mogą pojawić się zwyrodnienia stawów i ograniczenie ruchomości nadgarstka i palców. Poza problemami związanymi z pipetowaniem musimy pamiętać o plecach. Stojąco-siedząca praca, jaką wykonujemy w laboratorium nie jest obojętna dla naszego kręgosłupa. Pipetujmy zawsze w pozycji prostej, nie wyginajmy się na boki. Czy stoimy, czy siedzimy, zwróćmy uwagę na to jak wysoko umieszczony jest blat roboczy. Nie powinniśmy się garbić przy pipecie ani wyciągać jak struna. Czynności laboratoryjne powinniśmy wykonywać w pozycjach fizjologicznych. To samo tyczy się także pracy z komputerem. Zwróćmy uwagę na wygodę pracy biurowej, zatroszczmy się o odpowiednie krzesło i nowoczesny monitor. Wady postawy i zwyrodnienia kręgosłupa szyjnego to już niemal choroba cywilizacyjna- a wszystko przez nieodpowiednią postawę podczas pracy z komputerem! Jeżeli jesteśmy już w temacie komputerów oszczędzajmy swoje oczy. Szczególnie bioinformatycy, ale także osoby dużo czasu spędzające na wypisywaniu wyników, obrabianiu danych, rozporządzaniu bazami genomowymi: wszyscy oni są narażeni na stopniowe pogorszenie wzroku. Dla osoby pracującej także z pipetą może to być wyrok: powodzenie reakcji zależy od tego, czy dostrzeżemy 1ul w końcówce tipsa! Najbardziej narażeni na pogorszenie wzroku w laboratoriach medycznych są histopatolodzy, cytolodzy, cytogenetycy i hematolodzy- wszyscy ci, którzy godzinami oglądają preparaty mikroskopowe. Dla nich jedyną radą jest korzystanie z częstych, kilku-kilkunastominutowych przerw w pracy i roztropne korzystanie ze swojego sprzętu. Gdy w grę wchodzi nasze zdrowie, warto jest przyjrzeć się swojemu środowisku pracy. Lata zaniedbań z pewnością odbiją się na naszym

28 zdrowiu, a dokonując niewielkich poprawek swojej pozycji przed monitorem lub pod komorą laminarną możemy uniknąć długofalowych, negatywnych konsekwencji naszej pracy zawodowej. Wyniki fałszywie pozytywne w PCR! Jak się przed nimi bronić? (II) Kontaminacja to chyba najbardziej przerażające wyrażenie w słowniku każdego biologa molekularnego. Przypadkowe przeniesienie produktu PCR na blaty, plastiki lub sprzęt laboratoryjny może zamienić życie pracowników laboratorium w koszmar na długie tygodnie. Jak nie dopuścić do tej sytuacji? W części pierwszej przestawiłam podstawowe sposoby na uniknięcie fałszywych pozytywów i obnażyłam słabości lamp UV. Dziś przedstawiam Wam rozwiązania, które można zastosować, jeśli już kontaminacja nam się zdarzyła. 1. Na kłopoty wybielacz W pierwszej części tego dwuodcinkowego cyklu wspominałam, że pomieszczenie w którym pracować będziemy z produktami PCR powinno być odporne na utleniacze. Co konkretnie miałam na myśli? Żeby pozbyć się DNA najprościej jest je chemicznie unieszkodliwić. Są na to dziesiątki sposobów, a jak zwykle najlepsze są te najtańsze i znane z naszych gospodarstw domowych.

29 * W literaturze spotykamy różne pomysły na dekontaminację, prym wiedzie HCl i mieszaniny kwasu z rozmaitymi substancjami (np.glicyną) wspomagającymi. HCl 1M obniża ph do tego stopnia, że indukuje depurynację i hydrolizę DNA. Gorący kwas solny z glicyną jest szczególnie polecany do dekontaminacji końcówek pipet, jednak mycie nim większych powierzchni jest kłopotliwe. Poza tym kwaśna hydroliza wymaga albo podwyższonej temperatury, albo długiego czasu ekspozycji. Dlatego nie jest polecana do ogólnych zastosowań. * DNA ulega hydrolizie także pod wpływem środków do sterylizacji i dezynfekcji wysokiego stopnia, takich jak tlenek etylenu i gazowy formaldehyd oraz aldehyd glutarowy. Jednakże tych związków każdy z nas chciałby unikać jak ognia- uwierzcie na słowo. Są to środki bardzo korozyjne i niebezpieczne dla błon śluzowych, używane w celu całkowitej eliminacji patogenów np. z materiałów i narzędzi chirurgicznych. Nie wiem, czy gdziekolwiek stosuje się rutynowo te środki (może poza formaldehydem, znam osobę która używa tej nad wyraz nieprzyjemnej substancji). * Dostępne w katalogach niektórych firm produkujących odczynniki są specjalne, przeznaczone do dekontaminacji preparaty typu DNA-Away. Mogą to być roztwory DNAz lub środki chemiczne. Są stosunkowo drogie, a ich skuteczność jest podobna jak rozwiązań opisanych poniżej. * Najlepsze w walce z kontaminacją DNA są komercyjnie dostępne wybielacze i środki czyszczące. Odpowiednio rozcieńczony roztwór NaOCl tworzy nacięcia nici (nick uje DNA) i tym samym uniemożliwia amplifikację. Podobnie działa wiele innych środków dostępnych w sklepach z chemią gospodarczą. Tabletki calgonitu, zawierające wodorotlenki sodu i potasu oraz podchloryn, wszelkie środki w sprayu wydzielające wolny chlor lub tlen rodnikowy (oparte na eterach, epoksydach, aldehydach) są jak najbardziej skuteczne i bardziej bezpieczne dla użytkownika niż środki do sterylizacji gazowej. * Jak używać wybielacza? Ważne jest stężenie aktywnego chloru. DNAbójczo działa nawet 0,5% roztwór, wystarczy więc odpowiednio rozcieńczyć wybielacz i przemyć blaty. Albo zastosować spryskiwacz. Ważne jest, by pozostawić warstwę wybielacza na mytej powierzchni przez 15minut albo do wyschnięcia, a potem zmyć wodą. Najlepsze działanie związków

30 generujących rodniki tlenowe i wolny cholor otrzymujemy przy kontakcie preparatu z powietrzem, dlatego nanosimy cienką warstewkę. Dlatego nie urządzamy kąpieli np. statywów w wybielaczu, raczej je spryskujemy. Tipsy z filtrem- koszt który warto ponosić W połączeniu z regularnym myciem powierzchni wybielaczami i okresowymi kąpielami końcówek pipet w HCL-glicynie, dobrze jest stosować tipsy z filtrem jako prewencję w codziennej praktyce laboratoryjnej. Tipsy z odpowiednio umiejscowionymi, grubymi filtrami pozwalają na ochronę pojedynczych próbek przed aerozolami DNA, które mogą osadzić się na dispenserze podczas pipetowania. Taka ochrona jest szczególnie polecana w laboratoriach diagnostycznych i w placówkach korzystający z metod QPCR i nested PCR. Warto zwrócić uwagę na jakość filtra. Spotkałam się z produktami, w których silikonowa wkładka nie powinna w ogóle zostać uznana za filtr, gdyż jej niewielka grubość nie zapewniała żadnej ochrony. Na rynku dostępne są końcówki zawierające nawet 2 lub 3 warstwy filtrujące- takiemu rozwiązaniu nie oprze się żaden aerozol DNA. Nie polecam oszczędzać na końcówkach z filtrem, jeżeli w naszym laboratorium zdarzały się w przeszłości zanieczyszczenia, oraz w sytuacji, gdy nie dysponujemy pomieszczeniami dedykowanymi do PCRu i komorami laminarnymi. Oszczędność 10zł na opakowaniu tipsów może nas kosztować setki złotych stracone na powtarzaniu reakcji PCR! UNG: rozwiązanie wygodne, ale nie zawsze praktyczne Uracylo-N-glikozylacja to elegancka metoda unieszkodliwiania kwasów nukleinowych po reakcji PCR. Używana jest już od wielu lat i pozwala na większą swobodę pracy z produktami PCR. * UNG to system amplifikacji opartej na deoksyurydynie zamiast deoksytymidynie. Po reakcji PCR otrzymujemy produkt z inkorporowanym du, który (o ile zostanie przeniesiony do kolejnej reakcji) jest niszczony przez specjalny, dodawany do reakcji enzym urydylo-n-glikozylazę przed rozpoczęciem właściwej amplifikacji PCR. Tym sposobem nici zawierające du degradują i nie mogą stanowić matrycy w tej reakcji. * Warto zasygnalizować, że UNG pozwala na uniknięcie kontaminacji tylko

31 matrycami z inkorporowanym du z poprzednich reakcji PCR< nie daje natomiast żadnej ochrony przed kontaminacją na pierwszych etapach pracy z analitem. Tak więc wracamy do punktu wyjścia, czyli opisanego w I części tego opracowania GLP. * Drugim ważnym mankamentem może być bezzasadność wykorzystania UNG w reakcjach nested-pcr, w których konieczne jest reamplifikowanie matrycy z poprzedniego PCRu. Można do drugiego MIXu nie dodawać UNG, ale w ten sposób znowu wystawiamy się na kontaminację! Tak oto wspólnie dotarliśmy do końca opracowania, które może ułatwi Wam pracę w czystym, wolnym od kontaminacji otoczeniu. Czego Wam i sobie życzę! Opracowanie powstało na bazie własnych doświadczeń, jednak niezwykle pomocne okazały się artykuły z BiteSizeBio: Eliminate PCR Amplicon Carry-Over With UNG PCR: The Right Way to Decontaminate and Eliminate False Positives Wyniki fałszywie pozytywne w

32 PCR! Jak się przed nimi bronić? (I) Kontaminacja to chyba najbardziej przerażające wyrażenie w słowniku każdego biologa molekularnego. Przypadkowe przeniesienie produktu PCR na blaty, plastiki lub sprzęt laboratoryjny może zamienić życie pracowników laboratorium w koszmar na długie tygodnie. Jak nie dopuścić do tej sytuacji? Przedstawiam Wam rozwiązania, które uchronią Was przed fałszywymi pozytywami i oszczędzą mnóstwa frustracji. 1. GLP przede wszystkim Niestety nie istnieje rozwiązanie, które pozwoli nam zupełnie beztrosko poczynać sobie z produktami PCR w laboratorium. Podstawą każdej czynności, począwszy od pipetowania, skończywszy na usuwaniu odpadów, musi być dobra praktyka laboratoryjna i należy mieć tego pełną świadomość. Zacznijmy od najważniejszego: myślmy nad każdą wykonywaną czynnością. Niech nie zgubi nas rutyna! * Aby nie dopuścić do kontaminacji, spróbujmy rozdzielić przestrzennie czynności wykonywane w laboratorium. Przypiszmy pipety do poszczególnych stanowisk laboratoryjnych i nie wychodźmy z nimi poza obszar roboczy, do którego są przyporządkowane. * Pilnujmy tipsów- czy nakładane są do pudełek w innym miejscu niż wykonujemy PCR? Czy personel który to robi, używa zawsze świeżych rękawic? Czy pudełka na tipsy są zamykane, gdy z nimi nie pracujemy? * Uważajmy na standardy do Real-Time PCRu i próbówki z produktami reakcji. Kwestia warta rozważenia: jeżeli w każdym mikrolitrze standardu jest sto milionów kopii matrycy, to co się stanie, jeśli taki mikrolitr kapnie nam na stół a następnie zostanie roztarty przez sprzątaczkę ścierką po całym blacie? Albo gdy kapnie nam na rękę, którą następnie złapiemy za pipetę, klamkę lub mikropłytkę? * * Zachowujmy szeroko rozumiany porządek wokół siebie Dbajmy o reagenty: gdy to tylko możliwe, pipetujmy duże objętości na

33 małe alikwoty do jednorazowego użytku. Zmieniajmy tipsy dodając po sobie kolejne reagenty. Nigdy nie przelewajmy resztek z jednej buteleczki do drugiej, bo możemy zepsuć kolejną partię odczynnika lub buforu! 2. Odpowiednie pomieszczenia laboratoryjne są na wagę złota Jeżeli planujemy dopiero rozkład pomieszczeń laboratoryjnych, od początku miejmy na uwadze, że będziemy wykonywać w tych pomieszczeniach rożne etapy naszej pracy. Oddzielenie przestrzenne PCRu od reszty zadań laboratoryjnych jest najłatwiejszą i najskuteczniejszą bronią w walce z kontaminacją. Walczmy o każdą piędź ziemi z tymi, którzy finansują przedsięwzięcie, bo im więcej zainwestujemy w pomieszczenia, tym mniej stracimy na powtarzaniu nieudanych reakcji. To się zwróci- nie od razu, ale z cała pewnością. * Pomieszczenie, w którym będziemy trzymać nowe odczynniki, przygotowywać MIXy i bufory, DEPCować wodę, powinno być jak najbardziej oddalone od reszty pomieszczeń. Jest to pomieszczenie czyste. * Drugie pomieszczenie, które powinno oddzielać część brudną od czystej, to pomieszczenie biurowe/socjalne/sala komputerowa- miejsce na dokumentację, seminaria, pracę z komputerem itp. W nim w ogóle nie powinny znajdować się próbki ani reagenty. * Trzecie pomieszczenie to pomieszczenie brudne do preparatyki próbek. Ideałem byłoby, gdyby odbywała się tam tylko wstępna preparatyka próbek, izolacja DNA i RNA, ewentualnie katalogowanie i mrożenie analitów. * W ostatnim pomieszczeniu przygotowujemy PCR, rozcieńczamy matryce, puszczamy żele i utylizujemy materiał. Jest to najbardziej narażona na skażenie cześć laboratorium, idealny pokój tego typu jest całkowicie wyłożony kafelkami i powierzchniami zmywalnymi, odpornymi na silne utleniacze. Zamiast komory laminarnej (radzę sobie ją całkowicie odpuścić o ile nie pracujemy z próbkami o wysokim zagrożeniu biologicznym lub z mikrośladami!) radzę właśnie kafelki. Zero półek, zakamarków, tylko stół, krzesło, 1 zestaw pipet i nic poza tym. Wszystko powinno dać się odkazić po zakończonym dniu pracy! (czym odkażać? O tym będzie traktować druga część opracowania!) 3. Mit lampy UV