SPEKTROSKOPOWA IDENTYFIKACJA I ANALIZA ILOŚCIOWA BARWNIKÓW ANTOCYJANOWYCH ORAZ WPŁYW KOMPLEKSOWANIA METALAMI NA WIDMA ABSORPCYJNE

Transkrypt

1 SPEKTRSKPWA IDENTYFIKACJA I ANALIZA ILŚCIWA BARWNIKÓW ANTCYJANWYCH RAZ WPŁYW KMPLEKSWANIA METALAMI NA WIDMA ABSRPCYJNE Antocyjany (z greckiego: anthos kwiat, kyanos niebieski) są barwnikami roślinnymi należącymi do licznej rodziny rozpuszczalnych w wodzie flawonoidów. Występują głównie w wakuolach komórek epidermy i odpowiadają za wszystkie odcienie czerwonej lub niebieskiej barwy liści, kwiatów i owoców. Jesienią, liście zawdzięczają swoje przepiękne barwy antocyjanom i karotenom, gdyż wtedy nie są maskowane przez chlorofil. Antocyjany znaleźć można w roślinach kwiatowych, za wyjątkiem goździków, oraz niektórych mchach i paprotnikach. 2' 3' 4' H 7 8 1' 2 pierścień A pierścień B 6' 5' Rysunek 1. Budowa chemiczna antocyjanidyny. Termin antocyjany oznacza występującą naturalnie formę, która zawiera związane kowalencyjnie węglowodany, najczęściej monosacharydy (glukoza, galaktoza, ksyloza lub arabinoza) oraz di- lub trisacharydy. Głównym rdzeniem cząsteczki barwników antocyjanowych jest aglikon, zwany inaczej antocyjanidyną (Rysunek 1). Glikozydy antocyjanidyny to antocyjany. Pojedyncze cząsteczki antocyjanidyny różnią się między sobą podstawnikami (grupy hydroksylowe lub metoksylowe) przy pierścieniu B aglikonu w pozycji 3, 4 i 5 oraz rodzajem węglowodanów przyłączonych przy pierścieniu A w pozycji 3 i/lub 5 (Tabela 1). Różnorodność barwników naturalnych z tej grupy spowodowana jest również możliwością acetylowania antocyjanów kwasami organicznymi (octowym, kawowym lub bursztynowym) i tak np. barwnik występujący w pomarańczy to 3- acetyloglukozyd cyjanidyny. 1

2 Tabela 1. Naturalne antocyjanidyny najczęściej występujące w roślinach. Związek Podstawniki Barwa λ max, nm Występowanie (Rys. 1) przy ph = 1 (w Me) Cyjanidyna H czerwona różowa 535 jabłka, truskawki, czerwona kapusta, żurawina, czerwona cebula, maliny, czarny bez, winogrona, róża, czarne jagody, aronia, wiśnie, owoc róży, chaber bławatek, fiołek, mak polny Delfinidyna niebieska fioletowa 546 czarne jagody, czarny bez, hortensje, borówki, hibiskus, malwa, żurawina Malwidyna CH 3 CH 3 fioletowa 542 czarne jagody, malwa, borówka, winogrona, 530 truskawki, pelargonie, begonie, winogrona Pelargonidyna H H pomarańczowa łososiowa Peonidyna CH 3 H czerwona różowa 532 żurawina, piwonie, czarny bez, czarne jagody, Petunidyna CH 3 fioletowa 543 czarne jagody, petunie, winogrona Antocyjany są naturalnie występującymi wskaźnikami ph. W roztworze, przy ph = 1, występują w formie jonu oksoniowego o barwie czerwonej (kation flawyliowy), natomiast przy wartości ph powyżej 3 dominuje hemiacetalowa forma bezbarwna. Z kolei w roztworze o wyższym ph pojawia się forma chinoidowa, która charakteryzuje się barwą niebieską (Rysunek 2). W 1957 r. po raz pierwszy wyizolowano kompleks antocyjanów z magnezem z niebieskich kwiatów Komeliny pospolitej. Rok później, Bayer opisał strukturę kompleksu cyjaniny z metalem, wyekstrahowanego z kwiatów chabra bławatka. Kompleksowanie antocyjanów metalami (Rysunek 3), naturalnie występującymi w glebie lub dostarczanymi w postaci nawozów, powoduje zmianę barwy i przesunięcie maksimum absorpcji w kierunku dłuższych fal. Znane są kompleksy z jonami Mg 2+, Al 3+, Fe 3+, Sn 2+, Ca 2+. Reakcja z metalami zachodzi w kwaśnym środowisku, przy ph = 3.5 i wyższym, zbliżonym do warunków występujących w wakuolach komórek roślinnych, w których ph waha się od 2.5 do

3 H - H + /+H 2 H kation flawyliowy - barwny hemiacetal - bezbarwny + -H -H + H tautomeria forma chinoidowa - barwna forma chinoidowa - barwna Rysunek 2. Struktury antocyjanów w roztworze. M (n-1)+ H M n+ H - 2H + = alkil, sacharyd = H, alkil, sacharyd Rysunek 3. Schemat reakcji kompleksowania jonu flawyliowego metalem. 3

4 Barwniki antocyjanowe analizowane są najczęściej metodami spektrofotometrycznymi z uwagi na fakt, że charakteryzują się wysokim molowym współczynnikiem absorpcji, zwykle rzędu od dm 3 mol -1 cm -1. Przykładowe widmo elektronowe antocyjanów przedstawiono na Rysunku 4. Antocyjany w herbacie owocowej (Dzika róża z hibiskusem) 2 Absorbancja 1,5 1 0, długość fali, nm ph=1 ph=4.5 ph=4.5 z dod. Al(III) ph=8.3 ph=4.5 z dod. Sn(II) Rysunek 4. Widmo UV-vis antocyjanów i ich kompleksów z metalami. Przy oznaczaniu antocyjanów wykorzystuje się różnicę absorbancji roztworu przy ph=1 (forma barwna barwnika) i 4.5 (forma bezbarwna barwnika). Zawartość np.cyjanidyno- 3-glukozydu w próbkach wyznacza się korzystając z poniższych zależności: A = [ A ( ph.0) A ( ph1.0) ] [ A ( ph 4.5) A ( 4.5) ] 510nm 1 800nm 510nm 800nm ph A V Z(%) = M R 100% ε L m gdzie: A absorbancja A 510nm (ph 1.0) absorbancja roztworu przy λ = 510 nm i ph 1.0 A 510nm (ph 4.5) absorbancja roztworu przy λ = 510 nm i ph 4.5 A 800nm (ph 1.0) - absorbancja roztworu przy λ = 800 nm i ph 1.0 A 800nm (ph 4.5) - absorbancja roztworu przy λ = 800 nm i ph 4.5 M masa cząsteczkowa barwnika (M = dla cyjanidyno-3-glukozydu) ε molowy współczynnik absorpcji (ε = dla cyjanidyno-3-glukozydu, ph=1) L grubość kuwety, cm R współczynnik rozcieńczenia próbki V objętość próbki, ml m masa próbki, mg Z(%) zawartość procentowa antocyjanów w próbce 4

5 pis wykonania ćwiczenia. dczynniki: g płatków kwiatów (np. róże, tulipany, oprócz goździków) g owoców (np. wiśnia, malina, czarna jagoda, truskawka, czarna porzeczka) - bufory ph = 1, 4.5, roztwory soli metali: Al 3+, Sn 2+ - ziemia okrzemkowa (Celit), bibuła filtracyjna - woda destylowana Sprzęt: - moździerz - kolbki 100 ml, 25 ml - pipety wielomiarowe 5 ml, nasadki do pipet - pipety Pasteura - kolbka ssawkowa z lejkiem Büchnera/piankowym - zlewki Wykonanie ćwiczenia: dważoną ilość owoców lub kwiatów rozetrzeć w moździerzu, a następnie zalać 80 ml wody destylowanej i pozostawić na 10 min. Następnie odpipetować pipetą Pasteura roztwór przez watkę do kolby miarowej o pojemności 100 ml i uzupełnić wodą do kreski. Jeśli roztwór jest mętny, należy go przesączyć przez Celit lub gęstą bibułę filtracyjną. Pobrać 1 ml roztworu do kolbki o pojemności 25 ml i uzupełnić do kreski roztworem buforu o ph = 1, a następnie dobrze wymieszać. W podobny sposób przygotować roztwór o ph = 4.5 i ph =

6 Wykonać widmo UV-vis przygotowanych roztworów, stosując wodę destylowaną jako roztwór odniesienia. Następnie, wykonać widma po dodaniu do kuwety z roztworem o ph=4.5 paru kropli roztworu soli metalu. Na widmach odczytać absorbancję przy λ max i przy 800 nm. Jeśli absorbancja roztworu wynosi powyżej 1.0, należy wykonać widmo po odpowiednim rozcieńczeniu próbki. UWAGA!! W przypadku rozcieńczenia roztworu, należy zapisać krotność rozcieńczenia, gdyż współczynnik rozcieńczenia próbki R należy uwzględnić w obliczeniach. Przeprowadzić interpretację widm. bliczyć zawartość procentową antocyjanów w badanych próbkach (wynik przeliczyć na masę próbki). pracowanie wyników powinno obejmować następujące punkty: 1) Analiza widm wyznaczenie λ max poszczególnych pasm i wartości absorbancji. 2) kreślenie rodzaju barwnika występującego w próbce (w oparciu o dane z Tabeli 1). 3) Wyjaśnienie przyczyny obserwowanych różnic między widmami absorpcji poszczególnych form barwników, przy różnym ph próbki. 4) Wyjaśnienie wpływu metalu na przesunięcia pasm absorpcji. 5) znaczenie zawartości barwników antocyjanowych w badanej próbce. 6) Zaproponowanie równania reakcji powstawania kompleksów barwników obecnych w badanej próbce z metalami. 7) Wyjaśnienie wpływu ph gleby na barwę niektórych kwiatów, np. hortensji (interpretacja zjawiska w kontekście przyswajania metali przez rośliny). Zagadnienia teoretyczne: Spektroskopia UV/vis. Widma elektronowe związków organicznych. Chromofory i auksochromy. Przesunięcia batochromowe i hipsochromowe pasm absorpcji. Definicja 6

7 absorbancji i transmitancji, przeliczanie absorbancji na transmitancję. Prawa Lamberta-Beera i odchylenia od praw absorpcji. Interpretacja widm Abs=f(λ). Schemat budowy spektrofotometru. Flawonoidy. Antocyjany budowa chemiczna, występowanie, właściwości fizyko-chemiczne. Bibliografia: 1) R. Curtright, J. A. Rynearson, J. Markwell, J. Chem. Educ. 73, 4, 306, ) R. Curtright, J. A. Rynearson, J. Markwell, J. Chem. Educ. 71, 8, 682, ) W. Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, Warszawa, ) D. A. Skoog, D. M. West, F. J. Holler, S. R. Crouch, Podstawy chemii analitycznej, T. 2, PWN, Warszawa, ) INA method , 6) 7