Pomiar stężenia glutationu w płynie stawowym w różnych stanach fizjopatologicznych stawu kolanowego badanie pilotażowe

Transkrypt

1 diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics Diagn Lab 2015; 51(4): Praca oryginalna Original Article Pomiar stężenia glutationu w płynie stawowym w różnych stanach fizjopatologicznych stawu kolanowego badanie pilotażowe Measurement of synovial fluid glutathione concentration in various pathophysiological states of knee joint pilot study Michał Chmiel, Elżbieta Ciszek, Edward Golec, Mateusz Głowa Akademia Wychowania Fizycznego Kraków, Katedra Rehabilitacji Klinicznej Streszczenie Wprowadzenie. Glutation (GSH) jest złożonym z reszt kwasu glutaminowego, glicyny i cysteiny tripeptydem obecnym we wszystkich komórkach ludzkiego ciała. Największą jego zawartość stwierdza się w wątrobie, nerkach i soczewce oka. Od szeregu lat jest uznawany za jeden z podstawowych antyoksydantów biorących udział w neutralizacji reaktywnych form tlenu, takich jak wolne rodniki tlenowe czy nadtlenki. Cel badań. Celem pracy była ocena przydatności zmodyfikowanej metody Beutlera oznaczeń stężenia glutationu w płynie stawowym, pochodzącym od osób z chorobą zwyrodnieniową stawu kolanowego, osób po zabiegu artroskopii oraz osób z uszkodzeniem więzadła krzyżowego przedniego i/lub łąkotek. Materiał i metody. Badania przeprowadzono w grupie 36 osób z rozpoznaniem choroby zwyrodnieniowej lub z uszkodzeniem więzadeł, łąkotek i torebki stawowej, względnie po zabiegu rekonstrukcji więzadła krzyżowego przedniego i/lub meniscektomii. Pacjenci byli leczeni w Poradni Urazowej Szpitala Uniwersyteckiego im. Mikołaja Kopernika w Krakowie, 5-tym Wojskowym Szpitalu Klinicznym z Polikliniką w Krakowie oraz Szpitalu Ortopedycznym Ortopedicum w Krakowie. Glutation oznaczano według E. Beutler w modyfikacji własnej. Wyniki. Otrzymane wyniki badań wskazują na wyższe stężenia glutationu u chorych z chorobą zwyrodnieniową stawu kolanowego, co może być adaptacyjnym mechanizmem, mającym na celu ochronę chondrocytów przed zniszczeniem, wspomagając ich regenerację. Obecność krwinek czerwonych nie wpływała na zwiększenie poziomu GSH. Wnioski. Podwyższone stężenie GSH w płynie stawowym pochodzącym od osób z chorobą zwyrodnieniową stawu kolanowego może pełnić rolę antyoksydacyjną i obronną. Obserwowany brak zależności pomiędzy liczbą krwinek czerwonych w płynie stawowym a stężeniem GSH może wskazywać na uszkodzenia erytrocytów obecnych w płynie Summary Background. Glutathione(GSH) is a tripeptide which consists of glutamate, glicyne, cysteine. It can be observed in every cell of human body, however the biggest concentrarion of GSH is found in liver, kidneys and eye lens. For many years it is described as a one of major antioxidants, which plays important role in neutralising reactive oxygen species. Aim. The aim of this study was to assess usefulness of modified Beutler method to compare glutathione level is synovial fluid from patients with osteoarthrtitis, patients after artroscopy and patients with anterior cruciate ligament injury and/or injury of menisci Material. Research material consist of 36 patients diagnosed with knee osteoarthritis, ligaments, menisci and joint capsule ruptures or after crucial ligament reconstruction and/or meniscotomy. Patients were recruited from Univesity Hospital of Nicholas Copernicus in Cracow, 5th Army Hospital in Cracow and Orthopedic Hospital Ortopedicum in Cracow. Method. Glutation was marked according to E. Beutler in authors modification. Result. Higher glutathione levels were shown in knee osteoarthritis samples which might be adaptive mechanism, to protect chondrocytes and support their regeneration. Red blood cells appearance did not increase glutathione level. Conclusions. Increased glutathione level in samples from patients with osteoarthritis might be protection of chondrocities. Red blood cells appearance did not increase glutathione level what may suggest that they were damaged. Słowa kluczowe: Keywords: choroba zwyrodnieniowa, glutation, GSH, płyn stawowy glutathione, GSH, osteoarthritis, synovial fluid 291

2 Wstęp W warunkach fizjologicznych płyn stawowy okrywa cienką warstwą ściany jamy stawowej. Jej grubość w stawie kolanowym waha się w granicach 26 µm. Płyn ten jest mieszaniną składników osocza przenikających do jamy stawowej przez ściany naczyń krwionośnych błony maziowej oraz substancji wytwarzanych w stawie. Ilość płynu stawowego jest stale regulowana przez substancję podstawową, która ma cechy żelu i w sposób ciągły niejako zasysa składniki z osocza krwi. W skład substancji podstawowej wchodzi kwas hialuronowy i lumbrycyna, wytwarzane przez synowiocyty typu B budujące błonę maziową. W warunkach prawidłowych zwiększają one lepkość płynu oraz uszczelniają jamę stawową. Ruch w stawie wspomaga ten proces poprzez zwiększenie przepływu krwi i chłonki. Prawidłowy płyn stawowy jest bezbarwny lub słomkowy, przejrzysty, o ph 7,2-7,4 i nie stwierdza się w nim kryształów, ani innych dodatkowych substancji [1]. Staw kolanowy jest miejscem, w którym wielokrotnie dochodzi do przeciążeń. Wieloletnie ich powtarzanie może prowadzić do rozwoju choroby zwyrodnieniowej. Chociaż jest to głównie choroba chrząstki stawowej wpływa na funkcje stawu poprzez formowanie osteofitów, zwiększenie sztywności stawu, wzrost dolegliwości bólowych i zmniejszenie przejrzystości płynu [2]. Płyn stawowy w chorobie zwyrodnieniowej ma zwykle charakter niezapalny, poza niektórymi przypadkami, kiedy dochodzi do jej zaostrzenia, wówczas przy towarzyszącym odczynie zapalnym, możliwy jest spadek lepkości płynu i wzrost stężenia białka. Dochodzi też często do wzrostu liczby komórek w płynie, zwłaszcza leukocytów [1]. Jednorazowe oddziaływanie siły przekraczającej wytrzymałość tkanek może być przyczyną uszkodzeń więzadeł, łąkotek, struktur chrzęstnych, kostnych lub o charakterze mieszanym. Płyn pourazowy cechuje się krwistym zabarwieniem, zwiększoną ilością lipidów, które mogą utworzyć oddzielną warstwę na jego powierzchni. Nie notuje się zmian w stężeniu glukozy, natomiast liczba komórek w płynie jest niezwykle zmienna [1]. Pacjentom o nasilonych dolegliwościach bólowych, połączonych z wylewem krwi do stawu znaczącą ulgę przynosi punkcja stawu kolanowego. Pobranie płynu maziowego, oprócz w pewnym sensie znaczenia terapeutycznego tego zabiegu, pozwala na uzyskanie materiału przeznaczonego do badania w kierunku występowania kryształów, bądź oceny zakażenia [2]. Celem podjętych badań było porównanie stężenia glutationu oznaczanego zmodyfikowaną metodą Beutlera w płynie stawowym pobieranym od pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawu kolanowego (grupa I), osób po zabiegu arteroskopii (grupa II) oraz pacjentów z uszkodzeniem wiązadła krzyżowego przedniego i/ lub łąkotki (grupa III). Materiał i metody Próbki płynu stawowego uzyskano od 36 osób, leczonych w Poradni Urazowej Szpitala Uniwersyteckiego im. Mikołaja Kopernika w Krakowie, 5-tym Wojskowym Szpitalu Klinicznym z Polikliniką w Krakowie oraz Szpitalu Ortopedycznym Ortopedicum w Krakowie. Wiek badanych wahał się od 18 do 81 lat (średnio 47,1 lat). Płyn stawowy pobierał lekarz ortopeda ze stawu kolanowego techniką Brotzmana z dojścia podrzepkowego bocznego. Płyn stawowy (5-10 ml w zależności od stanu chorobowego) aspirowano do probówek z wersenianem potasu. Płyn w objętości większej niż 10 ml pobierano celem usunięcia wysięku przy dużych obrzękach jako działanie terapeutyczne. Komisja bioetyczna nie wyraziła zgody na pobieranie materiału od osób zdrowych. Pobrany materiał transportowano w temperaturze 2 0 C. W niniejszej pracy do uzyskania parametrów badawczych posłużono się metodą oznaczania glutationiu według Beutler [4] w modyfikacji własnej. Stosowana metoda była opracowana dla oznaczania stężenia glutationu w erytrocytach przemywanych, pełnej krwi lub osoczu, natomiast wprowadzona modyfikacja polegała na dwukrotnym wirowaniu płynu ze stawu kolanowego, z zachowaniem pozostałej procedury podanej przez autora. Probówki z płynem stawowym opisano oceniając jego klarowność i obecność krwi. Pobrany materiał wirowano z prędkością RPM przez okres 10 minut. Nadsącz w ilości 1 ml płynu mieszano z 1,5 ml płynu precypitującego (1,67 g skrystalizowanego kwasu metafosforowego, 0,2 g dwusodowego wersenianu i 30 g chlorku sodu w 100ml). Powstały roztwór wirowano w probówkach Eppendorfa z prędkością RPM przez 15 minut celem uzyskania większej ilości osadu, z którego wykonywano rozmaz, suszono i utrwalano w alkoholu metylowym. Komórki w rozmazie mimo wysokich obrotów zachowały prawidłowy kształt. 0,5 ml uzyskanego nadsączu mieszano w probówce z 2 ml 0,3 molarnego roztworu Na 2 HPO 4. Powstałą mieszaninę przenoszono do kuwetki, dokładnie mieszano i umieszczono w spektofotometrze, celem pomiarów absorbancji wobec dwóch ślepych prób. Pierwszą ślepą próbę stanowiła kuwetka z wodą destylowaną, natomiast drugą woda destylowana z dodatkiem 250 µl kwasu 5,5 -dithio- -2nitrobenzoesowego (DTNB). Zmierzoną wartość absorbancji A podstawiono do wzoru. Następnie dodano 250 µl DTNB do próbki badanej, dokładnie mieszano i po 10 minut powtarzano pomiary absorbancji A 1. Absorbancja była badana w czasie 20 sekund, przy długości fali 412 nm. Stężenie glutationu wyliczano na podstawie wzorów: 412 Δ A 1 A x (A1/13,6) x 5,5 µmol = stężenie GSH w kuwecie A1/13,6 = μmol w 1ml płynu stawowego (13,6 współczynnik dla DTNB) Wyniki Do grupy pierwszej zaliczono 12 pacjentów (tab. I) z chorobą zwyrodnieniową stawu kolanowego. Średni wiek osób badanych wyniósł w tej grupie 65 lat i 7 miesięcy, średnie stężenie glutationu 1,35±1,06 µmol/ml płynu stawowego. W trakcie badania mikroskopowego rozmazów płynów stawowych zauważono nieliczne kryształy i leukocyty. Poziom glutationu kształtował się w granicach 0,14 3,08 µmol/ml płynu. Do drugiej grupy (tab. II) włączono 12 badanych z uszkodzeniem łąkotek i więzadeł krzyżowych u których wykonano artroskopię oraz w trakcie badania w dwa tygodnie po zabiegu płyn stawowy był klarowny, bez domieszki krwi. Średni wiek pacjentów w tej grupie badanych wyniósł 38,4 lat, średnie stężenie glutationu wynosiło 0,47±0,22 µmol/ml płynu stawowego (zakres wahań 292

3 Diagn Lab 2015; 51(4): w granicach 0,09-0,85 µmol/ml płynu). Grupę II w analizie wyników przyjęto za kontrolną. Do trzeciej grupy badanych (tab. III) zakwalifikowano 12 osób, u których w płynie stawowym stwierdzono obecność śladów krwi. Średnia wieku w tej grupie wyniósła 37,3 lat a średnie stężenie glutationu wynosiło 0,44±0,14 µmol/ml (0,27-0,66 µmol/ml płynu). Na uwagę zasługuje fakt stosunkowo niskich stężeń GSH pomimo obecności krwinek czerwonych. Podczas analizy rozmazów płynów z domieszką krwi stwierdzono w polu widzenia pojedyncze erytrocyty i leukocyty. Nie wykazano jednak w płynach żadnych innych cech świadczących o ostrym stanie zapalnym. W grupie I w porównaniu do grupy II stwierdzano istotnie wyższe stężenie glutationu p=0,006 Brak było natomiast istotnych statystycznie różnic pomiędzy grupami III i II (p=0,35). Mogło to być spowodowane stosunkowo krótkim czasem po zabiegu operacyjnym i nie zakończeniem procesów gojenia w stawie kolanowym. Tabela I. Stężenie glutationu w płynie stawowym u chorych z chorobą zwyrodnieniową (grupa I). Płeć Wiek Stężenie glutationu [µmol/1ml płynu] Mężczyzna 47 0,82 Kobieta 50 3,08 Kobieta 55 0,22 Kobieta 64 1,34 Kobieta 66 0,74 Kobieta 66 3,53 Kobieta 67 0,14 Kobieta 67 2,08 Kobieta 70 0,77 Mężczyzna 74 1,07 Mężczyzna 81 1,67 Kobieta 81 0,73 Tabela II. Stężenie glutationu w płynie stawowym po artroskopii stawu kolanowego (grupa II). Płeć Wiek Stężenie glutationu [µmol/1ml płynu] Mężczyzna 18 0,09 Mężczyzna 18 0,44 Kobieta 25 0,49 Mężczyzna 26 0,45 Kobieta 31 0,51 Mężczyzna 34 0,80 Mężczyzna 40 0,85 Mężczyzna 41 0,57 Mężczyzna 51 0,39 Kobieta 57 0,52 Mężczyzna 59 0,47 Mężczyzna 60 0,11 Tabela III. Stężenie glutationu w płynie stawowym z domieszką krwi (grupa III). Płeć Wiek Stężenie glutationu [µmol/1ml płynu] Mężczyzna 25 0,61 Kobieta 29 0,66 Mężczyzna 31 0,66 Kobieta 33 0,29 Mężczyzna 34 0,44 Mężczyzna 35 0,27 Kobieta 37 0,42 Mężczyzna 40 0,29 Mężczyzna 41 0,47 Mężczyzna 43 0,29 Kobieta 48 0,49 Kobieta 51 0,39 Dyskusja Glutation (GSH) jest tripeptydem złożonym z reszt kwasu glutaminowego, glicyny i cysteiny, obecnym we wszystkich organizmach roślinnych i zwierzęcych, może występować w formie wolnej lub związanej z białkami. Uznawany jest za jeden z głównych antyoksydantów, biorących udział w neutralizacji reaktywnych form tlenu, takich jak wolne rodniki tlenowe czy nadtlenki [5]. W organizmie ludzkim obecny jest w każdej komórce, największą jego zawartość stwierdza się w wątrobie, nerkach i soczewce oka i jak wynika z naszych badań jest on także obecny w płynie stawowym. Wyniki przeprowadzonych badań wskazują na zmienność jego stężeń w zależności od stanu chorobowego i również w zależności od obecności krwi w płynie ze stawu kolanowego. W płynie stawowym pochodzącym od osób z chorobą zwyrodnieniową stężenia GSH wykazywały najwyższe wartości (średnie 1,35±1,06 µmol/ml płynu). Może być to związane z uszkodzeniem chondrocytów i kompensacyjnym napływem glutationu do płynu stawowego. Carlo i wsp. [6] zauważyli już, że chondrocyty częściej obumierają, gdy GSH ulega w nich wyczerpaniu lub gdy stwierdza się wysoki poziom glutationu utlenionego (GSSG). Jedną z przyczyn tego procesu wydaje się być zmieniona aktywność enzymów antyoksydacyjnych i peroksydacja lipidów, co prowadzi z kolei do degradacji kolagenu w chrząstce stawowej, a w konsekwencji do zaburzenia funkcji chondrocytów i zmiany ich fizykochemicznych właściwości. Może to powodować przyspieszone starzenie się tkanki chrzęstnej i w następstwie rozwój zmian zwyrodnieniowych [7]. W grupie badanych ze zmianami zwyrodnieniowymi stawu kolanowego przeważały osoby starsze, średnia wieku wyniosła 65,7 lat. Nie można wykluczyć, że u osób tych występowały choroby towarzyszące, które mogły wpływać na stężenie GSH w płynie stawowym, m.in. często spotykane u osób starszych nadciśnienie tętnicze. Badania wykazały znaczący wzrost stężenia GSH we krwi osób leczonych z powodu nadciśnienia w porównaniu do osób zdrowych w podobnym wieku [8]. Wykazano również, że szereg leków stosowanych w leczeniu nadciśnienia ma właściwości przeciwutleniające i zdolność do obniżania stresu oksydacyjnego [9, 10, 11, 12, 13]. Jakkolwiek z drugiej strony nie można jednak zakładać, że zwiększone stężenie GSH jest równoznaczne z obniżeniem stresu oksydacyjnego. Wysokie stężenie glutationu może być również efektem mechanizmu adaptacyjnego rozwijającego się w odpowiedzi na wyżej wymieniony stres, który pobudza syntezę endogennych antyoksydantów. Dodatkowo sugeruje się, że GSH może być również kumulowany w erytrocytach gdy jest nieodpowiednio wykorzystywany w komórkach [8]. 293

4 Stężenie GSH [µmol/1ml płynu] 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0, Numery prób w poszczególnych grupach Rycina 1. Wykres wartości stężeń glutationu w poszczególnym próbach. W badaniach Regan i wsp. [2] poziom GSH w płynie stawowym spadał wraz z wiekiem. Glutation w tych badaniach oznaczano metodą kolorymetryczną (Bioxytech GSH/GSSG 412 kit). Autorzy nie podają dokładnych wartości stężeń, zaznaczając jedynie, że GSH wykazywał zależność jedynie od wieku w obu badanych grupach(zmiany zwyrodnieniowe do osób poddanych zabiegowi artroskopii), natomiast GSSG wykazywał zależność od stadium choroby, wieku i BMI. Autorzy nie podają również danych dotyczących poziomu GSH u osób zdrowych. Sutipornpalangkul i wsp. [14] przeprowadzili badania w grupie 32 pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawu kolanowego. Do oznaczeń stężenia GSH w płynie stawowym stosowano metodę Andersona i wsp. Badania wykazały stężenie GSH u osób z chorobą zwyrodnieniową na poziomie 120,98±54,25 nmol/ml, a dla osób poddanych zabiegowi artroskopii 138,56±85,12 nmol/ml. Wyniki powyższej pracy pozostają w sprzeczności z wynikami badań Regan i wsp. [2] i z prezentowanymi naszymi wynikami, które wskazują na podwyższony poziom glutationu u chorych z choroba zwyrodnieniową [14]. Stosunkowo niskie stężenia glutationu obserwowano w płynach stawowych z domieszką krwi. Warto zaznaczyć, że erytrocyty zawierają aż 95% GSH znajdującego się we krwi [15, 16]. Możliwe jednak, że czerwone krwinki obserwowane pod mikroskopem w płynie stawowym są uszkodzone, a większość glutationu w nich zawartego mogła zostać utleniona do GSSG. Dla porównania rzędu wartości stężenia GSH, Beutler [4] podaje jako normę dla przemytych erytrocytów 6,51±1,04 µmol GSH/gHb, co odpowiada 68,5±10,8 mg/ghb. W naszych badaniach w grupie z domieszką krwi stężenie GSH wyniosło 0,44±0,14 µmol/ml. Istnieje wiele badań dotyczących poziomu glutationu we krwi, które donoszą o związanych z wiekiem zaburzeniach metabolizmu glutationu [17, 18]. Opinie na ten temat nie są jednoznaczne, część prac przedstawia informacje odnośnie spadku stężenia w krwi obwodowej GSH wraz z wiekiem, zwłaszcza po 45 r.ż. [19, 20, 21, 22], inne natomiast sugerują wzrost jego stężenia u osób starszych [11], bądź też o braku zauważalnych zmian w jego poziomie [23]. W niektórych z prac przypisuje się wysokiemu stężeniu GSH w osoczu wartość rokowniczą, związaną ze zmniejszoną zapadalnością na choroby chorób w trakcie starzenia się [24, 25]. Niewiele jest natomiast badań dotyczących poziomu GSH w płynie stawowym [2, 14]. Istotnym czynnikiem wpływającym na stężenie antyoksydantów, a w tym glutationu, w płynie stawowym wydaje się być dieta i nawyki żywieniowe. W badaniach epidemiologicznych wykazano odwrotną zależność pomiędzy przeciwutleniaczami przyjmowanymi w diecie, a rozwojem zmian zwyrodnieniowych [26, 27, 28, 29]. Michelet i wsp. [30] po przebadaniu ponad 200 dorosłych i ocenie stylu życia pod kątem grupa I grupa II palenia tytoniu, konsumpcji alkoholu, zażywania grupa III doustnych środków antykoncepcyjnych i regularnego wysiłku fizycznego doszli do wniosku, że na poziom glutationu we krwi mogą mieć istotny wpływ nawyki życiowych, a nie płeć czy wiek. Możliwe, że podobne zależności dotyczą także glutationu w płynie stawowym. Richie i wsp. [31] wykazali, że poziom GSH we krwi obwodowej wśród palaczy tytoniu jest wyższy niż wśród osób niepalących. Sugeruje to, że stężenie glutationu może być formą adaptacyjnej odpowiedzi organizmu na długotrwały stres oksydacyjny [32]. Być może podobny proces zachodzi u pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów. Wydaje się, że GSH może być czułym wskaźnikiem poziomu antyoksydantów zarówno w warunkach fizjologicznych jak i patologicznych. Omawiane badania wskazują na zależność między poziomem GSH we krwi obwodowej, a dietą, stylem życia i poziomem aktywności. Chociaż wyniki nie są jednoznaczne, można z dużą dozą prawdopodobieństwa założyć, że poziom glutationu w płynie stawowym jest również zależny od wyżej wymienionych czynników. Potrzeba jednak przeprowadzenia kolejnych, bardziej szczegółowych badań na większej liczbie osób, aby potwierdzić te przypuszczenia. Wnioski Podwyższone stężenie GSH w płynie stawowym, pochodzącym od osób z chorobą zwyrodnieniową kolana może potwierdzać jego rolę antyoksydacyjną i obronną na powierzchni chrząstki stawowej. Piśmiennictwo: 1. Zimmermann-Górska I, Białkowska-Puszczewicz G, Puszczewicz M. Atlas płynu stawowego, Wyd Lek PZWL, Warszawa, Regan EA, Bowler RP, Crapo JD. Joint fluid antioxidants are decreased in osteoarthritic joints compared to joints with macroscopically intact cartilage and subacute injury. Osteoarthritis Cartilage 2008; 16; Brotzman SB, Wilk KE: Rehabilitacja Ortopedyczna, Elsevier Urban & Partner, Wrocław, 2008; 395, Beutler E. Red Cell Metabolism. Edinburgh, New York: Churchill Livingstone, 1986, chapter 5, p Pompella A, Visvikis A, Paolicchi A, et al. The changing faces of glutathione, a cellular protagonist, Biochem Pharmacol 2003; 66; Carlo MD Jr, Loeser RF. Increased oxidative stress with aging reduces chondrocyte survival: correlation with intracellular glutathione levels. Arthritis Rheum 2003; 48(12); Surapaneni KM, Venkataramana G. Status of lipid peroxidation, glutathione, ascorbic acid, vitamin E and antioxidant enzymes in patients with osteoarthritis. Indian J Med Sci 2007; 61; Rybka J, Kupczyk D, Kędziora-Kornatowska K, et al. Glutathione-related antioxidant defense system in elderly patients treated for hypertension. Cardiovasc Toxicol 2011; 11; Ghiadoni L, Magagna A, Versari D, et al. Different effect of antihypertensive drugs on conduit artery endothelial function. Hypertension 2003; 41;

5 Diagn Lab 2015; 51(4): Grossman E. Does increased oxidative stress cause hypertension? Diabetes Care 2008; 31(2); Rodrigo R, Prat H, Passalacqua W, et al. Relationship between oxidative stress and essential hypertension. Hypertens Res 2007; 30; Ward NC, Hodgson JM, Puddey IB, et al. Oxidative stress in human hypertension: Association with antihypertensive treatment, gender, nutrition, and lifestyle. Free Radic Biol Med 2004; 36; Wassmann S, Wassmann K, Nickenig G. Modulation of oxidant and antioxidant enzyme expression and function in vascular cells. Hypertension 2004; 44; Sutipornpalangkul W, Morales NP, Charoencholvanich K, et al. Lipid peroxidation, glutathione, vitamin E, and antioxidant enzymes in synovial fluid from patients with osteoarthritis. Int J Rheum Dis 2009; 12; Constantin A, Constantinescu E, Dumitrescu M, et al. Effects of ageing on carbonyl stress and antioxidant defense in RBCs of obese Type 2 diabetic patient. J Cell Mol Med 2005; 9(3); Fang YZ, Yang S, Wu G. Free radicals, antioxidants, and nutrition. Nutrition 2002; 18; Liu H, Wang H, Shenvi S, et al. Glutathione metabolism during aging and in Alzheimer disease,ann N Y Acad Sci 2004; 1019; Rebrin I, Sohal RS. Pro-oxidant shift in glutathione redox state during aging. Adv Drug Deliv Rev 2008; 60; Favilli F, Marraccini P, Iantomasi T, et al. Effect of orally administered glutathione on glutathione levels in some organs of rats: Role of specific transporters. Br J Nutr 1997; 78; Gil L, Siems W, Mazurek B, et al. Age-associated analysis of oxidative stress parameters in human plasma and erythrocytes. Free Radic Res 2006; 40; Hagen TM, Wierzbicka GT, Bowman BB, et al. Fate of dietary glutathione: Disposition in the gastrointestinal tract. Am J Physiol 1990; 259; Liu RM, Dickinson DA. Decreased synthetic capacity underlies the age-associated decline in glutathione content in Fisher 344 rats. Antioxid Redox Signal 2003; 5; Kasapoglu M, Ozben T. Alterations of antioxidant enzymes and oxidative stress markers in aging. Exp Gerontol 2001; 36; Lang CA, Naryshkin S, Schneider DL, et al. Low blood glutathione levels in healthy aging adults. J Lab Clin Med 1992; 120; Lang CA, Mills BJ, Lang HL, et al. High blood glutathione levels accompany excellent physical and mental health in women ages 60 to 103 years, J Lab Clin Med 2002;140; McAlindon TE, Jacques P, Zhang Y, et al. Do antioxidant micronutrients protect against the development and progression of knee osteoarthritis? Arthritis Rheum 1996; 39; Olivieri O, Stanzial AM, Girelli D, et al. Selenium status, fatty acids, vitamins A and E, and aging: the Nove Study. Am J Clin Nutr 1994; 60; Yang W, Fu J, Yu M, et al. Effects of flaxseed oil on anti-oxidative system and membrane deformation of human peripheral blood erythrocytes in high glucose level. Lipids Health Dis 2012; 11; Zhang Y, Jordan JM. Epidemiology of osteoarthritis Rheum Dis Clin North Am 2008; 34; Michelet F, Gueguen R, Leroy P, et al. Blood and plasma glutathione measured in healthy subjects by HPLC: relation to sex,aging, biological variables, and life habits. Clin Chem 1995; 41; Richie JP Jr, Skowronski L, Abraham P, et al. Blood glutathione concentrations in a large-scale human study. Clin Chem 1996; 4; Hernanz A, Fernandez-Vivancos E, Montiel C, et al. Changes in the intr acellular homocysteine and glutathione content associated with aging. Life Sci 2000; 67; Adres do korespondencji: mgr Michał Chmiel Akademia Wychowania Fizycznego im. Bronisława Czecha w Krakowie Katedra Rehabilitacji Klinicznej, Pracownia Patologii Narządu Ruchu Kraków, al. Jana Pawła II 78 tel mail: michal.chmiel@outlook.com Zaakceptowano do druku:

6