Autoreferat przedstawiający opis dorobku i osiągnięć naukowych

Transkrypt

1 ZAŁĄCZNIK 2 Autoreferat przedstawiający opis dorobku i osiągnięć naukowych dr Aneta Strachecka Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie Wydział Biologii i Hodowli Zwierząt Katedra Biologicznych Podstaw Produkcji Zwierzęcej Zakład Biologii Eksperymentalnej i Środowiskowej Lublin 2015

2 1 Autoreferat A. Strachecka 1. POSIADANE DYPLOMY, STOPNIE NAUKOWE 2006r. Dyplom magistra biologii specjalność biochemia; Wydział Biologii i Nauk o Ziemi (obecnie Wydział Biologii i Biotechnologii), Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie Praca magisterska pt. Analiza systemu proteolizy kwaśnej powierzchni ciała owada społecznego pszczoły miodnej (Apis mellifera) 2010r. Stopień doktora nauk biologicznych w zakresie biologii; Wydział Biologii i Nauk o Ziemi (obecnie Wydział Biologii i Biotechnologii), Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie Praca doktorska pt. Proteazy i inhibitory proteaz na powierzchni ciała pszczoły miodnej (Apis mellifera) jako element odporności nieswoistej 2. INFORMACJE O DOTYCHCZASOWYM ZATRUDNIENIU W JEDNOSTKACH NAUKOWYCH Asystent w Katedrze Biologicznych Podstaw Produkcji Zwierzęcej, Wydział Biologii i Hodowli Zwierząt, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie do chwili obecnej Adiunkt w Katedrze Biologicznych Podstaw Produkcji Zwierzęcej, Wydział Biologii i Hodowli Zwierząt, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie 3. WSKAŹNIKI BIBLIOMETRYCZNE Moja praca naukowa rozpoczęła się już na studiach magisterskich w 2004 roku. Stopień doktora nauk biologicznych uzyskałam w 2010 roku. W ciągu 11 lat mojej działalności naukowej opublikowałam 46 (po uzyskaniu stopnia doktora - 41) oryginalnych prac naukowych i 9 (wszystkie po uzyskaniu stopnia doktora) prac przeglądowych. 37 z tych 55 prac (w tym 35 po uzyskaniu stopnia doktora) to prace z Impact Factor (zsumowany IF = 18,023). W moim dorobku znajduje się także 38 komunikatów konferencyjnych, 6 artykułów popularno-naukowych i 3 recenzje książek w czasopismach naukowych. Szczegółowy wykaz zawiera Zał. 1 - Wykaz opublikowanych prac naukowych lub twórczych prac zawodowych oraz informacja o osiągnięciach dydaktycznych, współpracy naukowej i popularyzacji nauki.

3 2 Autoreferat A. Strachecka 4. PROBLEMATYKA BADAWCZA PRZED UZYSKANIEM STOPNIA DOKTORA Badania realizowane przed uzyskaniem stopnia doktora można podzielić na dwa okresy; podczas studiów magisterskich (Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie) i podczas studiów doktoranckich (Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie) Okres studiów magisterskich W czasie studiów magisterskich, od 2004 do 2006 roku, byłam członkiem i jednocześnie prezesem Naukowego Koła Biochemików na Wydziale Biologii i Nauk o Ziemi Uniwersytetu Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie. W czasie wakacyjnych obozów naukowych pobierałam owady z Helu oraz z Dębna, a następnie określałam aktywności anty-entomopatogenne na powierzchni ich ciał. Wyniki zostały przedstawione na dwóch studenckich konferencjach w Wiśle i w Kazimierzu Dolnym. Jednocześnie, nie zdając sobie w pełni z tego jeszcze sprawy, rozpoczęłam kontynuowane do dziś badania nad mechanizmami biochemicznej odpowiedzi organizmów owadów na presję środowiska. Pracę magisterską pt. Analiza systemu proteolizy kwaśnej powierzchni ciała owada społecznego pszczoły miodnej (Apis mellifera) realizowałam w Zakładzie Biochemii na Wydziale Biologii i Nauk o Ziemi Uniwersytetu Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie, pod kierunkiem prof. dr hab. Krzysztofa Grzywnowicza uzyskując stopień magistra nauk biologicznych w roku W ramach tych badań określiłam aktywność kwaśnych proteaz (asparaginowych) i ich inhibitorów na kutikuli matek, robotnic i trutni A. mellifera, stawiając hipotezę, że pełnią one dużą rolę w systemie nieswoistej odporności kutikuli. Równocześnie uczestniczyłam w badaniach mających na celu wstępne określenie aktywności proteaz obojętnych i zasadowych oraz ich inhibitorów na powierzchni ciała u tych trzech kast pszczół. Moje zainteresowania zaczęły się koncentrować wokół biochemii A. mellifera, ze szczególnym uwzględnieniem, wtedy zupełnie nie poznanego, systemu proteolitycznego ich kutikuli Okres studiów doktoranckich Po uzyskaniu stopnia magistra nauk biologicznych, w latach , podjęłam i kontynuowałam studia doktoranckie na Wydziale Biologii i Hodowli Zwierząt Uniwersytetu Przyrodniczego w Lublinie, gdyż tam, w należącej do tego Uniwersytetu pasiece doświadczalnej, były szersze możliwości do prowadzenia badań na pszczołach A. mellifera. Kontynuowałam prace nad systemem proteolitycznym kutikuli pszczół. Moim opiekunem naukowym był prof. dr hab. Jerzy Demetraki-Paleolog. Moje zainteresowania naukowe w latach koncentrowały się na dwóch zagadnieniach: A) Kontynuowałam, rozpoczęte podczas studiów magisterskich, badania nad aktywnością enzymów proteolitycznych i ich inhibitorów na powierzchni ciała u robotnic A. mellifera. Związki te, opisane po raz pierwszy w pracy, której byłam współautorem, okazały się elementem systemu oporności nieswoistej u tej pszczoły (Zał. 1, II A poz. 26). Byłam

4 3 Autoreferat A. Strachecka wówczas współpomysłodawcą określenia the body-surface proteolytic system pszczół. Aktywność proteaz i ich inhibitorów, jak głosiły moje hipotezy robocze, zależy od kasty, stadiów preimaginalnych A. mellifera, a nawet od pór roku. Następnie postawiłam pytanie, jak zmienia się aktywność systemu proteolitycznego na kutikuli pszczół pod wpływem zanieczyszczeń środowiska. W celu udzielenia odpowiedzi na to pytanie, pobierałam jaja, larwy, poczwarki i imago robotnic A. mellifera z dwóch różnych środowisk: czystego (Nowiny, k. Lublina) i zanieczyszczonego - przy drodze szybkiego ruch (S17, Lublin). Okazało się, że silna presja środowiska spowodowana skutkami wzmożonego ruchu ulicznego i uprzemysłowieniem jest przyczyną niszczenia proteolitycznych barier ochronnych na powierzchni ciała pszczół, niezależnie od stadium rozwojowego i w konsekwencji osłabienia ich odporności nieswoistej (Zał. 1, II A poz. 25). Wyniki tych dwóch prac skłoniły mnie do poszerzenia badań: (1) o analizę systemu proteolitycznego kutikuli w kolejnych stadiach rozwoju robotnic, z naciskiem na stadia preimaginalne w określonych dniach rozwoju ontogenetycznego; (2) do sprawdzenia wpływu innych, tym razem antropogenicznych czynników środowiskowych, tj. akarycydy, środowisko bytowania [naturalne; - ul versus laboratoryjne; klatka], na procesy proteolityczne kutikuli robotnic; (3) w tamtym czasie, zupełnie nowymi były odkrycia z zakresu epigenetycznej regulacji ekspresji genomu, w tym próby określenia roli mechanizmów epigenetycznych w kształtowaniu odpowiedzi organizmu na różnorodne wpływy środowiska. Dlatego wzięłam udział, w prowadzanym we współpracy z ośrodkami z USA, badaniu wpływu niskocząsteczkowego przełącznika epigenetycznego fenyloacetyloglutaminianu sodu [PG] na ekspresję genów A. mellifera wzbogacając je o określenie wpływu PG na system proteolityczny kutikuli (poziom fizjologiczny). Wszystkie te prace zaowocowały obroną dysertacji doktorskiej, pt. Proteazy i inhibitory proteaz na powierzchni ciała pszczoły miodnej (A. mellifera) jako element odporności nieswoistej na Wydziale Biologii i Nauk o Ziemi Uniwersytetu Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie i uzyskaniem stopnia naukowego doktora nauk biologicznych w zakresie biologii (23 czerwca 2010). Wyniki badań przedstawione w pracy doktorskiej i publikacjach Zał. 1, IIA poz. 18, 21 oraz IID poz. 2, 7 wzbogaciły wiedzę o biochemicznych aspektach odporności nieswoistej A. mellifera o następujące, nowe treści: - na etapie larwy 1-4 dniowej, 8-dniowej oraz poczwarki i pszczoły gniazdowej (nest bee) aktywowane są elementy systemu proteolitycznego, które zabezpieczają te stadia przed patogenami, co wykazałam w testach in vitro aktywności przeciwgrzybowej i przeciwbakteryjnej. Najniższą aktywność proteolityczną obserwowałam u jajeczek, pszczół od wygryzienia do dwu dni po wygryzieniu i u pszczół lotnych zbieraczek (forager bee). U larw i poczwarek większość stanowiły białka hydrofilne, a u robotnic hydrofobowe. Białka hydrofobowe miały zarówno wyższe aktywności, jak i bardziej hamowały rozwój grzybów i bakterii, niż białka hydrofilne. Ponadto, potwierdziłam przewagę proteaz asparaginowych i serynowych na powierzchni ciała A. mellifera, ale także zaobserwowałam proteazy tiolowe i metalozależne, których dotychczas na powierzchni ciała pszczół nie opisano.

5 4 Autoreferat A. Strachecka - pospolicie stosowane chemioterapeutyki, jako nowy, antropogeniczny element pszczelego środowiska stworzony w skutek usiłowań zapobiegania ich wymieraniu, wywierają nadspodziewanie silny, destrukcyjny wpływ na aktywność proteolityczną powierzchni ciała robotnic. Spostrzeżenie to wzbogaciło wiedzę o przyczynach obserwowanego w wielu krajach spadku odporności pszczół. - chów laboratoryjny (środowisko klatki) wpływa destabilizująco, a niekiedy i supresyjnie, na aktywność systemu proteolitycznego na powierzchni ciała utrzymywanych w niej pszczół. Należy brać to pod uwagę przy interpretowaniu wyników testów klatkowych wykonywanych dla potrzeb weterynaryjnych i w doświadczeniach biologicznych. - podanie PG w stadium larwy, zwiększało stężenie białka ogólnego zmniejszając jednocześnie aktywność proteaz i ich inhibitorów na powierzchni ciała robotnic powstałych z tych larw w 4 6 tygodniu po podaniu PG i przepoczwarzeniu. Tym samym potwierdziłam, że PG, stosowane także w terapii antynowotworowej, jest bardzo aktywnym, długotrwale działającym, niskocząsteczkowym przełącznikiem epigenetycznym, a skutki jego działania (długoterminowy efekt epigenetyczny) są wyraźnie widoczne wśród białek powierzchni ciała pszczół, które otrzymywały pokarm z dodatkiem PG jeszcze w stadium larwy. B) Dodatkowym cyklem badawczym, który rozpoczęłam przed i kontynuowałam po uzyskaniu stopnia doktora, były prace związane z zależnymi od wieku zmianami elementów morfotycznych krwi i kluczowych wskaźników biochemicznych u ptactwa domowego, głównie kur i indyków (Zał. 1, II D, poz. 11, 12). W zakresie mojej odpowiedzialności były badania biochemiczne. Zespoły zajmujące się apiologią i ptactwem domowym wchodzą w skład Zakładu Biologii Eksperymentalnej i Środowiskowej, którego jestem pracownicą, więc podjęcie takiej współpracy wyłoniło się w sposób naturalny, dając szersze możliwości wykorzystania moich umiejętności biochemicznych. Ważnym aspektem tego okresu mojej działalności naukowej było poszerzenie profilu badawczego zespołu apidologicznego Uniwersytetu Przyrodniczego w Lublinie. Przed moim do niego dołączeniem, zajmował się on biologią behawioralną, środowiskową oraz genetyką i hodowlą pszczół. Nie zajmował się natomiast fizjologią i biochemią tych owadów. Mój wkład polegał na wniesieniu metodologicznego know-how oraz wkładu intelektualnego do planowania i prowadzenia doświadczeń z zakresu biochemicznych aspektów biologii środowiskowej A. mellifera. W konsekwencji rozwinęłam laboratorium umożliwiające wykonywanie analiz biochemicznych materiału pozyskanego od pszczół. Ponadto, zmodyfikowałam metody (w tym warunki konkretnych reakcji) określania aktywności enzymów proteolitycznych i ich inhibitorów stricte dla pszczół. Można to traktować jako element nowatorski i mój skromny wkład do poszerzenia wiedzy o metodach analitycznych u A. mellifera. Było to możliwe nie tylko dzięki ukończonym przeze mnie studiom o profilu biochemicznym, ale przede wszystkim dzięki doświadczeniu jakie zdobyłam jeszcze w latach , podejmując pracę oraz praktyki w akredytowanych laboratoriach analitycznych różnych branż przemysłu (Załącznik 3) i odbyciu szeregu specjalistycznych kursów zawodowych (Załącznik 5).

6 5 Autoreferat A. Strachecka 5. PROBLEMATYKA BADAWCZA PO UZYSKANIU STOPNIA DOKTORA 5.1. GŁÓWNE OSIĄGNIĘCIE NAUKOWE Prace badawcze po uzyskaniu stopnia doktora nauk biologicznych można podzielić na dwa obszary. Pierwszy, związany z biochemicznymi mechanizmami obronnymi organizmu A. mellifera będący głównym kierunkiem moich zainteresowań i drugi, do którego zaliczam pozostałe prace badawcze. Pierwszy obszar badawczy, zaowocował cyklem publikacji, które łącznie zatytułowałam: Wzbogacenie wiedzy o biochemicznych barierach obronnych i epigenetycznej odpowiedzi Apis mellifera na niektóre czynniki środowiska, przedstawionym do oceny osiągnięć naukowych zgodnie z art. 16, ust. 2 Ustawy z dnia 18 marca 2011 r. o zmianie ustawy Prawo o szkolnictwie wyższym, ustawy o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki oraz o zmianie niektórych innych ustaw (Dz. U. z 2011 r. Nr 84, poz. 455) Omówienie celu naukowego i wyników prac wymienionych jako osiągnięcie naukowe wraz ze wskazaniem ich ewentualnego wykorzystania Osiągnięcie naukowe stanowi cykl sześciu oryginalnych publikacji naukowych opublikowanych w latach w czasopismach znajdujących się w bazie Journal Citation Reports (Zał. 1, IB, poz. 1-6). Sumaryczny impact factor (zgodny z rokiem opublikowania) tych pozycji wynosi 6,295 a sumaryczna liczba punktów MNiSW to 110. We wszystkich sześciu publikacjach jestem autorem pierwszym i korespondencyjnym. a) Kierunki badań realizowane w ramach osiągniecia naukowego Na wybór kierunków badań będących przedmiotem prac w ramach osiągnięcia naukowego wpływ miały następujące wydarzenia: zmapowanie genomu pszczoły A. mellifera, co umożliwiło pełniejszą interpretację zjawisk fizjologicznych; pojawienie się światowego problemu określanego jako wymieranie albo nagła depopulacja rodzin pszczelich (CCD, CDS), za które odpowiedzialnością obciążano cywilizacyjne czynniki antropogeniczne i malejącą odporność A. mellifera na presję tak zmienianego środowiska. W naukach biomedycznych pojawiły się próby wykorzystania pszczoły miodnej jako organizmu modelowego do badań procesów starzenia i epigenetycznych, co stworzyło potrzebę poszerzenia wiedzy o jej biochemii. Podstawy do podjęcia badań stworzyły wyniki przedstawione w trzech pracach mojego współautorstwa opublikowanych po uzyskaniu stopnia doktora. W pierwszej z nich, która częściowo zawierała wyniki pracy doktorskiej, wykazałam (Zał. 1, II A, poz. 14), że promowany w krajach zachodnich, jako mało-szkodliwy lek naturalny, kwas mrówkowy używany przeciw Varroa destructor jest przyczyną niszczenia proteolitycznych barier ochronnych na powierzchni ciała pszczół. V. destructor są najgroźniejszymi w skali całego świata pasożytami A. mellifera, które w razie braku skutego przeciwdziałania powodują śmierć rodziny. Wykazałam, że aktywność obronnego systemu proteolitycznego kutikuli zmniejsza się wraz z długością działania kwasu

7 6 Autoreferat A. Strachecka mrówkowego, ale nie w sposób prosty, lecz zależnie od stadium rozwojowego pszczoły i sub-kasty. Osłabiając system proteolityczny okrywy ciała, kwas mrówkowy ułatwia wnikanie innych patogenów. Między innymi tworzy on środowisko sprzyjające do rozwoju grzybów (ph kwaśne), co potwierdziły testy z entomopatogenami nieswoistymi, np. Candida albicans, Aspergillus niger. Patogeny są ważnym elementem środowiska, a wyścig zbrojeń patogen-gospodarz, w tym jego aspekty biochemiczne, są jednym z kluczowych zagadnień biologii. Człowiek, zwalczając patogeny ingeruje w ten wyścig w znaczący sposób. Dlatego w drugiej pracy (Zał. 1, IIA, poz. 12), zdecydowałam się na zbadanie wpływu związków powszechnie używanych przeciw V. destructor na wtórne zakażenia pszczół miodnych innymi patogenami. Te biologicznie aktywne związki stały się pospolitym elementem środowiska wewnątrz rodziny pszczelej w związku z próbami przeciwdziałania zjawiskom wymierania i depopulacji rodzin pszczelich (colony collapse disorder / colony depopulation syndrom). W tym przypadku, stosowaną na całym świecie chemioterapię, zdecydowałam się potraktować jako specyficzny przejaw antropopresji. Wykazałam, że u pszczół chemioterapia niszczy bariery obronne organizmu i sprzyja zakażeniom; grzybami w przypadku kwasów organicznych oraz bakteriami w przypadku amitrazu {N,N'-(metyloiminodimetylideno)bis-2,4-ksylidyna / N,N-bis[(2,4- dimetylofenylo)iminometylo] metyloamin}. Dodatkowo, w trzeciej pracy (Zał. 1, IIA poz. 13) udowodniłam, że wzrastająca aktywność metaloproteaz na powierzchni ciała pszczół jest wskaźnikiem rosnącego zanieczyszczenia środowiska. Wyniki tych prac skłoniły mnie do postawienia następujących pytań, na które próbowałam odpowiedzieć w pracach określonych mianem osiągniecia naukowego: - jakie inne, poza systemem proteolitycznym związki, znajdują się na powierzchni ciała pszczół miodnych i czy ich poziom jest stały, czy zależy od takich czynników jak wiek albo przynależność do grupy genetycznej (podgatunek/rasa)? - czy antybiotyki działają w podobny sposób na organizmy pszczół jak akarycydy? - jak, w odróżnieniu od związków działających supresyjnie/inhibująco, związki uważane za biostymulatory będą wpływać na biochemiczne mechanizmy obronne i wskaźniki fizjologiczne organizmów pszczół miodnych? - co dzieje się wewnątrz organizmu pszczoły po podaniu niektórych biostymulatorów? Jak zmienia się aktywność systemów odpowiedzialnych za biochemiczną odpowiedź i biochemiczne mechanizmy obronne organizmu pszczół? Czy odpowiedź organizmu owada jest porównywalna do lepiej poznanej odpowiedzi organizmu ssaka? - czy biostymulatory, podobnie do związków szkodliwych, mogą wpłynąć na mechanizmy wyciszania genów w drodze metylacji DNA u A. mellifera? - skoro poziom globalnej metylacji DNA zmienia się w odpowiedzi na bodźce środowiskowe a rodzina pszczela jest układem eusocjalnym, to jak zmienia się poziom globalnej metylacji DNA u różnych stadiów preimaginalnych matek, trutni i robotnic A. mellifera? Postawienie tych pytań i chęć udzielenia na nie odpowiedzi doprowadziły do sformułowania konkretnych zagadnień badawczych.

8 7 Autoreferat A. Strachecka b) Zagadnienia rozpatrywane w ramach osiągnięcia naukowego 1) Zdecydowałam się poszerzyć i dalej rozwijać prace nad związkami na kutikuli robotnic A. mellifera. Poza dotychczasowymi badanymi (proteoliza), zainteresował mnie poziom innych związków na powierzchni ciała robotnic, np. estrów, węglowodorów itp. Oprócz systemu proteolitycznego mogą one stanowić składniki biochemicznego systemu obronnego pszczelich organizmów. 2) Szczególną uwagę zwróciłam także na zmiany stężeń białek na kutikuli pod wpływem antybiotyku. 3) Skoro czynniki antropogeniczne powodują spadek odporności pszczół miodnych, to w takiej sytuacji lepiej jest stymulować własne bariery obronne organizmu niż leczyć choroby wywołane ich osłabieniem. Nauki biomedyczne także zwracają się w stronę biostymulatorów, szczególnie pochodzenia naturalnego. Dlatego zdecydowałam się na rozpoczęcie zupełnie nowych prac nad fizjologicznymi skutkami podania substancji, które działając protekcyjnie lub biostymulująco, mogą zwiększać biochemiczne bariery obronne organizmu pszczół i tym samym przeciwdziałać destrukcyjnej presji środowiskowej. 4) Postanowiłam wzbogacić o nowe treści wiedzę z zakresu fizjologii owadów, a w szczególności o mechanizmach kształtowania ich odpowiedzi biochemicznej na różne bodźce środowiskowe. Dlatego rozszerzyłam znacznie zakres moich prac na badania kluczowych systemów biochemicznych związanych z odpornością/opornością i procesami starzenia (np. system antyoksydacyjny), tym razem jednak nie tylko na powierzchni ciała, ale przede wszystkim w hemolimfie pszczół. Badania hemolimfy należy traktować jako zupełnie nowy (po uzyskaniu stopnia doktora) element moich działań. 5) Interpretowanie wyników biochemicznych poszerzyłam dodatkowo o analizy ogólnej metylacji pszczelego genomu, gdyż zmiany jej poziomu są uważane za jeden z mechanizmów odpowiedzi organizmu na presję środowiskową. c) W jakim zakresie najważniejsze wyniki poszczególnych prac wymienionych jako osiągnięcie naukowe wzbogaciły wiedzę z zakresu fizjologii / biochemii pszczoły miodnej? Zał. 1, IB, poz. 5 - W kutikuli pszczół, jako pierwszej linii obronnej organizmu, zachodzi wiele procesów biochemicznych, np. melanizacja, sklerotyzacja, chitynizacja, które związane są z reakcjami zachodzącymi w hemolimfie. W większości przypadków nośnikiem związków pomiędzy hemolimfą a kutikulą są lipoforyny związane z węglowodorami. Na kutikuli znajdują się białka (w tym, przebadane i opisane przez mnie, proteazy i inhibitory proteaz), lipidy, węglowodory, estry i fenole, które pełnią różne funkcje, od feromonów aż po ochronę przed niekorzystnymi czynnikami. Autorzy większości prac koncentrowali się na określeniu jednej grupy związków na kutikuli pszczół, np. tylko na alkanach. Dlatego wzbogacającym istniejącą wiedzę było opisanie procentowego udziału poszczególnych grup związków (line alkanes, branched alkanes, methyl alkanes, alkenes, esters, phenols) w kontekście wpływów środowiskowych i genetycznych. Co więcej, związki te badałam w dwu różnych grupach genetycznych na

9 8 Autoreferat A. Strachecka kutikulach robotnic 1-dniowych, potraktowanych tutaj jako osobniki bardzo młode, które nie miały styczności ze środowiskiem zewnętrznym (poza-ulowym), oraz robotnic lotnych, potraktowanych jako osobniki fizjologicznie stare, mające kontakt ze środowiskiem pozaulowym. Okazało się, że robotnice 1-dniowe, niezależnie od grupy genetycznej, miały więcej alkenów w porównaniu z robotnicami lotnymi. Może to być jeden ze wskaźników odpowiedzi organizmu na presję środowiskową. Wykazałam, że na kutikuli pszczół znajduje się 17 typów alkanów (C17-C33), 13 alkenów (C21-C33), 21 estrów (C12-C32) i fenole (C14). Ponadto, wg mojej wiedzy, jest to jedyna praca, która wykazuje, że pszczoły zlokalizowane w tej samej pasiece, ale należące do różnych grup genetycznych (podgatunek/rasa syntetyczna), różnią się poziomem i aktywnością związków na powierzchni ciała (białka, estry, węglowodory, fenole). Przy okazji wykazałam, że związkiem, który w przyszłości może być traktowany jako marker różnicujący linie genetyczne czyste jest alken C33, który występuje tylko u robotnic kaukaskich. Moje badania nad zmiennością związków na powierzchni ciała pszczół miodnych zasugerowały mechanizm powodujący, że kutikule robotnic z różnych grup genetycznych mogą być w różnym stopniu podatne na zakażenia patogenami. Koresponduje to z obserwacjami terenowymi, dokonywanymi podczas powszechnego dziś transferu pszczół na nowe terytoria, wskazującymi np. na różną podatność różnych podgatunków A. mellifera na grzybice. Spostrzeżenia o genetycznej zmienności aktywności systemu proteolitycznego kutikuli w odpowiedzi na presję środowiska, wnoszą nowe treści do wiedzy o roli proteolizy powierzchniowej, jako nieswoistej bariery ochronnej. Jest to ważny przyczynek do zrozumienia ewolucji systemów odporności pszczół miodnych i cenna wskazówka dla działań hodowlanych u A. mellifera. Rozwijając ww. badania wniosłam skromny wkład w rozwój metod analitycznych. Aby pokazać spektrum różnych grup związków na kutikuli żywych pszczół opracowałam metodę odpowiedniego ich zabezpieczania, tak aby nie naruszyć sondy chromatografu oraz warunków niezbędnych do zobrazowania widm związków za pomocą chromatografii gazowej ze spektrometrem mas GCQ. Metoda polega na umieszczeniu pszczół w fiolce z siateczkowym, nie wykazujący widma ogranicznikiem, nad którym poprzez nakrętkę wkłada się sondę chromatografu. Zał. 1, IB, poz. 6 - Kluczowym dla medycyny jest pozyskiwanie nowych, skutecznych antybiotyków, a poszerzanie wiedzy o ubocznych skutkach ich podawania jest ważne dla nauk biomedycznych i weterynaryjnych. W kontekście tych skutków oraz powszechności stosowania, antybiotyki mogą być traktowane jako wyjątkowo aktywny, antropogeniczny czynnik środowiskowy. Takim szkodliwym, lecz użytecznym w medycynie antybiotykiem jest amfoterycyna-b. Amfoterycyna-B jest organicznym związkiem chemicznym, wytwarzanym przez bakterie z rodzaju Streptomyces. Zawiera pierścień makrocykliczny zbudowany z fragmentu polienowego oraz polihydroksylowego, co umożliwia walkę z zakażeniami grzybowymi, głównie przy AIDS i w transplantologii. Lek działa poprzez interakcję z ergosterolami błon komórek gospodarza. Efektem jest zaburzenie integralności błony komórkowej, co powoduje wypływ jonów potasowych, oraz innych składników wewnątrzkomórkowych, oraz napływ składników zewnątrzkomórkowych, co skutkuje lizą

10 9 Autoreferat A. Strachecka komórki. Poza tym, u ssaków, amfoterycyna-b powoduje wzrost wydzielania cytokin, oraz pobudza makrofagi do wytwarzania wolnych rodników. Skutkiem ubocznym jest tworzenie przez nią agregatów, które odkładają się w tkankach miękkich i powodują wiele zaburzeń. Amfoterycyna-B, przed przystąpieniem Polski do Unii Europejskiej (Dyrektywa UE nr 2377/90), była wykorzystywana w pasiekach do zwalczania grzybicy otorbielakowej i Nosema spp. Zważywszy na globalny problem z mikozami u ludzi i pszczół oraz że w niektórych przypadkach pszczoły miodne są traktowane jako organizmy modelowe, sprawdziłam działanie amfoterycyny-b na długość życia, poziom globalnej metylacji DNA, stężenie białek na powierzchni ciała i tworzenie agregatów w ciele robotnic A. mellifera. Wykazałam, że amfoterycyna-b skraca życie pszczół, jednocześnie tworząc agregaty w jelicie grubym robotnic, podobnie jak to się dzieje w wątrobie kręgowców. Nagromadzenie takich złogów jest bardzo szkodliwe dla organizmu i może przyspieszać procesy starzenia. Bardzo niskie wartości poziomu metylacji genomu u pszczół, którym podawano amfoterycyne-b wskazują, że amfoterycyna-b destabilizuje układ metylowania genów, najprawdopodobniej poprzez zachwianie równowagi pomiędzy metylacją / demetylacją aktywnych genów i junk DNA. Amfoterycyna powodowała też rozregulowanie biochemicznych barier ochronnych na powierzchni ciała pszczół, na co mogą wskazywać wysokie wartości stężeń białek. Wszystkie te wyniki istotnie wzbogacają wiedzę o ubocznych, biologicznych skutkach pobierania antybiotyków przez organizm, wskazując nie tylko na ich toksyczność/szkodliwość, ale także na powodowanie niekorzystnych zmian w epigenetycznym systemie regulacji ekspresji genów. Novum tej pracy jest również opracowanie techniki umożliwiającej wizualizację amfoterycyny w odwłoku żywej pszczoły z zastosowaniem systemu Faxitron MX-20. Dotychczasowe metody umożliwiały taką wizualizację dopiero po uśmierceniu owada. Metoda ta polega na krótkim uśpieniu owada i prześwietleniu go wiązką promieni (X-ray). Dokładny opis tej metody nie jest przedstawiony w omawianej pracy, gdyż będzie ona przedmiotem przygotowywanego wniosku patentowego. Ponadto, byłam współ-pomysłodawcą metody umożliwiającej wizualizację żywych (bez zniekształceń) tkanek, układów (w tym przypadku przewodu pokarmowego), w której natychmiast po dekapitacji odwłoka stosowano techniki podtrzymujące życie i normalne funkcjonowanie narządów/tkanek (wykorzystywane również w transplantologii u ssaków), a następnie wykonywano zdjęcia, pomiary itp. Metodę tą z powodzeniem zastosowałam w praktyce. Metoda ta również będzie przedmiotem przygotowywanego wniosku patentowego. Niniejszych metod nie omawiam szczegółowiej w autoreferacie ze względu na procedury patentowe. Uważam je za mój istotny wkład do rozwoju metod analitycznych związanych z fizjologią pszczół. Zał. 1, IB, poz. 1, 3 i 4 - W warunkach szkodliwej, obniżającej odporność, presji środowiska ważną rolę odgrywają biostymulatory, a szczególnie poznanie mechanizmów ich działania na poziomie biochemicznym. Do swoich badań wybrałam kofeinę, koenzym Q10 i kurkuminę, które działają protekcyjnie i biostymulująco na ssaki. Kofeina jest alkaloidem purynowym, który działa głównie jako antagonista receptorów adenozynowych i przez to jest najbardziej popularnie stosowaną substancją o działaniu psychoaktywnym. Kofeina stymuluje działanie ośrodkowego układu nerwowego oraz zwiększa metabolizm i

11 10 Autoreferat A. Strachecka jako taka jest używana zarówno w celach konsumpcyjnych oraz leczniczych. Koenzym Q10 (ubichinon) jest chinonem, prowitaminą rozpuszczalną w lipidach, występującą naturalnie w mitochondriach. Jest odpowiedzialny za przenoszenie elektronów w łańcuchu oddechowym i tym samym uczestniczy w wytwarzaniu ATP. Koenzym Q10 jest suplementowany głównie przy kardiomiopatiach, chorobach neurodegeneracyjnych i związanych z deficytem CoQ10. Z kolei kurkumina jest fenolem, immunostymulantem i antyoksydantem o szerokich właściwościach terapeutycznych, antynowotworowych i antymikrobiologicznych. Każdy z tych związków ma udowodnione działanie stymulujące na organizm człowieka i od dawna były one wykorzystywane w medycynie ludowej do zwalczania wielu chorób. Ponieważ, jak wcześniej wspomniałam, dużym, ogólnoświatowym problemem jest obniżanie się odporności pszczół, postanowiłam sprawdzić, jaki wpływ mają te substancje, podawane per os, na te charakterystyki biochemiczne hemolimfy pszczół, które są powiązane z odpornością, opornością i procesami starzenia. Postawiłam hipotezy, że 1) biostymulatory wpływają na mechanizmy biochemicznej obronności/odporności organizmu pszczół miodnych, i tym samym ograniczają rozwój patogenów, na przykładzie Nosema spp.; 2) biostymulatory wydłużają życie pszczół; 3) biostymulatory wpływają na mechanizmy epigenetyczne u pszczół, szczególnie na poziom globalnej metylacji DNA. Badając mechanizmy oporności nieswoistej na kutikuli pszczół zaczęłam się zastanawiać jak funkcjonuje system proteolityczny wewnątrz organizmu, np. w hemolimfie pszczół. Czy jego aktywność, tak jak na powierzchni ciała, zmienia się także wraz z wiekiem robotnic i pod wpływem czynników środowiskowych, np. biostymulatorów. W literaturze przedstawiono działanie proteaz i ich inhibitorów na aktywowanie/inhibowanie wielu procesów metabolicznych, np. aktywowanie zymogenów, uwalnianie hormonów i fizjologicznie aktywnych białek, itp. Jednak literatura dotycząca pszczół koncertowała się głównie na procesach zachodzących w przewodzie pokarmowym, jadzie i relacjach dotyczących pasożyt-gospodarz (na przykładzie V. destructor pszczoły). Inhibitory proteaz serynowych oraz elementy układu antyoksydacyjnego stymulują aktywowanie kaskady fenolooksydazy, która uczestniczy przede wszystkim w procesach odpornościowych i morfogenetycznych. Ważne, że system proteolityczny wspomaga działanie systemu antyoksydacyjnego, unieczynniającego wolne rodniki. U ssaków, w wyniku procesów antyoksydacyjnych gromadzą się oksydacyjnie uszkodzone białka tworzące bezużyteczne agregaty w komórkach. Enzymy proteolityczne rozpoznają i degradują te uszkodzone białka, przez co zabezpieczają przed tworzeniem i akumulacją proteinowych agregatów, łagodząc skutki stresu oksydacyjnego. Założyłam, że podobne mechanizmy zachodzą w organizmach pszczół, i systemy proteolityczny i antyoksydacyjny w ich hemolimfie współdziałają ze sobą. W przemianach białek w organizmie uczestniczą biomarkery, tj. ALT, AST, ALP. ALT katalizuje odwracalną reakcję przenoszenia grupy γ-aminowej L-alaniny na α-ketoglutaran z wytworzeniem kwasu pirogronowego i L-glutaminianu. AST ułatwia przemianę asparaginianu i α- ketoglutaranu do szczawiooctanu i glutaminianu. ALP uczestniczy w katalizowaniu defosforylacji różnych estrów fosforanowych, nukleotydów i białek. Enzymy te pośrednio lub/i bezpośrednio uczestniczą w przemianach podczas syntezy ATP, przemianach

12 11 Autoreferat A. Strachecka węglowodanów i białek, a ponadto znane są jako markery różnych stanów fizjologicznych i patologicznych u ssaków. W tamtym czasie była znana tylko jedna praca (Sapcaliu, A., Pavel, C., Savu, V., Căuia, E., Matei, M. and Rădoi, I Biochemical and cytological investigations on haemolymph of Apis mellifera carpathica bee in stressful conditions. Bulletin UASVM Animal Science and Biotechnologies 67: ), w której przedstawiono zmiany tych enzymów pod wpływem czynnika stresogennego u pszczół. W związku z tym założyłam, że biomarkery są także elementem systemu biochemicznej obrony organizmu pszczół i współdziałają z systemem proteolitycznym i antyoksydacyjnym. Należy tutaj wspomnieć, iż w dotychczasowych pracach z zakresu apidologii nie znalazłam próby połączenia poszczególnych tych systemów w funkcjonalną całość i łącznego zbadania współzależności pomiędzy nimi. Moje badania obrazujące aktywności/stężenia ALT, AST, ALP oraz systemów proteolitycznego i antyoksydacyjnego są więc pierwszym etapem, który w przyszłości umożliwi poznanie modelu funkcjonowania pełnego mechanizmu obrony biochemicznej A. mellifera w połączeniu z innymi białkami, hormonami, itp. Z moich badań wynika, iż kofeina (Zał. 1, I B, poz. 3), koenzym Q10 (Zał. 1, I B, poz. 4) i kurkumina (Zał. 1, IB, poz. 1) wydłużają życie A. mellifera i ograniczają rozwój Nosema spp. potraktowanej tu jako powszechny, specyficzny entomopatogen (grzyb) wskaźnikowy. Wykazałam także, że kofeina, koenzym Q10 i kurkumina zwiększają aktywność pszczelego systemu antyoksydacyjnego i proteolitycznego oraz stężenie/aktywność biomarkerów enzymatycznych w nieoczekiwanie wysokim stopniu. Cennym i poszerzającym wiedzę o fizjologii owadów spostrzeżeniem było stwierdzenie odwrotnych mechanizmów aktywowania biomarkerów enzymatycznych (tj. AST, ALT, ALP) u pszczół w porównaniu do ludzi. Pojawienie się czynnika chorobotwórczego u człowieka powoduje wzrost aktywności tych biomarkerów, natomiast u pszczół jej spadek (w tym przypadku model mechanizmu czeka na opracowanie). Z kolei kofeina, koenzym Q10 i kurkumina obniżają aktywność AST, ALT, ALP u ludzi, a u pszczół ją podwyższają. Wiedza o funkcjonowaniu tych mechanizmów właśnie w taki sposób, jest ważna podczas interpretowania wyników doświadczeń na A. mellifera, ostatnio coraz częściej traktowanej jako organizm modelowy w epigenetyce i gerontologii. Ponadto zaobserwowałam, że u robotnic A. mellifera podobnie jak u ludzi, kurkumina i kofeina powodują obniżenie poziomu globalnej metylacji DNA (Zał. 1, I B, poz. 1 i 3). Spostrzeżenie to, wnosząc nowe treści do wiedzy o fizjologii procesów starzenia, jest cenne w kontekście porównywania biochemicznych mechanizmów zmian geriatrycznych człowieka i pszczół miodnych. Prowadząc wszystkie ww. badania wniosłam także swój skromny wkład w doskonalenie metod analitycznych związanych z biochemią i fizjologią pszczół: 1) zmodyfikowałam metodę pobierania hemolimfy od pszczół (przedstawiona w publikacjach Zał. 1, IB, poz. 3 i 4). Ta zmodyfikowana metoda polega na pobieraniu hemolimfy do schłodzonych kapilar typu end to end (bez antykoagulantu), których końce zamknięte są 0,6% NaCl (dla owadów). Takie kapilary umieszcza się w sterylnych probówkach typu Eppendorf ze schłodzonym 0,6% NaCl, a następnie zamraża się je. Metoda ta umożliwia transport próbek hemolimfy nawet na duże odległości, bez obawy ich utlenienia; 2) zmodyfikowałam metody określania aktywności i stężeń elementów systemu antyoksydacyjnego, proteolitycznego i markerów biochemicznych stricte do badań na pszczołach; z małą ilością materiału biologicznego.

13 12 Autoreferat A. Strachecka Zał. 1, IB, poz. 2 Prace przedstawione w Zał. 1, I B, poz. 1 i 3 oraz Zał. 1, IIA, poz. 8 i 21 były punktem wyjścia do pracy Zał. 1, IB, poz. 2. Skoro poziom metylacji DNA zmienia się w odpowiedzi na bodźce środowiska, a rodzina pszczela jest superorganizmem o strukturze kastowej, zaczęłam się zastanawiać nad wpływem diety i warunków rozwoju w okresie preimaginalnym pszczół na poziom globalnej metylacji DNA u poszczególnych kast płciowych. W literaturze jest przedstawiony epigenetyczny sposób regulacji genów u robotnic i matek, i tylko w 3 i 4 dniu rozwoju, jako kluczowym okresie różnicującym samice na płodne matki lub niepłodne robotnice. Szczególną uwagę zwracano ponadto na wyciszanie genów w mózgu dorosłych matek i robotnic, pomijając inne tkanki. Moimi badaniami uzupełniłam informacje o zmiany w poziomach globalnej metylacji DNA w 3 i 4 dniu rozwoju (larwy) każdej z trzech kast, również u dotąd nie badanych trutni. Novum było określenie poziomu 5-metylocytozyny w DNA u przedpoczwarek, poczwarek i świeżo wygryzionych matek, trutni i robotnic A. mellifera. Zupełnym zaskoczeniem okazał się bardzo wysoki poziom 5-metylocytozyny u przedpoczwarek i poczwarek matek w porównaniu z tymi samymi stadiami trutni i robotnic. Wytycza to kolejne kierunki badań, w których powinno być wyjaśnione dlaczego świeżo wygryzione matki mają wyższy globalny poziom metylacji DNA niż trutnie i robotnice. Wyniki moich badań sugerują, że biorąc pod uwagę podobieństwa zmian epigenetycznych obserwowanych podczas ontogenezy robotnic i trutni, robotnice nie koniecznie są ewolucyjnie starsze od matek, a tak się powszechnie uważa. Wyjaśnienie tej kontrowersji może być jednym z kroków umożliwiających lepsze zrozumienie ewolucji układów eusocjalnych. d) Podsumowanie głównego osiągnięcia naukowego Przedstawiony powyżej cykl publikacji, omawiany jako główne osiągnięcie naukowe wniósł do nauk biologicznych następujące treści: - określiłam procentowy udział poszczególnych grup związków (line alkanes, branched alkanes, methyl alkanes, alkenes, esters, phenols) na kutikuli robotnic z różnych linii genetycznych i wykazałam, że związkiem różnicującym te linie jest alken C33. Wykazałam, że aktywność systemu proteolitycznego kutikuli zależy nie tylko od wpływu środowiska, ale także od rodzaju grupy genetycznej i wieku pszczół miodnych. Wnosi to nowe treści do wiedzy o roli proteolizy powierzchniowej, jako nieswoistej barierze ochronnej. Jest to ważny przyczynek do zrozumienia ewolucji systemów biochemicznej obrony pszczół, jako elementu ich odporności nieswoistej i cenna wskazówka dla działań hodowlanych u A. mellifera; - potwierdziłam, że czynniki antropogeniczne wpływają destrukcyjnie na organizm pszczoły. Wykazałam, że amfoterycyna-b skraca życie pszczół, jednocześnie tworząc agregaty w jelicie grubym robotnic, obniża poziom metylacji genomu i podwyższa stężenie białek. Wyniki te wzbogacają wiedzę o ubocznych skutkach pobierania antybiotyków, wskazując nie tylko na ich toksyczność/szkodliwość, ale co ważniejsze, także na powodowanie niekorzystnych zmian w epigenetycznym systemie regulacji ekspresji genów; - wykazałam, że ważnymi, biochemicznymi elementami pszczelej odporności w hemolimfie są: system proteolityczny i antyoksydacyjny oraz biomarkery. Stwierdziłam,

14 13 Autoreferat A. Strachecka że powinny być one analizowane razem aby dać pełniejszy obraz przemian metabolicznych zachodzących w organizmie tych owadów pod wpływem różnych bodźców środowiskowych; - wykryłam istnienie odwrotnych mechanizmów aktywowania takich biomarkerów enzymatycznych, jak AST, ALT, ALP u pszczół w porównaniu do ludzi. Wiedza o funkcjonowaniu tych mechanizmów właśnie w taki sposób, jest ważna podczas interpretowania wyników doświadczeń na A. mellifera, ostatnio coraz częściej traktowanej jako organizm modelowy w epigenetyce i gerontologii; - wykazałam, że biostymulatory tj. kofeina, koenzym Q10 i kurkumina aktywują biochemiczne mechanizmy obrony organizmu poprzez zwiększenie aktywności systemu antyoksydacyjnego i proteolitycznego oraz zmiany poziomu/aktywności biomarkerów enzymatycznych. Wpływają też one na mechanizmy odpowiedzialne za regulacje epigenetyczne. Te wszystkie zmiany wydłużają życie pszczół. Stosowanie tych biostymulatorów może także ograniczać rozwój patogenów, co wykazałam na przykładzie, zagrażającego światowej populacji pszczół miodnych, grzyba Nosema spp. Wszystko to wnosi nowe treści do wiedzy o fizjologii owadów, szczególnie A. mellifera i ich procesach starzenia. Dlatego wiedza ta jest cenna w kontekście porównywania biochemicznych mechanizmów zmian geriatrycznych człowieka i pszczół miodnych. Ponadto, są to istotne informacje dla pszczelarzy praktyków, którzy w przyszłości poprzez stosowanie biostymulatorów, będą mogli wpłynąć na wzmocnienie biochemicznych mechanizmów pszczelej odporności nieswoistej; - poszerzyłam wiedzę z zakresu procesów epigenetycznych o opisanie zmian w poziomach globalnej metylacji DNA w 3 i 4 dniu rozwoju (larwy) u wszystkich trzech kastach pszczół, szczególnie trutni. Novum moich badań było określenie poziomu 5- metylocytozyny w DNA u przedpoczwarek, poczwarek i świeżo wygryzionych matek, trutni i robotnic A. mellifera. Moje badania wymagały rozwinięcia lub udoskonalenia metod analitycznych. Za twórczy wkład do metodyki badań entomologicznych uważam: - opracowanie nowych metod: 1) przyżyciowej wizualizacji związków (na przykładzie amfoterycyny-b) za pomocą systemu Faxitron MX-20; 2) wizualizacji żywych (bez zniekształceń) tkanek, układów z zastosowaniem technik podtrzymujących ich życie i normalne funkcjonowanie; 3) odpowiedniego przygotowywania żywych pszczół do chromatografii gazowej ze spektrometrem mas GCQ; - zmodyfikowanie metod: 1) pobierania hemolimfy; 2) określania aktywności i stężeń elementów systemu antyoksydacyjnego, proteolitycznego i biomarkerów biochemicznych stricte do badań na pszczołach; z małą ilością materiału biologicznego; Chcę jednocześnie dodać, że rozszerzenie profilu badawczego zespołu, do którego dołączyłam, o mechanizmy biochemicznej/fizjologicznej odpowiedzi owada na presję środowiska, modyfikacja metod pobierania, przechowywania materiału i jego analizowania pod względem biochemicznym, wraz z ukończonymi kursami i szkoleniami (Załącznik 5) okazały się pomocne podczas tworzenia i rozwijania Zakładu Biologii Eksperymentalnej i

15 14 Autoreferat A. Strachecka Środowiskowej. Stanowi to mój skromny wkład organizacyjno-naukowy w rozwój struktury Katedry i Wydziału, gdzie pracuję DODATKOWE OSIĄGNIĘCIA NAUKOWE W dodatkowych badaniach, nie zakwalifikowanych do głównego osiągniecia naukowego, ale również związanych z mechanizmami biochemicznej odporności i fizjologią pszczół oraz ich pasożytów, zajmowałam się: A) Genetyczną i biochemiczną charakterystyką roztoczy Varroa destructor opornych i wrażliwych na tau-fluwalinat (Zał. 1, II A, poz. 1, 11, 17). Zadanie badawcze realizowane przeze mnie było częścią projektu badawczego N N , którego byłam wykonawcą. Omówię teraz zagadnienia, którymi osobiście zajmowałam się podczas realizacji tego projektu (łącznie z projektowaniem protokołów doświadczalnych) i najważniejsze wyniki: - Wykazałam, że samice V. destructor z grupy opornej na tau-fluvalinat miały małe stężenia białek na powierzchni swoich pancerzy i jednocześnie największe aktywności proteaz asparaginowych w ph 3.4, serynowych w ph 7.0 i w ph 12.2 (Zał. 1, IIA, poz. 11). Stwierdziłam na powierzchni pancerzy roztoczy opornych występowanie dodatkowych proteaz o masach 116 i 120 kda oraz inhibitorów proteaz o 42 kda. Najprawdopodobniej, jest to jedna z form ochrony ich pancerzy przed akarycydami. - Samice oporne na tau-fluvalinat charakteryzowały się niskim poziomem globalnej metylacji DNA w porównaniu z samicami z grupy kontrolnej oraz wrażliwej. Wykrycie tej prawidłowości stwarza podstawę podania epigenetycznych przyczyn powstawania oporności u V. destructor. Jest to novum pracy Zał. 1, II A, poz. 1, które wskazuje oprócz znanych już 3 mechanizmów biochemiczno-genetycznych na czwarty nowy, z którego wynika że akarycydy wpływają de novo na zaprogramowanie metylacji DNA podczas rozwoju roztoczy. Informacje te wnoszą nowe treści do wiedzy o nabywaniu oporności na chemioterapeutyki przez roztocza i mogą mieć charakter aplikacyjny oraz są przyczynkiem do wiedzy o wyścigu zbrojeń patogen-gospodarz. - Współopracowywałam nową, molekularną metodę indywidualizacji roztoczy V. destructor opornych i nieopornych na akarycydy, bazującą na PCR-SSCP (Zał. 1, II A, poz. 1). Okazało się, że prążki na elektroforegramie PCR-SSCP były widoczne tylko dla genu COI 320 bp (ponadto analizowano: COI 929 bp, COII-ATP6 775 bp, ATP6-COIII 818 bp, i CytB 958 bp), dla którego oporne roztocza miały dwa dodatkowe prążki w porównaniu z roztoczami wrażliwymi i z grupy kontrolnej. Dodatkowo potwierdzono tą tendencję podczas sekwencjonowania roztocza oporne miały 8% większą częstotliwość mutacji sensownych w porównaniu z dwiema pozostałymi grupami. B) Zachowywaniem się plemników przechowywanych w zbiorniczku nasiennym matki oraz czynnikami wpływającymi na koagulację spermy (Zał. 1, II A, poz. 6, 24). - Uczestniczyłam w badaniach, w których stosując techniki fluorescencyjnego znakowania DNA plemników stwierdzono, że na skutek kontaktu plemników z płynem zbiorniczka nasiennego matki pszczelej, plemniki układają się w kołowe skupiska. Wiąże się to z

16 15 Autoreferat A. Strachecka ważnym dla biologii rozrodu zagadnieniem sperm competition. Wyniki te, traktowane jako wstępne, wskazują na konkurencję między plemnikami przechodzącymi do zbiorniczka nasiennego. Ponadto określano wpływ rozcieńczalników i barwników na zachowanie plemników; reinseminowano matki nasieniem uprzednio zdeponowanym w zbiorniczkach nasiennych innych matek. Stwierdzono, że z jaj zapłodnionych przez znakowane fluorescencyjne DNA plemników rozwijały się zdrowe robotnice, co wskazuje na brak szkodliwego wpływu zastosowanego barwnika na ontogenetyczny rozwój pszczół. Stwierdzenie to należy uznać za ważne dla metodyki badań nad plemnikami i zapłodnieniem. - W ramach tego zadania, byłam pomysłodawcą wykonania analiz aktywności systemu proteolitycznego w spermie trutni. Wykonałam analizy biochemiczne mające na celu określenie różnic w stężeniu białek oraz aktywności systemu proteolitycznego w spermie pobranej od pojedynczych trutni, spermie zmieszanej od kilku trutni i w spermie skoagulowanej (Zał. 1, IIA, poz. 6). Wykazałam, że skoagulowane nasienie charakteryzuje się wysokim stężeniem białek, przy jednocześnie małej aktywności proteaz, których optimum ph wynosiło 3.0; 7.0 i Podczas mieszania spermy dochodzi do denaturacji/inaktywacji proteaz w zakresie mas kda. Zagadnienie to czeka na wyjaśnienie i stwarza nowy obszar badawczy dla embriologii i biologii rozrodu owadów. C) Wybranymi zagadnieniami z behawioru A. mellifera. Ten obszar badawczy nie jest głównym tematem moich zainteresowań, ale współuczestniczyłam w badaniach realizowanych przez moich kolegów w zespole. W ramach tych prac realizowano następujące zagadnienia: a) Agresywność matek i robotnic. Analizowano jaki wpływ na zachowania robotnic ma agresywna matka i odwrotnie (Zał. 1, II A, poz. 19). b) Współdziałanie robotnic w testach polowych i klatkowych. Określano współpracę pszczół Buckfast i kraińskich podczas pobierania i gromadzenia syropu [hoarding behaviour] (Zał. 1, II A, poz. 9, 10, 22, 23; II D, poz. 5, 6). c) Efekt CO 2 na długowieczność pszczół (Zał. 1, II A, poz. 16). W badaniach entomologicznych, szczególnie laboratoryjnych, używa się CO 2 do anastezji owadów. d) Zachowania behawioralne pszczół wychowywanych w małych komórkach (Zał. 1, II A, poz. 3, 4). D) Zmianami poziomu ogólnej metylacji genomu (zmiany epigenetyczne) u zwierząt. Moje badania wykonywałam, oprócz pszczół, na ptactwie domowym (Zał. 1, II A, poz. 7). Ponadto kontynuowałam, rozpoczęte jeszcze podczas studiów doktoranckich, badania biochemiczne u drobiu (Zał. 1, IIA, poz. 5, 15; II D, poz. 1, 3, 4, 9, 10). Planowałam protokoły doświadczalne i wykonywałam związane z nimi oznaczania biochemiczne interpretując wyniki w świetle ogólno-biochemicznej wiedzy. Na zakończenie omawiania moich osiągnięć naukowych pragnę nadmienić, że w swoich badaniach wykorzystywałam obszerne bazy danych, charakteryzujące się bardzo dużą liczebnością próbek (np robotnic [Zał. 1, IB poz. 2]; robotnic [Zał. 1, 1IA poz. 14]). Dlatego moje wyniki i poczynione na ich podstawie spostrzeżenia uważam

17 16 Autoreferat A. Strachecka za dobrze udokumentowane i w niedalekiej perspektywie, dające podstawy do stworzenia dotąd nieopracowanych, norm referencyjnych dla pszczół. Wiedza ta jest przydatna dla przedstawicieli nauk biomedycznych i weterynaryjnych o czym świadczy duże zainteresowanie wynikami moich badań periodyku Veterinary Medicine Science and Practice. Rozpowszechnianie moich wyników przez to czasopismo (na prośbę redakcji), traktuję jako wstęp do ich wykorzystania w praktyce. Warto dodać, że czasopismo nie ma zbyt wysokiego IF, ale za to jest czytane nie tylko przez naukowców, ale przez rzesze praktykujących weterynarzy i biologów oraz przez producentów leków PLANY NA PRZYSZŁOŚĆ W najbliższym czasie moje badania naukowe nadal będą się skupiać na poszerzaniu wiedzy i lepszym, kompleksowym zrozumieniu biochemicznych i epigenetycznych mechanizmów odpowiedzialnych za pszczelą nieswoistą odporność. Tematami, którymi zaczęłam się już zajmować i chciałabym je pogłębić są: 1) Związane z procesem starzenia zmiany w kluczowych dla odporności systemach u specjalnej grupy robotnic A. mellifera, rebeliantek (rebel bees), w porównaniu z matkami i robotnicami nie-rebeliantkami. W rozdz wspomniałam, że jak wskazują moje wyniki, robotnice nie koniecznie są ewolucyjnie starsze niż matki. Zasugerowałam też, że wyjaśnienie tej kontrowersji może umożliwić lepsze zrozumienie ewolucji układów eusocjalnych. W roku 2013, podczas mojego stażu w Instytucie Nauk o Środowisku Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie zapoznałam się z pracami nad nowoodkrytymi tam robotnicami rebeliantkami. Prace te zmierzały do zmodyfikowania reproductive ground plan hyphothesis (RGPH) opisanej po raz pierwszy w Nature przez Amdam i in. (2006). Badania rebeliantek, jako potencjalnie pośredniego ogniwa pomiędzy robotnicami i matkami mogą rzucić nowe światło na tą hipotezę. Moim zdaniem właśnie badania systemów antyoksydacyjnych, regulacji epigenetycznych i innych biochemicznych przyczyn szybszego starzenia się robotnic niż matek mogą być w tym przypadku kluczowe. Moje wstępne badania i bibliografia dotycząca tego zagadnienia są na razie pilotowe i fragmentaryczne (Zał. 1, IIK, poz. 9), ale projekt z NCN nr 2014/13/B/NZ8/04705 (Opus) w UJ, którego jestem głównym wykonawcą oraz projekt nr 2014/15/B/NZ9/00425 (Opus; Zał. 1, IIi) w UP Lublin, którego jestem kierownikiem stwarzają szansę na istotne uzupełnienie wiedzy o miejscu rebeliantek w superorganizmie rodziny pszczelej i tym samym, znaczące uzupełnienie wiedzy z zakresu biologii ewolucyjnej owadów społecznych. Z punktu widzenia moich zainteresowań najistotniejsze są mechanizmy biochemiczne. Badania są w toku, a na znaczące publikacje trzeba poczekać. 2) Zależne od wieku zmiany histologiczne i biochemiczne w ciele tłuszczowym oraz gruczołach kieszeniowych u matek pszczelich i w gruczołach Nasonova u robotnic pszczół miodnych. Opracowanie nowych metod i modyfikacja tych istniejących przedstawionych w rozdz umożliwiły mi rozszerzenie badań na inne tkanki, tj. ciało tłuszczowe, gruczoły. Najczęściej zmiany biochemiczne i histologiczne są ze sobą powiązane i

18 17 Autoreferat A. Strachecka zrozumienie tych powiazań może znacznie wzbogacić wiedze o starzeniu A. mellifera. Chciałabym także uzyskać odpowiedź, w jaki sposób swoiste białka, w tym proteazy i ich inhibitory, wydzielane są przez pancerz chitynowy na powierzchnię ciała pszczół A. mellifera. Poznanie tego mechanizmu jest ważne dla poszerzenia wiedzy o fizjologii biochemicznych mechanizmów obronnych owadów, a z drugiej strony, dla parazytologii przy analizowaniu relacji gospodarz patogen. Pierwsze wyniki zostały przedstawione na konferencjach Zał. 1, IIK, poz. 1, 2, 11, 13, 14. I w tym przypadku duże nadzieje pokładam w łącznym interpretowaniu badań histologicznych i biochemicznych. W tym kontekście jest jeszcze wiele pytań, na które poszukuję odpowiedzi, dlatego na znaczące publikacje trzeba poczekać. 3) Zależne od płci i wieku zmiany histologiczne w ciele tłuszczowym i biochemiczne w hemolimfie pszczół samotnic; u pszczoły Osmia rufa. Ze względu na ogólnoświatowy spadek liczby zapylaczy, coraz częściej zwraca się uwagę na inne, niż A. mellifera, gatunki pszczół. Są to owady, które większość swojego życia spędzają w formie diapauzy i procesy fizjologiczne w tym okresie są najczęściej opisywane w literaturze. Okres stadium imago, w którym owady zapylają, składają jaja, budują gniazda, itp. bywa pomijany przez naukowców, głównie ze względu na trudności w schwytaniu owadów. A przecież okres ten jest kluczowy dla przetrwania kolejnych pokoleń murarki. Dlatego, w dwóch ostatnich latach łapałam samce i samice w różnym wieku, wykonywałam analizy histologiczne ciała tłuszczowego, pobierałam hemolimfę i analizowałam ją pod względem biochemicznym. Wyniki są obiecujące, część z nich przygotowuję do druku, a na pozostałej części próbek będę wykonywać kolejne analizy. Chciałabym poznać mechanizmy odporności u murarki (Osmia rufa), jako pszczoły samotnej i porównać je do tych u pszczoły miodnej, jako gatunku o społecznym trybie życia. Liczę, że w ten sposób wzbogacę wiedzę o biochemicznych mechanizmach u owadów samotnych versus socjalnych w aspekcie ich ewolucji. 4) Wpływ endopasożyta Nosema spp. na zmiany histologiczne i biochemiczne w ciele tłuszczowym, procesy biochemiczne w hemolimfie oraz regulacje epigenetyczne/genetyczne u różnych gatunków owadów społecznych. Nosemoza, w rozumieniu choroby odnoszącej się do A. mellifera, wywoływana jest przez dwa gatunki mikrosporydiów: N. apis i N. ceranae, ale znane są również N. bombi u trzmieli. Jak pisałam w rozdz. 4 i 5, w ostatniej dekadzie nastąpił gwałtowny rozwój oraz rozprzestrzenienie chorób pszczół i innych zapylaczy. Taka sytuacja wymaga zdecydowanego zwiększenia intensywności badań, głównie pod kątem relacji gospodarz pasożyt. Pierwsza praca z tego zakresu wykonana na trzmielach ukazała się w tym roku (Zał. 1 IIA, poz. 2), a na kolejne trzeba będzie jeszcze poczekać. Warto dodać, że praca ta, tak jak wcześniej wspominane badania niskocząsteczkowego przełącznika epigenetycznego (PG) umożliwiła mi współprace międzynarodową z ośrodkami w Rosji i USA. Moim priorytetem ostatnich dwu lat było pozyskanie projektu badawczego NCN, w którym byłabym głównym pomysłodawcą i kierownikiem. Działania te uwieńczone zostały sukcesem. Obecnie za priorytetowe uważam rozwijanie współpracy

19 18 Autoreferat A. Strachecka międzynarodowej, w tym staże zagraniczne. W chwili obecnej podjęłam współpracę z ośrodkami na Ukrainie i w Rosji. Chciałabym także wznowić współpracę z prof. Ryszardem Maleszką z Australian National University. Prowadziliśmy już wspólne badania nad ekspresją genów i białek mózgu związanych z uczeniem się pszczół, ale wstępne wyniki nie dały materiału na publikacje. Do tematu chciałabym jednak powrócić. 6. DZIAŁALNOŚĆ DYDAKTYCZNĄ I ORGANIZACYJNĄ przedstawiłam w Zał.1, III.