O NIEKTÓRYCH NIEDIAGNOSTYCZNYCH ZASTOSOWANIACH CYTOMETRII PRZEPŁYWOWEJ

Transkrypt

1 tom 1, zeszyt nr 1, 2012 O NIEKTÓRYCH NIEDIAGNOSTYCZNYCH ZASTOSOWANIACH CYTOMETRII PRZEPŁYWOWEJ Cezary Watała, Joanna Rywaniak, Karolina Siewiera, Hassan Kassassir, Radosław Sychowski 1, Magdalena Łabieniec-Watała 2 1 Zakład Zaburzeń Krzepnięcia Krwi, Katedra Diagnostyki Laboratoryjnej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi 2 Uniwersytet Łódzki, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Katedra Termobiologii Adres korespondencyjny: Cezary Watała Zakład Zaburzeń Krzepnięcia Krwi Uniwersytet Medyczny w Łodzi ul. Żeromskiego Łódź tel./faks: / cezary.watala@umed.lodz.pl STRESZCZENIE W pracy skupiono uwagę na wybranych zastosowaniach cytometrii przepływowej w naukach podstawowych: (a) badaniach czynności i żywotności płytek krwi człowieka i gryzoni laboratoryjnych, (b) oznaczaniu powierzchni prokoagulacyjnej komórek, oraz (c) badaniach mitochondriów i liposomów. Zwrócono szczególną uwagę na metodyczne oraz techniczne uwarunkowania protokołów badawczych, które mogą prowadzić potencjalnie do przekłamywania zbieranych wyników i/lub przywodzić do niesłusznych wniosków. Wyniki zbierane przy wykorzystaniu techniki cytometrii przepływowej zestawiono z alternatywnymi metodami stosowanymi w badaniach naukowych poszczególnych obiektów. W szczególności, opisano rozróżnianie aktywacji, reaktywności i agregacji płytek krwi. Wskazano na znaczenie oznaczeń żywotności płytek, jako parametru, który może interferować w badaniach czynności tych komórek i często wpływa na płynące z badań wnioski. Opisano metody służące do badania powierzchni prokoagulacyjnej płytek krwi, akcentując zagrożenia zbieraniem artefaktów, jakie towarzyszą stosowaniu poszczególnych protokołów badawczych. Zwrócono uwagę na odmienności badania płytek krwi innych ssaków niż człowiek, w szczególności, w modelu mysim, najpowszechniej stosowanym. Praca przedstawia także wykorzystanie cytometrii przepływowej w dość nietypowych zadaniach badawczych, w których przydatność tej techniki wydawałaby się wręcz niemożliwa, a mianowicie oznaczenia obiektów subkomórkowych i parakomorkowych, jakimi są mitochondria i liposomy. W szczególności opisano sposoby badania parametrów funkcjonalnych mitochondriów, z wyraźnym zaakcentowaniem tych, znajdujących zastosowanie w śledzeniu procesu apoptozy. Na przykładzie płytek krwi zwrócono uwagę na badanie parametrów opisujących zachodzenie apoptozy w komórkach bezjądrzastych. SŁOWA KLUCZOWE: aktywacja i reaktywność płytek krwi, mikropłytki, agregaty płytkowe, selektyna P, receptory błonowe, reakcja uwalniania, żywotność płytek, płytki gryzoni laboratoryjnych, apoptoza płytek, liposomy, potencjał mitochondrialny, polarografia, spektrofluorymetria ABSTRACT The paper is focused on chosen applications of flow cytometry in basic sciences: (a) investigations of blood platelet function and viability in humans and rodents, (b) determination of procoagulant activity in blood platelets, and (c) investigations of mitochondria and liposomes. The particular attention was paid to methodological and technical aspects of research protocols, which could potentially lead to distortions in the col- 1

2 lected results and/or drive to raising of false conclusions. The results obtained with flow cytometry were compared to those obtained with use of alternative techniques applied in scientific research of particular objects. We discuss in this paper proper distinguishing of platelet activation, reactivity and aggregation. Also, protocols for estimating blood platelet viability the parameterm, which can potentially interfere with functional assays and have an impact on final conclusion of an experiment, are critically reviewed. The article also describes the methods of platelet procoagulant activity and emphasizes the risk of collecting artifacts in calcium-rich environment. Another raised topic is the selection of an approach for studying blood platelets from other mammals (especially in mouse model, which is commonly used by researches) and the discussion of hints distinguishing between investigation of human and mouse platelets. The last, our paper describes possibilities of using flow cytomery in research applications, which at the first side, appear quite unusual for this technique investigations on subcellular and paracellular objects, like mitochondria and liposomes. In particular, the characterization of parameters explored in functional mitochondria and applications of such methods to study cell apoptosis is presented. The latter is also referred to anucleate cells, like blood platelets. KEY WORDS platelet activation and reactivity, microplatelets, platelet aggregates, P selectin, platelet membrane receptors, release reaction, platelet viability, platelets of laboratory rodents, platelet apoptosis, liposomes, mitochondrial transmembrane potential, polarography, spectrofluorometry WSTĘP O sukcesie cytometrii przepływowej w naukach doświadczalnych zadecydowała m.in. wszechstronność jej zastosowań oraz plastyczność, z jaką badacz może adaptować standardowe protokoły rutynowych oznaczeń cytometrycznych do ustawiania nowych metod badawczych. Panuje obecnie uzasadnione przekonanie, że metody cytometrii przepływowej można z mniejszym lub większym powodzeniem zaadoptować i zastosować wszędzie tam, gdzie pomiary oparte są na zmianach fluorescencji obiektów. Cytometria ma właśnie tę olbrzymią przewagę nad innymi metodami spektrofluorometrycznymi, że stosuje się ją w odniesieniu do obiektów rozpraszających światło i zawiesin lub roztworów nie-rzeczywistych (np. komórki, biopolimery wielkocząsteczkowe), czyli w przypadkach, gdzie klasyczne techniki spektrofotometryczne i spektrofluorometryczne nie sprawdzają się, gdyż zbierają kumulatywny sygnał pochodzący zarówno z obiektów (np. komórek), jak i ośrodka, w którym te obiekty są zawieszone. To co jest podstawowym ograniczeniem technik konwencjonalnych (spektrofluorymetria), tzn. obecność policzalnych rozpraszających światło obiektów, stanowi niejako warunek sine qua non stosowania cytometrii przepływowej. W miarę udoskonalania możliwości techniki cytometrii rosły także apetyty badaczy na implantowanie tej techniki do badania jak największej rozmaitości procesów cytofizjologicznych. W praktyce często okazywało się, że pozornie proste aplikacje stawały się zupełnie karkołomnym wyzwaniem w odniesieniu do niektórych typów komórek, ale dzięki temu technika cytometrii rozwijała się na wielu płaszczyznach: aparaturowej (np. stosowanie kilku różnych laserów wzbudzających w tym samym urządzeniu), analitycznej (różnicowanie sygnału pochodzącego z wnętrze struktur komórkowych i z powierzchni nienaruszonych komórek), czy wykorzystującej zaawansowane techniki biologii molekularnej (badania ekspresji wybranych fragmentów genomu, technika Flex-Set, techniki FRET). Podane wybiórczo poniżej niektóre zastosowania cytometrii przepływowej nie wyczerpują szerokich możliwości wykorzystania cytometrii w badaniach podstawowych i diagnostycznych: analiza morfometryczna populacji obiektów (na podstawie rozproszenia czołowego światła, Forward Scatter, FSC); analiza morfologiczna struktur wewnątrzkomórkowych (ziarnistość) na podstawie rozproszenia światła na organellach wewnątrzkomórkowych i błonie komórkowej (rozproszenie boczne światła, Side Scatter, SSC); analiza ekspresji i gęstości rozmieszczenia wybranych antygenów powierzchniowych metody fenotypowania komórek; analiza intermediatów metabolizmu tlenowy i generowania wolnych rodników; analiza mobilizacji i transportu jonów (H+, Ca2+, Mg2+, Na+, itp.); badanie zmian potencjału błonowego komórek i organelli; analiza zużycia i rozpadu komórek, procesów mikrowezykulacji, apoptozy, nekrozy; określanie asymetrii błon komórkowych i płynność błon komórkowych; analiza zawartości i replikacji kwasów nukleinowych, badanie ploidii komórek; analiza polimeryzację białek cytoszkieletu; szereg innych, m.in. zachodzenie fagocytozy i pinocytozy, sekrecja komórkowa, adhezja i agregacja komórek, chemotaksja komórek, opłaszczanie komórek przeciwciałami. Fakt, iż cytometria przepływowa dostarcza nam możliwości badania dużych i bardzo dużych populacji komórek w krótkim czasie oraz uśredniania niektórych reprezentatywnych dla takiej populacji parametrów strukturalnych i funkcjonalnych, np. stopnia ekspresji określonych antygenów/receptorów, nasilenia reakcji uwalniania komórek, mobilizacji określonych jonów w wewnątrzkomórkowych kompartmentach, określania fazy cyklu komórkowego, itp., stawia ta technikę niejako w opozycji do technik pozwalających na badanie zjawisk unikalnych (np. mikroskopia fluorescencyjna). Ten walor numeryczny cytometrii, sprawia, że w opinii wielu badaczy cytometrii trudno odmówić cech statystycznej wiarygodności. Z drugiej strony, w swej czystej postaci cytometria nie pozwala badaczowi na zobrazowanie pojedynczych rejestrowanych obiektów. Niekiedy może to prowadzić do przekłamywania zbieranej informacji, o ile - przy wsparciu o inne metody, nie przekonamy się o tym, czy rzeczywiście badamy obiekty, które nas interesują. Dotyczy to zwłaszcza szczególnych przypadków zastosowania tej techniki w badaniach podstawowych i niediagnostycznych (w rozumieniu: diagnostyki materiału badawczego, najczęściej krwi, pochodzącego od ludzi). Z drugiej strony, wsparcie cytometrii o moduł sortowania komórek pozwala na badanie mniejszych populacji obiektów o szczególnej charakterystyce z całych komórkowych populacji. Sama możliwość wysortowania określonych komórek/subpopulacji komórek tworzy dla badacza bardzo atrakcyjny pomost między cytometrią (jako narzędziem służącym do przygotowania materiału badawczego) a technikami hodowli komórkowych i dalszej analizy zmienionych linii komórkowych. Ogólnie, problemy, jakim musi sprostać badacz w celu wszechstronnego, ale i obiektywnego wykorzystania techniki cytometrii przepływowej można podzielić na dwie grupy. Pierwsza dotyczy właściwego przygotowania materiału badawczego do pomiaru cytometrycznego, druga wiąże się z doborem odpowiednich przeciwciał oraz znaczników fluorescencyjnych do badania pożądanych zjawisk cytofizjologicznych i/lub procesów biochemicznych. W niniejszej pracy staraliśmy się zilustrować na wybranych przykładach niektóre z wyzwań, jakie stoją przed badaczem zajmującym się mniej typowymi zastosowaniami cytometrii przepływowej niż aplikacje typowo diagnostyczne i medyczne (1). 1. Cytometria płytek krwi: aktywacja, reaktywność, agregacja czy da się te zjawiska wiarygodnie monitorować? Jak minimalizować ryzyko artefaktów pomiarowych w badaniach czynności płytek krwi przy zastosowaniu cytometrii przepływowej? Problemy, z jakimi może zmierzyć się badacz płytek krwi, mogą dotyczyć: przygotowania materiału badawczego do pomiaru i utrwalania komórek, doboru przeciwciał i stosowania przeciwciał izotypowych, rejestrowania tzw. ekspresji antygenu oraz liczby kopii antygenu, badania frakcji mikropłytek (mikrocząstek) i frakcji agregatów (2-4). Przygotowanie materiału do badań cytometrycznych. Jednym z krytycznych czynników decydujących o wiarygodności analizy cytometrycznej jest moc rozdzielcza cytometru przepływowego. Stąd też, zbyt małe rozmiary nawet właściwie przygotowanego preparatu komórek mogą znacząco ograniczyć wiarygodną analizę cytometryczną. Dobrym testem czułości cytometru może być badanie zdolności rozdzielczej kuleczek żywicowych o wielkościach w zakresie przystającym do zakresu wielkości badanych obiektów lub komórek. Przy badaniu tak małych komórek, jak płytki krwi, problemem może stać się także występowanie bakterii w buforach użytych do sporządzania zawiesin komórkowych, cząstki kurzu, itp. Dlatego też zaleca się filtrowanie roztworów stosowanych do analizy cytometrycznej przez filtry o wielkości por 0.2 μm. i przechowywanie ich w wa- 2 3

3 runkach sterylnych (5). Ponieważ płytki krwi bardzo łatwo ulegają aktywacji i/lub uszkodzeniu podczas procedur ich izolowania i oczyszczania, należałoby te czynności te zminimalizować oraz stosować odpowiednie inhibitory spontanicznej/samoistnej aktywacji. Jednakże, podejście takie sprawdza się jedynie w doświadczeniach, gdy nie zależy nam na monitorowaniu czynności płytek krwi, gdyż zastosowanie inhibitorów będzie - w sposób oczywisty, przekłamywało obraz odpowiedzi płytek krwi na badane czynniki. Pewnym kompromisem mogłoby tutaj być zastosowanie niefrakcjonowanych próbek pełnej krwi, bez uciekania się do izolowania płytek czy nawet bogatopłytkowego osocza. To co sprawdza się znakomicie w badaniach diagnostycznych lub klinicznych, gdzie najczęściej badanym materiałem jest pełna krew, może zawodzić w badaniach podstawowych, gdy pozyskanie frakcji płytek krwi w osoczu (osocze bogatopłytkowe) lub buforze (zawiesina płytek) jest niezbędne do ich właściwego i skutecznego wyznakowania (zob. niżej, np. badanie żywotności, komórek, mobilizacji czy transportu jonów) lub w protokołach, gdzie zastosowanie pełnej, niepreparowanej krwi wyklucza poprawne przeprowadzenie pomiaru (zob. niżej, np. badanie płytek gryzoni laboratoryjnych). Często ryzyko samoistnej, niepożądanej (artefaktualnej) aktywacji płytek wzrasta niepomiernie z czasem upływającym od momentu wynaczynienia. Dlatego też wskazane jest wykonywanie badania w czasie możliwie jak najkrótszym po pobraniu materiału, jak również właściwe przetrzymywanie materiału do czasu analizy (np. temperatura 37 C jest o wiele bardziej korzystna dla płytek krwi niż temperatura ok. 4 C, preferowana w przypadku większości komórek). Niekiedy używa się komórek utrwalonych, w innych przypadkach wymagane jest badanie żywych komórek (3) (zob. też poniżej). W różnych protokołach przygotowywania płytek krwi do badań cytometrycznych znajdują zastosowanie dwie strategie badania: 1. w celu orzekania o funkcjonowaniu i odpowiedzi na bodźce komórek w ustroju stosuje się bardzo często utrwalanie komórek i niejako zamrażanie ich stanu funkcjonalnego; to podejście wykorzystuje się z reguły do określania stanu aktywacji płytek krwi krążących w łożysku naczyniowym; 2. barwienie i analiza przyżyciowa komórek pozwalają na ocenę czynnościową komórek w testach in vitro, np. przy badaniu reaktywności płytek krwi (2-4,6). Sposób pierwszy zwłaszcza w tych przypadkach, gdy badane komórki ulegają łatwej aktywacji w warunkach pozaustrojowych, co zaciemnia wyniki pomiaru. Barwienie przyżyciowe jest wymaganiem koniecznym do badania procesów cytofizjologicznych płytek krwi oraz testowaniu ich odpowiedzi na działanie czynników aktywujących. funkcji komórek. Utrwalanie pomaga nie tylko zamrozić stan funkcjonalny płytek krwi na badanym etapie procesu cytofizjologicznego, ale również jest często zasadniczym warunkiem permeabilizacji tych komórek dla niektórych reagentów stosowanych w protokołach badawczych i pomiarowych (1,7,8). Do utrwalania najpowszechniej stosuje się formaldehyd lub paraformaldehyd (w stężeniach 1-2% w PBS ph 7.0), niekiedy etanol, rzadziej glutaraldehyd. Można byłoby spodziewać się, że alkohole są lepszym wyborem, gdyż aldehydy reagując z różnorodnymi aminami w komórce mogą same w sobie warunkować powstawanie fluoryzujących pochodnych. Nie znajduje to jednak odzwierciedlenia w metodologii badania płytek krwi przy użyciu cytometrii, gdyż najpowszechniej stosuje się tu właśnie 1% paraformadehyd. Mechanizm utrwalania jest podobny dla większości substancji utrwalających: powodują one denaturację i/lub sieciowanie białek. Nie dziwi zatem, że w przypadku niektórych antygenów powierzchniowych na płytkach krwi, proces utrwalania przyczynia się do znaczącego spadku wiązanie przeciwciał z komórkami. Często utrwalaniu może towarzyszyć tworzenie agregatów komórkowych, co może być niepożądane w sytuacjach gdy chcemy badać pojedyncze niezgrupowane komórki, albo wnioskować o stopniu fizjologicznej agregacji w płynie biologicznym. W wielu protokołach przygotowania materiału do pomiarów cytometrycznych zaleca się stosowanie utrwalaczy razem z detergentami, aby przyspieszyć penetrację cząsteczek utrwalacza i ułatwić jego dystrybucję w komórkach. W badaniach płytek krwi stosowanie detergentów nie znalazło szerszego zastosowania. Warto pamiętać, że utrwalanie zmienia zdolności refrakcyjne komórek: współczynnik refrakcji cytoplazmy wzrasta z ok w komórkach żywych do ponad 1.5 w komórkach utrwalonych. Ponieważ współczynnik ten decyduje o wartościach parametru rozproszenia bocznego światła (SSC), należy pamiętać że komórki utrwalane będą się charakteryzowały znacznie podwyższonymi wartościami SSC, co może przyczyniać się do ich lepszej dyskryminacji w obrazie cytometrycznym. Jednak zwiększone rozpraszanie boczne utrwalonych komórek może mieć także wpływ na precyzję pomiarów fluorescencji, ponieważ zmiany konformacyjne struktur komórkowych na skutek utrwalania mogą wpływać na zmiany amplitudy sygnałów fluorescencji. Utrwalanie może utrudniać interpretację wyników badań, gdyż często zmienia wielkość komórek, a zatem proces ten w jakimś stopniu przekłamuje fizjologiczny obraz cytometryczny płytek krwi. Pomimo wielu korzyści jakie niesie ze sobą utrwalanie komórek w badaniach antygenów powierzchniowych (np. ochrona przed samoistną aktywacją), należy zaznaczyć, że działanie utrwalaczy na białka komórkowe może się wiązać ze zmianami konformacji tych białek na tyle rozległymi, że wybrane epitopy antygenów powierzchniowych przestają być rozpoznawane przez stosowane przeciwciała monoklonalne. Dlatego też, przed podjęciem decyzji o utrwalaniu badanych komórek wskazane jest udzielić sobie odpowiedzi na dwa zasadnicze pytania: (a) czy przeciwciała monoklonalne pozostają związane z epitopem po utrwaleniu?, oraz (b) czy epitop nie ulega istotnej zmianie na skutek zmian struktury chemicznej wywołanych utrwalaniem? Biorąc powyższe pod uwagę, często warunkiem przeprowadzenia efektywnego znakowania jest stosowanie żywych nieutrwalanych komórek. Z uwagi na nieprzewidywalne często efekty jakie może pociągać za sobą utrwalanie materiału badawczego, należałoby stosować stały protokół utrwalania i znakowania komórek w celu uzyskiwania w pełni porównywalnych wyników. Obok skrajnych opcji protokołu przygotowywania komórek do analizy (analiza komórek utrwalonych lub nieutrwalonych), niekiedy utrwalanie stosuje się w stosunku do płytek krwi uprzednio wyznakowanych odpowiednimi przeciwciałami. Często prowadzi to do większej powtarzalności zbieranych wyników, rzadziej, obserwujemy znaczący spadek świecenia obiektów utrwalonych (najprawdopodobniej na skutek obniżania trwałości wiązania antygen-przeciwciało). Dobór przeciwciał i stosowanie przeciwciał izotypowych. Z uwagi na olbrzymie zróżnicowanie powinowactwa różnych przeciwciał w kierunku określonych antygenów, godna polecenia jest jak największa powtarzalność procedury znakowania, a nawet stosowanie przeciwciał z tej samej serii produkcyjnej w danej serii doświadczeń. Oddzielnym problemem, z jakim badaczowi płytek krwi metodą cytometrii przychodzi się często zmierzyć, jest duża różnorodność komercyjnie dostępnych przeciwciał, z których żadne nie są niestety dokładnie scharakteryzowane co do rozpoznawanej determinanty antygenowej. Z tego względu najbardziej pożądane byłoby zastosowanie dopełniających do cytometrii narzędzi i technik obrazowania (np. Image Stream) (9), po to aby sprawdzić specyfikę wiązania poszczególnych przeciwciał, które chcemy stosować później korzystając z cytometrii przepływowej (10). Weryfikacja taka umożliwia potwierdzenie lub zaprzeczenie specyficzności na dwóch poziomach: (a) czy przeciwciało wiąże się selektywnie do wybranego antygenu występującego na komórkach określonego typu; w naszym przypadku oczekiwalibyśmy, że np. przeciwciało anty-cd61 będzie się wiązać preferencyjnie do płytek, a nie do innych komórek krwi (tutaj nie możemy wykluczyć zupełnie wiązania np. do leukocytów, do których mogą przylegać fragmenty błon komórkowych płytek, lecz gęstość takich antygenów na krwinkach białych będzie bez porównania mniejsza niż na samych płytkach, co ujawni się w obrazach cytometrycznych), oraz (b) czy występuje współzawodnictwo wiązania przeciwciał znakowanych i nieznakowanych do danego antygenu. Tak w przypadku badania płytek krwi, jak i w przypadku badania innych komórek, w celu wiarygodnego ustawienia markerów fluorescencji oraz zdefiniowania położenia komórek antygeno-negatywnych zaleca się dość powszechnie wykonywanie tzw. próby kontrolnej, tzn. znakowania kontrolnymi przeciwciałami izotypowymi, dla każdej serii oznaczeń (11,12). W próbie takiej zamiast przeciwciał monoklonalnych stosowanych do wykrywania określonego antygenu powierzchniowego wykorzystuje się przeciwciała IgG klasy takiej jak stosowane przeciwciała monoklonalne, po to aby przekonać się jakie jest wiązanie niespecyficzne przeciwciał do powierzchni komórek (tzn. wiązanie nie wynikające z selektywnego rozpoznawania epitopu badanego antygenu przez przeciwciało monoklonalne, a jedynie z przylegania/opłaszczania komórek przez cząsteczki białkowe). Zakłada się przy tym, że zarówno charakterystyka wiązania niespecyficznego, jak i własności biochemiczne przeciwciał izotypowych są takie same jak przeciwciał monoklonalnych stosowanych do badania określonego antygenu. Założenie takie nie zawsze okazuje się prawdziwe (przeciwciała izotypowe i przeciwciała monoklonalne mogą się np. różnić strukturą ciężkiego łańcucha immunoglobulin), dlatego też położenie populacji wiążących niespecyficznie przeciwciała izotypowe i przeciwciała monoklonalne może się nieco różnić (Ryc. 1). 4 5

4 Ryc. 1. Wykresy kropkowe ludzkich płytek spoczynkowych znakowanych przeciwciałami izotypowymi klasy IgG (A, B) dla przeciwciał rozpoznających antygen CD62P (FL2) i dla przeciwciał PAC-1 (FL1). Płytki nieutrwalone we krwi pełnej wybramkowano na obecność antygenu CD61 znakowanego Per-CP. Stwierdzono, że takie niespecyficzne wiązanie przeciwciał zachodzi przy udziale receptora FcRII (CD32). Ponieważ wiązanie immunoglobulin do receptora FcRII jest wyższe w komórkach pobudzonych (na skutek wyższej ekspresji receptora) (5), należałoby blokować receptor FcRII lub wykonywać osobną próbę kontrolną dla komórek stymulowanych (13). Ponieważ różne serie komercyjnie dostępnych przeciwciał izotypowych oraz przeciwciał swoistych zawsze w jakimś stopniu się różnią pod względem stechiometrii wyznakowania fluoroforem (zob. tez niżej), zbierając wyniki w dłuższym interwale czasu (a więc ze znikomą szansą zastosowania tej samej serii przeciwciał) musimy mieć świadomość, że zmienność blokowa kolejnych eksperymentów będzie zwiększona. Mając to na uwadze, bardzo uzasadnione jest korzystać przy analizie danych pochodzących z rozciągniętego w czasie eksperymentu z metod dwuczynnikowej analizy wariancji w modelu zrównoważonych bloków (bez interakcji). Idealnie, przeciwciała swoiste powinny być wyznakowane fluoroforem ze stechiometrią zgodną z wyznakowaniem stosowanych w pomiarach przeciwciał izotypowych. Jak wiemy, często tak nie jest. Toteż inną ważną implikacją faktu, iż stechiometria znakowania przeciwciał izotypowych jest inna niż przeciwciał swoistych, jest uświadomienie sobie kierunku przekłamywania wyniku rzeczywistego naszego pomiaru. Jeżeli stosowane przeciwciała izotypowe są wyznakowane gęściej (tzn. świecą intensywniej) niż przeciwciała swoiste, to mierzona populacja płytek krwi (lub ogólnie: obiektów badanych) będzie z reguły zubożona o subpopulacje słabo wyznakowane. W przeciwnym przypadku mierzona populacja będzie bogatsza o obiekty, które nie wcale są płytkami krwi (cząstki kurzu, bakterie, itp.). Problemy takie skłaniają niektórych badaczy do stosowania innych sposobów standaryzacji pomiaru (np. immunokompetycja między przeciwciałami swoistymi znakowanymi i nieznakowanymi fluorescencyjnie lub arbitralne określanie regionów płytek antygeno-pozytywnych) (2-4,6). Warto zwrócić uwagę, że odtwarzalność stałej stechiometrii wiązania fluoroforu do przeciwciała nie jest jednakowa dla wszystkich znaczników fluorescencyjnych i niekiedy może się dość znacznie wahać w zależności od rodzaju i serii przeciwciał, czasu i warunków ich przechowywania, itp. Znacznikiem, którego stechiometria wiązania z immunoglobulinami jest wysoce odtwarzalna (jest ona bliska stosunkowi 1:1) w różnych preparatach przeciwciał jest fikoerytryna. Z drugiej strony, stechiometria innego powszechnie stosowanego w cytometrii fluoroforu fluoresceiny, a właściwie jej pochodnej FITC, może się wahać w zakresie (1). Niestety, dostępne komercyjnie przeciwciała nie są scharakteryzowane pod względem ilości przyłączonego do nich znacznika. Można pokusić się o ustalenie takiej stechiometrii wiązania we własnym zakresie np. na podstawie znajomości wydajności kwantowej fluoroforu i stężenia białka. Z powyższych względów, zaleca się aby do potrzeb kalibracji starać się dobierać najlepiej przeciwciała znakowane fikoerytryną. Badanie ekspresji antygenu oraz liczby kopii antygenu. Na podstawie rejestrowanej emisji fluorescencji oceniamy zarówno powszechność występowania antygenu powierzchniowego błon płytkowych (na ilu komórkach występuje, parametr wyrażany w %), jak i gęstość powierzchniową (w ilu kopiach lub jak licznie występuje on na powierzchni komórek). Parametr zwany ekspresją receptora w płytkach określa w rzeczywistości frakcję komórek postrzeganych przez cytometr jako płytki antygeno-pozytywne (8,14). Ponieważ próg czułości techniki cytometrii przepływowej wyznacza liczbę kopii antygenu jako dolną granicę antygenopozytywności (tzn. płytka krwi posiadająca przynajmniej rozpoznawalnych przez przeciwciała epitopów antygenowych na swojej powierzchni będzie rejestrowana przez cytometr jako płytka antygeno-pozytywna), wszelkie fluktuacje liczby epitopów antygenowych na powierzchni pojedynczej płytki poniżej tej granicy, będą niezauważalne dla aparatury pomiarowej. Analogicznie, płytki krwi eksponujące na swej powierzchni mniej niż 800 kopii danego antygenu zostaną zdyskryminowane jako płytki antygeno-negatywne. Obfitość występowania danego antygenu na powierzchni błon komórkowych płytek (liczba kopii antygenu; wyrażana albo jako liczba cząsteczek antygenu przypadająca na jedną komórkę - wtedy gdy mamy możliwość kalibracji wiązania znakowanych przeciwciał do komórek, albo częściej - jako mediana intensywności fluorescencji). Podczas gdy ekspresja antygenu odzwierciedla zmiany występowania określonego antygenu w badanych procesach cytofizjologicznych (np. pojawianie się antygenów nieobecnych w płytkach niepobudzonych, lecz prezentowanych na powierzchni płytek po aktywacji), drugi pozwala rejestrować powszechność występowania antygenu w błonie cytoplazmatycznej. Do kalibracji gęstości rozmieszczenia antygenu w błonie płytkowej stosuje się zestawy znakowanych fluorescencyjnie kuleczek żywicowych (lub z tworzyw sztucznych) o rozmiarach odpowiadających zakresom rozmiarów pojedynczych płytek oraz ich agregatów (zob. niżej) i znanej gęstości cząsteczek znacznika przypadających na kulkę. Dysponując szeregiem kalibratorów z różną liczbą przyłączonych cząsteczek fluoroforu można wyznaczyć krzywą standaryzacyjną i w oparciu o nią dokonać bezwzględnej oceny ilościowej liczby kopii antygenu przypadającej średnio na powierzchnię jednej badanej płytki krwi. Taki sposób kalibracji sprawdza się dobrze dla antygenów licznie lub bardzo licznie występujących w błonie płytkowej (np. CD tys., CD42b 25 tys.). Więcej problemów może doświadczyć badacz usiłujący ocenić liczbę kopii antygenu mniej powszechnie reprezentowanego, 6 7

5 np. PAR-1 (około 1000 kopii). W płytkach aktywowanych trombiną receptor ten zostaje trawiony i jego gęstość rozmieszczenia w błonie maleje (15-19). Rejestrując zmiany liczby kopii PAR-1 w błonie płytek,,możemy uzyskać dichotomiczny rozkład zbieranych wyników (jest gdy liczba kopii > , lub brak gdy liczba kopii < 800). W sytuacji takiej wygodnie jest zastosować różne rodzaje przeciwciał, rozpoznające formę nietrawioną oraz formę trawioną receptora PAR-1 (18-23). Dodatkowo, mając świadomość faktu, iż niektóre fluorofory charakteryzują się wyższą wydajnością kwantową fluorescencji, najkorzystniej byłoby stosować przeciwciała nimi właśnie wyznakowane w badaniach antygenów mało licznych w błonie krwinek płytkowych. Sygnał fluorescencji można także dodatkowo zwiększać stosując obficie wyznakowane przeciwciała skierowane przeciwko samemu fluoroforowi, np. fluoresceinie czy FITC (24-26). Fenotypowanie płytek krwi na podstawie określenia ekspresji i liczebności kopii antygenów powierzchniowych W przypadku analizy powierzchniowych markerów antygenowych płytek krwi warto zwrócić uwagę na dwa typy antygenów powierzchniowych, których badanie oraz interpretacja wyników może napotykać pewne problemy, zwłaszcza u niedoświadczonych badaczy. Problemy te można roboczo podzielić Receptory/ antygeny konstytutywne to takie markery powierzchniowe, które zawsze występują na powierzchni komórki, a ich ekspresja w komórkach funkcjonalnych wynosi zawsze (przynajmniej z założenia) 100%. Są to antygeny, które stanowią dla nas najczęściej markery służące do bramkowania regionu określonej populacji/subpopulacji komórek. Jest zatem mały sens badania zmian ekspresji takich antygenów w funkcjonalnych pobudzanych komórkach, skoro ich występowanie jest warunkiem sine qua non poprawnej i wiarygodnej dyskryminacji danego typu komórek od innych obiektów. Można natomiast badać liczbę kopii takiego typu antygenu, np. jako względne zmiany natężenia fluorescencji w miarę wzrostu aktywacji komórek. Dynamika takich zmian fluorescencji jest tożsama ze zmianami liczby kopii antygenu konstytutywnego w następstwie zadziałania bodźca. Przykładem takiego konstytutywnego antygenu w płytkach krwi jest np. antygen CD61, leżący na glikoproteinie IIIa płytek krwi. Przyjmuje się, że występowanie tego antygenu jest immanentną cechą płytek krwi przyjęło się wręcz, iż obiektów, które nie wykazują na swojej powierzchni obecności antygenu CD61 nie klasyfikujemy jako płytki krwi (27). Antygen ten, pomimo, że na stałe obecny w błonie cytoplazmatycznej płytek nawet w stanie niepobudzonym, może zwiększać swoją liczebność około dwukrotnie w następstwie aktywacji komórek, kiedy z ziarnistości uwalniane są dodatkowe kopie kompleksu glikoprotein IIb/IIIa. Sytuacja taka dotyczy wszystkich przypadków z wyjątkiem pacjentów ze skazą krwotoczną zwaną trombastenią Glanzmann a. U osób takich płytki nie zawierają funkcjonalnego receptora GPIIb/IIIa (lub którejś z jego składowych), lub zawierają drastycznie obniżoną liczbę kopii tego receptora, albo też jedynie nieliczne frakcje płytek zawierają obniżoną liczbę jego kopii (28-30). W przypadkach takich, ekspresja antygenu CD61 określana metodą cytometrii przepływowej istotnie będzie się kształtowała poniżej 100%. Na tym polega właśnie prosty test diagnostyczny na wykrywanie tej skazy krwotocznej metodą cytometrii silnie obniżona ekspresja CD61 w płytkach w stanie spoczynkowym oraz minimalne zmiany pod wpływem działania czynników aktywujących wskazują, że mamy do czynienia z trombastenią Glanzmann a. Oczywiście, w celu wiarygodnej diagnostyki należy wybrać inny antygen bramkujący (np. CD36 lub CD42b) charakterystyczny dla płytek krwi w taki sposób, aby objąć analizą możliwie najpełniejszą populację płytek. Ponieważ w tym przypadku, żaden inny antygen powierzchniowy nie występuje na płytkach tak uniwersalnie jak CD61, spełnienie tego ostatniego warunku nigdy nie jest całkowicie możliwe (2-4,6). Antygeny zmieniające ekspresję powierzchniową to takie, które pojawiają się lub giną na powierzchni płytek aktywowanych. Najpowszechniej bodaj monitorowany antygen aktywacji płytek krwi, selektyna P (GMP-140, CD62P), to białko występujące w płytkach niepobudzonych w ziarnistościach i pojawiające się w błonach powierzchniowych w następstwie egzocytozy po aktywacji komórek. Jest to typowy marker aktywacji płytek: występuje w minimalnych ilościach w błonach powierzchniowych płytek w stanie niepobudzonym (poniżej progu detekcji metodą cytometrii), zaś jego masywne uwalnianie do błon komórkowych występuje w następstwie aktywacji płytek krwi. Najbardziej użytecznym parametrem wskazującym na stopień aktywacji płytek na podstawie reakcji uwalniania jest pomiar ekspresji (a nie liczby jej kopii!) selektyny P (28,31,32) (Ryc. 2). Ryc. 2. Analiza cytometryczna ekspresji selektyny P w ludzkich płytkach spoczynkowych (A, B), płytkach aktywowanych 10 μm ADP (C, D), 10 μg/ml kolagenem (E, F) lub 10 μm TRAP-14 (G, H). Płytki we krwi pełnej wybramkowano na obecność antygenu CD61 (FL1) i wyznakowano przeciwciałami skierowanymi przeciw antygenowi CD62P (FL2). Umownie zaznaczone regiony P2, P4 i P5 odnoszą się odpowiednio do mikropłytek, normopłytek i agregatów płytkowych 8 9

6 Ponieważ receptory antygenu CD62P znajdują się w błonach monocytów i neutrofili, wzrostowi jej ekspresji towarzyszy najczęściej wzrost frakcji agregatów płytek krwi z monocytami i płytkowo-neutrofilami. Inne powszechnie analizowane antygeny aktywacji płytek krwi to białko ziarnistości gęstych, CD63, antygen CD40L lub aktywna forma receptora dla fibrynogenu. Antygeny internalizowalne to takie, które paradoksalnie zmniejszają swoją ekspresję w procesie aktywacji komórek, ulegając na przykład redystrybucji do błon struktur wewnątrzkomórkowych (np. antygen CD42b na glikoproteinie GPIb w płytkach krwi). W tym przypadku malejąca ekspresja takiego antygenu może być markerem postępującej aktywacji komórki (6,33-35). W sytuacjach takich należy mieć na uwadze ryzyko błędnej interpretacji wyników zmniejszanie ekspresji antygenu(ów) nie musi bowiem wynikać jedynie z aktywacji komórek, ale może także wskazywać na zużycie komórek i degradację niektórych antygenów na ich powierzchni. Aby ustrzec się takiego błędu pożądane jest zwykle równoległe monitorowanie kilku markerów aktywacji i rejestracja równoległości zmian (Tabela 1). Badanie funkcji płytek jako komórek ulegających łatwej spontanicznej aktywacji w warunkach in vitro aktywacja i reaktywność płytek krwi Badania funkcji płytek krwi opierają się głównie na pomiarach ich aktywacji oraz zdolności do adhezji i agregacji. Płytki krwi są komórkami wyjątkowo wrażliwymi na działanie czynników aktywujących (np. izolowania czy przemywania) (36,37). Dlatego też badania zmierzające w kierunku obiektywnej oceny funkcji płytek krwi napotykają poważne trudności metodologiczne, gdyż praktycznie nie jest możliwe określenie stanu aktywacji płytek in vivo. Podstawowe testy diagnostyczne do badania funkcji płytek krwi mają wiele ograniczeń metodycznych i nie pozwalają na jednoczesne określanie aktywacji i reaktywności płytek krążących jako parametrów użytecznych w badaniach klinicznych (38,39). Badania płytek we krwi pełnej metodą cytometrii przepływowej, pozwalającą badać jednocześnie aktywację płytek krwi (stan pobudzenia) oraz reaktywność (odpowiedź na aktywację), pozbawione są większości ograniczeń i mogą być przeprowadzone przy użyciu minimalnej objętości krwi. Z oczywistych względów, aktywację płytek najwygodniej jest śledzić stosując przeciwciała monoklonalne, które wiążą się i rozpoznają selektywnie płytki podaktywowane, lecz nie wiążą się do płytek w stanie spoczynkowym. W grupie przeciwciał rozpoznających różne formy receptora dla fibrynogenu znajdują się na przykład takie, które rozpoznają (a) zmiany konformacyjne receptora wynikające z odsłonięcia miejsc wiążących dla ligandu (PAC-1) (40), (b) zmiany konformacyjne receptora wynikające ze związania ligandu (LIBS1, LIBS6, AP-6) (41), czy (c) zmiany konformacyjne ligandu (fibrynogenu) po jego związaniu z receptorem. Alternatywnym podejściem jest stosowanie przeciwciał, które wiążą się w niewielkim stopniu do płytek w stanie spoczynkowym, lecz wiązanie to nasila się w miarę wzrostu aktywacji płytek (np. anty-cd36 wiążące się z glikoproteiną GPIV) (42). Możliwość stosowania metody cytometrii przepływowej do badania płytek w pełnej krwi, bez potrzeby izolowania krwinek płytkowych lub bogatopłytkowego osocza, istotnie ogranicza ryzyko artefaktów pomiarowych. Ocena aktywacji czy reaktywności płytek pod wpływem różnych czynników aktywujących opiera się na określeniu frakcji płytek antygeno-pozytywnych pod względem obecności wybranych glikoprotein błony płytkowej stanowiących markery aktywacji (np. selektyny P (CD62), GPIb (CD42b) czy antygenu miejsca wiążącego fibrynogen w kompleksie GPIIb-IIIa (PAC-1)), oraz frakcji mikropłytek i agregatów (2-4,6,16,43) (Ryc. 2). Przy nieobecności zewnętrznych czynników pobudzających płytki (agonistów) pomiar techniką cytometrii przepływowej we krwi pełnej określa stan aktywacji płytek krążących na podstawie liczby związanych przeciwciał monoklonalnych. Obecność i liczebność takich antygenów powierzchniowych jak selektyna P, glikoproteina Ib (składnik receptora dla czynnika von Willebrand a), czy aktywny kompleks glikoprotein IIb i IIIa (receptor dla fibrynogenu), na powierzchni błony komórkowej płytek zależy od stanu aktywacji płytek. Zawartość taka, wyrażona jako frakcja płytek wykazujących dodatnią ekspresję określonego antygenu powierzchniowego, może stanowić dogodny wskaźnik aktywacji płytek występujących w krążeniu. Warto zwrócić uwagę, że badane markery aktywacji komórek mogą mieć charakter neoantygenów (tzn. nie są zasadniczo obecne na powierzchni komórek w stanie spoczynkowym, ale pojawiają się jedynie w wyniku uwalniania z ziarnistości wewnątrzkomórkowych pobudzonych komórek, np. selektyna P) lub antygenów konstytutywnych (obecnych zawsze na powierzchni komórek, nawet w stanie niepobudzonym, ale zmieniających dramatycznie swoją liczebność w następstwie aktywacji, np. antygen CD42b na glikoproteinie Ib, lub aktywna forma GPIIb/IIIa) (6,33-35,40). Zarówno jedne, jak i drugie antygeny powierzchniowe mogą być użytecznymi markerami procesów cytofizjologicznych: wiadomo na przykład, że zarówno pojawianie się nowych antygenów, jak i zmiany obfitości występowania antygenu w błonach komórkowych są wynikiem uruchomienia reakcji uwalniania zawartości ziarnistości wewnątrzkomórkowych. W procesie tym błona pęcherzyków wewnątrzpłytkowych ulega fuzji z błona cytoplazmatyczną, a glikoproteiny obecne w błonach ziarnistości wewnątrzkomórkowych przedostają się do błony cytoplazmatycznej i są eksponowane na powierzchni płytek. Poprzez dodatkowe zastosowanie zewnętrznych (egzogennych) czynników aktywujących komórki metoda cytometrii pozwala także analizować reaktywność płytek krwi w warunkach ex vivo w ich fizjologicznym środowisku, jako specyficzną odpowiedź funkcjonalną przejawiającą się w zmianach ekspresji powierzchniowych receptorów błonowych płytek krwi. Tak rozumiana reaktywność płytek jest funkcją zużycia i wyczerpania płytek krążących. Zatem wyniki aktywacji płytek dają badaczowi pojęcie nas temat tego czego komórki doświadczyły w krążeniu (śladem epizodów aktywacji w krążeniu będą zmiany ekspresji antygenów-markerów, np. selektyny P). Z drugiej strony, wyniki reaktywności pozwalają wnioskować o tym, na co komórki jeszcze stać i jak dalece są one jeszcze funkcjonalne i zdolne do pełnienia określonej roli w organizmie (obniżona reaktywność na działanie bodźców oznacza obniżoną funkcjonalność i większe zużycie komórek). Cytometryczna analiza funkcji płytek powinna być zawsze wieloparametrowa, dokonywana z pełnym zrozumieniem cytofizjologii i patofizjologii poszczególnych markerów dobranych jako wyznaczniki aktywacji tych komórek. Analiza jedno- lub dwuwymiarowa może bowiem często prowadzić do przekłamań wyników analizy i przywodzić badaczy do błędnych wniosków. Na przykład, badacz rejestrujący niewielkie wartości ekspresji markerów aktywacji płytek nie jest upoważniony do orzekania niewielkiej aktywacji płytek krążących, dopóki nie wykona oznaczeń reaktywności (cytometria) oraz stężenia rozpuszczalnych antygenów aktywacji (immunochemia). Dlaczego? Ponieważ wiele spośród tych antygenów aktywacji (np. CD62P, CD40L, CD42b) występuje w błonie komórkowej płytek przejściowo, a następnie ulega złuszczeniu do osocza krwi (scd62p, scd40l, glikokalicyna) (44-49). Niewykrywanie antygenów aktywacji w błonach powierzchniowych płytek nie jest świadectwem, iż epizody aktywacji nie miały miejsca w łożysku naczyniowym. Wykrycie podwyższonych stężeń tych antygenów w osoczu może być dla badacza użyteczną wskazówką, pozwalającą na sprecyzowanie dwóch wniosków. Po pierwsze, brak podwyższonej ekspresji antygenów-markerów aktywacji płytek w błonie komórkowej oraz wykrycie podwyższonych stężeń ich rozpuszczalnych form w osoczu, świadczyć może o tym, że doszło kiedyś do epizodu aktywacji komórek, ale było to na tyle dawno, że antygeny błonowe uległy złuszczeniu i znalazły się w osoczu. To może przemawiać za okazjonalnością epizodów aktywacji, gdyż jeżeli występowałyby często to najprawdopodobniej zostałyby wykryte zarówno w błonach płytek, jak i w osoczu. Pomiary reaktywności, czyli odpowiedzi płytek na działanie agonistów w warunkach ex vivo, dostarczają nam dodatkowych argumentów. Słaba odpowiedź płytek na działanie agonistów to pośredni dowód na zużycie płytek krążących w łożysku naczyniowym. Takie płytki podlegały najprawdopodobniej częstym epizodom aktywacji w krąż Wiele spośród tych antygenów aktywacji (np. CD62P, CD40L, CD42b) występuje w błonie komórkowej płytek przejściowo, a następnie ulega złuszczeniu do osocza krążeniu, a ich słaba odpowiedź na aktywatory może wynikać z wyczerpania zasobów wewnątrzpłytkowych (płytka jako komórka bezjądrzasta nie dysponuje sprawnym aparatem biosyntezy białka de novo) (Tabela 1) (2-4). Odpowiedź płytek krwi na różne aktywatory (agonistów) zależy od wielu czynników fizjologicznych czy patofizjologicznych, lecz także tych wynikających z różnic w metodyce i protokole badania, m.in. (a) tego, czy płytki krwi badamy we krwi pełnej, czy w osoczu bogatopłytkowym czy w zawiesinie wyizolowanych płytek w buforze, (b) tego, jaki marker aktywacji pragniemy monitorować, (c) tego, czy badamy komórki na świeżo czy w próbach utrwalonych, a nawet (d) tego, na jaki antykoagulant została pobrana krew do badań. Mając to na uwadze, powinniśmy unikać stosowania różnych protokołów do badania wybranych parametrów aktywacji czy reaktywności płytek czy nawet przeciwciał różnych producentów (zagrożenie takim postępowaniem może mieć miejsce np. w projektach wieloośrodkowych). Na przykład, płytki izolowane w buforze mogą odpowiadać słabiej niż we krwi pełnej, płytki w próbach utrwalonych mogą zawierać większe frakcje agregatów, wreszcie, niektórych agonistów nie sposób stosować bez modyfikacji protokołów oznaczeń. Do silnych agonistów powszechnie zalicza się trombinę, peptydy TRAP, czy kolagen, do słabych ADP, kwas arachidonowy, epinefryna (Ryc. 3)

7 Tabela 1. Przykładowa interpretacja wyników cytometrycznej analizy aktywacji i reaktywności płytek krwi. aktywacja płytek spoczynkowych we krwi krążącej reaktywność in vitro stężenie rozpuszczalnych form antygenów w osoczu wniosek podwyższona podwyższona niskie płytki podaktywowane (artefaktualnie?), o normalnej funkcjonalności, brak oznak częstych epizodów aktywacji w krążeniu podwyższona niska wysokie płytki podaktywowane (naturalnie?), o małej funkcjonalności, zużyte na skutek częstych epizodów aktywacji w krążeniu niska podwyższona niskie płytki o pełnej funkcjonalności i wysokim potencjale hemostatycznym niska podwyższona wysokie płytki o pełnej funkcjonalności, w przeszłości nieokazjonalne epizody aktywacji w krążeniu Ryc. 3. Wykresy kropkowe zależności czołowego rozproszenia światła (FSC) od bocznego rozproszenia światła (SSC) (A, B, D, F) oraz fluorescencji w kanale FL1 (PAC-1, aktywny kompleks GPIIbIIIa) od fluorescencji w kanale FL2 (anty-cd62p-pe, selektyna P) (C, E, G) dla ludzkich płytek spoczynkowych (B, C) oraz płytek aktywowanych 10 μm ADP (D, E) lub 10 μg/ml kolagenem (F, G). Płytki w nieutrwalonej krwi pełnej wybramkowano na antygen CD61 przy użyciu przeciwciał anty-cd61 znakowanych Per-CP. Kropki czerwone odpowiadają obiektom barwionym na CD62P, kropki zielone obiektom z przyłączonymi przeciwciałami PAC-1. Wykres A przedstawia rozkłady wielkości kulek polistyrenowych. Pionowe linie przerywane na wykresach kropkowych płytek oznaczają wielkości obiektów oznaczone na podstawie średnich wielkości subpopulacji kulek. Obrysy regionów występowania mikropłytek, normopłytek i agregatów płytkowych oznaczono linią przerywaną, odpowiednio w kolorach zielonym, czerwonym i niebieskim. Ogólnie, stopień zmian ekspresji danego antygenu, na podstawie którego wnioskujemy o stopniu aktywacji płytek, jest w oczywisty sposób uzależniony od biologii badanego antygenu markera aktywacji. Na przykład, zmiany ekspresji aktywnej formy receptora dla fibrynogenu (w płytkach ludzkich wykrywane przy użyciu przeciwciał PAC-1, w płytkach mysich JON/A) będą bardziej widoczne w płytkach aktywowanych ADP niż zmiany w ekspresji selektyny P. Płytki krwi pobranej na 3.2% cytrynian sodu będą odpowiadały mniejszymi zmianami ekspresji selektyny P czy aktywnej formy receptora dla fibrynogenu niż płytki w próbach pobranych na hirudynę. Wreszcie, w celu zastosowania niektórych agonistów musimy zmodyfikować protokół znaczeń, np. stosując trombinę w próbkach krwi pełnej czy bogatopłytkowego osocza (lecz nie w zawiesinach izolowanych płytek) musimy suplementować próby dość wysokimi stężeniami peptydu H-Gly-Pro-Arg-Pro-NH2 (0.5 mm), aby zapobiec polimeryzacji i stabilizacji tworzącego się w obecności trombiny włóknika (50). Badania zużycia i rozpadu (niszczenia) komórek oraz ich agregacji charakterystyka mikropłytek i agregatów płytkowych Chociaż frakcja agregatów komórkowych powstałych w warunkach krążenia in vivo może być oceniana jako niezależny parametr przy użyciu cytometrii przepływowej, to aby obiektywnie przypisać temu parametrowi znaczenie funkcjonalne, należy mieć świadomość, że technika ta nie pozwala nam określić ilości antygenu przypadającej na pojedynczą komórkę uwięzioną w agregacie złożonym z wielu komórek. Dzieje się tak dlatego, że cytometria umożliwia pomiar fluorescencji przypadającej na jeden obiekt (cząstkę), niezależnie od tego czy obiekt ten jest pojedynczą komórką czy agregatem wielu komórek. Wynika stąd, że duża liczba agregatów może istotnie fałszować rzeczywiste wartości fluorescencji odpowiadającej badanemu antygenowi powierzchniowemu i przypadającej na pojedynczą komórkę. Metodyka przygotowania materiału biologicznego do badań cytometrycznych powinna zatem być spójna ze strategią minimalizowania liczby agregatów komórkowych wynikających z błędów metodycznych przy pobieraniu i preparatyce krwi. Biorąc powyższe pod uwagę, można założyć, że cytometria pozwala na przybliżone oszacowanie frakcji agregatów jako obiektów większych od pojedynczych komórek (tzn. bardziej rozpraszających czołowo światło większe wartości FSC) w zbiorowości badanych obiektów (np. komórek krwi) (3). Należy jednak mieć świadomość, że pojedynczy obiekt o większych rozmiarach liniowych rejestrowany przez cytometr jako agregat jest zbiorowiskiem od kilku do kilkunastu czy wyjątkowo nawet kilkudziesięciu komórek. Zatem stwierdzenie występowania np. 2% frakcji agregatów komórkowych nie oznacza wcale, że 2% komórek badanej populacji jest uwięzione w agregatach; w rzeczywistości, komórek występujących w formie agregatów jest o wiele więcej. Metoda taka jest jednak zupełnie wystarczająca w badaniach porównawczych, chociaż wyznaczenie przedziałów wielkości (wartości parametru FSC) dla agregatów jest w dużej mierze umowna. Dodatkowe zastosowanie kuleczek kalibracyjnych o różnej średnicy umożliwia określenie sferycznych wymiarów agregatów komórkowych, zaś dodatkowe zastosowanie przeciwciał rozpoznających odpowiednie markery powierzchniowe (np. anty- -CD61/FITC dla płytek krwi, anty-cd11b/18/pe dla neutrofilów czy anty-cd14/pe dla monocytów) pozwala ocenić udział poszczególnych typów komórek w agregatach międzykomórkowych (37). Podobnie, zjawisko czołowego rozpraszania światła wykorzystuje się przy badaniu zawartości frakcji mikrocząstek (np. mikropłytek) (36,43,51-54). Mikrocząstki komórkowe (włączając mikropłytki) to małe obiekty ( μm), obejmujące egzosomy (mniejsze, nm; często mylnie klasyfikowane do tej samej kategorii co mikropłytki), mikrocząstki (mikropęcherzyki > 100 nm), ciałka apoptotyczne, itp., które zawierają wewnątrz białka ziarnistości wewnątrzkomórkowych (tak jak w egzosomach), lub eksponują markery powierzchniowe macierzystych komórek w błonach (tak jak np. w mikropłytkach). W przypadku płytek krwi mikrocząstki mogą być uwalniane z ziarnistości płytkowych (egzosomy) lub na skutek złuszczania błon komórkowych w procesie mikrowezykulacji (właściwe mikropłytki) (55,56). Biologia i fizjologia mikropłytek właściwych i egzosomów jest odmienna, lecz ponieważ bardzo trudno - ze względów metodycznych, zdyskryminować poprawnie te dwa typy obiektów, często określa się je łącznie mianem mikropęcherzyków. We krwi krążącej mikropłytki występują licznie w osoczu (stanowią aż do 70-90% całej puli mikrocząstek w osoczu) także w niechorobowych stanach fizjologicznych. Są one wygodnym markerem zużycia i/lub rozpadu komórek, a ich zwiększone miana mogą towarzyszyć niektórym chorobom (57,58) i często są uważane za ich swoiste markery diagnostyczne (np. mikropłytki 12 13

8 w procesach zakrzepicy, czy mikrocząstki śródbłonkowe w niewydolności zastoinowej serca) (52-54). W przypadku płytek krwi, mikrocząstki, posiadające na swej powierzchni liczne kopie antygenów CD41/ CD61, mogą wykazywać bardzo dużą aktywność biologiczną (prokoagulacyjną) dzięki PS eksponowanej w błonach (choć nie wszystkie mikropłytki ją posiadają) i dlatego stanowią wygodny wskaźnik reaktywności i/lub nadwrażliwości komórek w różnych stanach chorobowych (59,60). Chociaż mikropłytki mogą być badane także z zastosowaniem innych technik, jak mikroskopia sił atomowych, elektrochemiczna spektroskopia impedancyjna, technika dynamicznego rozpraszania światła, techniki ELISA, czy testy funkcjonalne, wykorzystanie standardowej techniki cytometrii ma szereg walorów w badaniu tych obiektów, a najważniejsze to możliwości enumeracyjne i możliwość wybarwiania wieloma znacznikami (polichromatyczność). Niestety, zakres rejestrowania mikrocząstek jest jeszcze bardziej umowny niż w przypadku określania frakcji agregatów (61). Warto zaznaczyć, że zarówno techniki izolowania mikropłytek, jak i ich liczenia i w końcu, wybarwiania, przedstawiają sobą szereg ograniczeń metodycznych i stanowią nie lada wyzwanie dla badaczy, głównie w kontekście: (a) dobierania właściwych sił odśrodkowych przy wirowaniu, w zależności od ośrodka (osocze, bufor), (b) enumeracji mikrocząstek niewybarwionych, (c) modulacji intensywności fluorescencji mikrocząstek wybarwionych przeciwciałami, czy (d) analizy polichromatycznej różnych subpopulacji mikropłytek. Pierwszemu z wymagań przypisuje się szczególnie duże znaczenie w przypadku mikrocząstek płytkowych, najprawdopodobniej dlatego, że płytki krwi są komórkami bardzo małymi. Optymalnie, w celu pozyskania osocza pozbawionego komórek powinno się je poddawać dwustopniowej procedurze oczyszczania, w której najpierw pozyskuje się osocze całkowicie wolne od płytek ( x g, min), a następnie, osocze ubogopłytkowe wiruje się jeszcze raz przy znacznie większych siłach odśrodkowych ( x g, 30 min). Tak uzyskane osocze zawiera mikropłytki, lecz nie zawiera wolnych płytek, nawet tych starych (i małych) (62). Niestety, wraz z płytkami tracimy także mikrocząstki pochodzące z erytrocytów i innych krwinek (63). Najpowszechniej w celu detekcji mikropłytek metodą cytometrii stosowana jest analiza FSC (względny rozmiar obiektu) ze skalą liniową vs. SSC (ziarnistość) ze skalą logarytmiczną. Jak dotąd nie ustalono standardu i nie przyjęto jakiegoś konsensusu, jak wyznaczyć próg czułości, aby nie pomijać odpowiednio małych obiektów. W literaturze istnieją propozycje jak dokonać tego względnie obiektywnie, np. na podstawie barwienia na typowe antygenu powierzchniowe (duże ryzyko artefaktów, patrz niżej) lub w oparciu o szum tła (64). Zasadnicze pytanie dotyczy tego, jaki szum tła należałoby przyjąć za odcinający. Aby zmierzyć się z tym problemem, można np. wykorzystać ultra czysty roztwór soli fizjologicznej (np. PBS sączony dwukrotnie przez filtr o wielkości porów 0.2 μm), który będzie stanowił odnośnik dla progowej liczby obiektów szumu tła rejestrowanych w jednostce czasu przy danej wartości przepływu. Dobranie szczegółowych warunków progu odcięcia oraz wzmocnienia instrumentu pomiarowego zależy od konkretnego celu badawczego (np. wielkości subpopulacji mikropłytek, jakie chcemy rejestrować), należy jednak pamiętać, iż powszechnie przyjmuje się 0.3 μm za graniczną wartość wielkości mikrocząstek, które mogą wiarygodnie rejestrować nowoczesne cytometry (60,65). Ogromnym ułatwieniem dla identyfikacji mikropłytek mogłoby być równoległe śledzenie rozproszenia czołowego światła i fluorescencji mikrocząstek po wyznakowaniu (jeżeli to możliwe) przeciwciałem rozpoznającymi antygen typowy dla komórek macierzystych. Technikę taką można na przykład z powodzeniem zastosować przy badaniach mikropłytek, które silniej niż normopłytki wiążą aneksynę V (z uwagi na silne właściwości prokoagulacyjne) (66). Chociaż barwienie mikropłytek mogłoby się wydawać wymarzonym sposobem ominięcia problemów związanych z wiarygodną identyfikacją tych obiektów, bezkrytyczne stosowanie tej techniki związane jest z największą bodaj częstością zbierania artefaktów w badaniach mikropłytek, czy ogólnie mikrocząstek komórkowych. Jest tak z kilku powodów. Po pierwsze, różne subpopulacje mikropłytek przenoszą na swej powierzchni różne antygeny aktywacji płytek, a znakowanie na którykolwiek z nich pojedynczo nie gwarantuje nam wybrania wszystkich subpopulacji mikropłytek. Jedynie niewielu badaczy barwi mikropłytki na kilka antygenów jednocześnie. Po drugie, bardzo rzadko znamy miano mikropłytek w badanej próbie, a miano takie podlega niezwykle dużej zmienności biologicznej i osobniczej, zależnej od wielu czynników, jak płeć, wiek, stan fizjologicznego czy patofizjologiczny organizmu, nie sposób zatem założyć jakiejkolwiek standaryzacji zależnej od objętości badanego płynu ustrojowego czy zawiesiny. W sytuacjach takich dobrym wyborem jest enumeracja mikrocząstek przy zastosowaniu znakowanych kulek żywicowych (63) oraz dobranie właściwej ilości przeciwciał lub fluoroforu do znakowania zawiesiny o znanym mianie mikropłytek (62) (Ryc. 2, 3). Z drugiej strony, należy pamiętać, że zastosowanie kuleczek określonych rozmiarów (o zakresie wielkości podobnym do wielkości badanych mikrocząstek) do kalibracji jest bardziej kłopotliwe z uwagi na nieliniowość zależności wartości parametru FSC i średnicy kulek dla małych zakresów wielkości. Alternatywnie, stosuje się także metodę pomiaru szybkości przepływu z odpowiednią kalibracją (kuleczki Trucount ) (67). Ogólnie, wzmocnienie cytometru powinno być dobrane w ten sposób, aby wystarczająca była rozdzielczość obiektów. Należy pamiętać, że zbyt małe wzmocnienie sprawia, że niewidoczne będą obiekty słabo świecące/rozpraszające światło, natomiast zbyt duże wzmocnienie powoduje, że rejestrowane będą także obiekty pochodzenia niekomórkowego (śmieci, kurz). Wybór właściwego wzmocnienia także można sprawdzić stosując kuleczki żywicowe o określonych wymiarach, wyznakowane odpowiednim fluoroforem w taki sposób, aby różne subpopulacje kulek miały różną gęstość znacznika fluorescencyjnego na swojej powierzchni. Badanie mobilizacji i transportu jonów w płytkach krwi uwalnianie jonów wapnia w cytoplazmie Zmiany cytoplazmatycznego stężenia jonów wapnia w cytoplazmie płytek krwi stanowią fundamentalny warunek przekazywania sygnałów wewnątrz komórki oraz między cytoplazmą płytki a środowiskiem zewnętrznym. Jony te mogą być uwalniane ze zmagazynowanych w ziarnistościach zasobów wewnątrzkomórkowych lub mogą przenikać do cytoplazmy przez błonę komórkową z zewnątrz. Wiadomo, że proces mobilizacji jonów wapnia nasila się w następstwie aktywacji płytek krwi. Tak więc, zmiany stężenia wewnątrzkomórkowego wapnia można postrzegać jako charakterystyczny przejaw pobudzenia płytek przez bodziec zewnętrzny. Do pomiarów zmian stężenia Ca2+ w komórkach stosuje się techniki wykorzystujące znaczniki fluorescencyjne, które można podzielić na dwie grupy: (i) takie, które zmieniają intensywność emisji gdy stężenie Ca2+ w cytoplazmie rośnie (np. Fluo-3, Quin-2, Rhod-2) (68-70), oraz (ii) takie, które charakteryzują się przesunięciem widma wzbudzenia lub emisji (np. odpowiednio, Fura-2, Indo-1) (71,72) (Tabela 2a). Na podobnej zasadzie jak oznaczanie jonów wapnia, można prowadzić inne oznaczenia opierające się na wahaniach stężenia jonów w określonych kompartmentach wewnątrzkomórkowych, np. mobilizację jonów magnezu, sodu czy potasu (Tabela 2b), jak również zmiany ph czy potencjału (Tabela 2c) (73). Tabela 2a. Fluorofory stosowane do racjometrycznego oznaczania wewnątrz-komórkowego stężenia wapnia nazwa fluoroforu Kd (µm) wzbudzenie (nm) emisja (nm) Fura / Indo /485 BTC 7 465/ Fluo-3/Fura Red Calcium Green-1/ Lucifer yellow 0.390/ / / Tabela 2b. Fluorofory stosowane do racjometrycznego oznaczania innych kationów jedno- lub dwuwartościowych Kd (µm) emisja (nm) nazwa fluoroforu wzbudzenie (nm) oznaczany jon Mag-Fura / magnez Mag-Indo /480 magnez SBFI / sód PBFI / potas Tabela 2c. Fluorofory stosowane do racjometrycznego oznaczania ph lub potencjału LysoSensor Yellow/ Blue zakres ph nazwa fluoroforu wzbudzenie (nm) /400 lub 365 emisja (nm) 520 lub 450/510 ph BCECF <7 440/ ph SNARF-5F lub /640 ph SNARF lub /640 ph zastosowanie di-4-an- EPPS 440/ potencjał di-8-an- EPPS 475 lub /620 lub 540/610 potencjał

9 Powszechnym problemem napotykanym przy stosowaniu powyższych znaczników jest ich duża polarność utrudniająca przenikanie przez błonę komórkową i wnikanie do wnętrza komórek (74). Aby ominąć tę przeszkodę, stosuje się często zestryfikowane formy znaczników, które są ponownie uwalniane w postaci wolnej przez cytoplazmatyczne esterazy. Z uwagi na obniżoną polarność estry znaczników łatwo przenikają dwuwarstwę lipidową błon płytkowych, a ich jonizacja w cytoplazmie w następstwie hydrolizy wiązań estrowych, umożliwia wiązanie jonów dwuwartościowych, m.in. jonów wapnia. Istotne jest, że fluorescencja zjonizowanych form znaczników jest o kilka rzędów wielkości większa niż pochodnych estrowych, toteż efektywna hydroliza znaczników w cytoplazmie komórki jest warunkiem użyteczności do badania zmian stężenia jonów w płytkach krwi. Aby ułatwić taką hydrolizę i jonizacje znaczników stosuje się często specjalne zabiegi mające przyspieszyć dyspersję znacznika w kompartmentach komórkowych i udostępnić go dla działania esteraz. Z drugiej strony, nadmiernie szybki transport znacznika i jego redystrybucja w komórce (np. na skutek zbyt wysokiego stężenia znacznika), może sprawić, że przenika on także przez błony ziarnistości wewnątrzkomórkowych (rezerwuarów jonów wapnia) i staje się w ten sposób bezużyteczny w monitorowaniu uwalniania jonów wapnia z tych ziarnistości do cytoplazmy komórki. Warunkiem właściwej adaptacji metody do badania określonego typu komórek jest zatem dobranie optymalnych warunków stężenia znacznika oraz czasu inkubacji. Zbyt krótki czas inkubacji i/lub zbyt Ryc. 4. Widma niektórych znaczników fluorescencyjnych stosowanych w technice racjometrycznego oznaczania stężenia wewnątrzkomórkowego wapnia. (A) Widmo emisji Fura-2 przy 510 nm dla wzbudzenia przy różnych długościach fali (zwykle przy 340 nm i 380 nm). Zależnie od stężenia wapnia zmieniają się intensywności fluorescencji dla emisji przy 340 nm i przy 380 nm. (B) Widmo emisji Indo-1 wzbudzanego przy 338 nm. Emisja wzrasta przy około 400 nm i spada przy około 500 nm wraz ze wzrostem stężenia wapnia. (C) Kombinacja dwóch znaczników: Fluo-3 i Fura Red wzbudzanych przy 488 nm. Intensywność Fluo-3 wzrasta przy około 520 nm, natomiast intensywność Fura Red maleje przy około 660 nm wraz ze wzrostem stężenia wapnia. (D) Widmo emisji nieracjometrycznego znacznika Calcium Green wzbudzanego przy 488 nm. Emisja przy około 510 nm wzrasta po związaniu wapnia; pomiar racjometryczny nie jest dla tego znacznika możliwy. Źródło: The Molecular Probes Handbook Online Edition. niskie stężenie znacznika ogranicza/spowalnia transport znacznika do cytoplazmy płytek i powoduje jego niecałkowitą hydrolizę. Niskie stężenie znacznika w cytoplazmie komórki sprawia, że układ jest słabo wrażliwy na duże zmiany stężeń wapnia w cytoplazmie, ponieważ cała pula dostępnego zjonizowanego fluoroforu szybko nasyca się jonami wapnia występującymi w ogromnej przewadze. Z drugiej strony, nadmiernie długi czas inkubacji i/lub za wysokie stężenie fluoroforu grozi jego zbyt równomierną dystrybucją w komórce; zmiany fluorescencji znacznika na skutek uwalniania jonów wapnia z ziarnistości wewnątrzpłytkowych do cytoplazmy nie będą rejestrowane, gdyż cała pula znacznika (także ta w ziarnistościach) jest równomiernie wysycona jonami wapnia. O wiele więcej problemów sprawiają znaczniki, które nie mają zdolności przenikania przez błony komórkowe. Można to zadanie ułatwić na drodze elektroporacji błony (np. w przypadku znakowania fallotoksynami) (75), ale perforacja błon płytkowych (tzw. permeabilizacja komórek) niesie ryzyko zmiany/utraty niektórych funkcji komórki. Innym sposobem jest modyfikacja chemiczna znaczników (np. ich estryfikacja). W takich przypadkach, efektywny transport znacznika do płytek jest jednocześnie dowodem doświadczalnym na funkcjonalność komórek i zachowanie integralności błon cytoplazmatycznych. Skoro bowiem zamiana niefluoryzującej pochodnej w chromogen wymaga obecności aktywnych enzymów w komórce (esteraz, oksydaz, itp.), świecenie znakowanych komórek może stanowić miarę aktywności charakterystycznych enzymów wewnątrzkomórkowych. Niektóre znaczniki mogą powodować fotouczulanie i uszkadzanie komórek w następstwie ich wystawienia na działanie światła lasera lub nawet na wielogodzinne działanie światła podczas wykonywania procedur pozyskiwania czy oczyszczania płytek, ich znakowania, itp. Słowa komentarza wymaga także dobór odpowiedniego fluoroforu czułego na zmiany stężenia jonów wapnia. Wiele fluoroforów pozostaje niedostępnych dla standardowej aparatury cytometrycznej dysponującej jedynym źródłem światła (najczęściej 488 nm) (Tabela 2a). Optymalnie do monitorowania zmian stężenia jonów wapnia dobiera się dwa różne fluorofory w taki sposób aby fluorescencja jednego malała, zaś drugiego wzrastała w miarę zmian stężenia jonów wapnia (Ryc. 4). Szersze możliwości techniczne cytometru pod względem długości fali wzbudzenia i tutaj oddają nieocenione usługi. W odniesieniu do cytometrii zastosowanie znaczników drugiej grupy, tzn. takich które charakteryzują się przesunięciem widma wzbudzenia lub emisji przy zmianach stężenia Ca2+ jest raczej ograniczone, gdyż przesunięcia te są zwykle na tyle niewielkie, że przypadają na ten sam kanał pomiarowy. Dlatego też, chętniej stosuje się znaczniki charakteryzujące się zmianami intensywności fluorescencji wraz ze wzrostem stężenia wapnia. Zmiany te można rejestrować albo jako zmiany fluorescencji względnej albo jako zmiany frakcji komórek fluoryzujących. Korzystnie, dobiera się dwa różne znaczniki, których emisja zmienia się przeciwstawnie (jednego rośnie, zaś drugiego maleje) w miarę wzrostu stężenia jonów wapnia. Jeden ze znaczników stanowi wtedy układ odniesienia. Należy podkreślić, iż pomimo pozornej wygody stosowania, metody nieracjometryczne niosą ze sobą wiele zagrożeń i potencjalnych przekłamań wyników (zwłaszcza w odniesieniu do komórek niesferycznych, tworzących wypustki, pseudopodia, itp., jak np. komórki nerwowe czy właśnie płytki krwi), stąd wielu badaczy unika ich stosowania (76). Decydując się na badanie transportu jonów w płytkach krwi metodą cytometrii przepływowej badacz musi stawić czoła kilku problemom natury metodologicznej. Ponieważ zjonizowane w cytoplazmie płytki znaczniki są anionami, istnieje ryzyko ich usuwania przez transportery anionów w błonach komórkowych płytek. W ten sposób stężenie aktywnego znacznika zmniejsza się w miarę upływu czasu i jedynie zastosowanie blokerów tego transportera za pomocą np. probenecidu lub sulfinopirazolu może zadecydować o przeprowadzeniu pomiarów i uzyskaniu wiarygodnych wyników. Niekorzystnie, liczne znaczniki (np. rodamina 123, pochodne SNAFL) charakteryzują się dużą szerokością widma emisji fluorescencji, co sprawia, że emitowane światło może trafiać do kilku kanałów pomiarowych. Nie stanowi to problemu jeżeli badamy jednorodną populację wyizolowanych płytek, bez potrzeby bramkowania określonych subpopulacji komórkowych w pełnej krwi przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym. W przypadku badania pełnej krwi, należałoby zadbać o właściwą kompensację interferującego sygnału przeciekającego z innych kanałów. Liczne znaczniki charakteryzują się także toksycznością dla płytek, co powoduje stopniowy wyciek fluoroforów ze znakowanych komórek. Dobrą metodą upewnienia się o zachodzeniu takiego wycieku może być dodanie do buforu, w którym zawieszone są komórki, jonów Mn2+. Jony te mają zdolność gaszenia 16 17

10 fluorescencji licznych znaczników: jeżeli występuje wyciek jonów przez uszkodzoną błonę komórkową płytek, to przenikają one do cytoplazmy płytek i - współzawodnicząc z jonami wapnia, wiążą się z cząsteczkami znacznika w komórce i gaszą jego świecenie. Z powyższego powodu stworzono metodę racjometryczną, która dostarcza danych przeliczonych jako stosunek intensywności fluorescencji znacznika przy dwóch różnych długościach fali. W celu kalibracji metody niezbędnej w przypadku bezwzględnej oceny wielkości zmian stężenia jonów wapnia w płytkach można zastosować odpowiednie jonofory, ułatwiające przenikanie jonów przez błonę płytkową i modulując stężenie badanego jonu na zewnątrz komórki (74). Ocena żywotności płytek krwi Można zaryzykować stwierdzenie, iż zainteresowanie metodami wiarygodnego badania żywotności tych szczególnych komórek, jaki są płytki krwi, jest odwrotnie proporcjonalne do znaczenia, jakie ten typ badania powinien odgrywać w każdym teście funkcjonalnym wybieranym w celu określenia czynności płytek krwi. Przeświadczenie takie płynie z prostego przełożenia zmian zachodzących w kuwecie pomiarowej na interpretacje wyniku. Metody agregometryczne to najpowszechniej stosowane metody bo badania funkcji płytek w rutynowej diagnostyce i w pracy badawczej. Zależnie od wyboru techniki klasycznej, turbidymetrycznej (optycznej) lub przewodnościowej (impedancyjnej, w pełnej krwi), spadek miana płytek krwi w zawiesinie może być interpretowany albo jako wzrost agregacji (i wzrost transmitancji zawiesiny) w metodzie optycznej lub jako spadek agregacji (i spadek oblepiania elektrod przez adherujące i agregujące płytki) (Tabela 3). Toteż, w celu uniknięcia artefaktów pomiarowych, pomiarom wpływu nieznanych, nowo badanych czynników na agregacje płytek, powinny towarzyszyć pomiary żywotności płytek, zwłaszcza w sytuacjach, gdy wyniki uzyskiwane metodą optyczną oraz impedancyjna nie są spójne (Tabela 3). Klasyczne metody oceny żywotności komórek są niestety mało użyteczne w przypadku badania płytek krwi. Źródła metodycznych ograniczeń oceny żywotności płytek krwi w warunkach pozaustrojowych upatruje się przede wszystkim w fizjologicznej funkcji płytek krwi oraz w ich morfologii. Po pierwsze, płytki krwi są wysoce reaktywne i bardzo łatwo może dochodzić do ich niepożądanej, artefaktualnej aktywacji w warunkach in vitro podczas procedury badawczej, zwłaszcza jeśli ta zakłada wielokrotne wirowanie badanego materiału. Po drugie, ze względu na brak jądra komórkowego, powszechnie stosowane metody oceny żywotności komórek jądrzastych (m.in. metody oparte na pomiarze aktywności metabolicznej komórki, jak testy MTT, XTT, WST-1, PrestoBlue, lizie komórki bądź uszkodzeniu błony plazmatycznej, jak testy dehydrogenazy mleczanowej lub barwienie błękitem trypanu, metody oparte na analizie fragmentacji DNA) najczęściej nie mogą być zaadaptowane na potrzeby badań płytek krwi (77,78). Najlepszą z ogólnie dostępnych metod badawczych umożliwiających ocenę żywotności płytek krwi, jest metoda cytometryczna wykorzystująca barwienie płytek krwi estrem kalceiny (79). Należy podkreślić, że głównym atutem stosowania cytometrii przepływowej jest możliwość oceny cytotoksycznego wpływu związków nie tylko w osoczu bogatopłytkowym, czy zawiesinie płytek izolowanych, ale również we krwi pełnej. Acetometoksylowy ester kalceiny (kalceina AM) jest to niefluorescencyjny lipofilny związek, który łatwo przenika przez błonę plazmatyczną żywych komórek, gdzie pod wpływem cytoplazmatycznych esteraz ulega hydrolizie do hydrofilowego, silnie fluoryzującego związku kalceiny (80). Wolna kalceina jest sprawnie zatrzymywana wewnątrz żywych komórek z nienaruszoną błoną plazmatyczną, natomiast jej wyciek do środowiska zewnątrzkomórkowego obserwowany jest w przypadku utraty przez komórki integralności błony plazmatycznej (81). Podobnie, jak w przypadku wielu protokołów cytometrycznych, również w tym przypadku należy zwrócić szczególną uwagę na przygotowanie optymalnych kontroli negatywnych i pozytywnych. Polecanym związkiem do pozyskania kontroli pozytywnej jest formaldehyd (Ryc. 5). Przed przystąpieniem do finalnych oznaczeń cytometrycznych, należy w pierwszej kolejności ustalić optymalne stężenie kalceiny oraz czas inkubacji ze znacznikiem. Jeżeli pracujemy na krwi pełnej konieczne jest użycie przeciwciał bramkujących, np. CD61-PE lub CD61-PerCP. Sama analiza zmian intensywności zielonej fluorescencji wybrakowanych płytek krwi może być mylna lub zafałszowana z powodu faktu, że w przypadku aktywacji płytek krwi obserwuje się pojawienie się frakcji obiektów wykazujących wzrost intensywności zielonej fluorescencji, co prawdopodobnie związane jest powstawaniem agregatów płytkowych. Dlatego też, najbardziej miarodajnym parametrem umożliwiającym rozróżnienie płytek krwi żywych, od tych z naruszoną integralnością błony plazmatycznej jest ustawienie odcięcia na histogramie (FITC) lub wykresie kropkowym (FITC/ PE lub FITC/PerCP) obiektów CD61-pozytywnych poniżej wschodzącego ramienia intensywności zielonej fluorescencji i rejestrowanie stopnia pojawiania się obiektów kalceino-negatywnych (81). Tabela 3. W jaki sposób obserwowany spadek miana płytek krwi mogą wpływać na interpretacje badania agregometrycznego? metoda agregometryczna zmiany w ośrodku podłoże/ mechanizm interpretacja optyczna (Borna, turbidymetryczna), osocze bogatopłyt kowe lub zawiesina płytek) miano płytek spada (efekt cytotoksyczny) transparencja wzrasta (rozpraszanie światła maleje) wzrost agregacji (fałszywa) miano płytek spada (agregacja) transparencja wzrasta (rozpraszanie światła maleje) wzrost agregacji (słuszna) impedancyjna (krew pełna) adhezja do elektrod spada(efekt cytotoksyczny) adhezja do elektrod spada (maleje agregacja) przewodność przewodność wzrasta wzrasta spadek agregacji (fałszywa) spadek agregacji /efekt przeciwagregacyjny (słuszna) Ryc. 5. Cytometryczna ocena wpływu kolagenu i formaldehydu na żywotność ludzkich płytek krwi. Płytki w osoczu bogatopłytkowym wybramkowano na antygen CD61PE (FL2) i wyznakowano estrem acetoksymetylowym kalceiny, świecącej na zielono (FL1). Żywotność komórek oceniano na podstawie frakcji płytek kalceino-ujemnych, która była znikoma w płytkach natywnych (A, większość komórek wybarwionych kalceiną) i rosła pod wpływem 10 g/ml kolagenu (B, frakcjs kalceino-ujemna wzrasta), a zwłaszcza pod wpływem 1% formaldehydu (C, większość komórek kalceino-ujemna)

11 Cytometria Polska tom 1, zeszyt nr 1, Problemy z pomiarami powierzchni prokoagulacyjnej co tak naprawdę mierzymy? Badanie asymetrii rozmieszczenia fosfolipidów w błonach komórkowych Proces aktywacji wielu komórek związany jest z symetryzacją rozmieszczenia cząsteczek fosfolipidów błonowych. Naturalnie fosfolipidy błon rozmieszczone są nierównomiernie w obu półwarstwach błony komórkowej, w taki sposób, ze w półwarstwie zewnętrznej dominują fosfatydylocholina i sfingomielina, zaś w wewnętrznej fosfatydyloseryna i fosfatydyloetanoloamina. Przemieszczanie fosfolipidów w procesie aktywacji komórek, np. płytek krwi, w obecności jonów wapniowych prowadzi do przejściowego gromadzenia się dużych ilości ujemnie naładowanego fosfolipidu fosfatydyloseryny w zewnętrznej półwarstwie błon. Z fosfolipidem tym wiąże się preferencyjnie anneksyna V, białko izolowane z łożyska rozpoznające grupy aminofosforowe i wiążące się do nich z dużym powinowactwem (82). Stopień wyznakowania komórek przez anneksynę może być zatem wskaźnikiem aktywacji komórek, zachodzącej symetryzacji ich błon cytoplazmatycznych oraz ekspozycji na zewnątrz ujemnie naładowanych fosfolipidów błon. W warunkach naturalnych, w żywych komórkach, fizjologiczna asymetria rozmieszczenia fosfolipidów dwuwarstwy jest utrzymywana dzięki działaniu enzymu translokazy (flippazy) (najprawdopodobniej z grupy ATPaz typu P, typ IV, P4-ATPases) (83,84), a utrzymywanie asymetrii fosfolipidów błonowych jest warunkiem niezbędnym do aktywności prokoagulacyjnej płytek krwi (85-88). Przywracanie asymetrycznego rozmieszczenia fosfolipidów w błonie związane jest z mikrowezykulacją błon i z wytwarzaniem mikropłytek o dużej aktywności prokoagulacyjnej (89). W płytkach krwi metoda ta znajduje uznanie jako w założeniu, prosta technika monitorowania właściwości prokoagulacyjnych komórek, ponieważ symetryzacji błon płytkowych towarzyszy nasilenie wiązania kompleksu protrombinazy z płytkami krwi oraz aktywowanie kaskady krzepnięcia (83,84,90). Stosowanie anneksyny V ma szereg zalet. Wiąże się ona do podaktywowanych płytek krwi, które odznaczają się zmniejszoną asymetrią rozmieszczenia fosfolipidów błonowych. Jej wiązanie zależy od agonisty: jest umiarkowane dla agonistów takich, jak trombina czy TRAP oraz bardzo silne np. dla kola20 Cytometria Polska tom 1, zeszyt nr 1, 2012 genu (82). Wiązanie anneksyny V do PS nie jest do końca specyficzne, białko to wiąże się także np. do sfigomieliny i kinazy białkowej C, stopień wiązania jest także bardzo zależny od zastosowanego stężenia wapnia w procedurze znakowania. W metodzie tkwi jednak haczyk. Przede wszystkim, wiązanie anneksyny V do powierzchni komórek wymaga pobierania krwi na antykoagulant nie chelatujący jonów wapniowych (najczęściej stosowana jest niskocząsteczkowa heparyna, np. Clexane). Po drugie, w celu poprawnego i wydajnego wiązania anneksyny V przez ujemnie naładowane (na skutek przedostawania się do zewnętrznej półwarstwy dwuwarstwy lipidowej błony komórkowej) cząsteczki fosfatydyloseryny (PS, główny składnik) i kwasu fosfatydowego (w mniejszości), protokół znakowania wymaga dodawania egzogennych jonów wapnia w stężeniach milimolowych (91). Znakowanie anneksyną V wymaga dość długich inkubacji nieutrwalonych płytek, co także może sprzyjać niepożądanej aktywacji. To, co sprzyja wymaganiom metodycznym pracy z anneksyną V, jest wyzwalaczem niekontrolowanej, artefaktualnej spontanicznej aktywacji płytek krwi, dla których wapń jest naturalnym aktywatorem. Zmiany te zaznaczają się nawet w tzw. płytkach spoczynkowych, tzn. badanych bez dodatku agonisty. Jeżeli pragniemy badać eksponowanie powierzchni prokoagulacyjnej w obecności powszechnie stosowanych agonistów płytek, jak ADP czy kolagen (a na tym w końcu najczęściej polega idea samego doświadczenia dotyczącego aktywności prokoagulacyjnej płytek krwi) (Ryc. 6, 7), to obecność jonów wapniowych jeszcze bardziej sprzyja artefaktualnej aktywacji, tworzeniu mikropłytek i agregatów w aktywowanych płytkach (Ryc. 8, panele 2A-C). Nie dziwi zatem, że nawet w płytkach spoczynkowych, w nieobecności agonistów, znakowanie komórek anneksyną V prowadzi do bardzo znacznego wzrostu frakcji agregatów płytkowych (Ryc. 8, 1A i 2A). Powstawanie frakcji agregatów nasilone jest szczególnie w obecności kolagenu, TRAP lub ADP, kolagen nasila także powstawanie mikropłytek (Ryc. 6D). Te ostatnie, odznaczają się szczególnie wysoką aktywnością prokoagulacyjną, zatem silne barwienie mikropłytek przez anneksynę V nie powinno dziwić (Ryc. 8, 2B). Obecność aktywująco działających jonów wapnia w otoczeniu płytek samo w sobie sprzyja tworzeniu powierzchni prokoagulacyjnej (83,85-88,92), co więcej przemieszczanie się fosfolipidów błonowych wymaga mobilizacji jonów wapnia. Wszystkie te powiązania między naturalnymi procesami fizjologicznymi, a nienaturalnymi zmianami związanymi ze znakowaniem anneksyną V, sprawiają, iż granica między stanem fizjologicznym i tym, wymuszonym metodologią, zaciera się. Mierzymy wprawdzie jakiś stopień aktywności prokoagulacyjnej, i nawet może- my orzec, że wzrasta on po dodaniu agonistów, lecz nie sposób określić, na ile jest on wynikiem tego co działo się z płytkami krwi w łożysku, a na ile tym, co zaistniało podczas procedury znakowania (na skutek dodania egzogennego wapnia do buforu). Ryc. 6. Analiza cytometryczna mikropłytek i agregatów płytkowych w preparatach ludzkich płytek spoczynkowych (A), w płytkach aktywowanych ADP (B), płytkach spoczynkowych wyznakowanych anneksyną V (C) oraz płytkach aktywowanych kolagenem wyznakowanych anneksyną V (D). Oznaczenie wykonano w próbkach pełnej krwi z wybramkowaniem płytek krwi na antygen CD61. Krew pobrana na Clexane 0.1 mg/ml. Płytki aktywowano ADP lub kolagenem w końcowych stężeniach, odpowiednio, 20 μm i 25 μg/ml. Regiony obramowane na czerwono i zielono odpowiadają arbitralnie przyjętym regionom mikropłytek i agregatów. Obiekty zaznaczone na niebiesko oznaczają płytki wybarwione anneksyną V. 21

12 Cytometria Polska tom 1, zeszyt nr 1, 2012 Cytometria Polska tom 1, zeszyt nr 1, 2012 Ryc. 8. Analiza cytometryczna tworzenia mikropłytek i agregatów płytkowych w preparatach ludzkich płytek spoczynkowych (A), aktywowanych 25 μg/ml kolagenem (B) i aktywowanych 20 μm ADP (C) w próbkach pełnej krwi wyznakowanych przeciwciałami anty-cd62p (1A-C), anneksyną V (2A-C) lub merocjaniną 540 (3A-C). Markerami M1 i M2 oznaczono bramki dla mikropłytek i agregatów. Ryc. 7. Analiza cytometryczna rozkładu wielkości płytek krwi spoczynkowych (C i D), płytek aktywowanych 10 μm TRAP (E i F) oraz płytek aktywowanych 10 μg/ml kolagenem (G i H). Płytki w ludzkiej krwi pełnej wybramkowano podwójnie, na obecność antygenu CD61 (FITC) oraz wiązanie anneksyny V (markera aktywności prokoagulacyjnej płytek). Wykresy A i B przedstawiają rozkłady wielkości i fluorescencji w kanale FL1 kulek polistyrenowych wyznakowanych znacznikiem Yellow Green. Pionowe linie przerywane na wykresach kropkowych płytek oznaczają wielkości obiektów oznaczone na podstawie średnich wielkości subpopulacji kulek. Mikropłytki, normopłytki i agregaty płytkowe oznaczono odpowiednio kolorami zielonym, czerwonym i niebieskim. Wybrane umownie regiony, w jakich je oznaczano, obrysowano przerywanymi liniami w tych samych kolorach. 22 Alternatywne metody określania powierzchni prokoagulacyjnej Asymetryzacja fosfolipidów dwuwarstwy i przedostawanie się ujemnie naładowanej PS powoduje jeszcze inne zmiany w błonie, jak zmiana potencjału powierzchniowego błony lub uporządkowania lipidów błonowych (płynność błony). Dzięki temu, do badania zmiany asymetryzacji fosfolipidów wykorzystuje się także dodatnio naładowane fluorofory, które są w stanie wykrywać zmiany w rozmieszczeniu ładunku elektrycznego pochodzącego od ujemnie naładowane cząsteczki PS w zewnętrznej półwarstwie błony. Przykładem znacznika, który alternatywnie próbowano stosować do badania asymetrii błon płytkowych jest merocjanina 540 (MC540). Merocjanina 540 anionowym lipofilnym fluoroforem nie przenikającym przez błony do komórek. Ten ujemny ładunek MC540 sprawia, że merocjanina wiąże się wydajnie do płytek niepobudzonych, gdzie w błonach przypowierzchniowo dominuje dodatnio naładowana fosfatydylocholina (PC), zaś jej wiązanie dramatycznie spada w stosunku do płytek po aktywacji, które odznaczają się aktywnością prokoagulacyjną i eksponują ujemnie naładowaną PS. W obecności kolagenu, silnego aktywatora płytek, wiązanie MC540 do płytek silnie spada (Ryc. 8, 3B), czego nie widać w takim stopniu w płytkach aktywowanych ADP (Ryc. 8, 3C), uważanym za słaby aktywator płytek. Dyskryminatywność między wiązaniem i niewiązaniem MC540 zależy od stężenia fluoroforu, toteż należy dokładnie wyznaczyć optymalne stężenie dla określonych warunków doświadczalnych ( μm) (Ryc. 9) (93). Wiązanie MC540 do płytek w funkcji ich aktywacji i tworzenia powierzchni prokoagulacyjnej jest wrażliwe, podobnie jak w przypadku anneksyny V, na potencjał aktywacyjny agonistów płytkowych, jony wanadanowe (inhibitor translokazy fosfolipidów błon), tapsgarginę (inhibitor zależnej od wapnia ATPazy błon systemu kanalikularno-tubularnego płytek): podczas gdy wiązanie anneksyny V wzrasta, wiązanie MC549 maleje w miarę aktywacji. Wiązanie MC540 nie zależy natomiast zupełnie od chelatorów jonów wapniowych, np. EGTA, które całkowicie blokują oddziaływanie błon z anneksyną V. Stosowanie MC540 wiąże się z mniejszym niż w przypadku anneksyny V niszczeniem płytek oraz większym odsetkiem agregatów płytkowych (Ryc. 10). Wykazano także, że precyzja pomiarowa i wiarygodność diagnostyczna nie są gorsze o tych charakteryzujących stosowanie anneksyny V, chociaż różnice między płytkami spoczynkowymi i komórkami po aktywacji mogą się wydawać mniejsze w przypadku MC540 (93). 23

13 Ryc. 9. Analiza cytometryczna wiązania merocjaniny 540 oraz powstawania mikropłytek i agregatów w ludzkich płytkach spoczynkowych (A) i płytkach aktywowanych 25 μg/ml kolagenem (B) wyznakowanych merocjaniną 540 w stężeniach: 1 μm (1), 10 μm (2), 50 μm (3) lub 100 μm (4). Znaczniki bramkowania M, M1 i M2 oznaczają odpowiednio frakcje płytek MC540-dodatnich (FL2, szare pola na histogramach), mikropłytek lub agregatów płytkowych (FSC, wykresy kropkowe). Ryc. 10. Analiza cytometryczna ludzkich płytek krwi wyznakowanych anneksyną V (A) lub merocjaniną 540 (B). Poziome markery (M) na wykresach histogramowych oznaczają zakresy obiektów dodatnich pod względem wiązania anneksyny V/PE (A) lub wiązania MC540 (B) w preparatach płytek spoczynkowych (obrys) lub aktywowanych 25 μg/ml kolagenem (szare pole). Znaczniki M1 i M2 w wykresach wstawkowych oznaczają odpowiednio zakresy mikropłytek i agregatów

14 Od czego zależy wiązanie merocjaniony 540 do błon płytek krwi? Jak wspomniano wyżej, przemieszczanie się fosfolipidów o różnych ładunkach cząstkowych między półwarstwami dwuwarstwy lipidowej błony wiąże się ze zmianami potencjału powierzchniowego błony oraz zmianami tzw. parametru uporządkowania dwuwarstwy (płynnością lipidową błony). Z uwagi na budowę chemiczną cząsteczki merocjaniny 540, wiąże się ona preferencyjnie do powierzchni błon komórkowych w sposób odwrotnie proporcjonalny do ilości występującej tam PS. Związana z błonami MC540 istnieje w dwóch formach: monomerycznej oraz dimerycznej. Jedynie forma monomeru MC540 fluoryzuje (94). Zmiany w wiązaniu MC540 do błon mogą wynikać ze zmian związanej MC540 lub zmian rozmieszczenia monomerów i dimerów znacznika. Ponieważ znacznik wiąże się z dużym powinowactwem do płynnych, słabo upakowanych domen fosfolipidowych błony ubogich w cholesterol, spadek płynności błon płytkowych, obserwowanych np. w procesie aktywacji płytek krwi, będzie skutkował zmniejszonym wiązaniem MC540. Modelowe badania z wykorzystaniem liposomów o różnej zawartości PC i PS pokazały, że wiązanie MC540 zmniejszało się wraz ze wzrostem udziału PS w pęcherzykach liposomalnych (Ryc. 11). Ponieważ, w odróżnieniu od anneksyny V, która rozpoznaje dość swoiście polarne reszty PS, wiązanie MC540 zależy nie tylko od powierzchniowego ładunku błon, lecz także od potencjału przezbłonowego (transmembrane potential, TMP) oraz rozmieszczenia fosfolipidów w dwuwarstwie, znakowanie MC540 mogłoby się w niektórych warunkach okazać mało specyficzne. W badaniach modelowych na liposomach zawierających różne proporcje PS:PC w błonach pokazano, że wiązanie MC540 zmieniało się proporcjonalnie do obniżania zawartości PS w błonach (Ryc. 11) oraz do wzrostu różnicy potencjałów między wnętrzem liposomów i buforem, w którym były one zawieszone (potencjał przezbłonowy, TMP) (Ryc. 12), jednak udział ujemnie naładowanych fosfolipidów błon przyczyniał się do zmian wiązania znacznika w o wiele większym stopniu (95). Ryc. 12. Analiza cytometryczna liposomów PS/PC z enkapsulowanym jodkiem 3,3 -dipentyloksakarbo-cyjaniny (DiOC5(3)), poddanych działaniu wzrastających stężeń jonów potasu w buforze [K+]zewn. Liposomy zawierające 5 mol% PS zawieszono w buforze FF0 (8 mm NaCl, 0.01 mm CaCl2, bez K+, z dodatkiem 1 μm walinomycyny) (szare pole), FF150 (z 150 mm KCl) (szary obrys) lub FF300 (z 300 mm KCl) (czarny obrys). Szarą pionową przerywaną linią oznaczono marker specyficznego wyznakowania liposomów znacznikiem DiOC5(3). Wstawkowe wykresy gęstości pokazują rosnącą akumulację znacznika w miarę wzrostu różnicy potencjałów w pęcherzykach inkubowanych w buforach z różnymi stężeniami jonów potasowych: 0 (A), 150 mm (B) i 300 mm (C). Ryc. 11. Analiza cytometryczna wiązania merocjaniny 540 (MC540) do liposomów. Wykresy histogramowe obrazują MC540-dodatnie liposomy zawierające 5 mol% (szare pole), 10 lub 20 mol% PS (obrysy od prawej ku lewej). Wstawkowe wykresy kropkowe odnoszą się do liposomów zawierających odpowiednio 5 mol% (A), 10 mol% (B) lub 20 mol% PS (C). Przerywaną linią pionową zaznaczono położenie markera specyficznego barwienia liposomów MC Analiza cytometryczna płytek krwi u gryzoni laboratoryjnych fakty i artefakty Wykorzystanie techniki cytometrii przepływowej w badaniach czynności płytek krwi u gryzoni laboratoryjnych, takich jak myszy i szczury, to odrębny rozdział w metodologii badań cytometrycznych. Odmienności w stosunku do badania płytek krwi człowieka odnoszą się nie tyle do wyszukanych wymagań instrumentalnych aparatury pomiarowej, co do istotnych różnic w protokołach pobierania i przygotowywania materiału do badań, utrwalania czy znakowania komórek przeciwciałami. Sprawia to, iż bezpośrednie ekstrapolowanie doświadczenia płynącego z badania płytek krwi u ludzi i wykorzystywanie analogicznych procedur postępowania z płytkami gryzoni, najczęściej nie wróży badaczowi sukcesu uzyskania wiarygodnych i powtarzalnych wyników. Jest to problem ważny, gdyż wykorzystywanie zwierząt laboratoryjnych w badaniach przedklinicznych stało się praktyką niemalże powszechną i codzienną, a wyniki badań modelowych z wykorzystaniem zwierząt traktuje się wielokrotnie jako zachętę do rozpoczęcia badań klinicznych (96-98). Badając płytki gryzoni, np. mysie lub szczurze, warto pamiętać o różnicach jakie je cechują w porównaniu do płytek krwi ludzkiej. Płytki mysie są na przykład o wiele mniejsze od płytek krwi człowieka. Średnica płytek wynosi około 0.5 µm (u człowieka 1-4 µm), jednak jest ich ponad dwukrotnie więcej, średnio około 1 miliona w mikrolitrze krwi. Podobną charakterystykę przedstawiają płytki krwi szczura, dla których górny zakres miana wartości referencyjnych wynosi około 1.3 mln/µl. Duże ułatwienie przy dokładnym określeniu wielkości płytek krwi mogą stanowić komercyjnie dostępne kulki o różnej średnicy, pokryte znacznikiem fluorescencyjnym (Ryc. 13). Kulki takie, dodane do próby, mogą ułatwiać określanie zakresów referencyjnych oraz oszacowanie wielkości, jakie mogą osiągać płytki w stanie spoczynkowym (Ryc. 13A) oraz agregaty płytkowe po aktywacji agonistą (Ryc. 13B) 26 27

15 Ryc. 13. Wykres kropkowy kulek polistyrenowych oraz mysich izolowanych płytek krwi w stanie spoczynkowym (A) oraz po stymulacji trombiną 0.25 U/ml (B). Zastosowano kulki o wielkościach 0.5 zostały μm, 1 μm, 2 μm i 6 μm, pokryte znacznikiem fluorescencyjnym Yellow Green. Mysie płytki krwi wyizolowane na złożu sefarozowym i wyznakowane przeciwciałami sprzężonymi z izotiocyjanianem fluoresceiny, skierowanymi przeciwko antygenowi konstytutywnemu CD41/61. Należy pamiętać, iż mimo pewnych podobieństw antygenów powierzchniowych płytek krwi ssaków, nie możemy oczekiwać, że do oznaczeń cytometrycznych będziemy mogli używać przeciwciał skierowanych przeciwko płytkom krwi człowieka i za ich pomocą znakować komórki myszy lub szczura. Może to być dla badacza szczególny problem, gdyż oferta komercyjnie dostępnych przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko antygenom płytkowym gryzoni jest dość skąpa. W szczególności, bardzo ubogi jest panel komercyjnych przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko antygenom płytkowym szczura. W takich przypadkach, badaczowi pozostaje korzystanie z przeciwciał poliklonalnych, lecz wtedy musimy pogodzić się ze znacznym pogorszeniem swoistości, gdyż przeciwciała takie będą rozpoznawały nieswoiście różne determinanty antygenowe. Ich wykorzystanie w tak czułej metodzie jaką jest cytometria przepływowa, gdzie często chcemy rozpoznać subtelne różnice w ujawnianiu się określonych epitopów białkowych, jest raczej niewielkie. Jeśli nawet nie chcemy różnicować form aktywnych /nieaktywnych określonych receptorów powierzchniowych (zmienionych konformacji czy kompleksów białkowych), to i tak należy liczyć się z niską wiarygodnością (możliwość występowania reakcji krzyżowych) i niską powtarzalnością (duża częstość wyników fałszywie-dodatnich) pomiarów cytometrycznych z wykorzystaniem przeciwciał poliklonalnych. Zawsze pozostaje badaczowi alternatywa przygotowania indywidualnych przeciwciał monoklonalnych oraz wyznakowanie ich dowolnym fluorochromem lub zastosowanie tzw. reakcji kanapkowej (wykorzystanie przeciwciała drugorzędowego w przypadku przeciwciał niewyznakowanych). Wszystkie te zabiegi podwyższają koszty oznaczeń i wpływają na zmniejszenie ich wiarygodności, często wydłużając i komplikując procedurę pomiarową. Wszystko to sprawia, że badania cytometryczne, szczególnie na płytkach krwi szczurzej, są niezwykle trudne i drogie. Sytuacja jest nieco lepsza w przypadku krwi mysiej. Obecnie istnieją wyspecjalizowane firmy oferujące pojedyncze przeciwciała, jak i gotowe zestawy przeciwciał służących do badania aktywacji płytek krwi. Często jednak, jak pokazuje nasze doświadczenie, oferowane są przeciwciała monoklonalne o małej specyficzności, a sugerowane przez producenta protokoły oznaczeń okazują się niesprawdzone i nieskuteczne w praktyce. Można odnieść wrażenie lub nawet zaryzykować stwierdzenie, że często oferowane są niesprawdzone przeciwciała, których użyteczność mają dopiero sprawdzić ich użytkownicy. Zważywszy na to wszystko, kuszące mogłyby wydać się próby wykorzystania przeciwciał dla ludzkich płytek krwi. Niestety, reaktywność krzyżowa przeciwciał dla płytek człowieka z antygenami na płytkach gryzoni jest minimalna, zatem nie ma możliwości wykorzystania przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom ludzkim w badaniach na materiale pochodzącym od szczura czy myszy. Poszukiwanie interesującej nas populacji komórek - płytek krwi, najczęściej odbywa się poprzez odnalezienie frakcji posiadającej na swojej powierzchni antygen konstytutywny, np. CD41 (99), CD61 (100) czy kompleks CD41/CD61 (101). Jednak w wielu opublikowanych pracach badacze posługiwali się jedynie analizą sygnałów FSC oraz SSC i tym sposobem wyodrębniali pulę badanych obiektów spośród pozostałych elementów morfotycznych we krwi pełnej lub we krwi pozbawionej osocza (102). Jak pamiętamy, parametry FSC i SSC charakteryzują, odpowiednio objętość komórek i ziarnistości wewnątrzkomórkowe. Tak, jak opisano to wcześniej, wielkość płytek, które są bezjądrzastymi fragmentami megakariocytów, jest znacznie mniejsza w porównaniu do pozostałych elementów morfotycznych krwi. Zatem teoretycznie, nie powinno być problemu z oddzieleniem tej frakcji komórek od RBC czy WBC. Warto jednak pamiętać,że w przypadku gryzoni, gdzie rozmiary płytek krwi są rzędu 0.5 µl (średnica), analiza FSC może nastręczać problemów technicznych związanych z dolną granicą rozpoznawanych przez cytometr obiektów. Należy w takich przypadkach zapoznać się ze specyfikacją techniczną wykorzystywanego urządzenia i sprawdzić czy jesteśmy w stanie przy pomocy danego urządzenia wiarygodnie analizować populację tak małych komórek. W wielu przypadkach obiekty poniżej 1 µm mogą nie być widoczne i zostaną potraktowane przez analizator jako tło. Zakładając jednak, że cytometr radzi sobie ze zliczaniem tak niewielkich obiektów, nadal stajemy przed dylematem, czy bramkowanie frakcji płytek krwi na podstawie jedynie charakterystyki FSC/SSC jest właściwym podejściem. Problem ten dotyczy w szczególności badań związanych z aktywacją/reaktywnością płytek, gdzie w przypadku aktywacji możemy mieć do czynienia z powstawaniem kompleksów płytki-płytki, jak i kompleksów płytki-krwinki białe. Pamiętajmy, że cytometr w takich przypadkach rozpoznaje każdy kompleks czy zlep płytkowy jako jeden element. Ograniczając nasze badania do frakcji normopłytek wyznaczonych jedynie w oparciu o wielkość/ziarnistość, powinniśmy pamiętać o fakcie, że świadomie pomijamy w takich wypadkach frakcję kompleksów płytkowych i płytkowo-leukocytarnych (często bardzo liczną). Co więcej, należy pamiętać że to właśnie ta frakcja zawierać może płytki, które cechuje stan pobudzenia i obecność na powierzchni swoistych markerów aktywacji. Kolejny aspekt tego typu analizy, który był już poruszany wcześniej w rozdziale pierwszym, to oszacowanie liczebności określonej frakcji. O ile frakcja normopłytek nie stwarza takich problemów, to frakcja agregatów płytkowych, gdzie każde skupisko płytek rozpoznawane jest jako jeden element składający się z kilku-kilkunastu pojedynczych komórek, nie pozwala rozstrzygnąć ile pojedynczych obiektów (płytek) wchodzi w skład tej frakcji. Z podobnym dylematem spotykamy się w przypadku kompleksów PLT-WBC, gdzie na jedną krwinkę białą może przypadać jedna lub kilka/ kilkanaście płytek krwi. Stosując przeciwciała monoklonalne, które swoiście łączą się np. z monocytami (CD14) czy granulocytami (CD11b) oraz przeciwciała swoiste dla płytek, możemy dokładniej scharakteryzować subpopulację kompleksów płytki-leukocyty. Warto nadmienić, że obecnie dostępne są analizatory (np. Image Stream), które pozwalają uzyskać zdjęcia komórek wchodzących w skład analizowanych subpopulacji, dzięki czemu można przekonać się naocznie i zobrazować kompleksy różnokomórkowe. Z uwagi na bardzo małe rozmiary płytek krwi gryzoni, problemem stają się także wszelkie inne obiekty o podobnej wielkości w preparacie (cząstki kurzu, bakterie, fragmenty komórek). Narzuca to potrzebę bardzo starannej i czystej pracy, o czym wspominano w poprzednich rozdziałach. Decydując się na bramkowanie płytek na podstawie rozpraszania światła możemy popełniać istotny błąd klasyfikując obiekty niepłytkowe jako płytki krwi, i stąd musimy się liczyć z mniej wiarygodnym zbieraniem wyników. Co więcej, taki sposób bramkowania wyklucza właściwie wiarygodne badanie frakcji mikropłytek lub agregatów. A zatem przemyślane wybranie właściwej metody bramkowania badanej frakcji płytek stanowi warunek sine qua non ich wiarygodnej analizy. Innym alternatywnym podejściem metodycznym stosowanym w pracy badawczej dotyczącej płytek krwi jest analiza wyizolowanej, przemytej frakcji krwinek płytkowych. W takim przypadku wydaje się nie być konieczne stosowanie bramkowania (chyba że w celu potwierdzenia czystości uzyskanego preparatu). Jednak pamiętajmy, że dobór jednej czy drugiej metody zależy w dużej mierze od tego, jakie pytania badawcze sobie stawiamy. Należy bowiem mieć na uwadze, że jeśli badane są oddziaływania w środowisku krwi pełnej, a następnie przeprowadzane jest izolowanie frakcji PLT, to świadomie pozbywamy się frakcji kompleksów płytek z leukocytami i znów pozostajemy z pytaniami bez odpowiedzi. Powszechnie, za dobry antygen pozwalający na bramkowanie frakcji PLT uznaje się konstytutywnie obecny na płytkach krwi integrynowy receptor dla fibrynogenu: kompleks GPIIbIIIa (CD41/CD61) (101). W przypadku krwi ludzkiej najczęściej do bramko

16 wania stosuje się przeciwciała skierowane przeciwko epitopowi na podjednostce GPIIIa receptora, CD61. W przypadku płytek mysich, częściej jest to antygen CD41 (135 kda) (99) lub epitop charakterystyczny dla całego kompleksu CD41/CD61 (101) niż antygen CD61 (90 kda) (100). Należy jednak pamiętać o fakcie, że przeciwciała takie mogą interferować z innymi, powszechnymi w użyciu i umożliwiającymi wykrywanie aktywnej formy receptora po aktywacji komórek. W sytuacji, gdy stosujemy mieszaninę przeciwciał rożnych firm, często nie znając szczegółów dotyczących konformacji badanego białka i specyficzności antygenowej określonego klonu stosowanych przeciwciał, jednoczesne wykrywanie fragmentów, które ulegają zmianom konformacyjnym po aktywacji komórek, w płytkach wybramkowanych na obecność epitopu CD41/CD61 może napotkać na przeszkody. Zastosowanie przeciwciał skierowanych przeciwko różnym domenom (często nieodległym od siebie) tego samego kompleksu białkowego może stwarzać ryzyko zawady przestrzennej uniemożliwiającej lub utrudniającej wiązanie się obu rodzajów przeciwciał. W skrajnych sytuacjach może dojść do zablokowania przez przeciwciało bramkujące epitopu, który ma być wykrywany przez przeciwciało, które zastosowaliśmy w celu wykazania zmiany konformacji określonej domeny białkowej tego samego kompleksu (np. przeciwciała tzw. JON/A łączące się z aktywną formą receptora CD41/CD61). Podkreślamy zatem, konieczność świadomego projektowania eksperymentów z wcześniejszym zaznajomieniem się (o ile to możliwe) ze strukturą molekularną i wariantami konformacyjnymi badanych antygenów. Dość osobliwym wśród znanych markerów aktywacji płytek krwi jest antygen CD42b (receptor dla czynnika von Willebranda - GPIb - glikoproteina będąca heterodimerem i składająca się z łańcucha alfa oraz beta), a właściwie proces jego internalizacji w pobudzonych płytkach krwi. Charakterystyka zmian ekspresji tego antygenu jest podobna w płytkach gryzoni do tej rejestrowanej w badaniach płytek człowieka. Spadek jego ekspresji jest miarą pobudzenia komórek, zatem najwyższych wartości powinniśmy się spodziewać w płytkach spoczynkowych, najniższych w płytkach silnie pobudzonych (np. trombiną). Warto o tym pamiętać i analizując wyniki przyjąć za miarę aktywacji płytek krwi zanik sygnału pochodzącego z przeciwciała anty CD42b. Po aktywacji płytek krwi dochodzi bowiem do oddzielenia się GPIb od kompleksu IX i odłączenia go od białek łączących z aktyną. Istotnym problemem, z jakim zmagają się często badacze, jest artefaktualna aktywacja płytek krwi. Problem ten dotyczy badań prowadzonych zarówno na krwi ludzkiej, jak i krwi pochodzącej od gryzoni. Zjawisko to szczególnie częste jest w przypadku badań na myszach i wynika z procedury pobierania krwi do badań. W przypadku szczurów stosunkowo łatwo jest pobrać krew metodą swobodnego wypływu z uwagi na rozmiar zwierzęcia i wprawny eksperymentator nie powinien mieć większych problemów z artefaktualną aktywacją płytek szczurzych. Niestety, w przypadku tak niewielkich zwierząt jakimi są myszy, pobranie krwi (której jest niewiele, bo zaledwie około 2 ml) z uniknięciem artefaktualnej aktywacji płytek, spowodowanej np. podciśnieniem w strzykawce i kontaktem z igłą, jest nie lada wyzwaniem. Zapewnienie swobodnego wypływu krwi, która ma kontakt z szeregiem cytokin uwolnionych z komórek w okolicy przerwania ciągłości tkanki, co sprzyja artefaktualnej spowoduje aktywacji płytek, wymaga dużego doświadczenia. Najczęściej, swobodny wypływ zapewnia pobieranie krwi z tętnicy, która będzie na tyle duża, że pozwoli wprowadzić igłę. Badacze wykorzystują w tym celu tętnicę brzuszną, a krew pobierana jest przez igłę przepłukaną antykoagulantem. Niektóre prace pokazują, że krew pobrana z aorty brzusznej lub z podgałkowej sieci naczyń żylnych charakteryzuje się najmniejszą aktywacją płytek krążących w porównaniu do innych znanych metod: pobrania z żyły ogonowej, z tętnicy lub żyły szyjnej oraz z serca ( ). Mimo to, pobranie ze splotu naczyń żylnych gałki ocznej nie jest bardzo powszechnie stosowane czy też nawet zalecane, gdyż wymaga użycia cienkiej szklanej kapilary, co przy kontakcie krwi ze szklaną powierzchnią może skutkować niepożądaną aktywacją płytek krwi (106). W wielu pracach znajdujemy także opisy pobierania krwi z żyły ogonowej. Jednak w takich przypadkach należy pamiętać, że krew musi być pobierana z zastosowaniem podciśnienia, które również może spowodować niepożądaną aktywację płytek. Niestety, w nadal nielicznych publikacjach naukowych, dotyczących badania płytek krwi gryzoni z zastosowaniem cytometrii, często pomijany jest dokładny opis metod pobierania krwi i w takich wypadkach należy z niezwykłą ostrożnością podchodzić do wyników badań aktywacji, jak i reaktywności płytek. W przypadku dalszego stymulowania płytek, które doświadczyły w krążeniu częstych epizodów aktywacji lub masywnej aktywacji podczas pobierania materiału, można się spodziewać niewielkich efektów działania agonistów w warunkach in vitro z uwagi znaczne wyczerpanie zasobów ziarnistości płytkowych i tzw. efekt zużycia. Podczas przeprowadzania eksperymentów na płytki krwi może mieć wpływ wiele czynników, np. dobór antykoagulanta stosowanego podczas pobierania krwi czy stosowanie utrwalania krwinek przed lub po znakowaniu przeciwciałami. Najczęściej stosowanymi antykoagulantami w badaniach przeprowadzanych na krwi gryzoni są cytrynian (107) i heparyna (108). Zdania na temat stosowania określonych związków chemicznych użytych w charakterze antykoagulanta i jego wpływu na aktywację płytek krwi są podzielone. Część doniesień nie wskazuje, żeby dobór antykoagulantu stanowił istotny czynnik wpływający na niepożądaną aktywację płytek krwi krążących, czy też zmieniał reaktywność płytek krwi in vitro (109). Jednak inne badania sugerują, iż wysoka dawka antykoagulantu, w tym wypadku heparyny, może hamować reakcję sekrecji zawartości ziarnistości alfa w odpowiedzi na różnych agonistów płytkowych (110). W przypadku ludzkich płytek krwi potwierdzono wpływ rosnących dawek heparyny niefrakcjonowanej na wzrost ekspresji markerów powierzchniowych płytek krwi, selektyny P oraz aktywnej formy glikoproteiny GP IIb/IIIa po stymulacji ADP (111). Stwierdzono także, iż cytrynian może powodować artefaktualną aktywację płytek krwi spoczynkowych, skutkując większą większa ekspresją selektyny P, w porównaniu do heparyny (112). Nasze własne doświadczenia wskazują zdecydowanie na przewagę użycia heparyny (szczególnie polecamy stosowanie heparyny niskocząsteczkowej, np. Clexane 10 IU/ml) jako optymalnego antykoagulantu, którego zastosowanie nie stwarza częstych epizodów artefaktualnej aktywacji płytek krwi (Ryc. 14). Kolejny aspekt pracy doświadczalnej, który może mieć niebagatelny wpływ na wyniki badań płytek krwi, to sposób znieczulania zwierzęcia do eksperymentu. Stosowane są dwa odmienne sposoby podania anastetyku: metoda wziewna (115) oraz metoda iniekcyjna (116). Obie metody mogą być w równy sposób stresogenne dla operowanego zwierzęcia. Wiadomo, iż stres przyczynia się do wzrostu stężenia katecholamin we krwi, przyśpieszenia czynności serca, wzrostu ciśnienia tętniczego krwi, skurczu naczyń wieńcowych oraz co istotne zwiększenia aktywności płytek krwi. Dodatkowo same związki stosowane do znieczulenia mogą wykazują działanie nie tylko na organy wewnętrzne ale także na pojedyncze komórki, modyfikując w różny sposób ich funkcjonowanie (117). Podczas, gdy utrwalanie próbek pełnej krwi w badaniach większości antygenów płytek człowieka, jest z powodzeniem praktykowane już od dziesięcioleci, w przypadku płytek krwi myszy zabieg taki zdecydowanie się nie sprawdza (47,113). Ryc. 14. Wykres kropkowy przedstawiający ekspresję aktywnej formy receptora GP IIb/IIIa (JON/A) w mysich płytkach krwi w stanie spoczynkowym. Krew pobrano na cytrynian (A) lub heparynę (B). Na zielono zaznaczono płytki krwi wybramkowane na podstawie wiązania przeciwciała skierowanego przeciwko antygenowi CD41/

17 Po pierwsze, przeciwciała monoklonalne skutecznie rozpoznające antygeny powierzchniowe w płytkach świeżych nie wiążą się do płytek mysich w preparatach utrwalonych. Świadczy to o tym, że zmiany ich konformacji przestrzennej białek błonowych po zadziałaniu paraformaldehydu są na tyle duże, iż przeciwciała nie rozpoznają swoich docelowych antygenów. W naszych badaniach wykazaliśmy, iż utrwalanie paraformaldehydem skutkuje obniżoną ekspresją selektyny P oraz aktywnej formy glikoproteiny GP IIb/IIIa po stymulacji ADP lub trombiną (Ryc. 15). Dlatego, w celu wiarygodnego oznaczania reaktywności płytek krwi, wskazane wydaje się być wykorzystanie komórek nieutrwalonych i ich szybka preparatyka, co zalecane jest nawet przez producentów niektórych przeciwciał (114). Istnieją doniesienia, iż ketamina podana dootrzewnowo stymuluje aktywację płytek krwi w mysim modelu doświadczalnym (118). Z kolei inhalacja wziewna izofluranem może skutkować spadkiem liczby płytek krwi in vivo (119). Jednak jak pokazuje literatura w większości badań obie wspomniane metody są stosowane zamiennie (120,121), co może poddawać w wątpliwość wiarygodność otrzymywanych rezultatów. Innym zagadnieniem wartym wzmiankowania jest nieco odmienna charakterystyka płytek gryzoni w porównaniu z płytkami człowieka pod względem odpowiedzi na czynniki aktywujące takie jak trombina, ADP, kolagen czy TRAP. Z naszych własnych doświadczeń wynika, że nienajlepsze efekty aktywacji mysich płytek krwi uzyskuje się przy zastosowaniu peptydów TRAP (thrombin- -receptor 1-activating peptide) (zwłaszcza tych o dłuższych łańcuchach oligopeptydowych (np. TRAP-14), które najprawdopodobniej słabo wiążą się z receptorem trombinowym w przypadku krwi mysiej (Ryc. 16). Oczywiście, w przypadku stosowania trombiny w eksperymentach aktywacji płytek krwi w krwi pełnej i/lub osoczu bogatopłytkowym, należy pamiętać o dodaniu tetrapeptydu GPRP (H- -Gly-Pro-Arg-Pro-NH2, 0.5 mm), który hamuje polimeryzację fibrynogenu poprzez bezpośrednie łączenie się z fibrynogenem i modyfikację glutaminy w łańcuchach α oraz γ fibrynogenu. W konsekwencji, obecność peptydu GPRP nie dopuszcza do tworzenia wykrzepiania krwi w próbce, dzięki czemu możliwa jest analiza cytometryczna (50). Dla osób zajmujących się problematyką związaną z płytkami krwi fakt ten jest oczywisty, jednak dla nowicjuszy w tej dziedzinie wart jest przypomnienia. Stosowanie trombiny daje najczęściej najlepsze efekty i obserwujemy i znaczną aktywację płytek (wysoka ekspresja selektyny P na powierzchni). Wykorzystywanie ADP czy kolagenu in vitro również skutkuje zaobserwowaniem aktywacji płytek krwi (Ryc. 17). Ryc. 16. Wykres kropkowy przedstawiający ekspresję selektyny P w mysich płytkach krwi po aktywacji trombiną (A) lub peptydem TRAP-14 (B). Na zielono zaznaczono płytki krwi wybramkowane na podstawie wiązania przeciwciała skierowanego przeciwko antygenowi CD41/61. Ryc. 15. Wykres kropkowy przedstawiający ekspresję selektyny P (a,b) oraz aktywnej formy receptora GP IIb/IIIa (c,d) w mysich płytkach krwi po aktywacji trombiną we krwi nieutrwalonej (A, C) lub utrwalonej paraformaldehydem (B, D). Na zielono zaznaczono płytki krwi wybramkowane na podstawie wiązania przeciwciała skierowanego przeciwko antygenowi CD41/61. Ryc. 17. Wykres kropkowy przedstawiający ekspresję selektyny P w mysich płytkach krwi w stanie spoczynkowym (A), po stymulacji kolagenem (B), ADP (C) lub trombiną (D). Na zielono zaznaczono płytki krwi wybramkowane na podstawie wiązania przeciwciała skierowanego przeciwko antygenowi CD41/

18 Reasumując, należy podkreślić jak bardzo istotne jest dopracowanie protokołu postępowania z materiałem badawczym i jego dopasowanie do stawianych przez badacza pytań. Dobór badanych antygenów (tutaj wielkiej gamy możliwości nie spodziewajmy się jednak lista dostępnych komercyjnie, swoistych przeciwciał jest krótka dla myszy, dla szczurów obejmuje zaledwie dwie pozycje), dobór antykoagulanta, sposobu pobierania krwi, jak również dobór stosowanych agonistów (jak i warunków ich użycia) mogą mieć kluczowe znaczenie w pozyskiwaniu wiarygodnych oraz informatywnych wyników badań prowadzonych z wykorzystaniem zwierząt laboratoryjnych. Bardzo często prace naukowe zawierają bardzo krótkie opisy zastosowanych metod cytometrycznych, a szczegółowe opisy techniczne parametrów związanych z ustawieniami aparatu są całkowicie pomijane. Dla badacza praktyka, stosującego w swojej pracy doświadczalnej metodę cytometrii przepływowej, bardzo istotna jest znajomość właśnie tychże szczegółów technicznych pomiarów, zarówno z punktu widzenia poznawczego, jak i z punktu krytycznej oceny tego, jak dalece przekazywanym przez innych badaczy wynikom może on zaufać i postrzegać je jako fakty a nie artefakty. Uczciwy opis tego, w jaki sposób bramkowana jest frakcja płytek czy opisywane zjawiska dotyczą wszystkich komórek, frakcji kompleksów, czy jedynie frakcji normopłytek, jakie przeciwciała są stosowane, czy jak pobierany i przygotowywany jest materiał do badań, wydaje się mieć fundamentalne znaczenie dla takiej oceny. Walorem publikacji dotyczących metod mniej poznanych, czy rzadziej stosowanych, jest też dobranie odpowiedniego materiału ilustracyjnego (np. wykresy kropkowe z zaznaczeniem regionów wybramkowanych). W wielu pracach grafikę taką się po prostu pomija (świadomie lub nie), jakby na przekór starej maksymie Konfucjusza, która sprawdza się w metodologii cytometrycznej znakomicie: Jeden obraz wart więcej niż tysiąc słów. 4. Cytometria przepływowa w badaniach obiektów parakomórkowych i subkomórkowych Cytometria przepływowa pozwala na analizę i identyfikację obiektów o różnych rozmiarach. Pierwotnie, komercyjnie dostępne cytometry zaprojektowane były głównie do analizy elementów znajdujących się w krwi ludzkiej i cząsteczek odpowiadających im wielkością. Posiadały przystosowane do tego celu płyny, optykę oraz elektroniczne systemy przetwarzania i dyskryminacji. Wielkość mierzonych cząsteczek mieściła się pomiędzy kilkoma a kilkudziesięcioma mikrometrami średnicy (122). Obecnie analiza mikroskopowych obiektów o wielkości do kilku µm (bliska możliwościom rozdzielczym większości cytometrów przepływowych) jest niezbędna w wielu badaniach z dziedziny nauk biomedycznych. Do obiektów takich należą m.in. liposomy, stosowane na przykład jako nośniki leków lub badane jako proste modele komórkowe, a także mitochondria, organelle o kluczowym znaczeniu w badaniach programowanej śmierci komórki. Liposomy jako parakomórkowe modele stosowane w badaniach transportu błonowego i potencjału przezbłonowego W medycynie wykorzystuje się najczęściej liposomy nie przekraczające wielkości 400 nm i charakteryzujące się wysoką homogennością, a należy pamiętać, że zarówno wielkość, jak i homogenność liposomów zależy od chemicznej charakterystyki zastosowanych lipidów oraz od procedury ich przygotowania (123). Cytometryczna identyfikacja liposomów opiera się o pomiar rozproszenia światła przez liposomy, a wykorzystywanie kulek lateksowych, żywicowych lub polistyrenowych o określonych rozmiarach pozwala z reguły na scharakteryzowanie populacji liposomów pod względem ich wielkości (124). Najmniejsze liposomy osiągają skalę nano, dlatego nazywane są również nanosomami. Cytometria przepływowa umożliwia badania tej wielkości obiektów dzięki temu, że cząstki mniejsze od długości fali wzbudzenia równomiernie rozpraszają fale świetlne we wszystkich kierunkach pod dużym kątem względem padającego światła wzbudzającego (tzw. rozproszenie Rayleigha). Większe cząstki sferyczne powodują natomiast tzw. rozpraszanie Lorenza-Mie. Rozpraszanie Rayleigha wraz ze wzrostem obiektów przechodzi w rozproszenia Lorenza-Mie, a zależność ta w uproszczeniu polega na tym, że im większy jest badany obiekt względem fali wzbudzającej, tym rozpraszanie przesuwa się bardziej z kątowego w czołowe. Oba te zjawiska powodują, że w większości cytometrów przepływowych wyposażonych w światło wzbudzenia pomiędzy 350 nm a 650 nm jesteśmy w stanie obserwować cząstki takie jak nanosomy. Dodatkowo, istnieje możliwość uwidocznienia tych obiektów przy pomocy barwienia, a nadaje się do tego celu większość znaczników wykorzystywanych do badania dużych obiektów (np. większych komórek). Jednakże pomiar tak niewielkich obiektów wiąże się z wieloma problemami, m.in. wysoką fluorescencją tła. Może ono być spowodowane np. dużą ilością zanieczyszczeń (których cząstki mają rozmiary podobne do małych liposomów) w zastosowanych buforach oraz płynie osłaniającym. Nowoczesne cytometry oraz procedury cytometryczne umożliwiają optymalizację ustawień aparatu do analizy niewielkich cząsteczek. Dotyczy to dostosowania filtrów, ustawienia kąta detektora FSC, zastosowania ultraczystego płynu osłaniającego czy obniżenia progu detekcji (threshold) blisko poziomu tła (12,122). W protokołach wykorzystujących znakowanie liposomów znacznikami fluorescencyjnymi, walory cytometrii i jej przewaga nad konwencjonalną spektrofluorymetrią jawią się szczególnie wyraziście. Liposom jest obiektem rozpraszającym światło, a więc nie ma potrzeby troszczenia się o odpłukanie nadmiaru znacznika wykorzystywanego do wyznakowania liposomów, które może być nietrywialnym wyzwaniem w pomiarach zawiesin obiektów badanych konwencjonalnymi technikami fluorescencyjnymi (np. technikami spektrofotometrycznymi lub spektrofluorescencyjnymi). Liposom jest prostą strukturą parakomórkową, którą można z powodzeniem wykorzystać do badania: (a) integralności błony (125), (b) transportu przezbłonowego, (c) potencjału błonowego, czy (d) dystrybucji fosfolipidów błonowych (93,95,126). Liposomy można podzielić m.in. ze względu na ilość warstw lipidowych błon (liposomy wielowarstwowe, kilkuwarstwowe, dwuwarstwowe oraz jednowarstwowe), rozmiar (duże, średnie i małe), czy też metodę przygotowania. Liposomy składające się z pojedynczej warstwy lipidowej posiadają zazwyczaj rozmiary od 50 do 250 nm i przeważnie używane są do enkapsulacji substancji rozpuszczalnych w wodzie. Natomiast wielowarstwowe liposomy osiągają najczęściej rozmiary od 1 do 5 µm i wykorzystywane są do przenoszenia substancji lipofilnych. W celu zwiększenia akumulacji liposomów w określonych tkankach, stosowane są liposomy odpowiednio wzbogacone na swojej zewnętrznej powierzchni, w takie związki, jak np. przeciwciała monoklonalne, peptydy, glikoproteiny, czy czynniki wzrostu, mające na celu nakierowanie liposomu na określone komórki (127). Cytometria może posłużyć do określania ilości przyłączonych do liposomu cząsteczek naprowadzających, dzięki zastosowaniu wyznakowanych przeciwciał skierowanych przeciwko tym składnikom błony. Dzięki zastosowaniu pochodnych fluoresceiny, kalceiny, Alexa488, czy kumaryny, cytometria przydatna jest również przy ocenie zdolności przenikania (zarówno biernego, jak i aktywnego) wybarwionych liposomów, np. do komórek nowotworowych (128,129), makrofagów (130), a nawet do organelli komórkowych, takich jak mitochondria (131). W celu zwiększenia sygnału pochodzącego od komórek charakteryzujących się niewielką gęstością powierzchniowych receptorów, które nie mogłyby być rozpoznawane przez tradycyjne przeciwciała wyznakowane fluoroforem o dużej wydajności kwantowej (np. pochodne fluoresceiny), można wykorzystać wybarwione liposomy połączone kowalencyjnie z charakterystycznymi białkowymi ligandami lub przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciwko interesującym nas antygenom. W ten sposób sygnał pochodzący od nielicznych antygenów, które zostały rozpoznane na liposomie przez przeciwciała, zostaje zwielokrotniony, co pozwala na jego odróżnienie od tła. W zależności od wielkości zastosowanych liposomów, sygnał może ulec zwielokrotnieniu od kilkudziesięciu do kilkuset razy w porównaniu do tej samej ilości białek/przeciwciał wyznakowanych tradycyjnie przy użyciu takiego samego fluoroforu (26). Liposomy mogą zawierać zarówno fluorofory osadzone w warstwie lipidowej, jak również znaczniki fluorescencyjne zamknięte w ich wnętrzu. Do enkapsulacji w przypadku jednowarstwowych liposomów wykorzystuje się m.in. pochodne fluoresceiny, pochodne rodaminy oraz żółcień lucyferową (Lucifer Yellow, LY). Problemem w przypadku tego typu znakowania jest możliwość wykorzystania jedynie hydrofilowych fluoroforów niewielkich rozmiarów (Ryc. 18) (132). Niejednokrotnie na fluorescencję takich znaczników wpływa ph i temperatura, dzieje się tak np. w przypadku karboksyfluoresceiny. Do barwienia błon liposomów stosowane są barwniki lipofilne, takie jak DPH, NBD-C6-HPC, DiI, N-Rh- -PE, DiA (80,133). Enkapsulowane barwniki mogą zmniejszać swoje stężenie na skutek powolnej dyfuzji lub mogą zostać utracone w wyniku niespecyficznej lizy liposomów (132). Z tego powodu, często stosuje się podwójne barwienie, w którym enkapsulowane barwniki wspomagane są barwnikami immobilizowanymi na powierzchni liposomów, np. inkorporowanymi do błon cząsteczkami fosfolipidów połączonych z fluoresceiną (134) lub fluorkiem NBD (4-fluoro-7-nitrobenzofurazan, 4-fluoro-7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol) (135)

19 Ryc. 18. Wykresy kropkowe analizy cytometrycznej liposomów znakowanych fluorescencyjnie. Jednowarstwowe liposomy, o średniej wielkości 100 nm, zbudowane z fosfatydylocholiny (90%) i fosfatydyloseryny (10%), uzyskiwano metodą ekstruzji (A), znakowano 6-karboksyfluoresceiną (B) i wykorzystywano do badania integralności dwuwarstwy lipidowej w obecności wzrastających stężeń prawastatyny. Ryc. 19. Wykres kropkowy (punktowy) przedstawiający populacje kulek polistyrenowych różniących się wielkością: o średnicach 0.5 μm, 1 μm, 2 μm i 6 µm (czarne punkty) oraz mitochondria izolowane z hepatocytów szczura stada niekrewniaczego Wistar (zielone punkty). W dotychczasowych badaniach liposomów z wykorzystaniem cytometrii, uwagę skupiano niemal wyłącznie na badaniu zjawisk jakościowych, opartych o rejestrowanie wielkości lub fluorescencji wyznakowanych liposomów (124,136). Ostatnio, coraz większą popularność zyskują adaptacje technik cytometrycznych umożliwiające również prowadzenie badań ilościowych czy kinetycznych. Stosując fosfolipidy znakowane fluorescencyjnie (np. znakowane 4-fluoro-nitrobenzofurazanem [fluorek NBD] lub rodaminą 123) oraz białka z dołączonym fluoroforem (tzw. cząsteczki z przywieszką, tagowane ) można pokusić się prowadzenie badań dotyczących oddziaływań białkowo-lipidowych, zmian konformacji białek błonowych, czy zmian krzywizny błon biologicznych (137). Wykorzystanie cytometrii do badania mobilizacji jonów i potencjału przezbłonowego w mitochondriach Obiektami chętnie badanymi przy pomocy cytometrii przepływowej są nieco większe od liposomów mitochondria, osiągające rozmiary od około 1 do 4 µm.. Ich wielkość może różnić się nawet znacznie w zależności od gatunku organizmu i narządu, z którego są izolowane. Mitochondria izolowane z wątroby szczura osiągają wielkość około 1 µm średnicy i 2 µm długości (138). Ich rozmiar można ocenić w przybliżeniu przy pomocy cytometrii przepływowej, stosując np. polistyrenowe kulki jako wzorzec wielkości (Ryc. 19). Na wykresie warto zwrócić uwagę na dużą homogenność wybarwienia kulek fluoroforem (Yellow Green, YG) (wąskie, cygarowate populacje obiektów). Z drugiej strony, heterogenność wielkości kulek jest największa dla kulek o najmniejszych rozmiarach i zmniejsza się w miarę wzrostu wielkości kulek. Mitochondria są niezbędne dla prawidłowego funkcjonowania komórki. Ich główną rolą jest wytwarzanie ATP na drodze oddychania komórkowego oraz regulacja metabolizmu komórki (139), jednakże biorą one również udział w wielu innych procesach biochemicznych, w tym, w regulacji homeostazy wapniowej (140) oraz kontroli apoptotycznej i nekrotycznej śmierci komórki (141). Metodologia badań dotyczących funkcjonowania mitochondriów jest obecnie niezwykle rozbudowana, co poniekąd stanowi odbicie mnogości procesów, w których organelle te biorą udział. Podane poniżej przykłady wykorzystania cytometrii do badania mitochondriów nie wyczerpują tej mnogości, mają raczej pomóc w zrozumieniu istoty odpowiedniego zaprojektowania badania wykorzystującego technikę cytometrii przepływowej oraz pokazać jak wiedza o zastosowanych sposobach wybarwienia badanych obiektów pomaga w ocenie wiarygodności otrzymanych wyników. Jednym z najczęściej mierzonych parametrów w badaniach tych organelli jest potencjał błon mitochondrialnych. Parametr ten jest czułym wskaźnikiem stanu energetycznego, zarówno mitochondriów, jak i całych komórek. Do jego oceny wykorzystywane są lipofilne barwniki o charakterze kationowym. Ponieważ potencjał wewnątrz komórki jest ujemy (około 60 mv dla większości komórek), dodatnio naładowane cząsteczki, swobodnie przemieszczające się przez błonę komórkową, przedostają się do cytoplazmy oraz do ujemnie naładowanych organelli. Ze względu na silnie ujemny potencjał wewnątrz macierzy mitochondrialnej (około -160 mv) w mitochondriach mogą gromadzić się ilości znacznika o 2-3 rzędy wielkości większe niż w cytoplazmie. Znaczne ilości znaczników będą lokowały się również w przestrzeni między błonami mitochondrialnymi. W związku z tym, całkowita ilość znacznika kationowego w komórce będzie zazwyczaj silnie uzależniona od potencjału mitochondrialnego (142). Problemy wiążące się z zastosowaniem kationowych lipofilnych barwników w celu monitorowania potencjału mitochondrialnego wiążą się m.in. z (a) niespecyficznym wiązaniem się barwnika, np. rodaminy 123 (Rh 123), która lokuje się w kilku miejscach, niezależnie od poziomu energetycznego mitochondriów czy z (b) potrzebą zastosowania odpowiednio dużej ilości materiału biologicznego w celu rejestrowania odpowiednio wysokiego sygnału (143). Ponadto, wiele wykorzystywanych w tym celu znaczników może nieswoiście hamować wydajność oddechową mitochondriów, a zatem pośrednio przyczyniać się również do wielkości wytwarzanego potencjału mitochondrialnego. Do znaczników takich należą m.in. znaczniki karbocyjaninowe, jak DiOC2(3), DiOC5(3), DiOC6(3), DiOC2(4) (144), a także wspomniana wyżej rodamina 123 (145). Między innymi, z powodu cytotoksyczności tych związków, zaleca się, aby unikać stosowania ich w stężeniach przekraczających 1 µm (146). Dodatkowo, uważa się, że intensywne wiązanie się tych znaczników do samej wewnętrznej błony mitochondrialnej mogłoby komplikować interpretację uzyskiwanych wyników, gdyż wiele z tych znaczników posiada również zdolność wygaszania fluorescencji w miarę ich akumulacji w mitochondriach (147). Wykazano, że niektóre barwniki, jak np. rodaminę 123, w przeszłości często wykorzystywaną do badania potencjału mitochondrialnego, można bez ryzyka stosować jedynie w przypadku badania izolowanych mitochondriów. Wysoki potencjał wyizolowanych mitochondriów powoduje akumulację barwnika i przesunięcie długości światła emitowanego fluorescencji oraz - proporcjonalne do wysokości potencjału, wygaszanie fluorescencji. W nienaruszonych komórkach w obecności dużego stężenia tego barwnika może dochodzić do jego silnej akumulacji 36 37

20 i intensywnego wygaszania fluorescencji. Pomimo uzyskania stabilnej fluorescencji w tych komórkach, transport znacznika nadal trwa, dlatego też, stopień wygaszania fluorescencji nie odpowiada wysokości potencjału mitochondrialnego. Interpretacja zmian fluorescencji tego barwnika w takim przypadku okazuje się zatem znacznie trudniejsza (148). Ponadto, znane są doniesienia literaturowe wskazujące na to, że rodamina 123 charakteryzuje się wysoką nieswoistą fluorescencją także w obecności podwyższonego stężenia reaktywnych form tlenu (RFT) w badanej próbie (bez względu na to, czy badamy mitochondria izolowane, czy całe komórki). Fluorescencja taka nie ma nic wspólnego z wartością potencjału mitochondrialnego (149,150). Mało doświadczony badacz może zatem świecenie rodaminy przyjąć za wskaźnik wysokiego (lub niskiego) potencjału mitochondrialnego, podczas gdy tak naprawdę (najczęściej nieświadomie) ocenia poziom RFT. W związku z powyższym, najbezpieczniej byłoby zrezygnować ze stosowania tego znacznika do oceny potencjału mitochondrialnego, o ile zależy nam na pozyskaniu wiarygodnych wyników (151). Niestety, dość niski koszt rodaminy (w porównaniu innymi znacznikami stosowanymi do oceny potencjału), pozorna łatwość interpretacji pozyskiwanych wyników oraz powszechność jej stosowania sprawiają, że rodamina wciąż jest wykorzystywana przez wielu badaczy do oceny potencjału mitochondrialnego, zarówno w badaniach z użyciem spektrofluorymetrii, jak i cystometrii przepływowej. Jednym z najczęściej stosowanych obecnie barwników do oceny potencjału mitochondrialnego jest JC-1 (5, 5', 6, 6'-tetrachloro-1, 1', 3, 3'-tetraetylobenzo-imidazolo-karbocyjanian jodku), który w wysokim stężeniu tworzy agregaty, charakteryzujące się odmiennymi właściwościami spektralnymi. Zmianie tej towarzyszy przesunięcie emisji fluorescencji z zielonej (kanał FL1) - charakterystycznej dla monomerów (niski potencjał mitochondrialny), do czerwonej (kanał FL2) charakterystycznej dla agregatów JC-1 (wysoki potencjał mitochondrialny). W mitochondriach o wysokim potencjale błonowym JC-1 spontanicznie tworzy agregaty dające intensywną fluorescencję barwy czerwonej (Ryc. 20A, B, C). Wraz ze spadkiem potencjału, spowodowanym np. dodaniem silnego rozprzęgacza potencjału mitochondrialnego (np. CCCP lub FCCP), dochodzi do zmniejszenia stężenia barwnika w wewnętrznej błonie mitochondrialnej i jednoczesnego rozpadu agregatów do form monomerycznych, co wiąże się ze zmianą barwy świecenia na zieloną (Ryc. 20C, D, E). Prosty mechanizm działania tego znacznika sprawia, że na podstawie zmiany w świeceniu, czyli emitowaniu fluorescencji pochodzącej od monomerów i/lub agregatów, stosowanie znacznika JC-1 pozwala na szybką i bezpośrednią ocenę potencjału mitochondrialnego, nie narażając się na popełnienie błędów w interpretacji wyników, które można popełniać stosując rodaminę 123. Jak wskazuje rycina, przed dodaniem FCCP potencjał mitochondriów jest bardzo wysoki, co powoduje silny wzrost stężenia znacznika w organellach i wydajne tworzenie agregatów JC-1. FCCP rozprzęga mitochondria i powoduje szybko drastyczny spadek potencjału, a zmiany potencjału wraz z upływem czasu od dodania FCCP (od 1 do 11 min) są już bardzo nieznaczne. Stosunek emisji światła czerwonego do zielonego doskonale nadaje się do oceny potencjału mitochondrialnego, gdyż wynik nie jest zależny od czynników, takich jak wielkość, kształt czy gęstość mitochondriów. JC-1 można stosować do barwienia zarówno izolowanych mitochondriów, jak i całych komórek (143,152). Metoda cytometrycznego oznaczania potencjału przy pomocy JC-1, w porównaniu ze spektrofluorymetrycznym oznaczaniem stosunku fluorescencji agregatów i monomerów, jak również pomiarem oksygraficznym wydajności oddechowej ma swoje wady i zalety.. Pomiar JC-1 przy użyciu spektrofluorymetru wiąże się z podobnymi jak w przypadku cytometru wadami wynikającymi z samej charakterystyki zastosowanego znacznika. Podobnie, jak w przypadku innych kationowych barwników o charakterze lipofilnym, również przy stosowaniu JC-1 istnieje ryzyko zbierania artefaktów związanych ze zbyt krótkim czasem inkubacji barwnika z komórkami czy mitochondriami. Można się o tym przekonać dokonując pomiaru w czasie (Ryc. 20 i 21). Dla zobrazowania problemu, mitochondria inkubowano przez 1 min z JC-1 przed przystąpieniem do badania, a następnie dokonano pomiaru po 5 i po 10 min od pierwszego pomiaru. Po 10-minutowej inkubacji mitochondria o wysokim potencjale zwiększyły stosunek świecenia czerwonego do zielonego z 0.3 do 1.1 w przypadku pomiaru cytometrycznego (Ryc. 20A, B, C) oraz z 3.2 do 8.0 w przypadku pomiaru spektrofluorymetrycznego dla tych samych preparatów mitochondrialnych (Ryc. 21A). Wzrostu takiego nie obserwowano w przypadku mitochondriów rozprzężonych przy pomocy FCCP (Ryc. 20D, E, F oraz 21B). Świadczy to o tym, iż zbyt krótki czas przeznaczony na akumulację barwnika sprzyja zaniżaniu wyników oraz zacieraniu różnic między mitochondriami różniącymi się wysokością potencjału. W związku z powyższym, bardzo ważne jest, aby podczas wykonywania badania potencjału mitochondrialnego rygorystycznie przestrzegać czasu preinkubacji preparatu mitochondrialnego ze znacznikiem (koniecznie w ciemności). Zalecany czas inkubacji próby z JC-1 przed przystąpieniem do pomiaru nie jest jednoznacznie określony i waha się w graniach od 1 min do 15 min. Należy zatem wypracować własny protokół eksperymentalny (który może różnić się w szczegółach i ściśle zależeć od typu badanych mitochondriów oraz aparatury, którą wykorzystujemy do badań) i trzymać się go wiernie. Ryc. 20. Analiza cytometryczna JC-1 w mitochondriach izolowanych z hepatocytów szczura. Frakcja agregatów JC-1 (region P1) w mitochondriach kontrolnych (A, B, C) zanika po 1 min (A, D), po 6 min (B, E) i po 11 minutach inkubacji (C, F) od dodania 5 µm FCCP, gdy świecą prawie wyłącznie monomery (region P2) (D, E, F). Kolorem zielonym oznaczono świecenie monomerów, zaś czerwonym - świecenie agregatów JC-1. Ryc. 21. Widma fluorescencji JC-1 w mitochondriach o wysokim potencjale (kontrola, A) oraz w mitochondriach po dodaniu FCCP (B). Mitochondria wyizolowano z wątroby szczura. Widma zarejestrowano po 1 minucie (niebieski), po 6 minutach (zielony) oraz po 11 minutach (czerwony) od dodania znacznika do próby