Ocena kompetencji rozwojowych zarodków króliczych po zapłodnieniu in vivo w różnych stadiach

Transkrypt

1 Rocz. Nauk. Zoot., T. 45, z. 2 (2018) Ocena kompetencji rozwojowych zarodków króliczych po zapłodnieniu in vivo w różnych stadiach rozwojowych* * Barbara Kij 1, Aleksandra Chećko 1, Karolina Fryc 2, Agnieszka Nowak 3, Agnieszka Kozłowska 4, Joanna Kochan 1 1 Uniwersytet Rolniczy w Krakowie, Instytut Nauk Weterynaryjnych, Katedra Weterynarii, Rozrodu i Dobrostanu Zwierząt, al. Mickiewicza 24/28, Kraków 2 Centrum Medycyny Rozrodu ARTVIMED, ul. Legendy 3, Kraków 3 Uniwersytet Rolniczy w Krakowie, Katedra Biotechnologii Zwierząt, ul. Rędzina 1B, Kraków 4 Państwowy Inspektorat Weterynarii w Pińczowie, ul. Łąkowa 28, Pińczów Królik domowy (Oryctolagus cuniculus f. domesticus) jest cenionym zwierzęciem modelowym w badaniach z dziedziny embriologii eksperymentalnej ze względu na cechy takie jak podobna budowa i rozmiar oocytów oraz zarodków, jasna barwa cytoplazmy umożliwiająca dostrzeżenie przedjądrzy i poszczególnych blastomerów, plenność i płodność. Celem pracy była ocena kompetencji rozwojowych zarodków i żywotności zarodków króliczych w różnym stadium rozwoju, pozyskanych po poubojowym wypłukaniu ich z jajowodów. Wyniki wykazały, że hodowla zarodków w warunkach laboratoryjnych osłabia ich potencjał rozwojowy. Porównując liczbę martwych blastomerów w zarodkach, których nie poddano hodowli in vitro w stosunku do liczby blastomerów martwych, w zarodkach hodowanych in vitro wzrosła ona o 9,4%. Zarodki po hodowli in vitro wykazywały dwukrotnie większy procentowy udział blastomerów martwych (10%) w porównaniu do zarodków rozwijających się in vivo (2,35%). Uzyskane wyniki świadczą o niemożliwości idealnego odwzorowania warunków panujących w żywym organizmie, a hodowle in vitro wymagają udoskonalenia i optymalizacji. Słowa kluczowe: królik, zarodki, kompetencje zarodkowe, fluorochromy, hodowla in vitro Królik domowy (Oryctolagus cuniculus f. domesticus) jest często wykorzystywanym zwierzęciem w badaniach biomedycznych (Wierzbicki, 2014), szczególnie w embriologii eksperymentalnej. Cechy takie jak podobna budowa i rozmiar oocytów oraz zarodków, jasna barwa cytoplazmy umożliwiająca dostrzeżenie przedjądrzy i poszczególnych blastomerów (Grygoruk i in., 2013), plenność i płodność powo- *Praca finansowana z UR Kraków, DS 3208.

2 204 B. Kij i in. dują, że gatunek ten jest świetnym zwierzęciem modelowym, wykorzystywanym do poszerzenia wiedzy o rozwoju zarodków ludzkich (Fisher i in., 2012). Zapłodnienie u królika zostało opisane już w 1932 roku przez Gregorego Goodwina Pincusa, co świadczy o dużym zainteresowaniu tym gatunkiem (Garcia, 1968). Jednym z etapów leczenia ludzkiej niepłodności jest zapłodnienie in vitro oraz obserwacja zarodków w warunkach laboratoryjnych. Trudności oraz kontrowersje związane z badaniami eksperymentalnymi na zarodkach ludzkich wiążą się z koniecznością wykorzystywania do tego celu zwierząt modelowych (Walczak i Bonczar, 2015). Celem pracy była ocena kompetencji rozwojowych zarodków i żywotności zarodków króliczych w różnym stadium rozwoju, pozyskanych po poubojowym wypłukaniu ich z jajowodów. Materiał i metody Przygotowanie dawczyń i pozyskanie zarodków Zarodki pozyskano od czterech dojrzałych płciowo i zdrowych samic rasy popielniańskiej białej o masie ciała od 3,8 do 4,3 kg. Przed planowanym terminem uboju królice kilkakrotnie pokryto samcem tej samej rasy. Wyizolowane post mortem jajowody czterech samic przepłukano płynem fizjologicznym, uzyskując zawiesinę, z której pod mikroskopem stereoskopowym wyszukiwano i pozyskano zarodki. Zarodki pozyskiwano w różnym czasie od prawdopodobnego zapłodnienia: Królica nr 1 pozyskanie zarodków jedną dobę po kopulacji Królica nr 2 pozyskanie zarodków dwie doby po kopulacji Królica nr 3 pozyskanie zarodków trzy doby po kopulacji Królica nr 4 pozyskanie zarodków cztery doby po kopulacji Zarodki poddano klasyfikacji na podstawie budowy morfologicznej i liczby blastomerów. Hodowla in vitro zarodków Pozyskane zarodki hodowano w warunkach in vitro, stosując pożywkę TCM 199 z dodatkiem 10% FBS, 16 µg/ml L-glutaminy oraz 4 µg/ml pirogronianu pod olejem mineralnym w czterodołkowych płytkach hodowlanych. Hodowlę przeprowadzono przez 24 godziny, w temperaturze 38 C z dodatkiem 5% CO 2. Barwienie fluorescencyjne i ocena zarodków W celu uwidocznienia blastomerów z uszkodzonymi błonami plazmatycznymi zastosowano barwienie 2-bromkiem etedyny, który po przeniknięciu do komórek wybarwia je na kolor czerwony. Do wybarwienia nieuszkodzonych blastomerów wykorzystano 1-dioctan fluoresceiny barwiący nieprzerwaną błonę plazmatyczną na zielono. Po 24-godzinnej hodowli zarodki umieszczano w kropli pożywki na szkiełku podstawowym, a następnie barwiono fluorochromami: 1-dioctanem fluoresceiny 0,005 mg/ml oraz 2-bromkiem etedyny 0,05 mg/ml. Tak przygotowane preparaty oceniano pod mikroskopem fluorescencyjnym, klasyfikując blastomery jako żywe i martwe na podstawie koloru sygnału fluorescencyjnego.

3 Rozwój zarodków króliczych 205 Wyniki W efekcie procedury płukania jajowodów czterech samic uzyskano 20 zarodków. Wszystkie przeznaczono do dalszych obserwacji. W związku z różnymi stadiami rozwojowymi zarodków pozyskanych po pierwszej i drugiej dobie po zapłodnieniu w stosunku do zarodków po trzeciej i czwartej dobie po zapłodnieniu w celu wyrównania stadium rozwoju zarodkowego zarodki od samicy nr 1 i 2 poddano hodowli in vitro (tab. 1). Każdy z zarodków został poddany ocenie żywotności i ustalono u nich liczbę blastomerów (tab. 2). Tabela 1. Kompetencje rozwojowe zarodków króliczych; 2B-zarodek dwublastomerowy; 8B-zarodek ośmioblastomerowy Table 1. Developmental competence of rabbit embryos; 2B-two-blastomere embryo; 8B-eight-blastomere embryo Samica Female Liczba pozyskanych zarodków N(%) No. of obtained embryos, N(%) stadium rozwoju zarodka po wypłukaniu od samicy N(%) embryo development stage after flushing from female, N(%) zygota zygote Zarodki po zapłodnieniu in vivo Embryos after in vivo fertilization stadium rozwoju zarodka po wypłukaniu i hodowli in vitro N(%) embryo development stage after flushing and in vitro culture, N(%) 2B morula 8B morula blastocysta blastocyst 1 5(25) 3(60) 1(20) 1(20) 1(20) 2 5(25) 4(80) 4(80) 3 2(10) 1(50) 4 8(40) 5(62,5) Omówienie wyników Wspomaganie rozrodu przez zapłodnienie in vitro jest coraz częściej stosowaną metodą w leczeniu niepłodności ludzi (Bensdorp i in., 2016). Badania prowadzone na zwierzętach modelowych, jakimi są króliki, dostarczają wielu cennych informacji o jakości i predyspozycjach do dalszego rozwoju zarodków (De Los Angeles i in., 2015; Duranthon i in., 2012). W celu prawidłowej i rzetelnej ich oceny stosuje się narzędzia i kryteria, takie jak ocena morfologiczna, rozwój w warunkach in vitro (Henrion i in., 1997), barwienie komórek (Amat i in., 2014) oraz mikroanaliza metabolizmu zarodków (Guitart-Mampel i in., 2018; Piliszek i in., 2017). Ocena morfologiczna z wykorzystaniem mikroskopu pozwala na określenie wielkości blastomerów, stopnia ich fragmentacji, barwy i ziarnistości cytoplazmy (Halacheva i in., 2011; Makarevich i in., 2005).

4 206 B. Kij i in. Tabela 2. Żywotność blastomerów w zarodkach króliczych Table 2. Viability of blastomeres in rabbit embryos Osobnik Animal Królik nr 1 Rabbit no. 1 Królik nr 2 Rabbit no. 2 Królik nr 3 Rabbit no. 3 Królik nr 4 Rabbit no. 4 Zarodki Embryos żywe live Ocena zarodków Assessment of embryos liczba blastomerów (N) no. of blastomeres (N) martwe (%) dead (%) razem total (0%) (16,6%) (11,5%) (11,1%) (12,3%) (17,9%) (1,5%) (0%) (0%) (0%) (3,6%) (10,5%) (0%) 20 Badania wykonane w ramach niniejszego doświadczenia wykazały, że hodowla zarodków w warunkach laboratoryjnych osłabia ich potencjał rozwojowy. Porównując liczbę martwych blastomerów w zarodkach, których nie poddano hodowli in vitro w stosunku do liczby blastomerów martwych, w zarodkach hodowanych in vitro wzrosła o 9,4%. Analiza jakości i szybkości rozwoju zarodka w warunkach laboratoryjnych pozwala na określenie kompetencji rozwojowych zarodków. Jednym z głównych kryteriów oceny zarodka jest jego zdolność do osiągnięcia stadium blastocysty, jednak w warunkach in vitro jest to problematyczne (Sugimoto i in., 2015; Sung i in., 2011; Petters i Wells, 1993). Gardnem i Schoolcraft (1999) wykazali, iż na podstawie liczby blastomerów, liczby komórek węzła zarodkowego i trofoblastu również można dokonać oceny jakości zarodka. Informacje te uzyskuje się między innymi w wyniku barwienia barwnikami fluorescencyjnymi. Do chwili obecnej badania z użyciem fluorochromów przeprowadzili Iwasaki i in. u bydła (1990), Mirkes i in. (2001) u myszy, a u ludzi Chatzimeletiou i in. (2005). Brak jest w dostępnej literaturze informacji o podobnych badaniach przeprowadzonych u królików. Wyniki uzyskane

5 Rozwój zarodków króliczych 207 w niniejszej pracy wykazały, że zarodki w późniejszych stadiach rozwojowych, jak blastocysta, posiadają większy procentowy udział blastomerów martwych w porównaniu do zarodków kilku kilkunastu blastomerowych. Zarodki po hodowli in vitro wykazywały czterokrotnie większy procentowy udział blastomerów martwych (10%) w porównaniu z zarodkami rozwijającymi się in vivo (2,35%). Uzyskane wyniki świadczą o niemożliwości idealnego odwzorowania warunków panujących w żywym organizmie, a hodowle in vitro wymagają udoskonalenia i optymalizacji. Wykorzystanie królików jako zwierząt modelowych w embriologii wydaje się być doskonałym narzędziem do poznania rozwoju zarodków w warunkach laboratoryjnych. Wiedza ta z powodzeniem może być wykorzystywana do testowania i udoskonalania procedur stosowanych w klinikach leczenia niepłodności ludzi, co związane jest zarówno z podobieństwami w rozwoju zarodków ssaków, jak i podobnymi mechanizmami rozwojowymi. Tego typu badania są niezwykle ważne i powinny być kontynuowane w celu osiągnięcia jeszcze lepszych efektów w leczeniu ludzkiej niepłodności. Piśmiennictwo Amat F., Lemon W., Mossing D.P., McDole K., Wan Y., Branson K., Myers E., Kell e r P.J. (2014). Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods., 11: Bensdorp A., Tjon-Kon-Fat R., Verhoeve H., Koks C., Hompes P., Hoek A., de Bruin J., Cohlen B., Hoozemans D., Broekmans F., van Bomme P., Smeenk J., M o l B., v a n d e r Ve e n F., v a n We l y M. (2016). Dropout rates in couples undergoing in vitro fertilization and intrauterine insemination. Europ. J. of Obstet. & Gynecol. Reprod. Biology, 205: Chatzimeletiou K., Morrison E.E., Prapas N., Prapas Y., Handyside A.H. (2005). Spindle abnormalities in normally developing and arrested human preimplantation embryos in vitro identified by confocal laser scanning microscopy. Hum. Reprod., 20: De Los Angeles A., Ferrari F., Xi R., Fujiwara Y., Benvenisty N., Deng H., L e n s c h M.W. (2015). Hallmarks of pluripotency. Nature., 525: Duranthon V., Beaujean N., Brunner M., Odening K.E., Santos A.N., Kacskov i c s I., H i r i p i L., We i n s t e i n E.J., B o s z e Z. (2012). On the emerging role of rabbit as human disease model and the instrumental role of novel transgenic tools. Transgenic. Res., 21: Fisher B., Chavatte-Palmer T., Viebahn C., Navarette Santos A., Duranthon V. (2012). Rabbit as a reproductive model for human health. Reprod., 114: G a r c i a C.R (1968). Gregory Goodwin Pincus Int. J. Fertil., 13: Gardner D.K., Schoolcraft W.B. (1999). Culture and transfer of human blastocysts. Curr. Opin. Obstet. Gynecol., 11: Grygoruk C., Mrugacz G., Modliński J., Gajda B., Grad I., Grusza M., Sieczyns k i P. (2013). Protective role of mucin coat. Prog. Health Sci., 3: Guitart-Mampel M., Gonzalez-Tendero A., Niñerola S., Morén C., Catalán- -Garcia M., González-Casacuberta I., Juárez-Flores D.L., Ugarteburu O., Matalonga L., Cascajo M.V., Tort F., Cortés A., Tobias E., Milisenda J.C., Grau J.M., Crispi F., Gratacós E., Garrabou G., Cardellach F. (2018). Cardiac and placental mitochondrial characterization in a rabbit model of intrauterine growth restriction. Biochim. Biophys. Acta. Gen. Subj., 1862: Halacheva V., Fuchs M., Dönitz J., Reupke T., Püschel B., Viebahn C. (2011). Planar cell movements and oriented cell division during early primitive streak formation in the mammalian embryo. Dev. Dyn., 250:

6 208 B. Kij i in. H e n r i o n G., B r u n e t A., R e n a r d P., D u r a n t h o n V. (1997). Identification of maternal transcripts that progressively disappear during the cleavage period of rabbit embryos. Mol. Reprod. Dev., 47: Iwasaki S., Yoshiba N., Ushijima H., Watanabe S., Nakahara T. (1990). Morphology and proportion of inner cell mass of bovine blastocysts fertilized in vitro and in vivo. J. Reprod. Fertil., 90: Makarevich A.V., Chrenek P., Zilka N., Pivko J., Bulla J. (2005). Preimplantation development and viability of in vitro cultured rabbit embryos derived from in vivo fertilized gene-microinjected eggs: apoptosis and ultrastructure analyses. Zygote, 13: Mirkes P.E., Little S.A., Umpierre C.C. (2001). Co-localization of active caspase-3 and DNA fragmentation (TUNEL) in normal and hyperthermia-induced abnormal mouse development. Teratology, 63: P i l i s z e k A., M a d e j a Z.E., P l u s a B. (2017). Suppression of ERK signalling abolishes primitive endoderm formation but does not promote pluripotency in rabbit embryo. Development, 144: Sugimoto H., Kida Y., Oh N., Kitada K., Matsumoto K., Saeki K., Taniguchi T., H o s o i Y. (2015). Production of somatic cell nuclear transfer embryos using in vitro-grown and in vitro-matured oocytes in rabbits. Zygote, 23: S u n g L.Y., Chen C.H., Xu J., Lin T.A., Su H.Y., Chang W.F., Liu C.C., Sung Y.S., Cheng W.T., Zhang J., Tian X.C., Ju J.C., Chen Y.E., Wu S.C., Du F. (2011). Follicular oocytes better support development in rabbit cloning than oviductal oocytes. Cell Reprogram., 13: Wa l c z a k M., B o n c z a r Z. (2015). Etyczne i prawne aspekty doświadczeń na zwierzętach. Wiad. Zoot., 4: W i e r z b i c k i M. (2014). Modele zwierzęce w badaniach medycznych, biologicznych i zootechnicznych. Prz. Hod., 6: Zatwierdzono do druku 11 I 2019 Barbara Kij, Aleksandra Chećko, Karolina Fryc, Agnieszka Nowak, Agnieszka Kozłowska, Joanna Kochan Evaluation of the developmental competence of rabbit embryos at various stages of development following in vivo fertilization Summary The domestic rabbit (Oryctolagus cuniculus f. domesticus) is a valued animal model in experimental embryology because of similar structure and diameter of oocytes and embryos, the bright cytoplasm colour allowing the visualization of pronucleus formation and individual blastomeres, prolificacy and fertility. The aim of the study was to evaluate the developmental competence and viability of rabbit embryos at various stages of development obtained after in vivo fertilization. It has been shown that in vitro embryo culture weakens their development potential. Number of dead blastomeres increased by 9.4% in in vitro cultured embryos. In vitro cultured embryos showed a fourfold higher percentage of dead blastomeres (10%) compared to embryos that developed in vivo (2.35%). The present results show that it is difficult to ideally reproduce the conditions of a living organism, and that in vitro cultures demand refinement and optimization. Key words: rabbit, embryos, embryo competence, fluorochromes, in vitro culture