Wykład 4 Biokataliza. Zastosowanie enzymów w procesach przemysłowych. Enzymy zbudowane z aminokwasów (białka)

Transkrypt

1 Biokatalizatory: Enzymy zbudowane z aminokwasów (białka) Rybozymy zbudowane z rybonukletydów (RNA)

2 Enzymy są superkatalizatorami niezwykle duża efektywność katalizy wysoka aktywność katalityczna w umiarkowanych warunkach swoistość reakcji specyficzność substratowa stereospecyficzność praktycznie 100% wydajność; brak produktów ubocznych

3 Siła katalityczna enzymów jest zdumiewająca

4 SWOISTOŚĆ SUBSTRATOWA L-asparaginaza EC Substrat Aktywność względna K M 10 5 (M) V L-asparagina D-asparagina Amid kwasu bursztynowego Diamid kwasu bursztynowego 0 - -

5 Stereospecyficzność działania enzymów

6 Dlaczego enzymy są tak efektywnymi katalizatorami? -grupy funkcyjne w centrum aktywnym -hydrofobowy charakter centrum aktywnego -współdziałanie koenzymów -kataliza kwasowo-zasadowa -maksymalne zbliżenie i optymalne ustawienie substratu(ów) -wzbudzone dopasowane enzymu

7 Centrum Centrum aktywne aktywne Kompleks enzym:substrat Struktura kompleksu enzym-substrat Centrum aktywne może obejmować reszty odległe od siebie Centrum w sekwencji aktywne może aminokwasowej obejmować łańcucha polipeptydowego reszty aminokwasowe odlegle od siebie w sekwencji aminokwasowej enzymu W centrum aktywnym znajdują się reszty wiążące substrat (ew, także koenzym) oraz reszty katalityczne

8 Niektóre enzymy potrzebują pomocników... Koenzym niewielka cząsteczka organiczna współpracująca z cząsteczką enzymu podczas aktu katalitycznego, której obecność jest niezbędna dla katalizy. Koenzym wiąże się z enzymem tylko w trakcie aktu katalitycznego Grupa prostetyczna cząsteczka organiczna lub jon metalu niezbędna dla działania enzymu, połączona trwale z cząsteczka enzymu

9 Szybkość reakcji zależy od energii aktywacji układu. v = f ( G * ) Szybkość reakcji enzymatycznej Enzym, podobnie jak każdy inny katalizator, przyśpiesza reakcję, ale nie zmienia jej stanu równowagi. Enzymy katalizują jedynie reakcje termodynamicznie możliwe, czyli takie, dla których G 0. Uwaga: enzymy w komórkach mogą katalizować reakcje, dla których G >0. Warunek: sprzężenie z reakcją, dla której G <0. Warunkiem zajścia reakcji jest efektywne zderzenie cząsteczek (cząsteczki muszą posiadać odpowiednią energię oraz być odpowiednio ustawione względem siebie) Najmniejsza energia, którą należy dostarczyć molowi substratów, aby każda z cząsteczek stała się reaktywna energia aktywacji

10 Enzymy obniżają energię aktywacji układu

11 Enzym wiążąc substrat przyjmuje konformację komplementarną do stanu przejściowego

12 Indukowane dopasowanie enzymu Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA Konformacja heksokinazy zmienia się w wyniku związania substratu Indukowane dopasowanie substratu

13 Enzym przyciąga substrat do centrum aktywnego Sposoby oddziaływań elektrostatycznych enzymu z substratem Rozkład potencjału elektrostatycznego wokół enzymu dysmutazy nadtlenkowej Pokazano obszary potencjału dodatniego i ujemnego. Substrat: O 2-. jest naładowany ujemnie Efekt Kirke

14 Wykres zależności szybkości reakcji katalizowanej przez enzym od stężenia substratu ma kształt hiperboliczny v = V[ S] K [ S] M +

15 Czynniki wpływające na aktywność enzymu v temperatura odczyn środowiska potencjał redoks Zależność aktywności enzymu od temperatury T [P] 50 o C 70 o C v t 1 Zależność aktywności enzymu od ph t 1 t 2 80 o C t Kształt wykresu v = f(t) może się zmieniać w zależności od momentu pomiaru t 2 T

16

17 Wytwarzanie enzymów Dwa rodzaje procesów technologicznych, zasadniczo różniące się warunkami: 1. Enzymy wytwarzane w dużych ilościach, głównie dla celów przemysłowych, tylko częściowo oczyszczone (bulk enzymes) 2. Enzymy wytwarzane w niewielkich ilościach, dla celów terapeutycznych i naukowych, o wysokim stopniu czystości Obecne tendencje w produkcji enzymów: 1. Zastępowanie enzymów pochodzenia roślinnego i zwierzęcego przez enzymy rekombinowane, wytwarzane przez drobnoustroje w warunkach nadprodukcji 2. Wprowadzanie enzymów pochodzących z komórek drobnoustrojów ekstremofilnych 3. Zastosowanie inżynierii białka enzymy o zmienionych właściwościach

18 Schemat technologiczny wytwarzania enzymu typu bulk

19 Enzymy proteolityczne w przemyśle Enzym Reakcja lub substrat Źródło enzymu Zastosowanie Papaina Hydroliza białek Papaya latex Usuwanie zmętnienia piwa, kruszenie mięsa Renina Trypsyna, chymotrypsyna Ścinanie mleka Hydroliza białek Żołądki cielęce, białko rekombinowane Jelita zwierzęce Wytwarzanie serów Kruszenie mięsa, zastosowania medyczne Proteazy grzybowe Hydroliza białek Aspergillus oryzae Aspergillus niger Mucor pusillus Rhizomucor miehei Cryptonectria parasitica Kruszenie mięsa, piekarnictwo, piwowarstwo Serowarstwo Proteazy bakteryjne Hydroliza białek Bacillus subtilis Środki piorące, usuwanie żelatyny

20 Enzymy metabolizujące węglowodany w przemyśle Enzym Reakcja lub substrat Źródło enzymu Zastosowanie Amylaza Hydroliza wiązań α(1 4) glikozydowych Bacillus subtilis Aspergillus oryzae Hydroliza skrobi Celulaza Hydroliza wiązań β(1 4) glikozydowych Trichoderma viride Aspergillus niger Hydroliza celulozy do celobiozy β-galaktozydaza; sacharaza; laktoza sacharoza Aspergillus spp. Sacharomyces Otrzymywanie cukrów prostych z disacharydów β-glukoozydaza Oksydaza glukozowa Glukoza + O 2 Glukonolakton + H 2 O 2 Aspergillus niger Analityka medyczna Usuwanie cukru z produktów jajecznych Usuwanie O 2 z majonezu i soków Izomeraza ksylozowa Glukoza Fruktoza Streptomyces spp. Lactobacillus brevis Otrzymywanie słodkich syropów

21 Inne enzymy znajdujące zastosowanie w przemyśle Enzym Zastosowanie Izomeraza 11βsterydowa Aminoacylaza Penicylinaza Hydrataza nitrylowa Lipaza Pektynaza Biotransformacja sterydów Otrzymywanie optycznie czynnych aminokwasów Otrzymywanie kwasu 6AP Synteza aminokwasów Hydroliza triacyloglicerydów Klarowanie soków

22 Immobilizacja enzymów Metody immobilizacji a) Adsorpcja na powierzchni nośnika (alumina, hydroksyapatyt, kaolinit szkło, matryce jonowymienne); b) Wiązanie kowalencyjne z nośnikiem (poliakrylamid, nylon, celuloza, dekstran, Sephadex, Sepharose, Agarose, żel krzemionkowy, kulki szklane). Konieczna aktywacja nośnika; c) Uwięzienie w matrycy - akrylamid polimeryzowany w roztworze enzymu - żele tworzone in situ w roztworze enzymu; d) Kapsułkowanie w membranie półprzepuszczalnej liposomy, kapsułki nylonowe, celofanowe, celuloidowe, poliuretanowe e) Sieciowanie międzycząsteczkowe Czynniki sieciujące: aldehyd glutarowy, 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen;.

23 Immobilizacja enzymów Metody kowalencyjnej immobilizacji enzymów

24 Immobilizacja enzymów Immobilizacja enzymu z zastosowaniem molekularnego wysięgnika 1 immobilizacja bez wysięgnika; 2 - immobilizacja z użyciem krótkiego wysięgnika; 3 immoblizacja z użyciem długiego wysięgnika; 4 wysięgnik zbyt długi; 5 immobilizacja wielopunktowa; 6, 7, 8 relacja wysięgnik:centrum aktywne Immobilizowanego enzymu

25 Immobilizacja enzymów Otrzymywanie sol-żeli z zastosowaniem różnych dodatków oraz metod suszenia Sol-żele: żele nieorganiczne Otrzymywane głównie z tlenków krzemu, tytanu, cyrkonu, glinu i glinokrzemianów Większe możliwości alkoksydy Si(OR) 4 i alkoksysilany XSi(OR) 3 oraz XX Si(OR) 2 Aerożele wysuszane przez usunięcie płynu w stanie nadkrytycznym (CO 2 T k = 31 C) Ambiżele z materiałów zawierających dużą liczbę grup hydrofobowych

26 Immobilizacja enzymów Schemat immobilizacji enzymów w hydrożelach: a) alginianie wapnia; b) karagenianie

27 Schemat silanizacji szkła oraz immobilizacji enzymów po uprzedniej funkcjonalizacji podstawników silanowych Immobilizacja enzymów

28 Immobilizacja enzymów Przykłady procesów przemysłowych prowadzonych z użyciem immobilizowanych enzymów Enzym Matryca Metoda immobilizacji Zastosowanie Aminoacylaza DEAE-Sephadex Adsorpcja Otrzymywanie L-aminokwasów Izomeraza glukozowa Amberlit IRA904 Adsorpcja Otrzymywanie syropu fruktozoglukozowego Termolizyna Układ dwufazowy Otrzymywanie aspartamu β-galaktozydaza Krzemionka Adsorpcja Otrzymywanie mleka wolnego od laktozy Amidaza penicylanowa Poloakrylamid, celuloza Uwięzienie w matrycy Otrzymywanie 6- APA Oksydaza glukozowa Peroksydaza Kapsułkowanie Oznaczanie glukozy

29 Biokataliza w rozpuszczalnikach organicznych Charakterystyka biokatalizy dwufazowej w układzie woda/rozpuszczalnik organiczny Potencjalne zalety: -wysoka rozpuszczalność substratu i produktu -zmniejszenie możliwości inhibicji przez produkt lub nadmiar substratu -ułatwione wyodrębnienie produktu i odzysk biokatalizatora -wysoka rozpuszczalność gazów w rozpuszczalnikach organicznych -korzystne przesunięcie równowagi reakcji Potencjalne wady: -możliwa denaturacja i.lub inhibicja biokatalizatora przez rozpuszczalnik organiczny -zwiększona złożoność reakcji

30 Biokataliza w rozpuszczalnikach organicznych prof. Ernest Sym zapoczątkował na PG badania w dziedzinie biotechnologii; światowy pionier badań nad katalizą enzymatyczną w układach niewodnych.

31 Biokataliza w rozpuszczalnikach organicznych Biokompatybilne rozpuszczalniki organiczne Kryterium wartość parametru Hanscha - log P oct - współczynnik podziału w układzie n-oktanol/woda Rozpuszczalniki charakteryzujące się log P oct <2 są uważane za nieprzydatne do biokatalizy; log P oct = 2 4 biokompatybilność pośrednia i zmienna; log P oct > 4 rozpuszczalniki biokompatybilne Przykłady: n-dekanol 4,0 n-heptan 4,0 n-dodekanol 5,0 n-nonan 5,1 eter difenylowy 4,3 n- undekan 6,1 benzoesan pentylu 4,2 oleinian butylu 9,8 ftalan dibutylu 5,4

32 Biokataliza w rozpuszczalnikach organicznych (a) dwufazowa emulsja wody w oleju (b) dwufazowa emulsja oleju w wodzie (c) enzym immobilizowany na porowatym nośniku w układzie dwufazowym (d) enzym w odwróconej miceli (e) kowalencyjnie zmodyfikowany enzym (np. glikolem polietylenowym) w rozp. org. (f) immobilizowany enzym rozpuszczony w rozp. org. (g) sproszkowany enzym rozpuszczony w rozp. org.

33 Biokataliza w innych układach Układ faza stała/faza gazowa Brak problemów z przenikaniem masy Kataliza z udziałem enzymów takich jak: dehydrogenaza alkoholowa, oksydaza alkoholowa, lipazy. Reakcje synteza związków lotnych, jak aldehydy, estry, ketony Reakcje w cieczach nadkrytycznych Duże szybkości przenikania masy i łatwe wyodrębnianie produktów. Aparatura wysokociśnieniowa Stosuje się głównie ditlenek węgla (Tk = 31 C). Reakcje dotyczące związków hydrofobowych, m.in. utlenianie cholesterolu przez oksydazę cholesterolową, stereoselektywne hydrolizy estrów przez immobilizowane lipazy, syntezy dipeptydów z użyciem enzymów proteolitycznych Biokataliza w cieczach jonowych Sole nie krystalizujące w temperaturze pokojowej (kation 1,3-dialkiloimidazoliowy lub N-alkilopirydyniowy i anion BF 4-, BF 6- lub NO 3-. Wiele enzymów wykazuje trwałość w cieczach jonowych, a nawet korzystniejsze właściwości (dotyczy to m.in. lipaz)

34 Przykłady zastosowań Działanie fosfolipaz na fosfatydylocholinę Schemat procesu usuwania fosfolipidów z olejów (odśluzowywanie)

35 Przykłady zastosowań Schemat produkcji syropu glukozowego E 1 alfa amylaza, E 2 - glukoamylaza

36 Przykłady zastosowań Reakcje katalizowane przez monooksygenazy wykorzystywane do biotransformacji w praktyce przemysłowej (a) hydroksylowanie alkanów (b) hydroksylowane arenów (c) epoksydacja alkenów (d) utlenianie heteroatomów (e) utlenianie ketonów do estrów

37 Przykłady zastosowań Biokatalityczna synteza optycznie czynnych aminokwasów O O O R OH R NH 2 R OR 2 NHC(O)R 1 NH 2 NHR 1 Acylaza Amidaza Esteraza lub proteaza CO 2 H liaza addycja amoniaku do podwójnego wią zania H R NH 2 dehydrogenaza redukcyjne aminowanie O O R OH R OH O

38 Przykłady zastosowań ZASTOSOWANIE ENZYMÓW DO OTRZYMYWANIA OPTYCZNIE CZYNNYCH AMINOKWASÓW NH 3 + H HOOC C C COOH H aspartaza H 2 N L COOH CH 2 COOH H H COOH NH 3 + C C H synteza NAc-DL-aminokwas chemiczna amoniako-liaza fenyloalaninowa L COOH aminoacylaza z Aspergillus oryzae H 2 NL-aminokwas H CH 2 + CH 3 COO - racemizacja NAc-D-aminokwas Biosynteza optycznie czynnych aminokwasów białkowych

39 Przykłady zastosowań ZASTOSOWANIE ENZYMÓW DO OTRZYMYWANIA OPTYCZNIE CZYNNYCH AMINOKWASÓW DL O NH hydantoinaza O O D OH NH NH 2 amidohydrolaza O D OH NH 2 N H O racemizacja, ph 8 O L NH N H O Synteza/biosynteza optycznie czynnych pochodnych glicyny substratów dla otrzymywania penicylin półsyntetycznych

40 Wykład 4 3 Biokataliza. Procesy biotechnologiczne Zastosowanie enzymów w procesach przemysłowych Przykłady zastosowań Alternatywne możliwości otrzymywania 6APA z penicyliny G

41 Przykłady zastosowań Wytwarzanie kwasu 6-aminopenicylanowego (6APA) Warunki hydrolizy enzymatycznej Biotransformacja 12-15% (w/v) roztworu soli penicyliny G lub V przez immobilizowaną amidazę penicylinową. Podczas reakcji utrzymuje się ph na poziomie 7 8 poprzez dodawanie KOH, NaOH lub wody aminiakalnej. Produkty: 6APA oraz odpowiedni kwas (fenylooctowy lub fenoksyoctowy). 6APA izoluje się poprzez zakwaszenie mieszaniny poreakcyjnej do ph = 4.0 w obecności rozpuszczalnika organicznego nie mieszającego się z wodą. W tych warunkach 6APA wytrąca się, a kwas prekursorowy przechodzi do fazy organicznej i jest zwykle zawracany jako dodatek do nowej fermentacji Korzyści z zastąpienia chemicznej hydrolizy penicyliny G do 6APA przez hydrolizę enzymatyczną Eliminacja chlorowcowanych rozpuszczalników organicznych, toksycznych odczynników i odpadów oraz potrzeby stosowania ciekłego azotu do chłodzenia; prowadzenie reakcji w umiarkowanych warunkach; łatwa kontrola ph, temperatury; zwiększenie wydajności, brak produktów ubocznych;

42 Przykłady zastosowań Synteza aspartamu z zastosowaniem biotransformacji enzymatycznej

43 Przykłady zastosowań Biotransformacje sterydów