Trombocytopoeza u chorych na astmę alergiczną

Transkrypt

1 Trombocytopoeza u chorych na astmę alergiczną Thrombocytopoesis in allergic asthma Izabela Kemona-Chętnik 1, Anna Bodzenta-Łukaszyk 1, Anna Butkiewicz 2, Violetta Dymnicka-Piekarska 2, Halina Kemona 2 1 Klinika Alergologii i Chorób Wewnętrznych, Akademia Medyczna, Białystok 2 Zakład Laboratoryjnej Diagnostyki Klinicznej, Akademia Medyczna, Białystok Streszczenie: Wprowadzenie. Astmę alergiczną charakteryzuje stan zapalny błony śluzowej oskrzeli oraz toczące się równolegle procesy naprawcze, które powodują postępujące upośledzenie czynności dróg oddechowych. Badania ostatnich lat wskazują, że w procesie tym istotną rolę odgrywają płytki krwi. Cele. Celem naszej pracy była ocena liczby płytek krwi, odsetka płytek retikularnych, stężenia trombopoetyny oraz interleukiny 6 (IL-6) w osoczu u chorych na astmę umiarkowaną. Pacjenci i metody. Grupę badaną stanowiło 12 chorych na alergiczną przewlekłą umiarkowaną astmę i 12 chorych na niealergiczną umiarkowaną astmę. Pacjenci otrzymywali leczenie spełniające standardy kryteriów GINA 24 dla astmy przewlekłej umiarkowanej. Grupę kontrolną stanowiło 7 zdrowych ochotników. Materiałem do badań była krew pobierana w godzinach porannych z żyły odłokciowej do probówek zawierających CTAD. Wyniki. W grupie chorych na astmę alergiczną wykazano istotnie statystycznie większą liczbę płytek krwi w porównaniu z grupą kontrolną. Liczba płytek u chorych na astmę niealergiczną była zwiększona w porównaniu z grupą osób zdrowych, jednak różnica nie była istotna statystycznie. Liczba płytek retikularnych u chorych na astmę alergiczną była istotnie statystycznie większa niż u chorych na astmę niealergiczną i osób zdrowych. Nie stwierdzono natomiast istotnych różnic pomiędzy chorymi na astmę niealergiczną i grupą kontrolną. U chorych na astmę alergiczną wartości IL-6 były istotnie większe niż u osób zdrowych. Nie obserwowano różnic w stężeniu IL-6 między grupami chorych na astmę alergiczną i niealergiczną. Stwierdzono stężenie trombopoetyny nieistotnie statystycznie większe u chorych na astmę niealergiczną w porównaniu z grupą chorych na astmę alergiczną, a także grupą kontrolną. Wnioski. Płytki krwi mogą aktywnie uczestniczyć w procesie zapalenia alergicznego oraz przebudowy dróg oddechowych. W badanej grupie chorych na astmę alergiczną stwierdzono większą liczbę płytek retikularnych, co wskazywać może na wzmożony proces megakariocytopoezy. Potrzebne są dalsze badania nad udziałem płytek krwi w patomechanizmie astmy oskrzelowej i jej powikłań, mogące się przyczynić do rozwoju nowych możliwości terapeutycznych. Słowa kluczowe: płytki retikularne, zapalenie alergiczne Abstract: Background. Allergic asthma is characterized by bronchial inflammation and simultaneous repair processes that results in increased airway obstruction. Recent studies indicate that platelets could play an important role in this process. Objectives. The aim of the present study was to evaluate the platelet count, the percentage of reticulated platelets, plasma thrombopoietin and interleukin 6 (IL-6) concentrations in patients with moderate bronchial asthma. Patients and methods. The study was performed in 12 allergic chronic asthma patients and 12 nonallergic chronic asthma patients. Patients were treated according to the GINA 24 recommendations for chronic moderate asthma. Seven healthy individuals served as negative controls. Blood was collected on CTAD from antecubital vein in the morning. Results. The platelet count was statistically higher in allergic asthma patients compared with healthy controls. In nonallergic asthma patients the platelet count was also higher but the difference was not statistically significant. The percentage of the reticulated platelets in allergic asthma patients was statistically higher as compared to nonallergic and healthy subjects, who had similiar values. The concentration of IL-6 was significantly elevated in allergic asthma patients as compared to healthy controls. There was no difference in IL-6 levels between both asthma patient groups. In nonallergic asthma patients plasma thrombopoietin levels were slightly higher, but not statistically significant, in comparison with allergic asthma patients and controls. Conclusions. Our findings suggest that platelets may be involved in allergic inflammation and play a significant role in remodeling of the airways. In patients with allergic asthma we found increased reticulated platelet count suggesting enhanced megakaryocytopoiesis. Further studies on a role of platelets in the pathogenesis of asthma and their potential clinical implications are warranted and may contribute to the development of novel therapies. Key words: reticulated platelets, allergic inflammation Trombocytopoeza u chorych na astmę alergiczną

2 WPROWADZENIE Astma jest przewlekłym procesem zapalnym dróg oddechowych. U osób podatnych zapalenie to jest przyczyną nawracającej duszności z towarzyszącymi świstami i uczuciem ucisku w klatce piersiowej. Objawy te związane są z uogólnionym, choć zmiennym ograniczeniem przepływu powietrza w drogach oddechowych. Zapalenie alergiczne cechują nacieki zapalne głównie z komórek tucznych, eozynofilów, limfocytów T oraz płytek krwi w błonie śluzowej oskrzeli [1]. Płytki krwi inicjują i podtrzymują procesy zapalne oraz biorą udział w regulacji procesu przebudowy dróg oddechowych poprzez wydzielanie czynnika aktywującego płytki (platelet activating factor PAF), płytkopochodnego czynnika wzrostu (platelet derived growth factor PDGF), transformujących czynników wzrostu β i α (transforming growth factor TGF-β i TGF-α) oraz prostaglandyn. W procesie zapalnym płytki krwi uwalniają selektynę P, co umożliwia ich oddziaływanie z leukocytami [2]. Płytki krwi mogą być aktywowane przez różne patogeny: bakterie, wirusy i grzyby oraz alergeny. Mogą aktywować fagocytozę, zwiększać degranulację lizosomów i potęgować cytotoksyczność neutrofilów, monocytów oraz naturalnych komórek cytotoksycznych (natural killers NK) [3]. Na powierzchni płytek krwi stwierdzono receptory o małym i dużym powinowactwie do IgE FcεRII i FcεRI oraz do IgG FcγRII [4,5]. U chorych na astmę liczba płytek krwi wiążących IgE jest o połowę większa niż w grupie osób zdrowych [6]. Beasley i wsp. wykazali zwiększone gromadzenie się płytek krwi w naczyniach oskrzeli po prowokacji swoistym alergenem [7]. Taytard i wsp. stwierdzili istotne skrócenie czasu przeżycia płytek krwi u chorych na astmę w porównaniu z grupą kontrolną [8]. Jeffrey i wsp. sugerują, że zjawisko to może być wynikiem migracji płytek krwi z krążenia do układu oddechowego [9]. Szczeklik i wsp. obserwowali wydłużenie czasu krwawienia u chorych na astmę alergiczną [1]. Badania Sullivan i wsp., dotyczące dynamiki liczby płytek krwi u chorych na astmę po prowokacji alergenem, wykazały zmniejszenie liczby płytek krwi w czasie późnej fazy reakcji alergicznej. Po 24 godzinach od rozpoczęcia badania nadal stwierdzano zmniejszoną liczbę płytek krwi, mimo normalizacji parametrów spirometrycznych [11]. Badając agregację płytek krwi indukowaną ADP (adenozynodifosforan) i adrenaliną u chorych na astmę, Maccia i wsp. stwierdzili jej istotne zmniejszenie [12]. Nie wykazano natomiast istotnych zmian w agregacji płytek krwi wzbudzanej PAF. Przedstawione dane z piśmiennictwa wskazują, że płytki krwi mogą uczestniczyć w alergicznej reakcji zapalnej. Adres do korespondencji: dr med. Izabela Kemona-Chętnik, Klinika Alergologii i Chorób Wewnętrznych, Akademia Medyczna, Białystok, Białystok, ul. M. Skłodowskiej-Curie 24a, tel.: , fax: , alergol@amb.edu.pl Praca wpłynęła: Przyjęta do druku: Nie zgłoszono sprzeczności interesów. Pol Arch Med Wewn. 27; 117 (1-2): 9-13 Copyright by Medycyna Praktyczna, Kraków 27 Płytki krwi powstają nie tylko w szpiku kostnym, ale również częściowo w płucach w wyniku fragmentacji megakariocytów. Jeśli weźmie się pod uwagę powyższe dane, interesująca wydaje się ocena trombocytopoezy w alergicznej astmie oskrzelowej. Rozwój megakariocytów pobudzają Meg-CSF (megacariocyte-colony stymulating factor) i GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor). Głównym hormonem odpowiedzialnym za proces megakariocytopoezy jest trombopoetyna (TPO) glikoproteina o masie cząsteczkowej 18 32, produkowana w nerce i wątrobie [13]. Odpowiada ona za proliferację, różnicowanie i dojrzewanie komórek szeregu megakariocytowego oraz przechodzenie płytek do krwiobiegu. W ocenie aktywności trombopoetycznej płytek pomocny może być również odsetek młodych płytek retikularnych z resztkowym RNA [14,15]. Interleukina-6 (IL-6) łącznie z IL-3 jest odpowiedzialna za krwiotworzenie i stymulację proliferacji oraz różnicowania macierzystych komórek progenitorowych wielu szeregów, zwłaszcza za różnicowanie megakariocytów oraz powstawanie kolonii granulocytarnych i makrofagowych [16]. Celem naszej pracy była ocena u chorych na astmę oskrzelową następujących parametrów: 1) liczby płytek krwi, 2) odsetka płytek retikularnych, 3) stężenia IL-6, 4) stężenia trombopoetyny w osoczu. PACJENCI I METODY Grupę badaną stanowiło 12 chorych (7 kobiet i 5 mężczyzn; średnia wieku 42 lat ±5,8 roku) na udokumentowaną alergiczną przewlekłą astmę umiarkowaną i 12 chorych (6 kobiet i 6 mężczyzn; średnia wieku 48 lat ±6,4 roku) na udokumentowaną niealergiczną umiarkowaną astmę oskrzelową, pozostających pod opieką Poradni i Kliniki Alergologii i Chorób Wewnętrznych Akademii Medycznej w Białymstoku. Pacjenci otrzymywali leczenie spełniające standardy kryteriów GINA 24 dla astmy przewlekłej umiarkowanej. Wszyscy pozostawali w stabilnym okresie choroby. Grupę kontrolną stanowiło 7 zdrowych ochotników (3 kobiety i 4 mężczyzn; średnia wieku 24 ±2,5 roku). Badania uzyskały zgodę Komisji Bioetycznej Akademii Medycznej w Białymstoku. Krew do badań w grupie chorych na astmę i w grupie kontrolnej pobierano w godzinach porannych z żyły odłokciowej do probówek zawierających CTAD (citrate theophylline adenosine dipiridamole). Liczbę płytek we krwi pobranej na EDTA (etylenediaminetetraacetic acid disodium salt p.a.) w tys./μl oznaczano na analizatorze Advial 65 (Bayer). Liczbę płytek retikularnych oznaczano za pomocą cytometru przepływowego Epics XL (Coulter USA). Stężenie IL-6 i trombopoetyny oznaczano z użyciem zestawów Quantikine Human HS ELISAKit (R&D Systems). 1 POLSKIE ARCHIWUM MEDYCYNY WEWNĘTRZNEJ 27; 117 (1-2)

3 Obliczenia statystyczne przeprowadzono za pomocą programu Medcalc. Wyniki wyrażono jako średnie wartości ±odchylenie standardowe (SD). Wartości p <,5 przyjęto za istotne statystycznie. WYNIKI Liczba płytek krwi W grupie osób na astmę alergiczną stwierdzono większą liczbę płytek krwi niż u chorych na astmę niealergiczną (281,75 ±58,95 vs 268,58 ±69,74 tys./μl) oraz w grupie kontrolnej (281,75 ±58,95 vs 22,5 ±58,3 tys./μl; p <,5). Liczba płytek u chorych na astmę niealergiczną była zwiększona w porównaniu z grupą osób zdrowych, jednak różnica ta nie była istotna statystycznie (268,58 ±69,74 vs 22,5 ±58,3 tys./μl) [ryc. 1]. Płytki retikularne Liczba płytek retikularnych u chorych na astmę alergiczną była istotnie statystycznie większa niż u chorych na astmę niealergiczną (2,58 ±1,48 vs 1,5 ±,91%; p <,5) i w grupie osób zdrowych (2,58 ±1,48 vs 1,32 ±,55%; p <,5). Nie stwierdzono natomiast istotnych różnic pomiędzy grupą chorych na astmę niealergiczną a grupą kontrolną (1,5 ±,91 vs 1,32 ±,55%) [ryc. 2]. Interleukina 6 U chorych na astmę alergiczną wartości IL-6 były istotnie większe niż u osób zdrowych (,57 ±,34 vs,25 ±,35 pg/ml; p =,5). Nie stwierdzono różnic w stężeniu IL-6 między grupami chorych na astmę alergiczną i niealergiczną (,57 ±,34 vs,57 ±,38 pg/ml). W grupie chorych na astmę niealergiczną stężenie IL-6 również było zwiększone, różnica ta nie była jednak istotna statystycznie [ryc. 3]. Trombopoetyna Stężenie trombopoetyny było nieistotnie statystycznie większe u chorych na astmę niealergiczną niż w grupie chorych na astmę alergiczną (41,55 ±39,64 vs 25,48 ±24,94 pg/ml) i osób z grupy kontrolnej (41,55 ±39,64 vs 22,19 ±2,16 pg/ ml). Stężenia trombopoetyny u chorych na astmę alergiczną były porównywalne ze stwierdzanymi w grupie osób zdrowych (25,48 ±24,94 vs 22,19 ±2,16 pg/ml) [ryc. 4]. tys./µl Ryc. 1. Liczba płytek krwi Ryc. 2. Liczba płytek retikularnych * nie Dane wyrażono jako średnią ±SD. * p<,5 w stosunku do grupy kontrolnej % 4,5 * 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1,5 nie Dane wyrażono jako średnią ±SD. * p<,5 w stosunku do pacjentów z astmą niealergiczną i grupy kontrolnej pg/ml 1 *,9,8,7,6,5,4,3,2,1 nie Dane wyrażono jako średnią ±SD. * p<,5 w stosunku do grupy kontrolnej Ryc. 3. Stężenie interleukiny 6 Trombocytopoeza u chorych na astmę alergiczną 11

4 pg/ml Ryc. 4. Stężenie trombopoetyny nie Dane wyrażono jako średnią ±SD. OMÓWIENIE Mechanizmy leżące u podłoża przebudowy dróg oddechowych w astmie wciąż nie zostały do końca poznane. Doniesienia od 2 lat sugerują, że istotną rolę w tym procesie może odgrywać aktywacja płytek [17]. W naszych badaniach wykazaliśmy znamiennie większą liczbę płytek retikularnych u chorych na astmę alergiczną w porównaniu z grupą chorych na astmę niealergiczną. W grupie chorych na astmę alergiczną zwiększona była również liczba płytek we krwi obwodowej. Może to wynikać z faktu, że chorzy byli prawidłowo leczeni i pozostawali w stabilnym okresie choroby. Pomocne w wyjaśnieniu uzyskanych przez nas wyników mogą być doniesienia dotyczące roli płytek w swoistej prowokacji dooskrzelowej alergenem Dermatophagoides pteronyssinus [18]. W trakcie późnej fazy reakcji alergicznej następuje istotne zmniejszenie liczby płytek we krwi obwodowej, związane najprawdopodobniej z ich migracją do miejsca, gdzie doszło do procesu zapalnego. Udokumentowano obecność agregatów płytek w naczyniach włosowatych płuc, popłuczynach oskrzelikowo-pęcherzykowych oraz nabłonku dróg oddechowych osób chorych na astmę alergiczną, co wskazuje na ich aktywny udział w procesie zapalnym [19,2]. Płytki biorą udział w przebudowie dróg oddechowych pośrednio poprzez chemotaksję leukocytów i eozynofilów, i bezpośrednio poprzez ekspresję czynników wzrostu i metaloproteinaz macierzy [21]. Myszy doświadczalne nebulizowane owoalbuminą, u których wywołano trombocytopenię metodami immunologicznymi (przeciwciała przeciwpłytkowe) i nieimmunologicznymi (busulfan), wykazywały znacznie mniejszy stopień przebudowy drzewa oskrzelowego niż zwierzęta, które poddano jedynie prowokacji dooskrzelowej [21]. Możemy wnioskować, że u chorych na astmę alergiczną dochodzi do migracji płytek do miejsca procesu zapalnego w wyniku powtarzającej się ekspozycji na alergeny, takie jak roztocza kurzu domowego czy sierść zwierząt, których całkowite wyeliminowanie z otoczenia nie jest możliwe. Taytard i wsp. wykazali skrócony czas przeżycia płytek u chorych na astmę alergiczną, najprawdopodobniej związany z ich migracją do drzewa oskrzelowego [8]. W naszych badaniach stwierdziliśmy istotnie większą liczbę płytek retikularnych w grupie chorych z alergią, co może wskazywać na wzmożony proces megakariocytopoezy związany z udziałem tych komórek w reakcji zapalnej. Niestety nie udało się nam odpowiedzieć na pytanie, czy Il-6 oraz trombopoetyna mogą w sposób istotny wpływać na powstawanie płytek w umiarkowanej astmie alergicznej. Il-6 jak wiadomo charakteryzuje się krótkim okresem półtrwania (około 5 h), a jej wytwarzanie związane jest z aktywacją komórek. Pacjenci, choć przewlekle stymulowani niewielkimi dawkami alergenu, pozostawali w stabilnym okresie choroby i byli leczeni. Być może dlatego nie zaobserwowaliśmy znaczących różnic w stężeniu Il-6. Z kolei czynnikiem wpływającym na powstawanie trombopoetyny jest jak wiadomo hipoksja, która w astmie umiarkowanej prawidłowo leczonej odgrywa najprawdopodobniej niewielką rolę. Trudność w interpretacji uzyskanych wyników jest spowodowana również niewielką liczebnością grup chorych na astmę. Do wyciągnięcia ostatecznych wniosków konieczne będą dalsze badania w tym kierunku. Doniesienia z ostatnich lat wskazują, że w płynie uzyskanym z popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych chorych na astmę alergiczną stwierdza się zwiększoną liczbę limfocytów T. Aktywowane płytki ułatwiają przyleganie limfocytów do śródbłonka i ich migrację do miejsca, w którym toczy się proces zapalny [22]. Limfocyty T wydzielają m.in. IL-3 oraz GM-CSF, które przyczyniają się do powstawania nadreaktywności drzewa oskrzelowego, a jednocześnie oddziaływują na megakariocytopoezę [23]. Wyjaśnienie wpływu tych cytokin na powstawanie płytek krwi u chorych na astmę będzie przedmiotem naszych dalszych badań. Przedstawione powyżej wyniki badań mogą sugerować, że płytki migrują do drzewa oskrzelowego chorych na astmę alergiczną i wpływają na jego przebudowę. Należy się zatem zastanowić, czy jesteśmy obecnie w stanie powstrzymać ten proces. Badania doświadczalne wykazały, że podawanie deksametazonu nie hamowało pogrubienia nabłonka oskrzeli ani podnabłonkowego włóknienia mimo znacznego zahamowania migracji leukocytów. Być może więc procesy prowadzące do przebudowy drzewa oskrzelowego nie zależą od obecności leukocytów, podczas gdy aktywacja płytek, jak twierdzi Pitchford i wsp., odgrywa w nich istotną rolę [21]. W naszych badaniach pacjenci z obu badanych grup byli leczeni steroidami wziewnymi, a mimo to zaobserwowaliśmy istotnie większą liczbę płytek retikularnych u chorych na astmę alergiczną. Płytki krwi mogą aktywnie uczestniczyć w procesie zapalenia alergicznego oraz przebudowy dróg oddechowych. W badanej grupie chorych na astmę alergiczną stwierdzono większą liczbę płytek retikularnych, co wskazywać może na wzmożony proces megakariocytopoezy w tej grupie chorych. Obecnie stosowane metody leczenia nie mają wpływu na to zjawisko. Dalsze badania nad udziałem płytek krwi w patomechanizmie astmy oskrzelowej mogą się przyczynić do rozwoju nowych interesujących możliwości terapeutycznych. 12 POLSKIE ARCHIWUM MEDYCYNY WEWNĘTRZNEJ 27; 117 (1-2)

5 PODZIĘKOWANIE Projekt był finansowany z pracy statutowej nr P. PIŚMIENNICTWO 1. Pearlman DS. Pathophysiology of the inflammatory response. J Allergy Clin Immunol. 1999; 14: Selak MA. Cathepsin G and thrombin: evidence for two different platelet receptors. Biochem J. 1994; 297: Herd CM, Page CP. Pulmonary immune cells in health and disease: platelets. Eur Respir J. 1994; 7: Hasegawa S, Pawankar R, Suzuki K, et al. Functional expression of the high affinity receptor for IgE (FcεRI) in human platelets and its intracellular expression in human megacariocytes. Blood 1999; 98: Capron A, Dessaint JP, Capron M, et al. From parasites to allergy: A second receptor for IgE. Immunol Today 1986; 82: Capron A, Ameisen JC, Joseph M, et al. New functions for platelets and their pathological implications. Int Arch Allergy Appl Immunol. 1985; 77: Beasley R, Roche WR, Roberts JA, et al. Cellular events in the bronchi in mild asthma and after bronchial provocation. Am Rev Respir Dis. 1989; 139: Taytard A, Guenard H, Vuileman L. Platelet kinetics in stable atopic tic patients. Am Rev Respir Dis. 1986; 134: Jeffrey PK, Wardlaw AJ, Nelson FC, et al. Bronchial biopsies in : an ultrastructural, qualitative study and correlation with bronchial hyperreactivity. Am Rev Respir Dis. 1989; 14: Szczeklik A, Milner PC, Birch J, et al. Prolonged bleeding time, reduced platelet aggregation, altered PAF-acether sensitivity and increased platelet mass are a trait of asthma and hay fever. Thromb Haemost. 1986; 56: Sullivan PJ, Jafar ZH, Harbinson PL, et al. Platelet dynamics following allergen challenge in allergic asthmatics. Respiration 2; 67: Maccia CA, Gallagher JS, Ataman G, et al. Platelet thrombopathy in asthmatic patients with elevated immunoglobulin E. J Allergy Clin Immunol. 1977; 9: Kaushansky K. Thrombopoietin: understanding and manipulating platelet production. Annu Rev Med. 1997; 48: 1-11, 14. Richards EM, Baglin TP. Quantitation of reticulated platelets: methodology and clinical application. Br J Haematol. 1995; 91: Rinder HM, Muntz UJ, Ault G, et al. Reticulated platelets In the evaluation of thrombopoietic disorders. Arch Pathol Lab Med. 1993; 117: Jędrzejczak WW, Podolak-Dawidziak M. Cytokiny. Zastosowanie kliniczne. Wrocław, Volumed, Morley J, Sanjar S, Page CP. The platelet in asthma. Lancet 1984; 1: Kowal K, Pampuch A, Kowal-Bielecka O, et al. Platelet activation in allergic patients during alergen challenge with Dermatophagoides pteronyssinus. Clin Exp Allergy 26; 36: Jeffery PK, Wardlaw AJ, Nelson FC, et al. Bronchial biopsies in asthma. An ultrastructural, quantitive study and correlation with hyperreactivity. Am Rev Respir Dis. 1989; 14: Metzger WJ, Sjoerdsma K, Richerson HB, et al. Platelets in bronchoalveolar lavage from asthmatic patients and allergic rabbits with allergen-induced late phase responses. Agents Actions 1987; 21: Pitchford SC, Riffo-Vasquez Y, Sousa A, et al. Platelets are necessary for airway wall remodeling in murine model of chronic allergic inflammation. Blood 24; 13, Li N, Ji Q, Hjemdahl P. Platelets-lymphocyte conjugation differs between lymphocyte subpopulations. J Thromb Haemost. 26; 4: Robinson DS, Ying S, Bentley AM, et al. Relationships among numbers of bronchoalveolar lavage cells expressing messenger ribonucleic acid for cytokines, asthma symptoms and airway metacholine responsiveness in atopic asthma. J Allergy Clin Immunol. 1993; 92: Trombocytopoeza u chorych na astmę alergiczną 13