Ocena wybranych parametrów krzepnięcia krwi u szczurów po ich ekspozycji na rtęć uwolnioną z amalgamatów*

Transkrypt

1 Czas. Stomatol., 007, LX,, Polish Dental Association Ocena wybranych parametrów krzepnięcia krwi u szczurów po ich ekspozycji na rtęć uwolnioną z amalgamatów* Evaluation of selected parameters of blood coagulation in rats following exposure to mercury released from amalgams Halina Pawlicka, Marta Michalska, Marcin Kozakiewicz, Łukasz Michalski 4, Piotr Arkuszewski Z Zakładu Endodoncji Katedry Stomatologii Zachowawczej, Endodoncji i Periodontologii UM w Łodzi Kierownik: prof. zw. dr hab. H. Pawlicka; Z Zakładu Biochemii Farmaceutycznej, Katedry Chemii Farmaceutycznej i Biochemii UM w Łodzi, Kierownik : prof. zw. dr hab. R. Wierzbicki; Z Kliniki Chirurgii Czaszkowo-Szczękowo-Twarzowej z Onkologią Uniwersytecki Szpital Kliniczny im. N. Barlickiego w Łodzi, Kierownik : prof. zw. dr hab. n. med. P. Arkuszewski; Ze Studenckiego Koła Naukowego przy Zakładzie Endodoncji Katedry Stomatologii Zachowawczej, Endodoncji i Periodontologii UM w Łodzi 4, Opiekun: prof. zw. dr hab. H. Pawlicka Streszczenie Wprowadzenie: dotychczasowe badania wykazały, że rtęć wpływa na proces krzepnięcia krwi i przyspiesza wytworzenie fibryny. Według Amerykańskiej Agencji Substancji Toksycznych rtęć może być uwalniana do organizmu powoli w wyniku korozji, żucia, lub zgrzytania. Cel pracy: oceniono wpływ chlorku rtęci (II) na wybrane parametry krzepnięcia krwi u szczurów. Materiał i metody: badania wykazały wpływ rtęci w stężeniach mol/ l na stężenie fibrynogenu, czas częściowej tromboplastyny (PTT), czas heparynowo - trombinowy (HTCT) i na aktywność antytrombiny III (ATIII). Chlorek rtęci (II) powoduje wzrost stężenia fibrynogenu w pierwszym, drugim i trzecim dniu, skrócenie czasu częściowej tromboplastyny w pierwszym i trzecim dniu oraz skrócenie czasu heparynowo-trombinowego w trzecim dniu doświadczenia w porównaniu z kontrolą. Podsumowanie: ilość rtęci uwalnianej z amalgamatów (kilka µg/dzień) nie stanowi realnego niebezpieczeństwa dla hemostazy pacjenta, co nie zwalnia z obowiązku zachowania wszelkich środków ostrożności przy pracy w gabinetach stomatologicznych. Summary Introduction: Recent research has indicated that mercury affects the process of blood coagulation and accelerates fibrin formation. According to the American Agency for Toxic Substances, mercury can be slowly released from amalgans due to corrosion, mastication or bruxism. Aim of the study: To evaluate the influence of mercuric chloride (II) on selected blood parameters in rats. Materials and methods: Research has indicated the influence of mercury in concentrations mol /l on fibrinogen concentration, partial thromboplastin time (PTT), heparin-thrombin time (HTCT) and antithrombin III (ATIII) activity. Mercury chloride (II) increased fibrinogen concentration on the first, second and third day, it shortened PTT time on the first and third day, and heparin-thrombin time on the third day of the trial in comparison with the control group. Conclusion: The amount of mercury released from amalgams does not pose a real threat to the patient s haemostasis, nevertheless, all precautions should be taken when working with amalgams in dental surgeries. HASŁA INDEKSOWE: chlorek rtęci, amalgamat KEYWORDS: mercuric chloride, amalgam *Praca finansowana z tematu KBN 4079/9/0. 56

2 007, LX, Krzepnięcie krwi u szczurów po ekspozycji na rtęć Wstęp Stosowany w stomatologii amalgamat jest przedmiotem licznych dyskusji na temat bezpieczeństwa jego stosowania. Amalgamat jest mieszaniną metali zawierającą około 50% rtęci, 5% srebra, 9% cyny, 6% miedzi i śladowe ilości cynku []. Jest tanim i łatwym w użyciu środkiem, ale zawarte w nim metale uwalniają się w procesach korozji, żucia i tarcia [7, 7, 8, ]. Uwalniana rtęć nie tylko może ulegać kumulacji w narządach organizmu, ale wywołuje także poważne objawy chorobowe. Narażenie na rtęć może wystąpić również u personelu stomatologicznego. Zawartość rtęci we krwi tych osób jest podwyższona. Według Amerykańskiego Towarzystwa Stomatologicznego preparaty amalgamatowe wymagają szczególnej ostrożności w zakresie bezpieczeństwa ich stosowania [5]. Toksyczne skutki ekspozycji na rtęć znane są od dawna, a od lat osiemdziesiątych ubiegłego wieku uważa się, że zatrucia rtęcią stanowią poważny problem zdrowotny [5, 8]. Rtęć łatwo pokonuje barierę krew mózg i wywołuje działanie neurotoksyczne uszkadzając ośrodkowy i obwodowy układ nerwowy. Istnieje również niebezpieczeństwo przenikania rtęci z wypełnień amalgamatowych zawierających ponad 50% rtęci do mleka matek. Z dotychczasowych badań wynika, że związki rtęci mogą powodować także zaburzenia w procesie hemostazy i wpływają na aktywność czynników krzepnięcia krwi oraz zmieniają strukturę utworzonej fibryny, która jest jednym z czynników sprzyjających formowaniu ognisk przerzutowych w chorobach nowotworowych i stymulujących proces angiogenezy [4, 5, 9,, 4]. Cel pracy Celem pracy było zbadanie wpływu chlorku rtęci (II) u szczurów na zawartość fibrynogenu, częściowy czas tromboplastyny (PTT), czas heparynowo- trombinowy (HTCT) i aktywność antytrombiny III. Materiał i metody Doświadczenie wykonano na samicach szczurów Wistar o wadze około 0g karmionych standardową dietą LSM. Zwierzęta podzielono na dwie grupy ( zwierząt w grupie). Grupa zwierząt badanych otrzymała dożołądkowo roztwór chlorku rtęci (II) w dawce 7,9 mg Hg/kg wagi ciała, tj. w ilości jaką stosowano we wcześniejszych pracach [0]. Grupa kontrolna i badana otrzymywała wodę do picia ad libidum. Oznaczenia wykonano w pierwszym, drugim i trzecim dniu po podaniu związku. Uzyskano Licencję Senackiej Komisji ds Etyki i Nadzoru Badań na Zwierzętach AM w Łodzi 0D. Osocze ubogopłytkowe otrzymywano przez odwirowanie krwi (00xg, 0 min., w 4 o C), pobranej do,8% cytrynianu sodowego (9:). Oznaczenie stężenia fibrynogenu w osoczu szczurów wykonano z użyciem zestawu Hemolab Fibrinomat (firmy bio Merieux). Stężenie fibrynogenu w osoczu podano w mg/dl. Czas częściowej tromboplastyny (PTT) oznaczano w osoczu ubogopłytkowym z użyciem zestawu Platelin plus activator firmy Gödecke. Wyniki wyrażono w sekundach. Czas heparynowo-trombinowy (HTCT) oznaczano w ubogopłytkowym osoczu cytrynianowym wg metody O Brien []. Czas heparynowo-trombinowy polega na oznaczeniu czasu krzepnięcia osocza po uprzednim dodaniu określonej ilości heparyny. Wyniki podano w sekundach. 57

3 H. Pawlicka i in. Czas. Stomatol., Aktywność antytrombiny III (ATIII ) oznaczono w osoczu ubogopłytkowym z użyciem amidolitycznego testu firmy Boehringer Mannheim Coagulation Diagnostica. Wyniki wyrażono w U/ml osocza. Oznaczenie rtęci było wykonano w cytrynianowym ubogopłytkowym osoczu metodą zimnej absorpcji atomowej [4] z zastosowaniem zestawu aparaturowego E-47 (Hendrey Relays and Electrical Equipment Ltd, Slough Buck, England). Rtęć całkowita była oznaczana po uprzedniej redukcji w obecności SnCl i CdCl []. Wyniki Analizę statystyczną wyników wykonano z użyciem testów t-studenta i Cochrana- Coxa. Uzyskane wyniki zestawiono w tabeli i. Omówienie wyników i dyskusja Badania wpływu związków rtęci na proces krzepnięcia krwi były dotychczas przedmiotem wielu prac doświadczalnych. Dotyczyły one wpływu chlorku lub metylochlorku rtęciowego na niektóre parametry krzepnięcia krwi u zwierząt [6, 0, ]. Przedmiotem badań była również ocena wpływu chlorku rtęci (II) na proces wytwarzania fibryny i jej podatność na działanie układu fibrynolitycznego []. W naszej pracy zbadaliśmy wpływ chlorku rtęciowego na zawartość fibrynogenu u szczurów i na kilka parametrów krzepnięcia krwi (PTT, HTCT, AT III) przydatnych w ocenie stanu krzepliwości krwi oraz wykrywaniu ewentualnych zmian zakrzepowo- zatorowych w układzie naczyniowym []. Zwierzęta otrzymały dożołądkowo jedną dawkę chlorku rtęci (II), tj. 7,9 mg Hg/kg wagi ciała. Stężenie rtęci w osoczu oraz badane parametry krzepnięcia oznaczono w, i dniu po podaniu chlorku rtęci (II). Zawartość rtęci w osoczu szczurów mieściła się w zakresie mol/l. We wszystkich dniach trwania doświadczenia obserwowano istotny statystycznie wzrost zawartości fibrynogenu u zwierząt narażonych na rtęć (tab. ). Czas częściowej tromboplastyny (PTT) oznaczano z użyciem zestawu zawierającego fosfolipidy pochodzące z mózgu króliczego (Platelin-S) i chlorek wapnia jako aktywator procesu wykrzepiania. Parametr ten jest miarą sprawności wewnątrzpochodnego układu aktywacji protrombiny. Zależy on od stężenia w osoczu czynników: II, V, VIII, IX, XI, XII i fibrynogenu; nie zależy zaś od liczby krwinek płytkowych. Czas wykrzepiania osocza zwierząt kontrolnych był w granicach 4, - 8, s, podczas gdy w grupie zwierząt narażonych na rtęć wynosił 6,9-9,6 s (tab. ). W pierwszym i trzecim dniu po podaniu chlorku rtęci (II) różnice te były statystycznie znamienne. Znaczny wzrost stężenia fibrynogenu w osoczu oraz skrócenie częściowego czasu tromboplastyny może świadczyć o istniejącej tendencji do nadkrzepliwości u zwierząt narażonych na związki rtęci. Częściowy czas tromboplastyny pozwala na kontrolę czynników krzepnięcia działających w układzie endogennym. Z kolei jego skrócenie może świadczyć o obniżonej aktywności czynników VIII i IX. Zasada oznaczania czasu heparynowo- trombinowego (HTCT) polega na pomiarze czasu krzepnięcia po dodaniu do osocza określonej ilości heparyny. Jest to oznaczenie czasu krzepnięcia w zwolnionym tempie, co znacznie zwiększa czułość oznaczanego czasu wykrzepiania. W niektórych trombopatiach standardowe oznaczanie czasu krzepnięcia daje wyniki w granicach normy, natomiast próba tolerancji heparyny często bywa przedłużona. W grupie zwierząt kontrolnych oznaczany czas HTCT był w zakresie 7,9 -,7 s, a w grupie której podano chlorek rtęciowy mieścił się 58

4 007, LX, Krzepnięcie krwi u szczurów po ekspozycji na rtęć w granicach 7,6,8 s. W trzecim dniu po podaniu związku rtęci wykazano różnicę znamienną statystycznie między grupą kontrolną i badaną. Parametrem hemostatycznym odpowiedzialnym za sprawność układu hamującego proces krzepnięcia jest antytrombina III. Jest to najważniejszy inhibitor trombiny i czynnika X. Aktywność antytrombiny III oznaczono za pomocą zestawu firmy Boehringer Mannheim z zastosowaniem substratu chromogennego. Nie wykazano istotnej różnicy w aktywności antytrombiny III między grupą kontrolną (8,8 0,9 U/ml) i grupą zwierząt otrzymującą chlorek rtęci (II); (7,9,9 U/ml). Zmiany w badanych parametrach krzepnięcia są zbieżne z zaburzeniami koagulacji krwi obserwowanymi w tym procesie pod wpływem związków rtęci we wcześniejszych badaniach. Chlorek i metylochlorek rtęci zwiększały u szczurów aktywność czynnika stabilizującego fibrynę [9] oraz proces konwersji fibrynogenu []. W badaniach in vitro związki te w stężeniach mol/l przyspieszały T a b e l a. Zawartość rtęci i fibrynogenu w osoczu szczurów po podaniu chlorku rtęci (II); 7,9 mg Hg/kg wagi ciała Dzień po podaniu chlorku rtęci (II) Grupa kontrolna Fibrynogen (g/l) Fibrynogen (g/l) Grupa badana Zawartość rtęci (mol/l),96±0,5 4,405±0,7* (7,5±,)0-6,956±0,5 4,96±0,6* (9,±0,6)0-7,8±0,,696±0,6* (8,7±,)0-7 *Różnica istotna w porównaniu z grupą kontrolną, p<0,05. T a b e l a. Czas częściowej tromboplastyny (PTT), czas heparynowo- trombinowy (HTCT) i aktywność antytrombiny III u szczurów i po podaniu chlorku ręci (II); 7,9 mg Hg/kg wagi ciała Badany parametr Dzień po podaniu chlorku rtęci (II) Grupa kontrolna Grupa badana 8,±,5 7,9±4,5* PTT (s) 6,±7,4 9,6±,6 4,±5, 6,9±,*,9±,,6±,6 HTCT (s),7±,,8±,0 7,9±, 7,6±,* 9,8±,8,9±,8 Antytrombina III (U/ml) 8,8±,5 0,±4, 0,9±0,9 7,9±4,5 *Różnica istotna w porównaniu z grupą kontrolną, p<0,05. 59

5 H. Pawlicka i in. Czas. Stomatol., proces generacji trombiny i zwiększały dynamikę uwalniania fibrynopeptydów A i B z fibrynogenu. Zaburzenia w koagulacji krwi obserwowano także u ludzi zawodowo narażonych na pary rtęci. Statystycznie znamiennie wzrastały: aktywność czynnika XIII, zawartość płytkowego czynnika 4 i generacja trombiny. Wzrastała również, aczkolwiek nieznamiennie statystycznie, liczba kompleksów trombina antytrombina i β-tromboglobulina, a spadała zawartość białka C. Dane te sugerują, że równowaga hemostatyczna u ludzi narażonych na rtęć została przesunięta w kierunku stanu nadkrzepliwości [4]. Warto jednak podkreślić, że wyników poziomu rtęci w osoczu krwi szczurów nie można bezpośrednio ekstrapolować do organizmu ludzkiego. Podsumowanie Wyniki naszych badań oraz innych autorów świadczą, że rtęć w niskich stężeniach ( mol/l) powoduje zaburzenia w układzie hemostazy prowadzące do nadkrzepliwości. Ilość rtęci uwalnianej z wypełnień amalgamatowych (kilka mikrogramów/ dzień) nie pozwala jednak na osiągnięcie takiego stężenia we krwi. Nie jest zatem możliwe, aby amalgamaty stanowiły realne zagrożenie dla układu hemostazy pacjentów. Należy jednak pamiętać, że rtęć jest pierwiastkiem silnie toksycznym, zwłaszcza wobec układu nerwowego. Zgodnie ze stanowiskiem Światowej Organizacji Zdrowia i Międzynarodowej Federacji Stomatologicznej należy stosować wszelkie środki ostrożności przy pracy z amalgamatami. Pomieszczenia, w których się je przygotowuje i gabinety dentystyczne powinny być dobrze wentylowane, a odpady amalgamatowe zabezpieczone. Piśmiennictwo. Balcerska I, Brzeźnicka E, Chmielnicka J: Oznaczanie rtęci nieorganicznej w próbkach materiału biologicznego z zastosowaniem zimnej absorpcji atomowej. Bromat Chem Toksykol 977, 0: O Brien J R, Etherington M D, Jameson S, Lawford P: Heparin thrombin clotting time and platelet factor 4. Lancet 974, : Chirba-Martin M A, Welshhans C M: An uncertain risk and an uncertain future : assessing the legal implications of mercury amalgam fillings. Health Matrix Clevel 004, 4, : Constantini V, Zacharski L R: The role of fibrin in tumor metastasis. Cancer Metast Rev 99, : Gelband H.: The science and politics of dental amalgam. Int J Technol Assess Health Care 998, 4, : Klöcking H P: The effects of a dose of mercuric chloride below the acute toxic dose on hemostasis in rats. Arch Toxicol suppl. 984, 7: Malinowski S: Amalgamat wypełnienie czy zagrożenie. Mag Stomatol 999, 9, : Moreau T: Dental amalgam and multiple sclerosis: what is the connection? Presse Med 999, 8, 5: Michalska M, Wierzbicki R: Plasma and platelet fibrin stabilizing factor activity in rats intoxicated with phenylmercuric acetate. Pol J Pharmacol Pharm 984, 6: Michalska M, Mirowski M, Wierzbicki R: Coagulation and fibrinolysis in rats poisoned with methylmercuric chloride (MeHg). Pol J Pharm 988, 40: Michalska M, Krajewska U, Wierzbicki R: Krzepnięcie i aktywność fibrynolityczna krwi szczurów w ostrym zatruciu związkami rtęci. Bromat Chem Toksykol 98, 6: Michalska M, Andryskowski G: Wrażliwość fibryny ludzkiej uformowanej w obecności 60

6 007, LX, Krzepnięcie krwi u szczurów po ekspozycji na rtęć chlorku i metylochlorku rtęciowego na degradację plazminową. Bromat Chem Toksykol 99, 6: Michalska M: Wpływ związków rtęci na trombinową konwersję fibrynogenu. Bromat Chem Toksykol 988, : Magos L, Cernik A A: A rapid method for estimating mercury in undigested biological samples. Br J Ind Med 969, 6: Rickles F R., Edwards R L: Activation of blood caogulation in cancer. Trousseau`s syndrome revisited. Blood 98, 6: Revista B R: Toxic effects of metals used in dentistry. Rev Esp Estomatol 987, 5, 5: Städtler P: Dental amalgam. III: Toxicity. Int J Clin Pharmacol Ther Toxicol 99, 9: Schiele R: W: Materiały stomatologiczne do wypełnień ubytków twardych tkanek zęba: zakres wskazań oraz techniki pracy. PZWL, Warszawa, 997, Shoji M, Hancock W. W, Abe K: Activation of coagulation and angiogenesis in cancer. Immunohistochemical localization in situ of clotting proteins and vascular endothelial growth factor in human cancer. Am J Pathol 998, 5, : Smetana R: Amalgam use in dentistry and blood mercury levels. Z Stomatol 986, 8: Tsopanoglou N E, Maragoudakis M E: Role of thrombin in angiogenesis and tumor progression. Sem Thromb Hemost 004, 0, : Tajanko E, Galar M, Piszcz J, Kłoczko J: Diagnostyka markerów aktywacji hemostazy w ostrej zakrzepicy żył głębokich. Pol Arch Med Wew 00, 07, : Wirz J: Mercury loading from amalgam fillings. Health Matrix Clever 004, 4, : Wierzbicki R, Prażanowski M, Michalska M, Krajewska U, Mielicki W P: Disorders in blood coagulation in humans occupationally exposed to mercury vapours. J Trace Elem Exp Med 00, 5: Wspólne stanowisko Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) i Międzynarodowej Federacji Stomatologicznej (FDI) w kwestii stosowania amalgamatu w stomatologii. Tł. Popielarczyk P. Czas Stomatol 996, XLIX, : Otrzymano: dnia.x.006 r. Adres autorów: 90- Łódź, ul. Pomorska 5 Tel./Fax: h.pawlicka@wp.pl 6