Płyn pęcherzykowy. GinPolMedProject WSTĘP SKŁAD I ROLA PŁYNU PĘCHERZY- KOWEGO

Transkrypt

1 GinPolMedProject 1 (43) 2017: ARTYKUŁ POGLĄDOWY Płyn pęcherzykowy Magdalena Lemm (ABE), Władysław Skałba (AEF), Mirosława Mackiewicz (DE), Andrzej Witek (DE) Medical University of Silesia, Department of Gynecology and Obstetrics, Katowice, Poland STRESZCZENIE WKŁAD AUTORÓW: (A) Projekt badania (B) Zbieranie Danych (C) Analiza Statystyczna (D ) Interpretacja Danych (E ) Przygotowanie Rękopisu (F ) Gromadzenie Piśmiennictwa (G ) Gromadzenie Funduszy Płyn pęcherzykowy jest bezpośrednim otoczeniem rozwijającej się komórki jajowej. W związku z tym określenie składu zapewnia dobre narzędzie do oceny jakości oocytów i jego zdolności do zapłodnienia, a także do oceny przebiegu wczesnych stadiów ciąży. Przegląd dostępnej literatury dotyczącej tematu dowodzi, że istnieje potrzeba dalszych badań dotyczących składu i roli płynu pęcherzykowego, który pozwoli poznać nieznane mechanizmy odpowiedzialne za niepowodzenia rozrodu i patologię wczesnego rozwoju zarodka. Słowa kluczowe: płyn pęcherzykowy; dojrzewanie pęcherzyka; oocyt Adres do korespondencji: Magdalena Lemm UCK SUM w Katowicach, Medyków 14, Katowice Tel , magdalena.lemm@gmail.com Liczb słów: 3131 Tabele: 0 Ryciny: 0 Piśmiennictwo: 46 Received: Accepted: Published: WSTĘP Folikulogeneza jest procesem, w którym pierwotny pęcherzyk jajnikowy dojrzewa i różnicuje się w pęcherzyk antralny, a następnie przedowulacyjny, który po osiągnięciu całkowitej dojrzałości zdolny jest w momencie owulacji do wydalenia gotowej do zapłodnienia komórki jajowej. U kobiety proces wzrastania i dojrzewania pęcherzyków jajnikowych od stadium pęcherzyków primordialnych do dojrzałych zdolnych do owulacji trzeciorzędowych pęcherzyków Graafa trwa około jednego roku. Los pęcherzyków jest kontrolowany zarówno przez hormony o budowie białkowej oraz steroidowej, jak i przez wewnątrzjajnikowe czynniki wzrostu. Rekrutacja pęcherzyków odbywa się w pierwszych dniach cyklu miesiączkowego, jednak cały okres przygotowania pęcherzyków do owulacji trwa około 85 dni i nie podlega regulacji hormonalnej [1]. SKŁAD I ROLA PŁYNU PĘCHERZY- KOWEGO Pierwszą oznaką początku powstawania stadium pęcherzyka trzeciorzędowego jest pojawienie się jamki wśród komórek ziarnistych. Jamka wypełnia się płynem pęcherzykowym, którego źródłem jest zarówno transfer osocza, jak i wydzielnicza aktywność komórek ziarnistych i otoczki pęcherzyka. Nieznany jest dokładny mechanizm kontrolujący wczesną fazę powstawania jamki. Wydaje się, że polega on na działaniu autokrynno/parakrynnym, w tym takich czynników jak: aktywina, ligand KIT czy proteina złączy szczelinowych Cx 37. Podstawowa hipoteza dotycząca powstawania płynu pęcherzykowego sugeruje, że komórki ziarniste produkują kwas hialuronowy i siarczan chondroityny, proteoglikany, które generują gradient osmotyczny, powodujący przenikanie płynu z naczyń krwionośnych otoczki pęcherzyka. W płynie pęcherzykowym obecny jest ponadto inhibitor inter-alfa-trypsyny i versican (Vcan), które tworzą kompleksy z kwasem hia- 87

2 GinPolMedProject 1 (43) 2017: luronowym i dodatkowo zwiększają retencję tych cząsteczek do wnętrza jamki. Płyn pęcherzykowy tworzy środowisko w którym komórki ziarniste i komórka jajowa znajdują cząsteczki regulacyjne niezbędne dla ich dalszego rozwoju [2]. Począwszy od stadium jamki (stadium pęcherzyka antralnego) dalszy jego rozwój zależy od hormonów przysadkowych: LH i FSH, które kontrolują końcowe etapy folikulogenezy, chociaż powstające lokalnie czynniki wzrostu mogą modulować ich działanie. Biochemiczna analiza składu płynu pęcherzykowego może dostarczyć istotnych informacji na temat jakości i dojrzałości oocytu. Zadanie powyższe spełniają analizy pojedynczych parametrów, uznanych za predyktory jakości oocytu, jak też metabolomika badania procesów chemicznych związanych z dojrzewaniem oocytu i proteomiczną analizą ujawniającą produkty genowe związane z tym procesem. Proteomiczna analiza płynu pęcherzykowego ujawnia obecność w nim białek z różnych grup czynnościowych np. insulinopodobny czynnik wzrostu, receptory, białka antyapoptyczne, czy mataloproteinazy. Zidentyfikowano 17 białek, których ekspresja w płynie pęcherzykowym zmieniała się po podaniu HCG, co pozwala uznać je za biomarkery, które pokazują, w jaki sposób mikrośrodowisko pęcherzyka zmienia się w zależności od warunków niepłodności [3]. Chemiczne składniki płynu pęcherzykowego mające istotne znaczenie dla rozwoju pęcherzyka i oocytu można pogrupować w następujące kategorie: a) hormony, b) czynniki wzrostu, c) reaktywne formy tlenu będące wolnymi rodnikami, e) czynniki anty-apoptotyczne, f) białka, peptydy i aminokwasy, g) cukry, h) prostanoidy. Gonadotropiny przysadkowe: FSH i LH są obecne w płynie pęcherzykowym, a na ich zawartość wpływa ich stężenie w surowicy krwi. Występuje korelacja stężeń gonadotropin przysadkowych w obu środowiskach; surowicy krwi i płynie pęcherzykowym [4,5]. Średnie stężenie FSH w płynie pęcherzykowym jest małe i zaczyna wzrastać w około 10 godzin po piku LH, osiągając 50% wartości występującej w surowicy krwi [6]. Podobnie, jak w przypadku FSH, stężenie LH jest małe na początku cyklu i zwiększa się między 10. a 20. godziną po piku LH, osiągając najwyższe wartości między 20. a 30. godziną, które odpowiadają 40% wartości występujących w surowicy krwi [6]. Interesującą jest obserwacja ujawniająca, że 20. godzin po piku LH pogarsza się stan błony podstawowej pęcherzyka i rozpoczyna morfologiczny i czynnościowy proces luteinizacji. W tym samym czasie stężenie estradiolu w płynie pęcherzykowym gwałtownie maleje [6]. Podanie gonadotropin w kontrolowanej hiperstymulacji jajników stosowane w metodzie in vitro jest interwencją zmieniającą środowisko wewnątrzpęcherzykowe. Ostatnio publikowane badania wykazały, że hiperstymulacja z użyciem gonadotropin zmienia wewnątrzpęcherzykową zawartość cytokin, co może zaburzać dojrzewanie oocytów i kompetencje zarodków. Powyższe negatywne zjawiska nie występują w modyfikowanych cyklach naturalnych [7]. Gonadotropiny podobnie, jak hormon wzrostu wpływają na produkcję przez komórki ziarniste szeregu substancji, ważnych dla dojrzewania oocytu, np. kwasu hialuronowego. Działając synergistycznie z estradiolem poprzez wydzielanie cyklicznego AMP zwiększają cytoplazmatyczne dojrzewanie oocytu i kontrolują mejozę [5]. Płyn pęcherzykowy pochodzący z pęcherzyków zawierających oocyty, które z sukcesem zostały zapłodnione zawiera większe stężenie HCG i FSH w porównaniu do otoczenia oocytów, których nie udało się zapłodnić, co dowodzi istotnej roli gonadotropin w tym procesie [8]. Hormon wzrostu (GH) wzmacnia zależną od FSH produkcję estradiolu przez komórki ziarniste podobnie, jak powstawanie w tych komórkach receptorów dla LH i FSH. Obecność GH w płynie pęcherzykowym została udowodniona, chociaż nie ustalono jej związku z potencjalną ciążą i jej rozwojem [5]. Prolaktyna jest obecna w płynie pęcherzykowym i w przeciwieństwie do gonadotropin przysadkowych i hormonów steroidowych jej stężenie w tym środowisku nie koreluje z stężeniem we krwi [4]. Stężenie prolaktyny w płynie pęcherzykowym jest znamiennie mniejsze w późnej fazie pomiesiączkowej w porównaniu do innych faz cyklu miesiączkowego i jest relatywnie stałe w okresie piku LH [6]. Należy jednak wykluczyć występowania wewnątrz pęcherzykowego źródła hormonu, ponieważ w płynie pęcherzykowym pacjentek leczonych bromokryptyną prolaktyna jest niewykrywalna [6]. Stężenie prolaktyny w płynie pęcherzykowym, podobnie jak stężenia: estradiolu, progesteronu i androstendionu wykazują związek z różnicami w dojrzałości komórki jajowej oraz jej zdolności do zapłodnienia i podziałów po zapłodnieniu pozaustrojowym [9]. Wysoki poziom prolaktyny w płynie pęcherzykowym jest związany z sukcesem rozwoju ciąży, co sugeru- 88

3 M. Lemm et al. Płyn pęcherzykowy je istotną rolę tego hormonu w dojrzewaniu oocytu [8]. Estradiol i progesteron są obecne w płynie pęcherzykowym w pęcherzykach o różnych wielkościach, na etapie po spontanicznym piku LH, a także po podaniu HCG w cyklach niestymulowanych i stymulowanych. W fazie pomiesiączkowej cyklu stężenie estradiolu w płynie w dużych pęcherzykach (powyżej 8 mm) jest duże, natomiast w fazie przedmiesiączkowej stężenie estradiolu zmniejsza się, a progesteronu jest duże [4]. W pęcherzykach przedowulacyjnych, przed i około szczytu LH stężenie estradiolu w płynie pęcherzykowym jest nieznacznie większe, niż w pozostałych pęcherzykach, a następnie maleje. Stężenie progesteronu na krótko przed pikiem LH gwałtownie wzrasta i kontynuuje ten wzrost przez następne 25 godzin po czym wolno maleje. Zmiany stężenia progesteronu świadczą o przebytej owulacji. Poziomy stężeń obu hormonów i ich wzajemne proporcje pozwalają ocenić zdolność komórek jajowych do zapłodnienia [6]. W piśmiennictwie występują różne oceny znaczenia progesteronu w płynie pęcherzykowym. Część autorów twierdzi, że duże stężenia progesteronu, lub mała proporcja między stężeniami estradiolu i progesteronu są predykcyjne dla implantacji i ciąży, inni uważają, że wiążą się z nieprawidłowym zapłodnieniem skutkującym wzrostem powstawania multipronuklearnych zarodków. Wydaje się, że optymalna ekspozycja komórki jajowej na progesteron, czyli ustalenie progu, którego przekroczenie powoduje uszkodzenie komórki jajowej jest obecnie jeszcze niemożliwe [5]. W płynie pęcherzykowym obecne są również androgeny. Stężenia androstendionu i testosteronu w tym środowisku są wyższe w fazie przedowulacyjnej, chociaż są znacznie mniejsze, niż stężenie estradiolu. Większe stężenia androgenów w płynie pęcherzykowym notuje się przed pikiem LH. Potwierdza to, że wymienione hormony są istotnym elementem na drodze biosyntezy estradiolu [10]. Większe stężenie androgenów w płynie pęcherzykowym wiąże się z obniżeniem jakości oocytów i liczby podziałów zygoty po zapłodnieniu. Niski wskaźnik estradiol/testosteron wiąże się z wczesną atrezją pęcherzyków i ograniczeniem możliwości zapłodnienia oraz rozwoju ciąży. Powszechnie akceptuje się pogląd, że mimo iż androgeny są odpowiedzialne za atrezję pęcherzyków, pewne ich ilości w płynie pęcherzykowym są niezbędne dla właściwego ich wzrostu. Przypuszcza się, że kortykosteroidy wpływają pozytywnie na końcowe etapy dojrzewania pęcherzyków i implantacje zarodków. Kortyzol hamuje sterydogenezę w jajniku, ale pozytywnie wpływa na dojrzewanie oocytów. W czasie piku LH zwiększa się stężenie kortyzolu w płynie pęcherzykowym. Stężenie to jest większe w dojrzałych pęcherzykach w porównaniu z niedojrzałymi. Dehydrogenaza 11ß-hydroksysteroidowa, enzym ktory katalizuje przemianę kortyzonu w kortyzol, występuje w ludzkich jajnikach. Pomiar aktywności enzymu stanowi pośrednią ocenę stężenia kortyzolu i kortyzonu w płynie pęcherzykowym. Aktywność enzymu w aspiratach płynu pęcherzykowego po trzydniowej inkubacji pozostaje w odwrotnej proporcji do sukcesu zapłodnienia oocytu w procedurze in vitro i dlatego proponuje się uznać jego aktywność za potencjalny predyktor udanego zapłodnienia [11]. Poziomy 21-hydroksy- pochodnych steroidów (11-deoksykortyzol i 11-deoksykortykosteron) prekursorów 17-hydroksyprogesteronu w płynie pęcherzykowym pozytywnie korelują z zawartością lipidów w luteinowych komórkach ziarnistych. Związki te działając poprzez receptor mineralokortykoidów promują luteinizację komórek ziarnistych. Fizjologiczne znaczenie powyższej korelacji dla procesów folikulogenezy i dojrzewania oocytów nie zostało jeszcze w pełni poznane [12]. Hormon anty-müllerowski (AMH) jest produkowany przez komórki ziarniste pęcherzyków przedjamkowych oraz małych pęcherzyków jamkowych i jest uznawany za czynnik hamujący rozwój pęcherzyków primordialnych oraz odpowiedzialny za rekrutację i selekcję pęcherzyków podczas dalszych etapów folikulogenezy. Hormon jest obecny również w płynie pęcherzykowym, a jego stężenie w tym środowisku pozwala na ocenę jakości zarodka. Uważa się, że powyższe oznaczenie jest wiarygodnym markerem żywotności oocytu [13]. Cykliczny adenozyno-3',5'-monofosforan (camp) jest elementem transdukcji sygnału wykorzystywanym, jako jeden z przekaźników II rzędu, między innymi w działaniu LH na receptory błonowe komórek docelowych. U wielu gatunków nukleotyd ten pełni istotną rolę w dojrzewaniu komórki jajowej. camp jest obecny w płynie pęcherzykowym człowieka, gdzie notuje się jego duże stężenie przed pikiem LH, które maleje po 20. godzinach. Przyczyna raptownego spadku stężenia nukleotydu w płynie pęcherzykowy w starszych pęcherzykach nie 89

4 GinPolMedProject 1 (43) 2017: jest znana, chociaż być może jest wynikiem wzrostu aktywności fosfodiesterazy [6]. Inhibiny są produkowane przez komórki ziarniste pęcherzyków i ich poziom w płynie pęcherzykowym odzwierciedla aktywność komórek ziarnistych pojedynczych pęcherzyków. Prawdopodobnie wysoki poziom inhibin A i B jest związany z liczbą uzyskiwanych oocytów podczas procedury in vitro, lecz nie z ich jakością i zdolnością do zapłodnienia [14]. Lau stwierdził pozytywną korelację między jakością oocytów i stężeniem aktywiny A w płynie pęcherzykowym, przy braku podobnej korelacji w przypadkach inhibin A i B [15]. Białko morfogenetyczne kości 15 (BMP-15) wpływa na dojrzewanie oocytów. Jego stężenie w płynie pęcherzykowym pozytywnie koreluje ze stężeniem estradiolu, a większe stężenia tego białka występują w przypadkach udanego zapłodnienia i podziałów oocytu, niż w przypadkach braku zapłodnienia [16]. Stwierdzono, że insulinopodobne czynniki wzrostu I i II (IGF-I i IGF-II), polipeptydy promujące proliferacje i różnicowanie tkanek są obecne w płynie pęcherzykowym. Liczne badania dowodzą, jak ważny jest ich udział w prawidłowym funkcjonowaniu jajników, dojrzewaniu pęcherzyków, a tym samym jak wielka jest ich rola w płodności [17]. Niektóre badania dowodzą, że IGF 1 ma podstawowe znaczenie dla rozwoju pęcherzyka, aż do fazy zależnej od gonadotropin. Badania przeprowadzone na zwierzętach dowodzą, że inaktywacja IGF 1 powoduje zablokowanie wzrostu pęcherzyka, bez możliwości naprawczego wpływu gonadotropin. Należy jednak podkreśli, że prawidłowe poziomy GH i IGF 1 nie są warunkiem koniecznym do zachowania płodności [18]. Przykładem jest zespół Larona, w którym pomimo niskich wartości IGF 1 owulacje mogą występować prawidłowo [19]. Pod wpływem androgenów dochodzi do znaczącego wzrostu liczby pęcherzyków podstawowych czemu towarzyszy trzykrotny wzrost stężenia IGF 1 i 5. krotny wzrost produkcji receptora IGF w pęcherzykach pierwotnych [20]. Wykazano również, że w warunkach in vitro stymulowanie IGF 1 skutkuje wzrostem średnicy pęcherzyków preantralnych oraz produkcję estradiolu [21]. IGF 1 wpływa zarówno na komórki ziarniste, jak i tekalne, powodując, co wykazano w badaniach in vitro, wzrost proliferacji komórek ziarnistych i produkcji estradiolu, zwiększoną wrażliwość komórek ziarnistych na FSH, wzrost sekrecji inhibiny A, aktywiny A i folistatyny przez komórki ziarniste oraz wspomaganie syntezy androgenów w komórkach tekalnych [22]. U człowieka IGF 1 stymuluje produkcję VEGF przez komórki ziarniste, ale główny wpływ na funkcje autokrynne w komórkach tekalnych i parakrynne w komórkach ziarnistych ma IGF 2. Dobrze znany jest fakt synergistycznego działania IGF 1 i FSH na wzmacnianie proliferacji i sterydogenezy zwierząt [23]. W obecności FSH, IGF 1 powoduje wzrost syntezy receptorów dla LH w komórkach tekalnych i ziarnistych [24]. Białka wiążące IGF odgrywają kluczową rolę w regulacji biodostępności IGF przez selektywne wiązanie IGF i niedopuszczanie ich do związania się ze swoimi receptorami. IGFBP są inhibitorami indukowanego przez gonadotropiny wzrostu i różnicowania się pęcherzyków, co skutkuje hamowaniem działania na poziomie komórek docelowych. Tak więc zmiany w stężeniach wewnątrzpęcherzykowych IGFBP prowadzą do zmian w biodostępności IGF i w regulacji działania gonadotropin na pęcherzyki. Niektóre badania pokazują, że sama biodostępność IGF bardziej niż ich stężenie zmienia się podczas wzrostu i atrezji pęcherzyków jajnikowych. Jest to związane ze zmianami w ekspresji mrna dla IGFBP oraz ze zmianami w ich proteolitycznej degradacji [25]. Duże wewnątrzpęcherzykowe stężenie insulinopodobnych czynników wzrostu, podobnie jak stężenie białek wiążących insulinopodobne czynniki wzrostu znamiennie korelują z wskaźnikami zapłodnień oocytów i skalą oceniającą morfologię zarodków. Wykazano ponadto, że kombinacja wysokiego stężenia w płynie pęcherzykowym IGFBP-3 i IGFBP-4 z niskim stężeniem ciążowego białka osoczowego A (PAPP-A) wykazuje podobne korelacje [26]. PAPP A ciążowe białko osoczowe, czyli glikoproteina syntezowana w trofoblaście wykorzystywana między innymi do oceny wydolności łożyska i ryzyka wystąpienia zespołu Downa również wydaje się odgrywać kluczową rolę w dojrzewaniu pęcherzyków [27]. Wykazano, że ta występująca w płynie pęcherzykowym glikoproteina (ze wzrastającym stężeniem aż do porodu), działa jako proteaza, likwidując jedno z białek wiążących IGF, a tym samym wpływając na rozwój pęcherzyków. PAPP A może brać, także udział w ustalaniu pęcherzyka dominującego, a być może też w samej owulacji [28]. Amfiregulina jest cytokiną będącą członkiem rodziny naskórkowych czynników wzrostu (EGF). Prawdopodobnie mediuje efekt działa- 90

5 M. Lemm et al. Płyn pęcherzykowy nia HCG na dojrzewanie oocytów. Wykryto jej obecność w płynie pęcherzykowym i stwierdzono, że jej poziom odwrotnie koreluje z wskaźnikiem zapłodnienia, chociaż nie wpływa na jakość zarodków [29]. Źródłem obecnych w płynie pęcherzykowym prozapalnych cytokin jest osocze oraz miejscowa synteza w jajniku. Do tej grupy cytokin należą interleukiny (IL). Uważa się, że IL-1 beta płynu pęcherzykowego wpływa na dojrzewanie oocytów i zapłodnienie, lecz po zapłodnieniu nie odgrywa żadnej roli w rozwoju zarodka. Poziomy IF-2 i IF-10 korelują ze specyficznymi stężeniami hormonów w płynie pęcherzykowym, lecz nie stwierdzono ich związku z wynikami uzyskanymi przy stosowaniu metod rozrodu wspomaganego [5]. Zaobserwowano wysokie stężenie IF-12 i czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów (GM-CSF) w płynie pęcherzykowym w przypadkach zarodków o wysokim potencjale implantacyjnym. Nie stwierdzono natomiast istotnego związku między stężeniami: IF-2, TNF-alfa i leukotrienem B4 w płynie pęcherzykowym, a dojrzewaniem oocytów, zapłodnieniem i rozwojem ciąży. Natomiast proporcje między IL-1 alfa/ TNF alfa oraz IL-1 alfa/ltb4 (leukotrina B4) różnią się istotnie między grupami pacjentek, które zaszły i które nie zaszły w ciąże [30]. Między pacjentkami dobrze i słabo odpowiadającymi na metodę mikroiniekcji plemnika do komórki nie stwierdzono istotnych różnic w stężeniu w płynie pęcherzykowym: IGF-1, IL-6, IL-8, EGF i GM-CSF. Natomiast stężenie PDGF (płytkopochodny czynnik wzrostu) w tym środowisku jest wysokie u pacjentek dobrze odpowiadających [31]. Unaczynienie pęcherzyka, wewnątrzpęcherzykowa zawartość tlenu i aktywność mitochondriów to czynniki gwarantujące prawidłowy rozwój oocytów [5]. Reaktywne formy tlenu (ROS) spełniają ważną rolę w sygnalizacji komórkowej i homeostazie. Jednakże w okresie stresu oksydacyjnego poziom ROS może znacznie wzrosnąć i okazać się szkodliwym dla oocytów. Dokładny wpływ reaktywnych form tlenu na dojrzewanie oocytów wymaga jednak doprecyzowania. Wykazano bowiem pozytywną korelację pomiędzy poziomem ROS w płynie pęcherzykowym a parametrami dojrzałości oocytów, z drugiej strony ponad fizjologiczne poziomy ROS powodują uszkodzenie zarodków i negatywnie rzutują na rozrodczość. Należy przyjąć, że optymalny balans między dostępem oocytu do tlenu i antyoksydantami jest podstawą dla powstania prawidłowego wrzeciona mejotycznego i odpowiedniej liczby chromosomów. Szkodliwym działaniom ROS mogą przeciwstawić się zmiatacze wolnych rodników lub endogenne antyoksydanty. W płynie pęcherzykowym występują dysmutaza ponadtlenkowa i zależna od selenu peroksydaza glutationu. Duże stężenie dysmutazy ponadtlenkowej wiąże się z zaburzeniem zapłodnienia oocytów, natomiast duże stężenie peroksydazy glutationu ze zdolnością oocytów do zapłodnienia, przy czym małe stężenie tego enzymu z defektem zapłodnienia [32]. Całkowita zdolność antyoksydacyjna płynu pęcherzykowego jest istotnie większa w pęcherzykach zawierających oocyt zdolny do zapłodnienia i wykazuje pozytywną korelację z jakością zarodków i liczbą ciąż uzyskanych w wyniku stosowania technik rozrodu wspomaganego [33]. Płyn pęcherzykowy pęcherzyków zawierających dojrzałe oocyty, które są zdolne do zapłodnienia i tworzenia prawidłowych zarodków zawiera mniejsze ilości azotanów i azotynów, niż w przypadku zarodków o małej potencji do zagnieżdżenia. Poza tym stężenie tlenku azotu (NO) jest istotnie większe u pacjentek z endometriozą i wodniakiem jajowodu, schorzeniach związanych z obniżeniem zdolności do zapłodnienia [9]. Wydaje się zatem, że intensywna produkcja NO w mikrośrodowisku oocytu, jest niekorzystna i powadzi do zaburzenia rozwoju zarodka [34]. Negatywnym markerem jakości oocytu jest poziom czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) w płynie pęcherzykowym, ponieważ jego synteza jest związana z niedotlenieniem kompleksu wzgórek jajonośny oocyt. Marker ten jednak nie znalazł dotychczas zastosowania w praktyce [5]. Zmiany apoptotyczne w środowisku pęcherzyków wiążą się z niską jakością oocytów. Uważa się, że antygen apoptozy czynnik Fas rozpuszczalny w surowicy (sfas) reguluje atrezję pęcherzyków i dojrzewanie oocytów. Czynnik występuje w płynie pęcherzykowym [35]. Niski poziom sfas i wysoki sfas-l (ligandu sfas) wskazuje na wysoki poziom apoptozy i niską jakość oocytów [36]. Kompleksowa analiza danych dotyczących stężenia sfas w płynie pęcherzykowym wykazała, że nie jest on jednak wiarygodnym markerem jakości oocytów i uzyskanych z nich zarodków [5]. Płyn pęcherzykowy zawiera wiele białek, pochodzących z filtratu surowicy krwi oraz produkcji przez komórki ziarniste i tekalne pęcherzyka. Identyfikacja białek, które mogłyby być uznane za markery dobrego rozwoju pęcherzyka jest technicznie skomplikowana, dlatego zrozumienie roli poszczególnych białek 91

6 GinPolMedProject 1 (43) 2017: w procesie wzrostu pęcherzyków i dojrzewania oocytu jest nadal ograniczone [37]. Zmiany stężeń alfa-fetoproteiny, antygenów CEA i CA- 125 w płynie pęcherzykowym wydają się nie mieć znaczenia dla oceny jakości oocytów [37]. W płynie pęcherzykowym obecny jest antygen CD44, glikoproteina zaangażowana w interakcjach międzykomórkowych. Stężenie tego białka jest mniejsze w pęcherzykach zawierających oocyt zdolny do zapłodnienia i wytworzenia prawidłowego zarodka. Nie wiadomo jednak, czy zwiększone stężenie CD44 wywiera, czy też nie wywiera niekorzystnego wpływu na oocyt [38]. Stwierdzono, że stężenie leptyny w płynie pęcherzykowym pozytywnie koreluje z wskaźnikiem zapłodnień i słabo z morfologiczną skalą rozwoju zarodków. Ocenia się, że poziom leptyny w tym środowisku nie odzwierciedla precyzyjnie jakości oocytu i nie może być użyty do ich selekcji [39]. Endotelina jest peptydem złożonym z 21 aminokwasów wydzielanym przez komórki śródbłonka naczyń krwionośnych. Peptyd odgrywa kluczową rolę w homeostazie naczyniowej. Endoteliny składają się z trzech izoform: endoteliny-1, endotelinę-2 i endotelinę-3. Stężenie endoteliny-2 jest istotnie większe w pęcherzykach zawierających oocyt zdolny do zapłodnienia i podziałów [40]. Pęcherzykowe stężenie peptydu koreluje z IGF-1, co wskazuje na możliwość synergistycznego działania promującego aktywność FSH wewnątrz pęcherzyka [40]. Obserwuje się zmniejszenie stężenia inhibitora dojrzewania pęcherzyków (OMI) w płynie pęcherzykowym przed uzyskaniem dojrzałości oocytu i jego zapłodnieniem. Pęcherzyki z wysoką aktywnością OMI zawierają niedojrzały oocyt, co pozwala twierdzić, że OMI jest negatywnym markerem jakości oocytu [41]. Uważa się, że stężenie niektórych aminokwasów obecnych w płynie pęcherzykowym może mieć wartość predykcyjną. Wymienia się kwas D-asparaginowy, którego zawartość koreluje z odsetkiem oocytów o dobrej morfologii [42]. Kwas hialuronowy, główny składnik macierzy zewnątrzkomórkowej jest obecny w płynie pęcherzykowym, a jego stężenie pozytywnie koreluje z apoptozą komórek ziarnistych i jest większe w przypadkach pęcherzyków zawierających oocyty niezdolne do zapłodnienia [43]. Stężenie kwasu hialuronowego w płynie pęcherzykowym jest małe w przypadkach nieskutecznej implantacji i w zaburzeniach hormonalnych, co pozwala zakłada, że produkcja tego związku wpływa na potencjał implantacyjny embrionów [44]. Mio - inozytol, cykliczny sześciowęglowy alkohol polihydroksylowy występuje w płynie pęcherzykowym. Jego stężenie pozytywnie koreluje z stężeniem estradiolu oraz jakością oocytów i powstających z nich zarodków [45]. Suplementacja tym związkiem poprawia jakość oocytów uzyskanych po stymulacji jajników w metodzie zapłodnienia pozaustrojowego [46]. PODSUMOWANIE Płyn pęcherzykowy stanowi bezpośrednie środowisko rozwijającego się oocytu, dlatego ustalenie jego składu stwarza dobre narzędzie dla oceny jakości oocytu, jego zdolności do zapłodnienia i dla dalszego przebiegu wczesnych etapów ciąży. Poznanie czynników związanych z najwyższą jakością oocytów pozwoli na racjonalizację metod stosowanych w rozrodzie wspomaganym oraz zrozumienie przyczyn wczesnych strat ciąż, występujących po naturalnym zapłodnieniu. Przegląd dostępnego piśmiennictwa dowodzi, iż istnieje konieczność dalszych badań nad składem i rolą płynu pęcherzykowego, które pozwolą poznać nieznane dotychczas mechanizmy odpowiedzialne za niepowodzenia rozrodczości i patologię wczesnego rozwoju zarodka i płodu. 1. Fortune JE. Ovarian follicular growth and development in mammals. Biol Reprod 1994;50: Rodgers RJ, Irving-Rodgers HF. Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid. Biol Reprod 2010;82: Zamah AM, Hassis ME, Albertolle ME, Williams KE. Proteomic analysis of human follicular fluid from fertile women. Clin Proteomics 2015;12:5. 4. McNatty KP, Reader K, Smith P et al. Control of ovarian follicular development to the gonadotrophin-dependent phase: a 2006 perspective. Soc Reprod Fertil Suppl 2007;64: Revelli A, Piane L, Casano S et al. Follicular fluid content and oocyte quality: from single biochemical markers to metabolomics. Reprod Biol Endocrinol 2009;7: Lenton EA, King H, Thomas EJ et al. The endocrine environment of the human oocyte. J Reprod Fertil 1988; 82: Baskind NE, Orsi NM, Sharma V. Follicular-phase ovarian follicular fluid and plasma cytokine profiling of natural cycle in vitro fertilization patients. Fertil Steril 2014; 102: Laufer N, Botero-Ruiz W, DeCherney AH et al. Gonadotropin and prolactin levels in follicular fluid of human ova successfully fertilized in vitro. J Clin Endocrinol Metab 1984;58: Lee TH, Wu MY, Chen MJ et al. Nitric oxide is associated with poor embryo quality and pregnancy outcome in in vitro fertilization cycles. Fertil Steril 2004;82: Hiller SG, Reichert LE, Van Hall EV. Control of preovulatory follicular estrogen biosyntesis in human ovary. J Clin Endocr Metab 1981;52: PIŚMIENNICTWO 92

7 M. Lemm et al. Płyn pęcherzykowy 11. Lewicka S, Van Hagens C, Hettinger U at al. Cortisol and cortisone in human follicular fluid and serum and the outcome of IVF treatmen. Human Reproduction 2003; 18: Amin M, Simerman A, Cho M et al. 21-Hydroxylasederived steroids in follicles of nonobese women undergoing ovarian stimulation for in vitro fertilization (IVF) positively correlate with lipid content of luteinized granulosa cells (LGCs) as a source of cholesterol for steroid synthesis. J Clin Endocrinol Metab 2014; 99: Kim JH, Lee JR, Chang HJ et al. Anti-Müllerian Hormone Levels in the Follicular Fluid of the Preovulatory Follicle: A Predictor for Oocyte Fertilization and Quality of Embryo. J Korean Med Sci 2014;29: Wen X, Tozer AJ, Butler SA et al. Follicular fluid levels of inhibin A, inhibin B, and activin A levels reflect changes in follicle size but are not independent markers of the oocyte s ability to fertilize. Fertil Steril 2006;85: Lau CP, Ledger WL, Groome NP et al. Dimeric inhibins and activin A in human follicular fluid and oocyte-cumulus culture medium. Hum Reprod 1999;14: Wu YT, Tang L, Cai J et al. High bone morphogenetic protein-15 level in follicular fluid is associated with high quality oocyte and subsequent embryonic development. Hum Reprod 2007;22: Adashi EY, Thorner MO, Jaffe RB. The somatotrophic axis and the reproductive process in health and disease. Fertil Steril 1994; 61: de Boer JA, Schoemaker J, van der Veen EA. Impaired reproductive function in women treated for growth hormone deficiency during childhood. Clin Endocrinol (Oxf) 1997;46: Klinger B, Anin S, Silbergeld A et al. Development of hyperandrogenism during treatment with insulin-like growth factor-i (IGF-I) in female patients with Laron syndrome. Clin Endocrinol (Oxf) 1998 Jan;48(1): Vendola K, Zhou J, Wang J et al. Androgens promote oocyte insulin-like growth factor I expression and initiation of follicle development in the primate ovary. Biol Reprod 1999; 61: Zhou R, Yu SM, Ge W. Expression and functional characterization of intrafollicular GH-IGF system in the zebrafish ovary. Gen Comp Endocrinol 2015 pii: S : Spicer LJ, Chamberlain CS, Maciel SM. Influence of gonadotropins on insulin- and insulin-like growth factor- I (IGF-I)-induced steroid production by bovine granulosa cells. Domest Anim Endocrinol 2002;22: Giudice LC. Insulin-like growth factor family in Graafian follicle development and function. J Soc Gynecol Investig 2001;8 (1 Suppl Proceedings): Magoffin DA, Weitsman SR. Insulin-like growth factor- I regulation of luteinizing hormone (LH) receptor messenger ribonucleic acid expression and LH-stimulated signal transduction in rat ovarian theca-interstitial cells. Biol Reprod 1994; 51: Monget P, Mazerbourg S, Delpuech T et al. Pregnancy-associated plasma protein-a is involved in insulinlike growth factor binding protein-2 (IGFBP-2) proteolytic degradation in bovine and porcine preovulatory follicles: identification of cleavage site and characterization of IGFBP-2 degradation. Biol Reprod 2003;68(1): Wang TH, Chang CL, Wu HM et al. Insulin-like growth factor-ii (IGF-II), IGF-binding protein-3 (IGFBP-3), and IGFBP-4 in follicular fluid are associated with oocyte maturation and embryo development. Fertil Steril 2006;86: Mazerbourg S, Overgaard MT, Oxvig C et al. Pregnancy-associated plasma protein-a (PAPP-A) in ovine, bovine, porcine, and equine ovarian follicles: involvement in IGF binding protein-4 proteolytic degradation and mrna expression during follicular development. Endocrinology 2001;142(12): Rivera GM, Fortune JE. Selection of the dominant follicle and insulin-like growth factor (IGF)-binding proteins: evidence that pregnancy-associated plasma protein A contributes to proteolysis of IGF-binding protein 5 in bovine follicular fluid. Endocrinology 2003; 144(2): Asimakopoulos B, Abu-Hassan D, Metzen E et al. The levels of steroid hormones and cytokines in individual follicles are not associated with the fertilization outcome after intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril 2008;90: Bili H, Tarlatzis BC, Daniilidis M et al. Cytokines in the human ovary: presence in follicular fluid and correlation with leukotriene B4. J Assist Reprod Genet 1998;15: Hammadeh ME, Fischer-Hammadeh C, Hoffmeister H et al. Fibroblast growth factor (FGF), intracellular adhesion molecule (sicam-1) level in serum and follicular fluid of infertile women with polycystic ovarian syndrome, endometriosis and tubal damage, and their effect on ICSI outcome. Am J Reprod Immunol 2003;50: Paszkowski T, Traub AI, Robinson SY, McMaster D. Selenium dependent glutathione peroxidase activity in human follicular fluid. Clin Chim Acta 1995,236: Pasqualotto EB, Agarwal A, Sharma RK et al. Effect of oxidative stress in follicular fluid on the outcome of assisted reproductive procedures. Fertil Steril 2004, 81: Manau D, Balasch J, Jiménez W et al. Follicular fluid concentrations of adrenomedullin, vascular endothelial growth factor and nitric oxide in IVF cycles: relationship to ovarian response. Hum Reprod 2000,15: Onalan G, Selam B, Onalan R et al. Serum and follicular fluid levels of soluble Fas and soluble Fas ligand in IVF cycles. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2006; 125: José de los Santos M, Anderson DJ, Racowsky C, Hill JA. Presence of Fas-Fas ligand system and Bcl-2 gene products in cells and fluids from gonadotropin-stimulated human ovaries. Biol Reprod 2000, 63: Schweigert FJ, Gericke B, Wolfram W et al.. Peptide and protein profiles in serum and follicular fluid of women undergoing IVF. Hum Reprod 2006,21: Ohta N, Saito H, Kaneko T et al. Soluble CD44 in human ovarian follicular fluid. J Assist Reprod Genet 2001,18: De Placido G, Alviggi C, Clarizia R et al. Intra-follicular leptin concentration as a predictive factor for in vitro oocyte fertilization in assisted reproductive techniques. J Endocrinol Invest 2006;29: Sudik R, Chari S, Pascher E, Sturm G. Human follicular fluid levels of endothelins in relation to oocyte maturity status. Exp Clin Endocrinol Diabetes 1996;104: Channing CP, Liu CQ, Jones GS, Jones H. Decline of follicular oocyte maturation inhibitor coincident with maturation and achievement of fertilizability of oocytes recovered at midcycle of gonadotropin-treated women. Proc Nat Acad Sci USA 1983; 80: Sinclair KD, Lunn LA, Kwong WY et al. Amino acid and fatty acid composition of follicular fluid as predictors of in-vitro embryo development. Reprod Biomed Online 2008;16: Saito H, Kaneko T, Takahashi T et al. Hyaluronan in follicular fluids and fertilization of oocytes. Fertil Steril 2000; 74: Babayan A, Neuer A, Dieterle S et al. Hyaluronan in follicular fluid and embryo implantation following in vitro fertilization and embryo transfer. J Assist Reprod Genet 2008;25: Tony TY Chiu, Rogers MS, Eric LK et al. Follicular fluid and serum concentrations of myo-inositol in patients undergoing IVF: relationship with oocyte quality Hum Reprod 2002;17: Ciotta L, Stracquadanio M, Pagano I et al. Effects of myo-inositol supplementation on oocyte s quality in PCOS patients: a double blind trial. Eur Rev Med Pharmacol Sci 2011;15: