Modyfikacje chemiczne do badań metabolizmu i zastosowań terapeutycznych mrna

Transkrypt

1 Modyfikacje chemiczne do badań metabolizmu i zastosowań terapeutycznych mrna Jacek J e m i e l i ty LABORATORIUM CHEMII BIOORGANICZNEJ Centrum Nowych Technologii Uniwersytet Warszawski Zakład Biofizyki, Wydział Fizyki IGIB, Uniwersytet Warszawski Warszawa, 18 stycznia 2019

2 MNOGOŚĆ FUNKCJI MNOGOŚĆ ZASTOSOWAŃ

3 Nowe metody syntezy Temat 1 Analogi nukleotydów modyfikowane w mostku fosforanowym Reagenty do modyfikacji RNA terapia genowa Biokoniugacja nukleotydów z makrocząsteczkami i nanomateriałami Warminski et al. Org. Lett. (2017) Wanat et al. Org. Lett. (2015) Strenkowska et al. Org. Lett. (2012) Warminski et al. EurJOC (2016) Rydzik et al. Nucl. Acids Res. (2017) Wojtczak et al. RSC Adv. (2016) Zytek et al. OBC (2014) Warminski et al. Top. Curr. Chem. (2017) Walczak et al. Chemical Science (2017) Strenkowska et al. Nucl. Acids Res. (2016) Kowalska et al. Nucl. Acids Res. (2014) Nowakowska et al. OBC (2014) Patenty US i inne kraje Zochowska et al. Nanomedicine: NBM, (2015) Kijewska et al. Biomacromol. (2013) Szczepaniak et al. RNA (2012) Nukleotydowe sondy molekularne i znakowanie Badania białek metabolizmu nukleotydów i RNA Metody screeningowe inhibitorów i analiza metabolitów Projektowanie i optymalizacja inhibitorów Mamot et al. Angewandte Chem. (2017) Warminski et al. Bioconjugate Chem. (2017) Jemielity et al. OBC (2012) Ziemniak et al. RSC Adv. (2013) Wanat et al. Chem. Comm. Mugridge et al. Nature Struct. Mol. Biol. (2016) Mugridge et al. Nature Comm. (2018) Essig et al. Nature Comm. (2018) Baranowski, Nowicka et al. OBC (2016) Strzelecka et al. Sci. Reports (2017) Baranowski et al. JOC (2015) Kasprzyk et al. OBC (2016) Ziemniak et al. BMC (2015) Ziemniak et al RNA (2016) Kozarski et al. BMC (2018) Wojtczak et al. JACS (2018)

4 7-metylguanozyna mostek 5,5 -trifosforanowy transkrypt mrna Cechy charakterystyczne, niezwykłe dla kwasów nukleinowych, kluczowe dla specyficznego rozpoznania przez białka: Ujemnie naładowany mostek 5,5 -trifosforanowy : oddziaływania elektrostatyczne i wiąz. wodorowe Dodatnio naładowana zasada nukleinowa (7- metylguanina): kation-π staking

5 Jemielity J. et al. New J. Chem. 34, (2010)

6 DNA replikacja nośnika informacji genetycznej transkrypcja, eksport mrna przepis na białko GEN (cdna) translacja Białko Funkcje organizmu: składniki budulcowe, kataliza, transport, sygnalizacja i wiele innych GEN (mrna) GEN (cdna) nie ma niebezpieczeństwa mutacji, gdyż nie następuje integracja z genomem translacja mrna zachodzi w cytoplazmie błona komórkowa jest jedyną barierą do pokonania mniej immunogenne (w przeciwieństwie do DNA nie powoduje niespecyficznej aktywacji układu odpornościowego) efekt jest przejściowy znacznie mniejsza trwałość w warunkach komórkowych niż DNA otrzymywanie mrna transkrypcja in vitro

7

8

9 1. Komórki rakowe prezentują na swojej powierzchni specyficzne białka Komórka zdrowa Komórka rakowa 2. Takie specyficzne białko może być znakiem rozpoznawczym (antygenem) dla układu odpornościowego 3. Znając przepis na to białko (antygen), syntetyzuje się mrna kodujące go 4. mrna wstrzykuje się do węzłów chłonnych. Komórki dendrytyczne produkują atygen na bazie mrna i uczą limfocyty T go rozpoznawać. mrna 5. Wyszkolone limfocyty T rozpoznają i niszczą komórki rakowe

10 Wybór antygenu i synteza mrna ANTYGEN Transfekcja ex vivo Pobranie idc Wstrzyknięcie mrna Ekspresja mrna i dojrzewanie Przeszczep autologiczny Odpowiedź swoista

11 koniec 5 Pozostała część cząsteczki mrna Kap Inicjacja biosyntezy białka zaczyna się od rozpoznania kapu przez eif4e Degradacja mrna rozpoczyna się od odłączenia kapu przez specyficzny enzym Dcp2/Dcp1 około 2000 nukleotydów koniec 3

12 Zwiększona odporność na Dcp1/2 = Zwiększony czas życia mrna in vivo Miejsce cięcia przez Dcp2 Dcp1/2 RNA Xrn1 RNA Dcp1/2 RNA Zwiększone powinowactwo do eif4e = Zwiększona szybkość inicjacji translacji, bardziej konkurencyjne terapeutyczne mrna niż endogenne RNA in vivo eif4e eif4e terapeutyczne terapeutyczne endogenne eif4e endogenne endogenne Rozwiązanie: analogi kapu modyfikowane w mostku trifosforanowym

13 O O P CH 2 O P O O O Tetrahedron Lett Bioorg. Med. Chem Org. Biomol. Chem RNA 2012 Bioorg. Med. Chem Zastosowania: J. Biol. Chem RNA 2007 Mol Cell 2008 Mol Cell 2009 RNA 2009 Gene Ther 2010 FEBS J 2010 RNA 2011 RNA 2012 RNA 2013 FEBS J 2013 Nanomedicine: NBM 2014 RNA 2016 NSMB 2016 Nucl. Acids Res J. Org. Chem Zgłoszenie patentowe 2014 Nucl. Acids Res RNA 2003 Biochemistry 2004 Tet. Lett Bioorg. Med. Chem RNA 2008 US Patent 2012 Przegląd modyfikacji mostka oligofosforanowego. New J. Chem Topics in Current Chemistry 2017 O O P O Se Bioorg. Med. Chem O ChemBioChem 2009 US Patent 2013 O P O BH 3 Nucl. Acids Res US Patent 2013

14 Warminski. et al. Topics in Current Chemistry DOI: /s y (2017)

15 Joanna KOWALSKA * β-s-arca RNA (D1 and D2) Poprawa właściwości biologicznych: Zwiększone powinowactwo do czynnika inicjującego translację, eif4e (2-4x) Odporność na enzym Dcp2 odpowiedzialny za odcinanie kapu z końca 5 mrna Zwiększony czas półtrwania mrna in vivo (3x) Zwiększona efektywność translacji w komórkach (5x) = Wysoka wydajność biosyntezy białka in vivo Kowalska J., et al. RNA 14, (2008) Grudzień-Nogalska et al. RNA 13, (2007) Jemielity et al. US Patent 2012, Kowalska et al. US Patent 2013 i patenty w innych krajach

16 Centrum stereogeniczne * (R)-β-S-ARCA D1 D1 D2 m 7 GpppG K AS [µm -1 ] 43.1 ± ± ± 0.4 (S)-β-S-ARCA D2 Lys162 Lys162 Arg 157 Arg 157 Z czego wynika stabilizacja kompleksu eif4e β-s-arca? Współpraca: M Nowotny, IIMCB, Warszawa Warmiński, et al. w przygotowaniu

17 b-s-arca (D1) LUC mrna kodujące lucyferazę wstrzyknięcie do węzła chłonnego 9 myszy Kuhn A., et al. Gene Therapy 17, (2010).

18 SIINFEKL ARCA b-s-arca (D1) krew SIINFEKL-specyficzne komórki T CD8+ śledziona Immunizacja: dzień 0 i 3 wyznaczanie liczby limfocytów T: dzień 8 krew śledziona ARCA b-s-arca (D1) ARCA b-s-arca (D1) 5 myszy Kuhn A., et al. Gene Therapy 17, (2010). Efekt w niedojrzałych komórkach dendrytycznych: 3-krotny wzrost specyficznej aktywacji limfocytów T u myszy po dowęzłowym wstrzyknięciu mrna kodującego antygen (β-s-arca D1 vs ARCA)

19 Jeśli mrna jest zrobione z a kap reprezentuje i zawiera jeden atom siarki to: * Zmiana 1 z 80 tysięcy atomów w mrna zbliża nas do terapii genowej opartej na mrna

20 : Cztery badania kliniczne nad szczepionką przeciw czerniakowi złośliwemu i rakowi piersi, szczepionki przeciw innym nowotworom w trakcie przygotowań (BioNTech, Mainz, Germany) XI 2015: Porozumienie o współpracy BioNTech SANOFI (sublicencja β-s-arca). 60 M$ 300M$ IX 2016: Porozumienie o współpracy BioNTech Genentech/Roche (sublicencja β-s-arca). 310M$ XII 2017: Genentech/Roche we współpracy z BioNTech rozpoczynają badania kliniczne nad spersonalizowanymi szczepionkami przeciwnowotworowymi

21 PCV Personalized Cancer Vaccine, antygen ustalany na podstawie badań genetycznych komórek zdrowych i nowotworowych danego pacjenta. 572 pacjentów w 38 ośrodkach w Stanach Zjednoczonych, Kanadzie oraz Europie: USA 18, Kanada 2, Belgia 3, Niemcy 5, Holandia 3, Hiszpania 2, Wielka Brytania 3, Szwecja - 2 Melanoma (czerniak złośliwy) Renal Cancer (rak nerki) Non-Small Cell Lung Cancer (niedrobnokomórkowy rak płuc) Bladder Cancer (rak pęcherza moczowego) Colorectal Cancer (rak jelita grubego) Triple Negative Breast Cancer (potrójnie ujemny rak piersi) Head and Neck Cancer (nowotwory głowy i szyi) Other Solid Cancers (inne nowotwory lite)

22 Dostarczanie antygenów Suplementacja białek i peptydów Dostarczanie nukleaz Choroby nowotworowe: immunoterapie oparte na komórkach dendrytycznych Szczepionki przeciw chorobom zakaźnym Choroby genetyczne, zaburzenia metaboliczne Medycyna regeneracyjna -dostarczanie czynników wzrostu (m.in. w chorobach sercowo naczyniowych) -generowanie i modyfikacje komórek macierzystych Edycja genów metodą CRISPR/Cas9

23 Messenger RNA Therapeutics can be developed and tested in just a few weeks, enabling an expedited process from concept to first-in-man studies on the order of less than one year. All messenger RNA Therapeutics are made using the same reagents in the same cell-free production process, enabling rapid, cost-effective GMP manufacturing. This is possible given the chemical similarities between all messenger RNAs, which vary only in their RNA sequence.

24 Czy coś można ulepszyć? Z w i ę k s z y ć ko n k u r e n c y j n o ś ć v s n a t u r a l n e m R N A b e z u t r a t y o d p o r n o ś c i n a e n z y m D c p 2 ( n o w e m o d y f i k a c j e o r a z p o z n a w a n i e s t r u k t u r ko m p l e k s ó w b i a ł ko - k a p ). J e s z c z e b a r d z i e j z w i ę k s z y ć t r w a ł o ś ć k a p u ( n o w e m o d y f i k a c j e o r a z p o z n a w a n i e s t r u k t u r ko m p l e k s ó w b i a ł ko - k a p ). Z w i ę k s z y ć t r w a ł o ś ć ko ń c a 3 m R N A W p ł y w a ć n a i m m u n o g e n n o ś ć m R N A P o p r a w i e n i e i u p r o s z c z e n i e p r o d u k c j i m R N A ( c h e m i c z n y c a p p i n g m R N A ) Z a h a m o w a ć o d c i n a n i e ka p u ( m a ł o c z ą s t e c z ko w e i n h i b i t o r y ) L e p i e j z r o z u m i e ć c o s i ę d z i e j e z m R N A w ko m ó r c e i p o z a n i ą ( m R N A z n a ko w a n e, f o t o z s z y w a l n e ) E f e k t y w n i e j d o s t a r c z a ć m R N A d o ko m ó r k i

25 Ditiofosforanowe analogi kapu biją rekordy, ale Malwina STRENKOWSKA Analogi kapu z modyfikacją bis(tiofosforanową) Katarzyna WNĘK Powinowactwo do eif4e wydajność ekspresji mrna w niedojrzałych ludzkich komórkach dendrytycznych (hidcs). Joanna KOWALSKA Współpraca: U. Sahin (Mainz, Niemcy) Strenkowska et al. Nucleic Acids Res. 44, (2016)

26 Równie skuteczne lecz prostsze w produkcji (brak centrum stereogenicznego) B. Wojtczak, P. Sikorski et al. JACS 140, (2018)

27 PS versus PSL w DNA Odporne na nukleazy Dwa stereoizomery Brak izomerów Równie skuteczne lecz prostsze w produkcji (brak centrum stereogenicznego) B. Wojtczak, P. Sikorski et al. JACS 140, (2018)

28 B. Wojtczak, P. Sikorski et al. JACS 140, (2018) 7 Ekspresja białek w komórkach z mrna zawierającym analog 7 jest porównywalna z mrna zawierającym β-s-arca ale bez stereoizomerów

29 J. Mugridge et al. Nature Struct. Mol. Biol. 23, (2016) Współpraca z John G. Gross (UCSF, San Francisco, USA)

30 J. Mugridge et al. Nature Struct. Mol. Biol. 23, (2016)

31 more tools for exploring mrna biology NAD-capped RNA mrna with cap1, cap2, m 6 A and other modifications Warmiński, Sikorski et al., unpublished A. Mlynarska-Cieslak, A.Depaix et al. Org. Lett., 2018, 20, pp

32 Znakowanie

33 Dwie startegie znakowania mrna Znakowanie ko-transkrypcyjne i post-transkrypcyjne cap labelled mrna

34 Dwie startegie znakowania mrna Strategies for 5 mrna cap labelling cap Co-transcriptional labelling labelled cap labelled mrna

35 Dwie startegie znakowania mrna Strategies for 5 mrna cap labelling cap mrna Post-transcriptional labelling labelled mrna

36 Dwie startegie znakowania mrna Strategies for 5 mrna cap labelling cap Co-transcriptional labelling labelled cap mrna Post-transcriptional labelling labelled mrna

37 Krok 1: Wybór strategii chemicznej NHS chemistry click chemistry cap analogue with linker terminated with amino group + NHS activated label cap analogue with linker terminated with azide group + DIBAC label Carboxylic acids of labels can be easily converted into NHS esters using in situ activation. Allows for bioorthogonal labelling. Jemielity et al. Organic & Biomolecular Chemistry 10, (2012)

38

39 + 2 isomer Mamot et al. Angewandte Chemie Int. Ed. 56, (2017)

40 Lokalizują się w cytoplazmie Ulegają translacji Transfected HeLa cells Mamot et al. Angewandte Chemie Int. Ed. 56, (2017)

41 Cy5 N 3 mrna transfection in cell labelling visualization Cy5 Hoechst Merge N 3 9d-RNA luc mock ARCA-RNA luc Mamot et al. Angewandte Chemie Int. Ed. 56, (2017)

42 Perspektywy na przyszłość Znakowanie mrna w żywych komórkach w czasie rzeczywistym przy użyciu sond fluorogenicznych Badanie lokalizacji i transportu mrna w zależności od sekwencji i wprowadzonych modyfikacji strukturalnych (fluorescencja pojedynczych molekuł Monitorowanie decappingu w P-bodies Badanie cyrkularyzacji mrna (w połączeniu ze znakowaniem końca 3 )

43 Koniugaty

44 Żywice powinowactwa Synthesis of affinity resins for purification of cap-related proteins, including decapping enzyme DcpS Szczepaniak S. A., Zuberek J., Darzynkiewicz E., Kufel J., Jemielity J., RNA 18, (2012).

45 Gold nanoparticles decorated with nucleotides: towards theranostic applications AuNP synthesis Cap analog for AuNP decoration Goal: Biosensor for capbinding proteins (molecular markers) Perzanowska, et al. unpublished UV-VIS

46 Dostarczanie do komórek koniugaty dodekahedron - kap anti-dd Immunodetection anti-cap Dd Dd-cap % Control Tumor size (HCC rat model) 1x 1x 1x 1/5x Zochowska et al. Nanomedicine: NMB 11, (2015) Collaboration: J. Chroboczek, La Tronche, France 40% tumor size reduction

47 Sztuczny kap

48 Nowe reagnety do modyfikacji mostka trifosfornaowego Przemysław WANAT Joanna KOWALSKA 1. Synteza nukleotydów modyfikowanych w łańcuchu fosforanowym grupą alkinową m= 0, 1, 2 m MgCl 2, DMF 0,5 h 2. Wykorzystanie modyfikowanych nukleotydów w reakcji CuAAC m n= 0, 1 15 przykładów Wydajności % Czas reakcji:0,5 2 h Sylwia WALCZAK Cu + 1h Błażej WOJTCZAK P. Wanat et al. Org. Lett. 17, (2015)

49 Uzyskiwanie kapowanych mrna inaczej: chemiczny capping Sylwia WALCZAK Przemysław WANAT Czy triazol w łańcuchu oligofosoranowym będzie zaburzał inicjację translacji? Czy możliwe będzie tworzenie kapu w reakcji click? Optymalizowane parametry: Pozycja reszty triazolowej Orientacja grupy triazolowej Długość łańcucha fosforanowego (2-4) Długość linkera (0-2) Atom łącznikowy (O, N, S, C) Kaja FAC Joanna KOWALSKA S. Walczak et al. Chemical Science 8, (2017)

50 Wydajność translacji jak dla naturalnie kapowanych mrna Sylwia WALCZAK Dorota KUBACKA Anna NOWICKA Joanna KOWALSKA S. Walczak et al. Chemical Science 8, (2017)

51 Synteza sond molekularnych: nukleotydy dwuklikalne

52 Synteza nukleotydów z dwoma klikalnymi podstawnikami Step 1 Przemysław WANAT Step 2 precipitation Michał KOPCIAŁ Joanna KOWALSKA Overall yield from NDP 40-80% IE chromatography / RP HPLC Base: A, C, G, m 7 G CH 3 I X: none, CH 2, OCH 2, di- and teraphosphates also available Warminski et al. Eur. J. Org. Chem, 2015 (28), Wanat et al. Chemical Communications 54 (2018)

53 Sondy ekscymerowe: synteza przez CuAAC A b s r o b a n c n m m/z 1442 m/z 609 ATP-Py 2 ATP-alkyne Py-N 3 2 Cu 2 h r e te n tio n tim e / m in F l u o r e s c e n c e i n t. F l u o r e s c e n c e i n t w a v e l e n g t h ( n m ) Wanat et al. Chemical Communications 54 (2018) w a v e l e n g t h ( n m ) Joanna KOWALSKA Przemysław WANAT

54 Monitorowanie hydrolizy enzymatycznej ATP-Py 2 Przemysław WANAT SVPDE 1 μm ATP-Py 2, 37 o C 100 mm Tris-CH 3 COOH ph 8 5 mm MgCl min 1.0 LC/MS/MS Michał KOPCIAŁ Normalized Intensity Em = 490 nm Em = 397 nm Renata KASPRZYK Time (min) Joanna KOWALSKA Wanat et al. Chemical Communications 54 (2018)

55 Zastosowania ekscymerowych sond nukleotydowych ATP-Py 2 + SVPD m 7 GTP-PEP 2 + hdcps d) e) (2) (1) (1) Fluorescence [A.U.] 6i 6f 7a I2 monitoring enzymatic activity in vitro and in cell lysates inhibitor discovery and evaluation (screening assays) Monitoring enzymatic activity in cells (???) E x c im e r e m is s io n (4 9 0 n m ) T im e (m in ) no enzyme Inh 1 Inh 2 no inhibitor (2) Wanat et al. Chemical Communications 54 (2018) Renata KASPRZYK Przemysław WANAT Michał KOPCIAŁ Joanna KOWALSKA

56 Badania na linii komórkowej cultured cells 1. probe 2. wash Paweł SIKORSKI confocal microscopy excitation 340/26 emission 387/11 (M) 525/30 (E) Wanat et al. Chemical Communications 54 (2018)

57 Podwójna detekcja sondy ATP w linii komórkowej Wanat et al. Chemical Communications 54 (2018) Paweł SIKORSKI

58 Podwójne znakowanie metodą one-pot two-step ADP-alkyne Cy3-N 3 (1 equiv.) 15 mm CuSO 4, 6 mm sodium ascorbate 60 mm ADP-Cy Cu Cy5-N 3 (1 equiv.) CuSO 4, 6 mm sodium ascorbate 60 mm Cu ADP-Cy3Cy R e te n tio n tim e / m in one-pot reaction! Wanat et al. in preparation Przemysław WANAT Joanna KOWALSKA

59 One-pot, two-step click chemisty - perspektywy Cy3 FL1 FL1 Cy5 FL2 Q FL1 FL1 B NP FL fluorescent label Q quencher B biomolecule: peptide, protein, nucleic acid NP nanoparticle: gold NP, magnetic NP, graphene oxide

60 Centrum Nowych Technologii i Zakład Biofizyki, Uniwersytet Warszawski Lab. Chemii Bioorganicznej: Dr Joanna KOWALSKA Dr Błażej WOJTCZAK Dr Dorota KUBACKA Dr Paweł SIKORSKI Dr Tomasz RATAJCZAK Dr Natalia KLECZEWSKA Dr Mikołaj CHROMIŃSKI Dr Mirosław ŚMIETAŃSKI Dr Anaix DEPAIX Mgr Sebastian CHMIELIŃSKI Mgr Karolina KACZMARSKA Mgr Marcin WARMIŃSKI Mgr. Zofia WARMIŃSKA Mgr Przemysław WANAT Mgr Sylwia WALCZAK, Mgr Anna NOWICKA Mgr Michał KOPCIAŁ Mgr Dominika STRZELECKA Mgr Renata KASPRZYK Mgr Marek BARANOWSKI Mgr Agnieszka MŁYNARSKA Mgr Marcelina BEDNARCZYK Mgr Adam MAMOT Mgr Mateusz KOZARSKI Mgr Olga PERZANOWSKA Sebastian GOŁOJUCH Radosław WÓJCIK Finansowane przez: Teodor OLEJKO Beata STAREK NCN, FNP i NCBiR Agnieszka BRZEZIŃSKA Jędrzej KUBICA Współpraca: John D. GROSS (University of California San Francisco, USA) Marcin NOWOTNY, IIMCB Warsaw) Ugur SAHIN (Gutenberg University of Mainz, GERMANY) Edward DARŻYNKIEWICZ (Faculty of Physics/CeNT UW) Robert E. RHOADS (Louisiana State University, Shreveport, USA) Zbigniew WIECZOREK (Univ. Warmia and Mazury, Olsztyn, POLAND) Joanna KUFEL (Faculty of Biology, University of Warsaw) Jadwiga CHROBOCZEK, (CNRS, Univ. Fourier, La Tronche, FRANCE) Franck MARTIN (Université de Strasbourg, CNRS, FRANCE) Maciej MAZUR (Faculty of Chemistry, University of Warsaw,) Andrzej DZIEMBOWSKI (IBB PAS, Warsaw) Rolf BARTENSCHLAGER (University of Heidelberg, GERMANY) Roger STROMBERG (Karolinska Intstytutet, Stockholm, SWEEDEN)