BACILLUS THURINGIENSIS W OCHRONIE LASU ALTERNATYWA DLA INSEKTYCYDÓW CHEMICZNYCH

Transkrypt

1 PRACE INSTYTUTU BADAWCZEGO LEŚNICTWA, 2000/2 Seria A 899 Alicja SIERPIŃSKA Instytut Badawczy Leśnictwa Zakład Ochrony Lasu ul. Bitwy Warszawskiej 1920 r. nr 3; Warszawa A.Sierpinska@ibles.waw BACILLUS THURINGIENSIS W OCHRONIE LASU ALTERNATYWA DLA INSEKTYCYDÓW CHEMICZNYCH BACILLUS THURINGIENSIS - AN OPTION FOR THE CONTROL OF DEFOLIATING LEPIDOPTERA IN FORESTRY Abstract. This review describes briejly the biology and mode ol action ol Baci/ lus thuringiensis (Bt), the refinement olbt application inforestry and commercial use ol Bt insecticides as well as environmentallactors injluencing the effective use ol Bt. Key words: Bacillus thuringiensis, biological controi oliorest insects, biopesticides.. Prac. Inst. Bad. Leś., A, 2000, 2(899):

2 1. WSTĘP Defoliacja koron powodowana przez owady jest jednym z głównych czynników inicjujących procesy zamierania drzew i drzewostanów. Obecnie, działania gospodarcze w zakresie ochrony lasu przed owadami obejmują czynności o charakterze profilaktycznym oraz zabiegi ratownicze z użyciem insektycydów. Dla zapewnienia stabilności i odporności biologicznej drzewostanów, oprócz integrowania sposobów gospodarowania w lesie z zasadami ochrony lasu, niezbędne jest w miarę potrzeb efektywne ograniczanie nadmiernego rozwoju populacji szkodliwych owadów oraz ciągłe qoskonalenie biologicznych, chemicznych i technicznych lnetod ich zwalczania (SIEROTA i in. 1994). Po latach intensywnego i skutecznego (w znaczeniu doraźnej redukcji liczebności populacji szkodnika) stosowania chemicznych środków owadobójczych o szerokim spektrum działania, zaczęto dostrzegać niewątpliwe ich wady: uodpornianie się owadów na insektycydy chemiczne, pojawianie się nowych szkodników, dotychczas bez znaczenia gospodarczego, różnorodne zakłócenia łańcuchów pokarmowych w ekosystemach, szkodliwy wpływ na organizmy nie będące celem zabiegu (w tym na ludzi) zanieczyszczenie środowiska na skutek kumulacji pestycydów w glebie i wodzie. Wszystko to skłania do poszukiwania i ulepszania środków owadobójczych działających selektywnie na szkodniki oraz racjonalnego włąc~ania ich do integrowanych programów ochrony przed szkodami wyrządzanymi przez owady..: NEALE (1997) do pestycydów biologicznych zalicza środki zawierające jako składnik aktywny mikroorganizmy (wirusy, bakterie,.grzyby i pierwotniaki lub ich produkty przemiany materii), feromony, roślinne i owadzie regulatory wzrostu,. ekstrakty roślinne, rośliny transgeniczne, oraz nicienie, parazytoidy i drapieżce. Autor ten podaje, że tak zdefiniowanych biologicznych środków ochrony roślin w jednym tylko 1990 roku sprzedano na świecie za 120 mln dolarów, co stanowi 0,5% światowego rynku pestycydów, a około 90% tej sumy to sprzedaż insektycydów Bacil,Ius thuringiensis. Szacuje się, że sprzedaż insektycydów B. thuringiensis rośnie o 10-25% rocznie (MCMANUS 1991; NEALE 1997). Największe zużycie produktów B. thuringiensis ma miejsce w Kanadzie i USA. Dokładna ocena wielkości światowej sprzedaży jest utrudniona ze względu na niekompletne dane z takich krajów jak Rosja, Chiny i Egipt. Oprócz kilku największych światowych producentów biopreparatów B. thuringiensis, w produkcję i rozwój tych środków zaangażowanych jest ponad 40 mniejszych firm. Wytwarzają one łącznie ponad 60 produktów B. thuringiensis służących ochronie około 80-ciu gatunków roślin przed prawie 100 gatunkami szkodników. Spośród producentów, około 20 firm jest zaangażowanych w prace badawcze związane z doskonaleniem szczepów naturalnych lub genetycznie zmienionych oraz przenoszeniem genów kodujących endotoksyny do innych bakterii lub roślin (EL Y

3 Bacillus thuringiensis w ochronie lasu - alternatywa dla insektycydów chemicznych ), czyli wytwarzaniem organizmów transgenicznych. Roczna światowa pro"" dukcja biopreparatów B. thuringiensis (bez Rosji i Chin) wynosi 2 do 3 tys. ton rocznie. Szacuje się, że w Chinach, w 1990 roku wyprodukowano łącznie 1500 ton preparatów B. thuringiensis. W 1993 r. Salama i Morris pisali, że "w krajach byłego ZSRR ok. 3 mln ha rocznie jest zabezpieczane przed szkodnikami przy wykorzystaniu B. thuringiensis ".. W Polsce, podczas gradacji brudnicy inniszki w latach zastosowano biopreparaty B. thuringiensis na powierzchni ok. 50 tys. ha, co stanowiło ok. 0,8% opryskanej powierzchni. Były to Bactospeine crelne, Thuridan WP, Thuridan krem, Bacilan WP i Dipel 8L (GŁOWACKA 1989) stosowane w zawiesinach wodnych, w dawce cieczy użytkowej Vha. Tak duża ilość wymaganej cieczy użytkowej przez wiele lat była jedną z przyczyn niewielkiego zainteresowania praktyków wykorzystaniem biopreparatów w leśnictwie. W latach 90-tych, po zarejestrowaniu bioinsektycydów Foray 02.2 UL i Foray 03,3 UL oraz Ecotech Pro 07,5 OF i Ecotech 15 OF, które stosuje się przy pomocy atomizerów w dawce 1-4 V ha bez rozcieńczania, zużycie B. thuringiensis w ochronie lasu znacznie wzrosło. W latach 90-tych biopreparatami B. thuringiensis traktowano 20-30% opryskiwanej powierzchni drzewostanów (GŁOWACKA 1996). Analiza Występowania i zwalczania owadów liściożemych w ostatniej dekadzie wskazuje, że ich znaczenie nie zmaleje ijestmało prawdopodobne, by ochrona lasu mogła obejść się bez bezpośrednich zabiegów ratowniczych przy użyciu insektycydów. Ważne jest przy tym, by zabiegi takie przeprowadzać przy użyciu metod i środków powodujących możliwie najmniejsze zaburzenia w biocenozach leśnych (SZUJECKI 1995). Obecnie do środków takich należą biopreparaty H thuringiensis w formie koncentratów do bezpośredniego stosowania aparaturą do oprysków UL V. Coraz szersze sto sowanie insektycydów B. thuringiensis staje się możliwe dzięki m.in. ciągłemu ulepszaniu preparatów i technologii oprysków. Duże znaczenie dla ich skutecznego stosowania ma zrozumienie sposobu działania B. thuringiensis na owady oraz znajomość wpływu różnorodnych czynników na skuteczność zabiegów i związany z tym wybór przez praktyków ochrony lasu optymalnego terminu i sposobu przeprowadzenia oprysków w drzewostanach. Skuteczność zabiegów ochronnych.przeciw owadom liściożemym, czyli ograniczenie strat listowia do akceptowalnego poziomu związane z redukcją liczebności populacji m~adą, w przypadku stosowania insektycydów B. thuringiensis zależy bezpośrednio od: aktywności owadobójczej patogena, wrażliwości traktowanego owada, kompleksu czynników środowiskowych w trakcie i po zabiegu oraz od terminu i sposobu przeprowadzenia zabiegu. Najlepszą skuteczność uzyskuje się przy pełnej optymalizacji wszystkich wymienionych czynników.

4 74. A. Sie rpińska 2. CHARAKTERYSTYKA B. THURINGIENSIS 2.1. Taksonomia Gatunek B. thuringiensis jest zaliczany do gramdodatnich, sporujących bakterii z rodzaju Bacillus, rodziny Bacillaceae (CLAUS, BERKELEY 1986). W zależności od morfologii spor i sporangium rodzaj Bacillus dzieli się na 3 grupy. B. thuringiensis należy do "kompleksu Bacillus cereus", do którego należą także B. 'cereus, B. anthracis ib. mycoides (TURNBULL i in. 1990). Istnieją kontrowersje dotyczące taksonomii B. thuringiensis, zarówno na poziomie gatunku, jak i podgatunków. Gatunki kompleksu B. cereus różnią się od siebie nielicznymi cechami. Jedyną cechą fenotyp owo różniącą B. thuringiensis od B. cereus jest wytwarzanie przez ten pierwszy gatunek białkowych kryształów parasporalnych, kodowanych przez geny zlokalizowane na plazmidach lub na chromosomie (GONZALES i in. 1981; JARRET 1985; ARONSON i in. 1986). Istnieje możliwość przekazywania materiału genetycznego warunkującego syntezę białek o właściwościach owadobójczych z komórek bakterii należących do jednego podgatunku B. thuringiensis do komórek bakterii innych podgatunków (JARRET, STEPHENSON 1990). Szczepy B. cereus także mogą być przekształcane w produkujące kryształy zarówno w warunkach in vitro jak i in situ (HANSEN 1996)., Do tej pory wyizolowano z różnych środowisk ponad izolatów B.thuringiensis (FEDERICI 1994). Klasyfikowano je, grupując w podgatunki, odmiany, sęrotypy, biotypy lub patotypy, itp. na podstawie cech biochemicznych (HEIMPEL, ANGUS 1958), antygenów rzęskowych (H serotypów) (BARJAC, BON NEFOI 1962; BARJAC, FRACHON 1990), antygenów kry,~ztałów parasporalnych (PENDLETON, MORRISON 1967; KRYWIENCZYK i in. 1978), produkcji esterazy (NORRIS, BURGES 1963), antybiotyków (TOUMANOFF, LAPIED 1954), enzymów (BARJAC, BONNEFOI 1973) i in. Obecnie, przy oznaczaniu podgatunków B. thuringiensis powszechnie akceptowane jest określanie H-serotypów, uzupełnione w niektórych przypadkach o specyficzne cechy biochemiczne (TAN ADA, KA Y A 1993). W oparciu o różnice antygenów rzęskowych (H) komórek wegetatywnych, szczepy B. thuringiensis zgrupowane są w kilkadziesiąt podgatunków. W Katalogu Szczepów nr 1 Międzynarodowego Centrum Entomopatogennych Bakterii z Rodzaju Bacillus przy Instytucie Pasteura w Paryżu (1994) wymienionych jest 58 podgatunków B. thuringiensis. W Katalogu tym wyróżnia się 45 głównych grup antygenowych(np.: H 1, H 3, H 4) i 13 podgrup (np.: H 4a4b, H 4a4c) określanych jako serotypy. Spektrum' aktywności owadobójczej szczepów B. thuringiensis jest słabo skorelowane z podziałem na podgatunki i nierozstrzygnięte pozostaje, czy profil patologiczny lub biochemiczny szczepu powinien pokrywać się z oficjalną taksonomią gatunku (FEDERICI 1994). Interesujące rezultaty świadczące o dużej zmienności aktywności owadobójczej w obrębie tego samego podgatunku B. thu-

5 Bacillus thuringiensis w ochronie lasu - alternatywa dla insektycydów chemicznych 75 ringiensis uzyskali DUBOIS i in. (1989) określając LC so (LC - "Lethal Concentration"; LC so - tu: stężenie zawiesiny spor i kryształów B. thuringiensis potrzebne do uśmiercenia 50% testowanych osobników) 260 szczepów B. thuringiensis z 26 serotypów dla larw L 2 brudnicy nieparki Lymantria dispar (L.) (Lep. : Lymantriidae) hodowanych na sztucznej 'pożywce. Porównywali oni aktywność każdego szczepu z aktywnością szczepu standardowego kurs taki HD-1-S Okazało si ę m.in., że spośród przebadanych 41 szczepów z podgatunku thuringiensis 5 było aktywniejszych od standardu, 30 miało podobną lub słabszą aktywność, a 6 szczepów było nieaktywnych. Podobnie, spośród 42 szczepów z podgatunku kurs taki 18 było aktywniejszych od standardu, 18 wykazywało podobnąlub słabszą aktywność, a 6 było nieaktywnych. Wśród 10 szczepów z podgatunku dendrolimus nie było żadnego aktywniejszego od standardu, 4 lniały słabszą aktywność, a 6 było nieaktywnych Cykl rozwojowy i toksyny B. thuringiensis.r' Wprowadzenie Cykl rozwojowy B. thuringiensis slcłada się z dwóch podstawowych faz: podziałów wegetatywnych oraz tworzenia form przetrwalnych czyli sporulacji (zarodnikowania). Spory nie wykazują aktywności metabolicznej i. mogą przetrwać przez okres wielu lat w niekorzystnych dla siebie warunkach ~rodowiska, np. przy niedoborze składników pokarmowych lub podczas suszy. " W różnych okresach cyklu' rozwojowego szczepy B. thuringiensis produkuj ą odmienne toksyny. Zgodnie z klasyfikacją, którą zaproponował HElMPEL (1967), wyróżnia się następujące toksyny B. thuringiensis: alfa-egzotoksyna, beta-egzotoksyna, delta-endotoksyna i gaffilna-egzotoksyna. Lista toksyri była w późniejszych latach uzupełniana (KRIEG, LYSENKO 1979; CARLSON i in. 1994). Za najbardziej istotne z punktu'widzenia praktyki ochroiw roślin 1łznaje się delta-endotoksynę (składnik białkowych kryształów parasporalnych) i beta-egzotoksynę Delta-endotoksyna Białkowe kryształy parasporalne,. wspomniane na początku rozdziału 2.1,. są produkowane przez komórki B. thuringiensis podczas sporulacji. Tworzenie kryształu rozpoczyna się w momencie powstawania przegrody (septum) oddzielającej presporę od pozostałej części komórki wegetatywnej, a kończy się przed wytworzeniem egzosporium '(SOMMERVILLE 1970.; LUTRY 1980). Kryształ jest tworzony zewnętrznie w stosunku do egzosporium i kiedy po ukończeniu procesu sporulacji ściana komórki wegetatywnej ulega lizie, kryształ i spora są osobno uwalniane do środowiska.

6 76 A. Sierpińska Kryształy białkowe mogą mieć różne kształty i rozmiary. Szczepy B. thuringiensis wykazujące aktywność owadobójczą wobec Lepidoptera wytwarzają kryształy o kształcie bi-piramidalnym (kształt struktilly diamentu), szczepy aktywne wobec Coleoptera - o kształcie spłaszczonych prostopadłościanów lub klockowatych bloczków (KRIEG i in. 1983), szczepy aktywne wobec Diptera - o kształcie sześciennym, bi-piramidalnym, jajowatym lub amorficzne (MIKKOLA i in. 1982). W jednej komórce wegetatywnej może powstawać jeden lub więcej typów kryształów, np. komórki niektórych szczepów podgatunku kurs taki (serotyp 3a3b) wytwarzają dwa typy kryształów, o kształcie bi-piramidalnym i jajowatym, każdy o innych właściwościach owadobójczych (KRYWIEŃCZYK i in. 1978). Skoro w większości przypadków kryształ białkowy jest protoksyną, określanie go nazwą delta-endotoksyny jest etymologicznie nieprawidłowe (TANADA, KA y A 1993). Autorzy proponują, by nazwy delta-endotoksyna używać wyłącznie dla określenia klasy działających owadobójczo białek, wytwarzanych w środowisku alkalicznym (ph>9) z protoksyny, na skutek jej degradacji przez enzylny proteolityczne na mniejsze, toksyczne fragmenty. Z powodu dużej różnorodności białek delta-endotoksyny, określanych też jako owadobójcze krystaliczne białka (Insecticidal Crystal Protein - ICP). lub białka "Cry", została utworzona klasyfikacja tych białek oraz kodujących je genów (HOFTE, WHITELEY 1989). W klasyfikacji tej termin "cry" (od ang. "crystal" - kryształ) oznacza gen,. a "Cry" - kodowane przez niego białko. Następującym dalej cyfrom rzymskim przypisano spektrum aktywności białek deltaendotoksyny (lcp): I i II - to białka toksyczne dla Lepidoptera, III - dla Coleoptera, IV - dla Diptera, V i VI - dla Nematoda. Po cyfrach rzymskich następują duże i małe litery łacińskie, odzwierciedlające większe (np.: CryIA i CryIB) i mniejsze (np.: CryIAa i CryIAb) różnice w budowie chemicznej białek (przy czym warto pamiętać, że nawet mała różnica w budowie może okazać się dużą różnicą w spektrum toksyczności). Działanie delta-endotoksyny na owady. Sposób działania delta-endotoksyny jest bardzo złożony i jak dotąd nie do końca poznany. Białkowe kryształy parasporalne trafiając do silnie alkalicznego środowiska w jelicie środkowym wrażliwych owadów, pod wpływem obecnych tam enzymów proteolitycznych ulegają degradacji na mniejsze białka. Według jednej z przyjmowanych hipotez, białka delta-endotoksyny wykazują powinowactwo chemiczne do receptorów znajdujących się na błonie komórkowej komórek epitelialnychjelita środkowego wrażliwych larw, dzięki czemu mogą się z nimi wiązać (HOFMANN i in. 1988a, b; KNOWLES, ELLAR 1987). Po wytworzeniu wiązań z receptorami białka delta-endotoksyny tworzą pory (kanaliki) w błonie komórkowej (KNOWLES, ELLAR 1986), przez które przenikają do wnętrza tych komórek niektóre jony. Na skutek tego błona komórkowa traci półprzepuszczalność (SACCHI 1986), co prowadzi do puchnięcia i lizy komórek (ENDO,

7 Bacillus thuringiensis w ochronie lasu - alternatywa dla insektycydów chemicznych 77 NISHIITSUTsun 1979). W efekcie dochodzi do perforacji jelita i przedostania się jego zawartości (łącznie ze sporami B. thuringiensis) do hemolimfy. Następuje wtedy paraliż przewodu pokarmowego lub paraliż ogólny, larwa przestaje żerować i zamiera po okresie od kilkudziesięciu minut do kilku dni. delta-endotoksyny na owady jest dodatkowo kompliko Sposób działania wany, ponieważ: - różne szczepy B. thuringiensis, czasami należące do tych samych podgatunków, mogą produkować w jednej kolnórce bakteryjnej kilka takich samych lub różnych delta-endotoksyn (ARONSON i in. 1986; KRONSTAD i in. 1983; ARVIDSON 1989), - wrażliwy owad może posiadać miejsca receptorowe dla kilku różnych delta-endotoksyn (FRANKENHUYZEN 1993), - ta sama delta-endotoksyna może wykazywać powinowactwo do więcej niż jednego typu miejsc receptorowych (KNOWLES 1994).c Beta-egzotoksyna Produkowana przez niektóre szczepy B. thuringiensis podczas fazy wzrostu wegetatywnego i wydzielana z komórek do podłoża hodowlanego toksyna, jest odporna na działanie wysokich temperatur (SEBESTA i in. 1973). Pod. względem chemicznym jest ona analogiem trifosforanu adenozyny i działa Jako. inhibitor prokariotycznej i eukariotycznej polimerazy DNA zależnej od RNA. Tylko część podgatunków B. thuringiensis (przy czym w obrębie danego podgatunku zwykle tylko, część szczepów) produkuje beta-egzotoksynę. Dotychczas jej obecność stwierdzono w hodowlach szczepów z podgatunków: thu'r'ingiensis (serotyp 1), kenyae (4a4c), sotto (4a4b), galleriae (5a5b), aizawai (7), morrisoni (8a8b), tolworthi (9), darmstadiensis (lo), toumanoffi (lla11b) i thompsoni (l 2) (SEBESTA 1981 ; TANADA, KAYA 1993). Beta-egzotoksyna ma znacznie szersze spektrum aktywności niż' deita~endotoksyna, działa toksycznie nie tylko na owady z rzędów Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hymenoptera (w tym pszczoły), Isoptera i Orthoptera, ale także na inne bezkręgowce spośród ' Arachnida, Oligochaeta. i Nematoda (KRIEG, LANGEN BRUCH 1981) oraz na kręgowce, (SEBESTA 1981). Znane jest również mutagenne działanie beta-egzotoksyny na komórki układu krwiotwórczego ssaków: Z powodu toksyczności dla kręgowców, w wielu krajach świata (np. w USA i Kanadzie) prawo zabrania sprzedaży środków ochrony roślin. zawierających beta-egzotoksynę na poziomie wykrywalnym współczesnymi technikami badawczylni. Zakaz taki nie istnieje w krajach byłego. ZSRR. Produkowane tam bioinsektycydy B. thuringiensis służące ochronie roślin przed owadami liściożemymi, zawierają od 0,6 do 20% beta-egzotoksyny. Biopreparat B. thuringiensis zawierający beta-egzotoksynę stosuje się patomiast z powodzeniem w Australii do zwalczania ektopasożytów owiec (PINNOCK i in. 1994).

8 78 A. Sierpińska 3. WYSTĘPOWANIE I IZOLACJA SZCZEPÓW B. THURlNGIENSIS Z RÓŻNYCH ŚRODOWISK B. thuringiensis, przez wielu autorów uważana za bakterię glebową, jest szeroko rozpowszechniona w przyrodzie. Izolowano ją w wielu krajach na różnych kontynentach z różnych nisz ekologicznych: gleby, liści drzew (iglastych i liściastych) i innych roślin, zamierających lub martwych owadów, pyłu VI lnagazynach zbożowych oraz ze zbiorników wodnych. Różne szczepy tego gatunku wytwarzają toksyny działające na organizmy z różnych grup systematycznych, a B. thuringiensis bedąc patogenem fakultatywnyin, dobrze rośnie i namnaża się na martwej lnaterii organicznej. Gleba, jako środowisko życia bakterii, charakteryzuje się ogromną heterogennością pod względem wilgotności, ph, ilości dostępnych składników pokarmowych i tlenu. Wielu autorów izolowało B. thuringiensis z gleby, m.in.: OHBA, AIZAWA (1986); MARTIN, TRAVERS (1989); CHILCOTT, WIGLEY (1993); HAN SEN i in. (1996) oraz YAO i in. (1998). Izolowane bakterie należały najczęściej do podgatunków kurs taki i galleriae. Wśród 6910 izolatów należących do grupy B. cereus - B. thuringiensis pochodzących z gleby, ORBA i AIZA WA (1986) znaleźli 189 (2,7%) takich, które produkowały kryształy parasporalne. Badając 1115 próbek gleby z 29 krajów na pięciu kontynentach MARlIN i TRA VERS (1989) wyizolowali B. thuringiensis z 785 próbek. Frekwencja próbek zawierających B.. thuringiensis wynosiła: 94% dla próbek z Azji oraz Centralnej i Południowej Afryki, 84% dla próbek z Europy, 60% dla próbek z Ameryki Północnej (USA) i 56% dla próbek z Nowej Zelandii. Autorzy ci najczęściej izolowali B. thuringiensis z gleb sawannowych, pustynnych i uprawnych, chociaż stwierdzili obecność tej bakterii także w glebach obszarów zurbanizowanych, leśnych,.tundrowych i stepowych. SMITH i COUCHE (1991) uznali, że właściwą niszą ekologiczną B. thuringiensis nie jest gleba lecz powierzchnia liści. Wedhig nich gleba jest tylko rezerwuarem spor tego gatunku. Izolowali oni B. thuringiensis z powierzchni liści w.wystarczającej liczbie, by uznać tę bakterię za organizm epifityczny. Izolaty B. thuringiensis,w : ilości'do 95% wszystkich znalezionych w danej próbce bakterii sporujących, uzyskano z liści jedenastu spośród czternastu przebadanych gatunków drzew"i:krzewów. Autorzy ci określili liczebność B. thuringiensis na powierzchni liści na 3 do 100 spor/cm 2. HANSEN i in. (1996) w 1 gramie materiału z liści znajdowali od 5 do 50 spor B. thuringiensis. Wśród B. thuringiensis izolowanych z powierżchni liści dominujący był podgatunek kurstaki. B. thuringiensis często izolowano z martwych i zamierających osobników wielu gatunków owadów, zwykle hodowanych w warunkach dużego przegęszczenia. W Japonii wielokrotnie izolowano B. thuringiensis z miejsc związanych z hodowlą jedwabników (ISHIWATA 1905; ORBA, ARATAKE 1994). Ponad 85%

9 Bacillus thuringiensis w ochronie lasu - alternatywa dla insektycydów chemicznych 79 izolatów B. thw:ingiensis wykazywało aktywność wobec larw jedwabnika morwowego Bombyx mori (L.) (Lep. : Bombycidae). Z hodowli laboratoryjnej larw skośnika bawełnowego Pectinophora gossypiella (Saud.) (Lep.: Gelechiidae) wyizolowa~o szczep HD-I podgatunku kurstaki, obecnie powszechnie używany w produkcji bioinsektycydów (DULMAGE 1970). Z larw Amyelois transitella (Walker) (Lep.: Pyralidae) wielokrotnie izolowano szczep z podgatunku aizawai i (co wyjątkowe) larwy te stanowiły bardzo dobre środowisko dla wzrostu B. thuringiensis. Pod koniec reprodukcji bakterii, martwe larwy składały się prawie wyłącznie ze spor i dużych bi-piramidalnych kryształów (FEDERICI 1994). Znacznie rzadziej natomiast izoluje się B. thuringiensis podczas naturalnie występujących epizoocji bakteryjnych wśród owadów. Jako przykład należy tu przede wszystkim podać odkrycie biotypu dendrolimus (podgatunek sotto) w larwach barczatki syberyjskiej Dendrolimus sibiricus (Tshtv.) (Lep.: Lasiocampidae) (TA LALAJEW 1956) oraz odkrycie podgatunku israelensis aktywnego wobec larw Diptera. Po raz pierwszy wyizolowano szczep podgatunku israelensis z chorych larw komara kłującego Culex pipiens (L.) (Diptera: Culicidae) zasiedlających w dużym zagęszczeniu mały staw na pustyni Negew w Izraelu (GOLDBERG, MAR GALIT 1977). Innym przykładem izolacji B. thuringiensis podczas epizoocji owadów występujących w nasileniu gradacyjnym, jest znalezienie szczepu K24 należącego do podgatunku israelensis w chorych larwach zasnui wysokogórskiej Cephalcia Jalleni (Dalm.) (Hymenoptera: Pamphilidae) zebranych w Gorczańskim Parku Narodowym. BENZ i JOERESSEN (1994) wykazali a~tywność szczepu K24 wobec larw niektórych Hymenoptera i Diptera. Występowanie owadów ib. thuringiensis jest naj ściślej ze sobąp~wiązane w miejscach takich.jak młyny, silosy i magazyny zbożowe. Miejsca te są idealnyiti środowiskiem dla wzrostu bakterii i przeżywania spoi w dobryiti stanie przez lata (MEADOWS 1993.). To właśnie w tym środowisku znaleziono B. thuringiensls po raz pierwszy na terenie Europy: z chorych larw mklika mącznego Ephestia kuehniella (Zell.) (Lep.: Pyralidae) znalezionych w Turyngii w przechowywanym ziarnie niemiecki uczony Berliner wyizolował w 1911 roku sporującą bakterię, którą nazwał Baclllus thuringiensis (BERLINER 1915). Pierwszy szczep z podg,atunku kurs taki wyizolowano również z larw tego gatunku Qwada (KURS T AK 1962). Szczep "tenebrionis" (zaliczany 'obecnie do podgatunku morrisoni), t\. -. wykazujący aktyw.ność owadobójczą wobec larw chrząszczy, znaleziony został w poczwarce mącznika młynarka Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) (KRIEG i in. 1983): CHAFAOUX i in.(1997) po p~zeanalizowaniu 4887 próbek pochodzących z różnych źródeł ze 101 krajów znaleźli 1260 szczepów B. thuringiensis. Większoś,ć szczepów pochodziła z kurzu zebrane'go w młynach i silosach oraz z martwych owadów, a stosunkowo ' niewiele.,szc~epów wyizolowano z próbek gleby.

10 80 A. Sierpińska 4. WRAŻLIWOŚĆ OWADÓW NA DELTA-ENDOTOKSYNĘ I SPORY B. THURINGIENSIS KRIEG i LANGENBRUCH (1981) podaj ą listę 320 gatunków z rzędu Lepidoptera wrażliwych na spory i endotoksynę B. thuringiensis pobierane z pokarmem. Ponieważ izolowane są kolejne szczepy o nieznanych dotąd właściwościach,,. spektrum aktywności owadobójczej B. thuringiensis stale poszerza się o nowe t~k - sony owadów i innych bezkręgowców. Oprócz szczepów B. thuringiensis z podgatunków kurs taki, morrisoni i israelensis, aktywnych wobec larw owadów z rzędów, odpowiednio, Lepidoptera, Coleoptera i Diptera, które wykorzystano do produkcji bioinsektycydów, znane są inne szczepy, wykazujące aktywność owadobójczą wobec niektórych gatunków rriszycowatych (Homoptera: Aphididde), wszy (Anoplura), karaczanów (Blattodea), mrówek (Hymenoptera: FormicirJ:ae) i rośliniarek (Hym.: Symphyta) a także działające toksycznie na nicienie (Nemqtoda) (zarówno na gatunki, których żywicielami są rośliny, jak i te, których żywi cielami są zwierzęta), pierwotniaki (Pro tozoa), roztocze (Acarina) i in. (BENZ, JOERESSEN 1994; FEITELSON 1994). HEIMPEL i ANGUS (1959) zaproponowali podział Lepidoptera na trzy gmpy w zależności od reakcji wrażliwych gatunków na B. thuringiensis z uwzględpieniem wrażliwych gatunków z innych rzędów, funkcjonujący z pewnymi zmi~nami do dziś: I -. gatunki, których larwy są zabijane jedynie przez delta - endotoksynę, wy:wołującą kilkanaście - kilkadziesiąt minut po połknięciu odpowiedniej dawki zahamowanie żerowania i paraliż ogólny, związany z gwałtownym wzrostem.ph hemolimfy o 1-1,5 jednostki z powodu wnikania do niej alkalicznej treści je1ita. Należą m m.in. jedwabnik morwowy, Manduca sexta (L.) (Lep.: Sphingiqae) (HEIMPEL, ANGUS 1959), Simulium vittatum, (Zetterstedt) (Dipt.: Simulii4,ae) (LACEY, FEDERICI 1979) i moskity (Dipt.: Culicidae) (BARJAC 1978). II - gatunki,których larwy po połknięciu odpowiedniej dawki ulegająje,dy-, nie paraliżowi jelita, odczyn hemolimfy nie ulega podwyższeniu i nie następ'uje paraliż. ogólny. Zabiciu wrażliwego owada sprzyja obecność spor, choć nie są 'pne niezbędn~. Ten typ reakcji jest u owadów najczęściej spotykany. LIP A (1967) wymienia przykładowo owocówkę jabłkóweczkę Cydia (=Carpocapsa) pomonella (L.) (Lep.: Tortricidae), prządki Malacosoma spp. (Lep.: Lasiocampidae) i bielinki Pieris spp. (Lep.: Pieridae). III - gatunki, których larwy są zabijane dopiero po kilku dniach, po wykiełkowaniu spor w jelicie i częściowym uszkodzeniu nabłonka jelita środko wego przez delta - endotoksynę. Przykładami owadów III typu są : mklik mączny (HEIMPEL, ANGUS 1959), mól barciak Galleria mellonella (L.) (Lep.: Pyralidae) (BURGES i in. 1976) i wyłogówka Choristoneurafumiferana (CIem.) (Lep.: Tortricidae) (VAN FRANKENHUYZEN 1994).

11 Bacillus thuringiensis w ochronie lasu - alternatywa dla insektycydów chemicznych 81 U niektórych gatunków spory znajdują w hemolimfie warunki, by kiełkować i namnażać się, co prowadzi z czasem do septicemii (masowego rozmnożenia bakterii w organizmie owada, połączonego z wydzielaniem toksyn) i staje się przyczyną śmierci (MCGAUGHEY 1978). 5. BIOPREPARATY B. THURINGIENSIS 5.1. Początki stosowania B. thuringiensis w ochronie roślin Pierwsze pr6by zwalczania owadów liściożernych przy pomocy B. thuringiensis dotyczyły brudnicy nieparki i odbyły się pod koniec lat 20. w USA (REAR DON 1994). Następnie, we wczesnych latach 30. w Europie wykonano próbę zwalczania omacnicy prosowianki Ostrinia nubilalis (Hbn.) (Lep.: Pyralidae) (FRANKENHUYZEN 1993). Pierwszy handlowy biopreparat B. thuringiensis, o nazwie Sporeine p wyprodukowany został w 1938 we Francji. Produkcję. handlowych bioprep~ratów B. thuringiensis na większą skalę rozpoczęto w latach 50. w Czechosłowacji, Francji, Niemczech i ZSRR (WEISER 1986). Równocześnie w USA prace Steinhausa ułatwiły wprowadzenie B. thuringiensis na rynek, dzięki czemu już w 1961 r. w Ameryce Północnej przeprowadzono kilka prób zwalczania Ch. fumiferana (IGNATOWICZ 1982). Początkowo :~iopreparaty produkowane na bazie B. thuringiensis 'ssp. thuringiensis miały forrń.ę proszków do sporządzania zawiesin wodnych lub olejowych. Dodawano do nich środki zwiększające przyczepność, fagostymulanty i środki chroniące przed promieniowaniem słonecznym. Stosowanie tego typu biopreparatów stwarzało d?że problemy. Krótki okres póhrwania na listowiu, niestabilność zawiesin, zatykan}e się dysz opryskiwaczy i nierównomierność oprysku były przyczynami słabej sk)iteczności i niskiej powtarzalności wyników (RE1'-RDON 1994). W 1970 r. Dtilmage uzyskał z larw skośnika bawełnowego izolat podgatunku kurs taki o bardzo silnej aktywności owadobójczej, który jest ' określany akronimem HD-l. OkaZ:ało się, że izolat HD-l miał razy większą aktywność owadobójczą wobec Iiaj~ażniejszych szkodników, niż dotychczas stosowany szczep z podgatunku thuringtensis (FRANKENHUYZEN 1993) oraz wykazywał aktywność wobec ponad 100 gatunków szkodników, będąc tym samym izolatem o naj szerszym spektrum działania (NAvON 1993). Szczep kurs taki HD-l posłużył do opracowania w 1971 r. preparatu Dipel, który jest produkowany do dziś. Kilka największych oraz wiele mniejszych firm zajmujących się produkcją biopreparatów B. thuringiensis wytwarza ró'żne formulacje na bazie szczepu kurstaki HD-l. Oprócz tego produkowane są bioinsektycydy zawierające B. thuringiensis z podgatunku israelensis (do zwalczania owadów z rzędu muchówek Diptera - wektorów chorół? człowieka), morrisoni (tenebrionis) (do zwalczania owadów

12 82 A. Sierpińska z rzędu chrząszczy Co leop tera, głównie stonki ziemniaczanej Leptinotarsa decemlineata (Say) (Col. : Chrysomelidae)) i aizawai (do zwalczania mola barciaka i tantnisia krzyżowiaczka Plutella xylostella (L.) (Lep.: Plutellidae). Produkuje się również biopreparaty zawierające szczepy bakterii B. thuringiensis o cechach nie występujących w naturze, które wytworzono wykorzystując występujące w przyrodzie zjawisko koniugacji lub metodami inżynierii genetycznej (SIERPIŃSKA 1997a). W Polsce badania nad możliwością wykorzystania B. thuringiensis do ograniczania liczebności leśnych Lepidoptera rozpoczęto na początku lat 60. (GŁOWACKA, KOEHLER 1965; SZMIDT, ŚUŻYŃSKI 1965). Produkcję biopreparatów na bazie B. thuringiensis ssp. kurs taki uruchomiono w naszym kraju w latach 80. (GŁOWACKA 1989). Produkowano wtedy trzy biopreparaty: Bacilan i Thuridan WP w formie proszków do sporządzania zawiesin i Thuridan kl"em w formie płynnego koncentratu Międzynarodowy system standaryzacji aktywności handlowych produktów B. thuringiensis Obok odkrycia szczepu kurs taki HD-1, ustanowienie międzynarodowego systemu standaryzacji aktywności produktów handlowych miało duże znaczenie dla poprawienia ich skuteczności i przyspieszyło wprowadzenie tych środków na rynek. Początkowo produkty standaryzowano na podstawie liczby SpOI' znajdujących się w jednostce objętości lub masy, co nie odzwierciedlało w pełni aktywności owadobój czej. Obecnie aktywność produktów wyrażana jest w jednostkach biologicznych wyliczanych w oparciu o biotesty przeprowadzane na żywych owadach według precyzyjnego protokołu (DULMAGE i in. 1971; DULMAGE 1981; BEEGLE 1986). Owadami testowymi w przypadku bioinsektydów do zwalczania Lepidoptera są w USA larwy Trichoplusia ni (Hbn.) (Lep.: Noctuidae), a aktualnie używanym szczepem standardowym szczep B. thuringiensis ssp. kurstaki HD-1-S-1980, o aktywności owadobójczej lu/mg (IU - "International Units" - jednostek międzynarodowych/mg). W krajach Unii Europejskiej testy są wykonywan~ na larwach mklika mącznego, a standard B. thuringiensis kurs taki HD-1 ma aktywność owadobójczą wynoszącą 1000 lu/mg (równą aktywności używanego kiedyś standardu E61) (GUILLON 1997). Zdrowe larwy owadów testowych żerują na sztucznej diecie zainfekowanej zawiesinami B. thuringiensis w odpowiednich rozcieńczeniach, po czym sprawdzana jest śmiertelność owadów i obliczane LC so badanej partii insektycydu oraz standardu. Aktywność produktu oblicza się podstawiając odpowiednie wartości do wzoru (DULMAGE i in. 1981): LC 50 (standardu) X lu / mg standardu LC 50 (produktu)

13 Bacillus thuringiensis w ochronie lasu - alternatywa dla insektycydów chemicznych 83 Oznaczona w ten sposób aktywność owadobójcza biopreparatów B. thuringiensis, stosowanych do zwalczania owadów z rzędu Lepidoptera, jest umieszczana przez producentów na etykiecie w BIU/litr lub BIU/galon ("B lu" - "Billions oflntemational Units" - miliardy jednostek międzynarodowych). Ponieważ aktywność owadobójcza wobec gatunków innych niż T ni może się znacząco różnić, czesto na etykiecie podawana jest również procentowa zawartość kryształów białkowych w preparacie i rekomendowana dawka formulacji produktu do stosowania przeciwko gatunkom, dla których został on zarejestrowany Doskonalenie technologii opryskiwania Intensywne prace nad doskonaleniem technologii opryskiwania lasów biopreparatami B. thuringiensis rozpoczęto w USA i Kanadzie w latach 70. Zmodyfikowano wtedy konstrukcję samolotów i opryskiwaczy, przeprowadzono liczne próby w celu określenia najwłaściwszych terminów i częstotliwości z,abiegów dla naj groźniejszych w Ameryce Północnej szkodników '(brudnica nieparka i Ch. fumiferana), j~k również dawek i objętości użytej cieczy. Do praktyki wprowadzono płynne form,ulacje, a pod koniec dekady zaczęto stosować koncentraty, co pozwoliło obniżyć koszty zabiegów i spowodowało poprawę powtarzalności wyników opryskiwań (FRANK.ENHUYZEN 1,990a). Dzięki kolejnym innowacjom w latach 80. koszty stosowaniab. thuringiensis w ochronie lasu przed szkodnikami liściożemymi zostały na tyle obniżone, że np. w Kanadzie spowodowało to bezprecedensowy wzrost zużycia z kilku prqcertt ca*owitej ilości stosowanych insektycydów rocznie na początku dekady (6~90 tys. ha) do kilkudziesięciu procent (650 tys. ha) w roku 1988 (FRANK.ENHUYZEN 1993). Najbardziej istotne było wtedy takie ulepszenie formulacji preparatów, że mogły one być stosowane bez rozcieńczania aparaturą ULV (REARDON i in. 199~). Z pracy P A YNE'A i FRANK.ENHUYZEN'A (1995) wynika, że d~lsze zwiększenie skuteczności B. thuringiensis można uzyskać dbając o takie rozpryskiwanie biopreparatów, by uzyskać odpowiednie pokrycie listowia. Autorzy ci wskazują, że dla określonej dawki bioinsektycydu naj skuteczniej sza jest kombinacja wielkości kropel i liczby kropel na j ednostk'ę powierzchni, zapewniaj ąca możliwie największy udział kropel zawierających dawkę letalną B. thuringiensis w osiadłym preparacie' (depozycie). Jeżeli natomiast udział kropel zawierających dawkę subletalną w depozycie wzrasta, to śmiertelność owadów znacząco spada i uzyskuje się znacznie gorszą skuteczność zabiegu. Wynika to ze sposobu działania B. thuringiensis. Larwy po połknięciu dawki, która nie jest dla nich śmiertelna przestają żerować, podobnie jak larwy, które połknęły dawkę letalną. O ile jednak te drugie po pewnym czasie zamierają, to u pielwszych mogązachodzić procesy regeneracyjne, mogą one, wyzdrowieć i podjąć żerowanie, mając już znacznie lnniejsze szanse na ponowne spożycie B. thuringiensis, ze względu na

14 84 A. Sierp ińska jego krótki okres półtrwania na liściach (SUNDARAM i in. 1992; DUBOIS 1993; HANSEN i in. 1996). 6. ODPORNOŚĆ OWADÓW NA B. THURINGIENSIS Pierwsze badania nad możliwością rozwoju odporności na B. thuringiensis u owadów i selekcją odpornego szczepu omacnicy spichrzanki prowadził MCGAU GHEY (1985). Odporność stwierdzona została w laboratoryjnej hodowli omacnicy,.jako rezultat ciągłej ekspozycji larw na B. thuringiensis przez 18 pokoleń. W warunkach terenowych nie zaobserwowano, by omacnica uodpolniła się na B. thuringiensis w wyniku zabiegów zwalczania. Ponadto, w badaniach laboratoryjnych, wykazano możliwość uodpornienia się na B. thuringiensis kilku innych gatunków owadów (MARRONE, McINTOSH 1993). Rozwój odporności na B. thuringiensis, będący skutkiem terenowych zabiegów ochronnych, jak dotąd zanotowano tylko u jednego gatunku owada, tantnisia krzyżowiaczka (TABASHNIK i in. 1990). Chroniąc uprawę rośliny Nasturtium ojjinicale (R. Br.) na farmie na Hawajach, w ciągu czterech lat wykonywano biopreparatem opartym na B. thuringiensis kurs taki od pięciu do ośmiu zabiegów przeciwko jednej generacji owada. Kiedy po 7 latach przerwy na tej samej farmie znowu zastosowano biopreparat B. thuringiensis kurstaki, po zabiegu zaobserwowano w traktowanej populacji jedynie 34% śmiertelność, podczas gdy śmiertelność we wrażliwej, laboratoryjnej populacji wynosiła %... Stan badań nad odpornością owadów na toksyny B. thuringirnsis przedstawił MALINOWSKI (1999). Biochemiczne mechanizmy odporności owadów na B. thuringiensis są badane przez wielu autorów. Przyjmuje się (V AJN RIE 1994), że najbardziej powszechny mechanizm odporności to zmniej szenib powinowactwa t białek receptorowych na błonie komórkowej komórek epit.e l~alnych w jelicie środkowym wrażliwych owadów do określonych białek toksyn.' W 1998 r. Milne i in. odkryli inny mechanizm odporności, wyjaśniający przyczyny naturalnej odporności pewnych gatunkowowadów na B. thuringiensis. Opublikowali oni wyniki badań nad białkiem TPP-75, znalezionym w treści jelita Ch. fumiferana, posiadającym właściwość unieszkodliwiania w wyniku pre~yl?it:acji niektórych delta-endotoksyn B. thuringiensis jeszcze przed związaniem rch ~ receptorami. Badania nad odpornością owadów leśnych na B. thuringieflsis prowadzili w USA i Kanadzie ROSSITER i in. (1990) oraz FRANKENHt)YZEN i in. (1995). Z pracy Rossiter. wynika, że zaobserwowana zmienność wrażliwości larw brudnicy nieparki na B. thuringiensis była spowodowana różnym zaopatrzeniem jaj w substancje zapasowe. Jaja składane przez samicę jako pierwsze zawierały więcej substancji zapasowych, a wylęgające się z nich larwy były bardziej żywotne i mniej wrażliwe nab. thuringiensis. Teoretycznie jest możliwe, że przy dosta-

15 Bacillus thuringiensis w ochronie lasu - alternatywa dla insektycydów chemicznych 85, tecznie dużej presji selekcyjnej mogą pojawić się genotypy brudnicy nieparki odporne na biopreparaty. Inni autorzy (DUBOIS 1993) uważająjednak za wątpliwe, by mógł nastąpić znaczący rozwój odporności brudnicy nieparki na B. thurżngżensżs będący rezultatem terenowych zabiegów opryskiwania, ze względu m.in. na inałą częstotliwość zabiegów z wykorzystaniem B. thuringiensżs przeprowadzanych w danym drzewostanie oraz duży zasięg terytorialny i behawior owada. FRANKENHUYZEN i in. (1995) badając wyłogówkę Ch.fumiferana stwierdzili, źe istnieje bardzo wysoka zmienność wrażliwości na B. thuringżensżs larw pochodzących od poszczególnych samic w obrębie jednej populacji (nawet 10- krotnie wyższa śmiertelność w odpowiedzi na tę samą dawkę). Wyniki te św~adczą, że zmienność wrażliwości na B. thurżngżensżs jest w dużym stopniu uwarunkowana genetycznie i w przypadku zaistnienia dostatecznie silnej presji selekcyjnej może ona sprzyjać wyselekcjonowaniu genotypów odpornych. Dlatego też nie jest celowe wprowadzanie genów warunkujących syntezę owadobójczych białek B. thuringiensżs do genomu drzew leśnych (choć podjęto już, takie próby w stosunku do topoli). " 7. CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA SKUTECZNOŚĆ B. rhuringiensis W ÓGRANICZANIU LICZEBNOŚCI OWADÓW LIŚCIOŻERNYCH 7.1. Wprowadzenie Poszczególnę etapy procesu apl~kacji biopreparatu mającego na-celu ograniczenie strat listowia i redukcję liczebności populacji szkodnika, to: rozpylenie i transport rozpylonej cieczy do chronionego listowia, osiadanie kropel, tworze!lie depozytu (osadu bioinsektycydu na listowiu), pobieranie dawki letalnej przez owada i działanie połkniętego biopreparatu B. thuringiensis w organizmie o~ada. Na każdy z tych etapów i w efekcie na ostateczny rezultat zabiegu ~oże wpływać szereg.:'czynników (SUNDARAM, SUNDARAM 1991; YOUNG 1994; RO WIŃSKI 1994), począwszy od jakości i spo~obu wykorzystania-sprzętu (samoloty, helikoptery i aparatura opryskująca), fizycznych właściwości cieczy użytkowej (gęstość, lepkość, napięcie powierzchniowe), cech morfologicznych liści,. intensywności żerowania "o,wada, wrażliwości owada nab. thurżngżensżs, trwałości preparatu na li~tow,iu, zastosowanej dawki bioprep~ratu, po skład chemiczny liści oraz warunki meteorologiczne podczasi po oprysku (opady, temperatura, prędkość wiatru, wilgotność względna powietrza i promięniowanie ultrafioletowe) (GŁOWACKA, CICHOŃSKA 1992; YOUNG'1993; ROWIŃSKI 1994).

16 86 A. Sie rpińska 7.2. Czynniki związane z owadobójczą aktywnością B. thuringiensis Aktywność owadobójcza B. thuringiensis przeciw danemu gatunkowi owada może być zależna od: - aktywności owadobójczej białek delta-endotoksyny wytwarzanych przez \ szczepy użyte do wyprodukowania biopreparatów, - roli spor w patogenezie danego szczepu B. thuringiensis wobec danego gatunku owada, - braku lub obecności beta-egzotoksyny (oraz innych toksyn). Aktywność owadobójcza B. thuringiensis zależna od rodzaju białek "Cry". (FRANKENHUYZEN i in. 1993) produkowanych przez szczepy bakterii określona jest przez zestaw posiadanych genów i wiąże się z różnorodnością genetyczną w obrębie gatunku B. thuringiensis (HOFTE, WHITELEY 1989) Czynniki związane z wrażliwością owadów Wrażliwość larw owadów na B. thuringiensis zależy bezpośrednio od: - ph zawartości jelita, - obecności w jelicie odpowiednich enzymów proteolitycznych rozcinających duże cząsteczki białkowe protoksyny na mniejsze białka "ery", - obecności w treści jelita środkowego białek powodujących precypitację delta-endotoksyn przed zwiazaniem ich z receptorami błonowymi, - obecności i liczby specyficznych miejsc receptorowych na błonie komórkowej komórek nabłonka epitelialnego jelita środkowego larw., rozpoznawanych przez białka '.'Cry" powstające z protoksyny, - w przypadkach, kiedy letalne działanie B. thuringiensis 'zależy w pewnym stopniu od spor - również od sprawności systemu immunolo.gicznego i ogólnej kondycji larw. B. thuringiensis, oprócz tego, że atakuje owada w sposób bezpośredni przy pomocy białkowych toksyn, wytwarza również substancje hamujące aktywność bakte~~obójczą hemolimfy zaatakowanego owada i niszczące jego system odpornościowy (GLIŃSKI, JAROSZ 1991). Wrażliwość larw owadów na B. ihuringiensis zmienia się z wiekiem. Starsze stadia larwalne sąna ogół mniej wrażliwe niż młodsze (WIEGAND 1963; SZMIDT 1974; ZEHNDER, GELERNTER 1989), chociaż nie brakuje dowodów na poparcie tezy przeciwnej, że wrażliwość ta nie jest zależna od wieku larw (FAST, DIMOND 1984). Z badań nad aktywnością owadobójczą~ilku szc~epów B. thuringiensis przeprowadzonych w Zakładzie- Ochrony Lasu IBL (SIERPIŃSKA 1997b) na larwach stadiów L3 i Ls barcz~tki sosnówkidendrolimus pini (L.) i brudnicy mniszki Lymantria monacha (L.) wynika, że wiek 'badanych larw był w istotny sposób związany z ich wrażliwością na B. thuringiensis, a młodsze stadia larwalne okazały się wrażliwsze. W hodowlach larw barczatki sosnówki infekowanych szcze-

17 Bacillus thuringiensis w ochronie lasu - alternatywa dla insektycydów chemicznych 87 pem kurstaki HD-1-S-1980, LTso (LT - "Lethal Time"; LTso - tu: czas, w którym następuje śmierć połowy owadów testowych pod wpływem określonej dawki lub stężenia spor i kryształów B. thuringiensis) dla larw Ls był średnio 3 razy dłuższy niż dla larw L3. W hodowlach larw brudnicy mniszki infekowanych tym samym szczepem 100% śmiertelność larw L3 obserwowano już po 3 dniach, a larw Ls dopiero po 7 dniach Czynniki środowiskowe Spośród czynników środowiskowych, które modyfikują zarówno aktywność owadobójcząb. thuringiensis jak i wrażliwość owadów, a także wpływają na proces aplikacji biopreparatu, najistotniejsze są: rodzaj pokarmu spożywanego przez owada, temperatura, promieniowanie UV oraz opady i wilgotność względna powietrza.. Rodzaj pokarmu Bakteriostatyczne i bakteriobójcze działanie ekstraktów z liści różnych roślin na komórki B. thuringiensis może mieć duży wpływ na skuteczność bakterii zwłaszcza w' tych przypadkach, gdy w patogenezie choroby istotna jest rola kiełkujących spor. Osbome już w 1943 r. (za MAKSYMIUKIEM 1970) opisywał antybakteryjne działanie substancji zawartych w sokach z liści. W 1958 r. Gukasjan wykazał ujemny wpływ soku z igieł i jego składników na B. thuringiensis ssp. sotto biotyp dendrolimus. SMIRNOFF i.hutchinson (1965) badając wpływ ekstraktów z listowia 74 gatunków roślin na rozwój B. thuringiensis ssp. thur{ngie.nsis Berliner zaobserwowali duże różnice w ich działaniu - od całkowitego zahamowania wzrostu bakterii do braku widocznego wpływu. Stwierdzili też, że spośród badanych roślin, naj silniej sze działanie na bakterie miały ekstrakh' z igieł drzew. KUDLER i LYSENKO (1975), analizując bakteriobójcze działanię igieł sosny, świerka i modrzewia na B. thuringiensis ssp. thuringiensis i ssp. kurs taki HD-1 ustalili, że najsilniejszą aktywność wykazywał ekstrakt z jednorocznych igieł modrzewia i świerka, a najsłabszą- z cz teroletnich igieł sosny.. CABRAL (1973) okr~ślała LDso (LD -. "Lethal Dbse"; LDso - tu: ~awka spor i kryształów B. thuringiensis powodująca śmierć 50% owadów testowych) 9 szczepów B. thuringiensis dla larw brudnicy nieparki hodowanych na liściach dębu (Quercus suber- L.) i topoli (Populus nigra L.). Okazało się, że larwy żerujące na topoli były znacznie bardziej wrażliwe na działanie badanych szczepów niż larwy żerujące na dębie ( razy niższe LDso). Najbardziej aktywne wobec larw hodowanych na liściach dębu były szczepy z podgatunków morrisoni, kenyae i subtoxicus, a wobec larw hodowanych na liściach topoli kolejność była zupełnie inna - najaktywniejszy był szczep z podgatunku thuringiensis, słabo aktywny wobec larw hodowanych na liściach dębu. Podobne obselwacje odnotowali ApPEL i SCHULZ (1994), którzy stwierdzili ponadto, że

18 88 A. Sierpińska śmielielność larw brudnicy nieparki była negatywnie skorelowana lti.in. ze stężenielti fenoli i gallotanin w liściach. I Wielu autorów badało wpływ różnych substancji allelochemicznych na interakcje między sporami i kryształami lub kryształami a owadami z drugiej strony. Kwasy: cynamonowy i p-kumarynowy obecne w liściach słonecznika zwiększają owadobójcze działanie B. thuringiensis na żywiące się liśćmi tej rośliny larwy Homoeosoma electellum (Hu1st) (Lep.: Pyralidae) (BREWER, ANDERS ON 1990). Skondensowane taniny znajdujące się w liściach bawełny działają antagonistycznie w odniesieniu do owadobójczej aktywności delta-endotoksyny B. thuringiensis przeciw larwom Heliothis virescens (F.) (Lep.: Noctuidae) (NAVON i in. 1993). Uważa się, że substancje allelochemiczne potęgujące szkodliwe działanie kryształów białkowych mogą być użyteczne w ulepszaniu fonnulacji B. thuringiensis (NAVON 1993). Czynniki meteorologiczne Warunki meteorologiczne w czasie i po zabiegu, a wśród nich temperatura i wilgotność powietrza, "opady, a także promieniowanie ultrafioletowe mogą znacząco zmieniać rezultat oprysku bioinsektycydamj B. thuringiensis. Temperatura wpływa m.in. na intensywność żerowania larw oraz na szybkość przemian metabolicznych w organizmach bakterii. RAUN i in. (1966) zaobserwowali, że larwy Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) (Lep.: Noctuidae) zamierają szybciej pod wpływem B. thuringiensis w temperaturze 32 niż 21 C, podobnie jak larwy omacnicy spichrzanki Ostrinia nubilalis Hbn. (Lep. : Pyralidae) w temperaturze 34 niż 20 oc. SVESTKA (1976), porównując szybkość zamierania larw piędzika przedzimka Operophthera brumata (L.) (Lep.: Geometridae) hodowanych w różnych temperaturach na liściach dębu opryskanych biopreparatami B. thuringiensis, maksymalną śmiertelność larw obserwował w temperaturze 22 oc po 5 dniach, a w temperaturze 4 oc po 22 dniach. Wpływ temperatury na szybkość zamier'.lnia i zdrowienia larw Ch.fumiferana-" owada wyrządzającego szkody w kanadyjskich lasach świerkowych i jodłowych - traktowanych B. thuringiensis badali van FRANKENHUYZEN i NYSTROM (1987). Stwierdzili oni, że LT 50 wydłuża się z 2-8 dni w temperaturze 28 oc do dni w temperaturze 16 oc, zależnie od stężenia zawiesin spor i kryształów. Zdrowiejące larwy zaczynają ponownie żerować po 2 dniach w temperaturze 28 oc, a po 6 dniach w temperaturze 16 C. FRANKENHUYZEN (1990b), kontynuując badania nad owadobójczą aktywnością B. thuringiensis wobec larw " Ch. fumiferana stwierdził, że temperatura nie wpływa na poziom śmiertelności badanych larw ~ a zmienia jedynie szybkość zamierania. Autor zauważył również, że zmiany temperatury między 13 a 25 oc miały ograniczony wpływ na pobieranie dawki letalnej, ponieważ 40-60% larw, niezależnie "od temperatury, było w stanie pobrać taką dawkę w ciągu 1 dnia

19 Bacillus thuringiensis w ochronie lasu - alternatywa dla insektycydów chemicznych 89 żerowania na igłach j odły balsamicznej, na których znajdowało się średnio 0,5-1,5 kropli biopreparatu na igle. Frankenhuyzen stwierdził, że w niektórych przypadkach obserwowane zahamowanie intensywności żerowania należy łączyć raczej z połknięciem subletalnej dawki biopreparatu i działaniem jej w organizmie wrażliwego owada, a nie z obniżeniem aktywności procesów metabolicznych larwy w niższej temperaturze. SIERPIŃSKA (1997b) oceniała m.in. wpływ temperatury na aktywność owadobójczą kilku szczepów B. thuringiensis wobec larw brudnicy mniszki, barczatki sosnówki i piędzika przedzimka. Obliczone wartości LT so wskazują, że w zależnoś ci od szczepu i stężenia B. thuringiensis oraz od gatunku owada testowego, infekowane larwy hodowane w temperaturze 22 lub 25 oc zamierają wielokrotnie szybciej niż larwy hodowane w temperaturze 12 lub 15 oc: larwy barczatki sosnówki od 3 do 6, a brudnicy mniszki i piędzika przedzimka od 2 do 5 razy szyb CIeJ. Rezultaty uzyskane przez SIERPIŃSKĄ (1997b) wskazują, że intensywność żerowania larw infekowany~h B. thuringiensis i hodowanych w temperaturach 12 i 15 oc była w niektórych przypadkach wyższa niż intensywność żerowania larw w temperaturach 22 i 25 oc. Mimo to, obserwowana śmiertelność larw była w tych przypadkach większa w wyższych temperaturach. Można to zjawisko wyjaśnić wpływem temperatury na szybkość przemian metabolicznych komórek B. thuringiensis rozwijających się w infekowanych larwach. FRANKENHUYZEN (1994) stwierdził, że w przypadku larw Ch. fumiferana, infekowanych B. th'uringiensis kurs taki HD-l-S-1980, śmierć larw następowała, szybciej w wyższych temperaturach z powodu szybciej przebiegających w takich warunkach podżiałów komórek wegetatywnych bakterii. Intensywne opady deszczu występujące przed wyschnięciem biopreparatu na opryskanym listowiu mogą go zmywać, czyniąc koniecznym ponowne przeprowadzenie zabiegu (MORRIS 1982). Zbyt mała wilgotność ' powietrza w okr.esie przeprowadzania zabiegu biopreparatami B. thuringiensis powoduje, że krople o średnicy mniejszej niż 100 ~m są bezpowrotnie tracone (SuNDARAM, $UNDA RAM 1991). Promieniowanie ui'trafioletowe Działanie promieniowania UV jest główną przyczyną krótkotrwałości okresu półtrwania spor i kryształów białkowych B, thuringiensis (BURGES i in. 1975; SA LAMA, ZAKI 1983). Okres półtrwania spor B. thuringiensis na listowiu wynosi godziny według SUNDARAM'A i in. (1992) i godziny według REAR DON'A i in. (1994). Według HANSEN'A i in. (1996) okres półtrwania kryształów białkowych na listowiu wynosi od mniej niż jednego dnia do kilku dni, a spor 16 godzin. BERNHARD (1998). podaje długą listę substancji ochronnych, które mogą być dodawane przez producentów do formulacji w celu, przedłużenia okresu

20 90 A. Sierpińska półtrwania B. thuringiensis na listowią eksponowanyln na bezpośrednie działanie promieni słonecznych Czynniki związane ze sposobem aplikacji B. thuringiensis Ze względu na pokarmowe działanie B. thuringiensis na owady, dla uzyskania wysokiej skuteczności biopreparatu bardzo ważna jest gęstość oprysku wyrażona liczbą kropel/cm 2 oraz wielkość kropel, podawana najczęściej w ~m średnicy (np.: średnia średnica arytmetyczna da lub średnia lnediana objętościowa dym). BRYANT i YENDOL (1988), stosując eksperymentalną technikę umożliwiającą aplikowanie dawek B. thuringiensis w kontrolowanej liczbie i wielkości kropel, wykazali istnienie zależności między gęstością oprysku i wielkością kropel biopreparatu a śmiertelnością larw brudnicy nieparki. Stosując krople w uśrednionych klasach wielkości 100, 200 i 300 ~m wykazali oni, że biopreparat był skuteczniejszy, jeśli daną dawkę aplikowano w postaci dużej liczby małych kropel (dym ~m), niż lnałej liczby dużych kropel (dym 150 ~m). Według MACZUGI i MIERZEJEWSK!EGO (1995), którzy również badali wpływ wielkości kropel i gęstości oprysku na larwy brudnicy nieparki aplikując krople w tych samych, uśrednionych klasach wielkości, L T 95 (tu: czas, w którym pod wpływem określonej ilości spor i kryształów B. thuringiensis zamiera 95% badanych osobników) zwiększa się, kiedy zmniejsza się gęstość oprysku i rozmiar kropel oraz kiedy zwiększa się wiek larw. Uważają oni, że drugie stadium larwalne brudnicy nieparki może być skutecznie zwalczane przy zastosowaniu standardowych dawek (4,7 l/ha przy preparatach zawierających 12,5 BIU/I) i przy widmie oprysku, w którym przeważają krople o średnicy 100 ~m (dym), a trzecie i czwarte stadium wymaga zastosowania wyższych dawek przy widmie oprysku, w którym przeważają większe krople. p A YNE i VAN FRANKENHUYZEN (1995) stwierdzili, że podawanie larwom Ch. fumiferana dawki letalnej w jednej, odpowiednio dużej kropli, jest efektywniejsze niż podawanie tej samej dawki w wielu małych kroplach. W badaniach użyli oni kropel o średnicach 52, 66 i 84 ~m (dym)' Rosnąca dyspersja dawki (zwiększenie ".' frekwencji coraz mniejszych kropel w widmie oprysku) powodowała ' zmniejsz nie skuteczności bioinsektycydu: śmiertelność po 24 godzinach ekspozycji na tę samą dawkę w jednej kropli o średnicy 84 ~m wynosiła 66%, a w wielu krpplach o mniejszych średnicach 40%. Natomiast REARDON i in. (1994), oceniając.wpływ rodzaju aparatury opryskującej i rozmiaru kropel na skuteczność biopreparatów B. thuringiensis w zwalczaniu brudnicy nieparki, nie zaobserwowali istotnych różnic w poziomie redukcji liczebności populacji dla kropel o średnicach 110 i 163 ~m (d VM )'