Ludzka katelicydyna LL-37 białko przeciwmikrobowe i jego rola w układzie odporności wrodzonej u noworodków

Transkrypt

1 Perinatologia, Neonatologia i Ginekologia, tom 5, zeszyt 4, , 2012 Ludzka katelicydyna LL-37 białko przeciwmikrobowe i jego rola w układzie odporności wrodzonej u noworodków MALWINA KUŹNIAK, MARTA SZYMANKIEWICZ Streszczenie Białka i peptydy przeciwmikrobowe są ważną częścią systemu odporności wrodzonej. Stanowią one pierwszą linię obrony organizmu przed drobnoustrojami chorobotwórczymi: bakteriami, wirusami i grzybami. Ich obecność stwierdza się już w okresie prenatalnym w płynie owodniowym oraz mazi płodowej pokrywającej skórę płodu i noworodka. Częściowo są one pochodzenia matczynego (transport przezłożyskowy), a częściowo są produkowane przez płód i noworodka w odpowiedzi na stan zapalny błon płodowych. Niniejsza praca skupia się na charakterystyce jednego z białek antymikrobowych ludzkiej katelicydyny LL37/hCAP18. Katelicydyna jest magazynowana w formie nieaktywnej w ziarnistościach leukocytarnych, a jej gen ulega ekspresji w komórkach nabłonkowych, szczególnie w narządach o dużej powierzchni mającej bezpośredni kontakt ze środowiskiem zewnętrznym (układ oddechowy, przewód pokarmowy). Oprócz niszczącego działania na komórki mikroorganizmów, posiada ona również właściwości chemotaktyczne wobec leukocytów, komórek T, mastocytów, indukuje różnicowanie komórek dendrytycznych, supresję apoptozy neutrofilów, angiogenezę, gojenie ran. Poprzez to jest czynnikiem łączącym odporność wrodzoną i nabytą. Na podstawie badań przeprowadzonych w populacji noworodków ludzkich stwierdzono, że jest ona białkiem indukowalnym, produkowanym nawet przez noworodki przedwcześnie urodzone, w odpowiedzi na zakażenie. Konieczne są dalsze badania, aby określić możliwości stymulowania syntezy katelicydyny i innych białek przeciwmikrobowych w ciążach zagrożonych porodem przedwczesnym lub ewentualnej podaży egogennych peptydów o właściwościach odpornościowych. Słowa kluczowe: noworodek, ludzka katelicydyna, odporność wrodzona Układ odpornościowy człowieka składa się z dwóch podstawowych części: odporności wrodzonej i nabytej. Odporność wrodzona jest to pierwsza linia obrony organizmu gospodarza, która zależy od barier anatomicznych (skóra i błony śluzowe) oraz fizjologicznych (np. niskie ph skóry i soku żołądkowego, temperatura głęboka ciała), a także od obecności specyficznych enzymów (lizozym) i białek przeciwmikrobowych. Mechanizmy odporności wrodzonej obejmują również niezależną od przeciwciał fagocytozę czy uwalnianie czynników prozapalnych przez makrofagi [1]. W skład odporności nabytej wchodzą dwie klasy wyspecjalizowanych komórek, limfocyty T i B, których działanie zależy od pierwotnej ekspozycji na antygen. Ważną częścią wrodzonego układu odpornościowego są białka i peptydy antymikrobowe (AMPs antimicrobial proteins and peptides), które pełnią rolę cząsteczek efektorowych i służą jako pierwsza, niezależna od pamięci immunologicznej, linia obrony przed mikroorganizmami w narządach o dużej powierzchni nabłonka stykającego się ze środowiskiem zewnętrznym (np. skóra, jelita, drogi oddechowe). Synteza AMPs ma miejsce w krążących leukocytach, będącymi głównymi komórkami efektorowymi wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, podlegającymi wpływowi stresu i aktywacji osi podwzgórze-przysadkanadnercza [2]. W przypadku dużych powierzchni nabłonkowych synteza AMPs odbywa się ponadto w komórkach skóry, przewodu pokarmowego, układu oddechowego i dróg moczowo-płciowych. Peptydy antymikrobowe mają działanie niszczące wobec drobnoustrojów, w tym prawdopodobnie również wobec bakterii opornych na antybiotyki [3]. Organizm ludzki pozostaje pod wpływem działania AMPs już w okresie płodowym, jako że cząstki te są obecne w mazi płodowej i płynie owodniowym. Fakt ten jest niezwykle istotny szczególnie u noworodków urodzonych przedwcześnie, u których ryzyko wystąpienia zakażenia wewnątrzmacicznego jest niezwykle wysokie [4]. Poniższa praca omawia jedno białko spośród zróżnicowanego spektrum białek i peptydów przeciwmikrobowych: LL37/ hcap18 (ludzka katelicydyna human cathelicidin). Katelicydyna jest białkiem posiadającym region stały i zmienny. Jest magazynowana w formie nieaktywnej w ziarnistościach leukocytarnych noszących nazwę wtórnych lub specyficznych na podstawie nieobecności w nich mieloperoksydazy (głównie w neutrofilach i makrofagach), a jej gen ulega ekspresji w różnych komórkach nabłonkowych [5-7]. Jedyną znaną ludzką katelicydyną jest LL37. Dojrzały peptyd powstaje z proformy (hcap18), białka kationowego o masie cząsteczkowej 18 kda, przez odcięcie C-końcowego peptydu przez proteazy serynowe. Wykazuje aktywność przeciwko szerokiemu spektrum bakterii, wirusów (m.in. Herpes simplex i HIV ) i grzybów [8, 9]. Oprócz tego wywiera również działanie immunomodulujące przez wpływ na chemotaksję leukocytów, komórek T, Katedra i Klinika Neonatologii, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego, Poznań

2 Ludzka katelicydyna LL-37 białko przeciwmikrobowe i jego rola w układzie odporności wrodzonej u noworodków 207 mastocytów, indukcję różnicowania komórek dendrytycznych, supresję apoptozy neutrofilów, angiogenezę, gojenie ran. Przez to jest czynnikiem łączącym odporność wrodzoną i nabytą.dzięki kationowemu charakterowi tego peptydu, a także obecności wielu fragmentów hydrofobowych i zasadowych i α-helikalnej budowie, może on oddziaływać z ujemnie naładowanymi fragmentami powierzchni drobnoustrojów i zaburzać ciągłość ich błony komórkowej poprzez tworzenie w niej porów i zwiększanie przepuszczalności błony, w efekcie prowadząc do śmierci komórki patogenu [10]. Ekspresja genu kodującego hcap18 jest regulowana przez witaminę D, która pobudza ją w keratynocytach i komórkach nabłonka oskrzeli [11]. Krążąca we krwi katelicydyna prawdopodobnie syntetyzowana jest w szpiku kostnym, choć dokładne źródło tego peptydu wciąż nie jest znane [12]. U noworodków pączkowanie i transport pęcherzyków zawierających hcap18 z aparatu Golgiego w neutrofilach mogą być niewystarczające [3]. LL37 u noworodków występuje w leukocytach, skórze [13], drogach oddechowych i jelicie, gdzie jest wskazywane jako krytyczny czynnik uczestniczący w kolonizacji przewodu pokarmowego bakteriami komensalnymi. Zwiększona podatność noworodków na infekcje związana jest z niedojrzałością układu odpornościowego. W momencie porodu istnieje niedobór odporności związanej z limfocytami Th-1, niewystarczająca synteza immunoglobulin oraz niektórych cytokin [14, 15]. Niedojrzałość układu odporności wrodzonej, a więc również pewnych czynników przeciwmikrobowych, przyczynia się do zwiększonej zachorowalności i śmiertelności w okresie noworodkowym. Płuca ze względu na ogromną powierzchnię nabłonka narażoną na kontakt ze środowiskiem zewnętrznym są drugimi w kolejności wrotami zakażenia dla rozmaitych patogenów [16]. Katelicydyna LL37 ulega ekspresji w nabłonku płucnym dorosłego człowieka [17]. Nie wiadomo czy jest ona również produkowana w drogach oddechowych noworodka. Stwierdzono jednak jej obecność w płynie pokrywającym nabłonek dróg oddechowych w podobnych ilościach u noworodków donoszonych i urodzonych przedwcześnie [18]. Badania nad homologami AMPs u gryzoni z rodziny myszowatych wskazują, że ich ekspresja wzrasta wraz z wiekiem ciążowym [19-21]. Z kolei praca Schaller-Bals i wsp. [18] dowodzi braku związku między stężeniem AMPs a wiekiem ciążowym u noworodków ludzkich. Pozytywna korelacja natomiast miała miejsce między stężeniem badanych białek antymikrobowych w popłuczynach oskrzelowych a obecnością infekcji systemowych bądź płucnych. Interesujący jest wzrost AMPs w treści oskrzelowej w zakażeniach systemowych przy jednoczesnym braku stanu zapalnego w płucach. Za ten efekt prawdopodobnie odpowiada systemowa odpowiedź zapalna. Ponadto stwierdzono, że stężenia białek przeciwmikrobowych korelują ze sobą, a także z poziomem interleukiny 8 i czynnika martwicy guza (tumor necrosis factor alpha TNF-α). Ich wzrost ma miejsce na zasadzie up-regulation sprzężenia dodatniego [18]. W badaniach z prowadzeniem hodowli tkankowej udowodniono wzrost LL37 na poziomie peptydu lub transkrypcji po stymulacji IL-1α, IL-6 i TNF-α [22-24]. Badania Starnera i wsp. [16] skupiły się na ontogenezie, ekspresji i regulacji m.in. katelicydyny LL37 w płucach noworodka, a ponadto na określeniu spektrum jej przeciwmikrobowej aktywności w odniesieniu do patogenów najczęściej stwierdzanych u noworodków. Do tego celu użyto m.in. eksplantów tkankowych pochodzących od tygodniowych płodów, pierwotnych hodowli tkankowych nabłonka dróg oddechowych, aspiratów treści tchawiczej oraz tkanek płucnych uzyskanych na drodze autopsji. Stwierdzono, że tkanki ze wszystkich badanych okresów rozwojowych wykazywały ekspresję katelicydyny. Przekaźnictwo dla LL37 stwierdzono jedynie w pierwotnym eksplancie płuca płodu, ale już nie po 24-godzinnej inkubacji. Wynika to prawdopodobnie z tego, że katelicydyna jest obecna w nabłonku dróg oddechowych i w neutrofilach, natomiast neutrofile nie przeżywają w hodowli. Zatem każdy sygnał wykrywany po 24 godzinach hodowli powinien pochodzić z tkanki płucnej. Ilość LL37 w aspiratach treści tchawiczej nie różniła się istotnie w próbkach uzyskanych od noworodków donoszonych, a jedyne zauważalne odchylenie w porównaniu do pierwotnego pomiaru miało miejsce w 10 dobie w próbkach pobranych od pacjentów powyżej 28. t.c. Nie zaobserwowano istotnych różnic między poszczególnymi grupami pacjentów w obecności IL-1β. Jeśli chodzi o spektrum działania antymikrobowego, ludzka katelicydyna posiada aktywność bakteriobójczą zarówno przeciwko bakteriom Gram-dodatnim, jak i Gramujemnym [16]. Ludzka katelicydyna jest proteiną specyficzną dla ziarnistości wtórnych neutrofilów. Praca Misawy i wsp. [3] wykazała, że ekspresja genu hcap18 w neutrofilach noworodków była znacząco mniejsza niż u dorosłych. Jednakże w przypadku monocytów krwi obwodowej nie stwierdzono istotnych różnic w ekspresji genu hcap18 między noworodkami a dorosłymi. Ekspresja genu katelicydyny w neutrofilach wzrastała wprost proporcjonalnie do wieku. Wykazano niską ekspresję w ciągu pierwszych 31 dni życia oraz wzrost do poziomu podobnego jak u dorosłych po ukończeniu 1. miesiąca życia, a przed końcem pierwszego roku życia. Stężenie badanego peptydu w surowicy było podobne u noworodków i u dorosłych; brakowało korelacji między stężeniem LL37 w surowicy a ekspresją genu w neutrofilach. Prawdopodobną przyczyną porównywalnego poziomu katelicydyny w surowicy w tych dwóch grupach pomimo różnej ekspresji w neutrofilach może być fakt, że liczba neutrofilów u noworodka jest około trzykrotnie wyższa niż u osoby dorosłej. Może to też wynikać z podobnej ekspresji genu i syntezy peptydu w komórkach

3 208 M. Kuźniak, M. Szymankiewicz nabłonka u noworodków i dorosłych. Sugeruje się, że u noworodków dochodzi do większej rekrutacji neutrofilów w miejscach zakażenia, aby osiągnąć wystarczające stężenie LL37. Doustna podaż 1α-hydroksy-witaminy D3 (1α(OH)D3) u noworodków z krzywicą przez 4 tygodnie spowodowała istotne zwiększenie ekspresji genu hcap18 w neutrofilach w porównaniu ze zdrowymi pacjentami z grupy kontrolnej nie przyjmującej witaminy D3. Wzrost ten był zależny od czasu, który upłynął od podania witaminy D3. Wskazuje to na potencjał witaminy D3 jako regulatora wrodzonej odpowiedzi immunologicznej u noworodków. Indukcja ekspresji genu LL37 w neutrofilach pacjentów z krzywicą po podaniu 1α(OH)D3 to efekt bezpośredniego działania farmaceutycznego, ale nie fizjologicznego, stężenia tej witaminy na myeloidalne komórki progenitorowe. Zawartość katelicydyny w neutrofilach noworodków z krzywicą, którzy posiadali więcej niż 50% neutrofilów z LL37, nie ulegała istotnemu zwiększeniu po podaniu witaminy D3. Te dane sugerują bardziej efektywne działanie 1α(OH)D3 na noworodki z niedojrzałymi neutrofilami [3]. Byfield i wsp.[25] w swojej pracy opisali wpływ LL37 na właściwości komórek nabłonka płucnego po zainfekowaniu ich Pseudomonas aeruginosa. Stwierdzili oni zależny od stężenia katelicydyny wzrost sztywności komórek nabłonkowych oraz zmniejszenie przepuszczalności błon komórkowych. Jak wspomniano we wstępie, białka i peptydy antymikrobowe obecne są w płynie owodniowym i mazi płodowej. Maź płodowa jest substancją białkowo-lipidową, unikalną dla ludzi, która jest produkowana przez płodowe gruczoły łojowe w trzecim trymestrze ciąży [26, 27]. AMPs są skoncentrowane w niezależnych, zorganizowanych, celularnych ziarnistościach zlokalizowanych w lipidowej macierzy. Wpływ ochronny na płód maź płodowa wywiera poprzez swoją strategiczną lokalizację pomiędzy skórą płodu a płynem owodniowym. Ponadto pod wpływem surfaktantu płucnego ulega ona oddzielaniu od skóry, a następnie jest połykana przez płód, skąd bierze się jej działanie ochronne na przewód pokarmowy [28]. Udowodniono, że katelicydyna LL37 jest obecna w mazi płodowej w zdrowych, donoszonych ciążach. Prawdopodobnie nie występuje ona w wysokich stężeniach przy braku infekcji, natomiast stan zapalny indukuje jej syntezę i uwalnianie. Tollin i wsp. [29] udowodnili, że lipidy mazi płodowej wzmacniają antymikrobową aktywność LL37 w warunkach in vitro, co wskazuje na istnienie interakcji między lipidami i AMPs zawartymi w mazi płodowej. Na stężenie LL37 w surowicy krwi pępowinowej wpływ ma prawdopodobnie sposób porodu. Badanie przeprowadzone przez Havelkę i wsp. [30] wykazało, że po porodzie siłami natury stężenie LL37 we krwi pobranej ze sznura pępowinowego jest trzykrotnie wyższe niż po cięciu cesarskim. Inna była również lokalizacja wewnątrzkomórkowa katelicydyny w zależności od sposobu porodu. Po porodzie siłami natury neutrofile zawierały 10 razy więcej wolnej LL37 w cytoplazmie (możliwy objaw aktywacji komórkowej), podczas gdy po porodzie cięciem cesarskim przeważała lokalizacja w ziarnistościach cytoplazmatycznych. Liczba leukocytów zarówno we krwi pępowinowej, jak i matczynej, była wyższa po porodzie naturalnym w porównaniu z cięciem cesarskim. Dodatkowo zaobserwowano wysoce istotną korelację między stężeniem katelicydyny we krwi matki i we krwi pępowinowej, niezależnie od drogi porodu. Najprawdopodobniej odzwierciedla to transport przezłożyskowy tego peptydu podczas późnej ciąży i porodu. Po porodzie cięciem cesarskim w surowicy matczynej stwierdzano wyższy poziom LL37 niż w surowicy krwi pępowinowej, z niskim gradientem stężeń LL37 między matką a noworodkiem. Zależności tej nie obserwowano po porodzie drogami i siłami natury. Przemawia to za transportem biernym tego peptydu. Nie można jednak wykluczyć współistnienia transportu aktywnego. We krwi pępowinowej stwierdzono trzykrotny wzrost stężenia hcap18 po porodzie siłami natury w porównaniu z cięciem cesarskiem, co wskazuje na uwalnianie peptydu przez płód w odpowiedzi na stres. Wzrost IL-8 podczas porodu może być czynnikiem indukującym degranulację i mobilizację katelicydyny [2, 31]. Synteza AMPs odbywa się w krążących leukocytach, których liczba podlega wpływowi stresu i aktywacji osi podwzgórze-przysadka-nadnercza [2]. Jako wykładniki stresu w badaniu Havelki i wsp. [30] wzięto pod uwagę ph krwi z tętnicy pępowinowej, stężenie glukozy i mleczanów. Wyniki były następujące: ph krwi pępowinowej uzyskanej z tętnicy było niższe po porodzie naturalnym, a stężenia glukozy i mleczanów we krwi pępowinowej i matczynej wyższe. W powyższym badaniu występowały bardzo istotne różnice stężeń LL37 w osoczu pomiędzy poszczególnymi pacjentami do 400 razy. Może to świadczyć o osobniczej różnicy w ekspresji genów. Niskie stężenia katelicydyny opisywano u pacjentów z chorobami nerek, u których stwierdzano również wyższą podatność na infekcje. Ponieważ wykazano związek pomiędzy matczynym i stwierdzanym u noworodka stężeniem LL37, prowadzi to do wniosku, że czynniki powodujące obniżenie stężenia tego peptydu u ciężarnej powinny stanowić przedmiot przyszłych badań. Ma to szczególne znaczenie w przypadku immunoniekompetentnych noworodków urodzonych przedwcześnie, jako że w innych badaniach wykazano między innymi, że LL37 hamuje wzrost Staphylococcus epidermidis, będącego główną przyczyną sepsy u wcześniaków [13]. Zatem wyższe stężenie tego peptydu, tak pochodzenia matczynego, jak i na skutek stymulacji stresowej związanej z porodem naturalnym, może być efektywne w ochronie przed zakażeniem. Jak wspomniano wyżej, witamina D odgrywa rolę regulatora ekspresji genu hcap18. W cytowanym badaniu jednakże nie stwierdzono korelacji między stężeniem LL37 i 25(OH)D ani u matek, ani u noworodków [30].

4 Ludzka katelicydyna LL-37 białko przeciwmikrobowe i jego rola w układzie odporności wrodzonej u noworodków 209 Wewnątrzmacicznie jelito płodu wypełnione jest jałowym płynem owodniowym. W momencie porodu dochodzi do masywnej kolonizacji bakteryjnej przewodu pokarmowego noworodka. Mimo tego i mimo jeszcze nie rozwiniętej nabytej odpowiedzi immunologicznej, rzadko dochodzi na tym tle do zakażenia u noworodka, co sugeruje istnienie silnych wrodzonych mechanizmów obronnych [32]. Praca dowodząca, że już w jelicie płodu dochodzi do produkcji AMPs, co przygotowuje przewód pokarmowy noworodka do kolonizacji bakteryjnej, została opublikowana przez Larsena i wsp. [33]. W pracy tej porównywano zawartość białek antymikrobowych, w tym ludzkiej katelicydyny, w smółce i stolcu noworodków w próbkach pobranych między 3. a 8. dobą życia, a także spektrum ich aktywności przeciw drobnoustrojom. Obecność LL37 stwierdzono zarówno w smółce, jak i w stolcu, ze znacząco wyższą zawartością w stolcu. Aby potwierdzić, że peptydy przeciwmikrobowe są pochodzenia płodowego, kiedy to w warunkach prawidłowych nie stwierdza się obecności drobnoustrojów, próbki smółki pobierano od noworodków urodzonych drogą elektywnego cięcia cesarskiego, bez wcześniejszej czynności porodowej. Ekstrakt smółki wykazywał silną aktywność niszczącą wobec Bacillus megaterium, Escherichia coli i paciorkowcom grupy B, ale nie przeciw Candida albicans. Z kolei AMPs zawarte w stolcu posiadały niską aktywność przeciw E. coli, GBS i C. albicans, natomiast wyższą przeciw B.megaterium. Jest to związane z kolejnością kolonizowania jelit noworodka przez bakterie. Jako pierwsze kolonizują przewód pokarmowy bakterie tlenowe Escherichia coli i Streptococci, a następnie bakterie beztlenowe, np. Bacteroides, Bifidobacteria i Clostridia. Prowadzi to do wniosku, że AMPs zawarte w smółce pełnią ochronną rolę w jelicie noworodka i regulują proces kolonizacji bakteryjnej podczas przejścia z jałowego środowiska wewnątrzmacicznego do środowiska zewnętrznego. Ponieważ peptydy zawarte w stolcu wykazują znacznie większą aktywność przeciwko B. megaterium, dowodzi to, że ich produkcja jest indukowana przez kontakt z patogenami [33]. Skóra ludzka jest efektywną barierą przeciwko bakteriom, a właściwość tę częściowo zawdzięcza obecności peptydów antymikrobowych, w tym katelicydyny LL37. Bakterie Gram-dodatnie są częstymi patogenami u noworodków, które atakują organizm właśnie przez skórę. Na powierzchni tych bakterii stwierdzono obecność włosowatych struktur zapewniających właściwości adhezyjne do komórek gospodarza. Staphylococcus epidermidis jest bakterią, która stanowi temat pracy Nelsona i wsp. [13]. Wykazali oni, że LL37, która jest obecna w barierze naskórkowej noworodka, istotnie hamuje wzrost S. epidermidis. Publikacja Marchini i wsp. [34] potwierdziła, że noworodek wyposażony jest w system ochrony przeciwmikrobowej skóry, który jest czymś znacznie więcej niż tylko barierą mechaniczną. Jest on aktywny już przed porodem (obecność peptydów antymikrobowych w mazi płodowej w efektywnych stężeniach) i ulega wzmocnieniu podczas pierwszych dni po urodzeniu w przebiegu ostrej komórkowej reakcji zapalnej skóry, znanej jako rumień toksyczny. Badacze w bioptatach skóry noworodków z erytema toxicum stwierdzili obecność gęstych, guzowatych nacieków z licznych komórek wykazujących ekspresję LL37 w skórze właściwej. Jako te komórki zidentyfikowano neutrofile, eozynofile i komórki dendrytyczne. Ponadto obecność katelicydyny stwierdzono w komórkach Langerhansa oraz w całej warstwie naskórka noworodków zarówno z rumieniem toksycznym, jak i bez wysypki. Sugeruje to konstytutywną ekspresję LL37 w tych typach komórek oraz indukowalność ekspresji w miejscach stanu zapalnego. Podobną indukcję obserwuje się u dorosłych w keratynocytach podczas zakażenia. Jako że peptydy przeciwmikrobowe wykazują również aktywność chemotaktyczną, wraz z lokalnym wzrostem IL-8 i eotaksyny, mogą przyczyniać się do napływu neutrofilów, eozynofilów i komórek dendrytycznych do skóry w reakcji na zapalenie. Ludzka katelicydyna posiada również właściwości antymikrobowe skierowane przeciwko grzybom. Jej działania polegającego na hamowaniu wzrostu drożdżaków Candida albicans dowodzi praca Wonga i wsp. [10]. Badacze dodawali do hodowli grzybów C. albicans LL37 lub jej fragmenty LL13-37 i LL17-32, a następnie poddawali inkubacji przez 24 godziny. Komórki niepoddawane leczeniu służyły jako kontrola. Stwierdzono, że zarówno LL37, jak i jej fragmenty, wykazują podobny potencjał hamujący wzrost strzępków C. albicans. W kontroli strzępki posiadały jednorodną grubość. Natomiast po leczeniu LL13-37, strzępki oceniono jako cieńsze, a pączkowanie jako słabsze, w następstwie czego obserwowano śmierć komórek. Po zastosowaniu wyższego stężenia LL13-37 (50 μm) nieobecna była forma strzępków, a jedynie forma okrągłokomórkowa. Już w niskim stężeniu (5 μm) LL13-37 była zdolna do zwiększania przepuszczalności błony komórkowej C. albicans niezależnie od postaci komórki. Dzięki temu stwierdzono obecność tego fragmentu katelicydyny w części (choć nie we wszystkich) strzępków C. albicans. Ponadto w komórkach drożdży poddanych leczeniu LL13-37 stwierdzono reaktywne formy tlenowe o właściwościach grzybobójczych. Wolne rodniki tlenowe uszkadzają różnorodne cząsteczki wewnątrz komórki, w tym kwasy nukleinowe, białka i lipidy. Dodatkowo LL13-37 uszkadzają błony mitochondrialne. Podsumowując, mechanizm przeciwgrzybiczego działania katelicydyny obejmuje zwiększenie przepuszczalności błony komórkowej C. albicans oraz indukcję wolnych rodników tlenowych. Zmiana przepuszczalności błony drożdży skutkuje zwiększonym wychwytem LL13-37, która może posiadać cele wewnątrz komórki, prawdopodobnie wykazując zdolność do wiązania się z kwasem nukleinowym. Rośnie liczba dowodów, iż te interakcje mogą wpływać na transport, właściwości immunomodulujące

5 210 M. Kuźniak, M. Szymankiewicz i antymikrobowe [35]. Lande i wsp. [36] udowodnili, że dzięki wiązaniu z LL37, DNA może tworzyć agregaty, które mogą przemieszczać się do komórek dendrytycznych, gdzie wzmagają produkcję interferonu. Obecność klinicznych lub bakteriologicznych wykładników przewlekłego zapalenia błon płodowych stwierdza się w ponad 50% ciąż zakończonych przed 30. tygodniem ich trwania [37]. Chorioamnionitis jest wymieniane jako jeden z czynników w patogenezie przewlekłej choroby płuc, leukomalacji okołokomorowej i mózgowego porażenia dziecięcego [38, 39]. Lepsze poznanie i zrozumienie endogennych mechanizmów obrony w środowisku płynu owodniowego może wpłynąć na rozwinięcie metod zapobiegania i leczenia zapalenia błon płodowych, a przez to zmniejszenie liczby porodów przedwczesnych czy polepszenie stanu i rokowania u noworodków przedwcześnie urodzonych. Potencjalnie możliwe staje się wykorzystanie bioaktywnych peptydów w leczeniu chorioamnionitis oraz zakażeń okresu noworodkowego. Celem takiej terapii byłaby poprawa immunokompetencji płodu we wczesnej ciąży oraz przedwcześnie urodzonego noworodka, co prowadziłoby do lepszych wyników długoterminowych. Mniejsza zawartość hcap18 w neutrofilach noworodków w porównaniu z dorosłymi powoduje jej słabsze działanie w miejscu stanu zapalnego, obniżoną aktywność przeciw patogenom oraz podatność na infekcje bakteryjne [3]. Ponieważ LL37 u noworodka jest zarówno pochodzenia matczynego (transfer przezłożyskowy), jak i płodowego (stres porodowy), wraz z przezłożyskowym transportem immunoglobulin może się ona przyczyniać do zwiększenia ochrony noworodka przeciw drobnoustrojom w okresie adaptacji pourodzeniowej [30]. Rozwój nowoczesnych metod terapeutycznych lekoopornych infekcji bakteryjnych jest naglącym problemem. Wrodzony układ odpornościowy człowieka jest naturalnym mechanizmem ochronnym przeciwko inwazji patogenów. Białka antymikrobowe odgrywają ważną rolę w tym systemie. Niektóre z tych peptydów są stosowane komercyjnie jako naturalnie antybiotyki [40, 41]. Podawanie egzogennych peptydów antymikrobowych lub zwiększanie ich stężenia na zasadzie dodatniego sprzężenia (np. upregulation katelicydyny przez podawanie witaminy D u noworodków) może być skuteczne w profilaktyce lub leczeniu ciężkich infekcji bakteryjnych w wieku noworodkowym. Przydatny może się także okazać skryning dzieci w kierunku niskiej ekspresji genu hcap18 w celu określenia pacjentów z wysokim ryzykiem zakażenia, będących kandydatami do terapii naturalnymi antybiotykami [3]. Piśmiennictwo [1] Medzhitov R., Janeway C. Jr. (2000) Innate immunity. N. Engl. J. Med. 343: [2] Yektaei-Karin E., Moshfegh A., Lundahl J. et al. (2007) The stress of birth enhances in vitro spontaneous and IL-8 induced neutrophil chemotaxis in the human newborn. Pediatr. Allergy Immunol. 18: [3] Misawa Y., Baba A., Ito S. et al. (2009) Vitamin D3 induces antimicrobial peptide 18 expression of human cathelicidin in newborns. Int. J. Hematol. 90: [4] Raba G., Kotarski J. (2010) Evaluation of selected morphological markers of inflammation in afterbirth from idiopathic premature labors. Ginekol. Pol. 81(6): [5] Cowland J.B., Johnsen A.H, Borregaard N. (1995) hcap-18, a cathelin/pro-bactenecin-likeprotein of human neutrophil specific granules. FEBS Lett. 368: [6] Borregaard N., Sorensen O.E., Theilgaard-Monch K. (2007) Neutrophil granules: a library of innate immunity proteins. Trends Immunol. 28: [7] Sorensen O., Arnljots K., Cowland J.B. et al. (1997) The human antibacterial cathelicidin, hcap-18, is synthesized in myelocytes and metamyelocytes and localized to specific granules in neutrophiles. Blood 90: [8] Gordon Y.J., Huang L.C., Romanowski E.G. et al. (2005) Human cathelicidin (LL-37), a multifunctional peptide, is expressed by ocular surface epithelia and has potent antibacterial and antiviral activity. Curr. Eye Res. 30: [9] Bergman P., Walter-Jallow L., Broliden K. et al. (2007) The antimicrobial peptide LL-37 inhibits HIV-1 replication. Curr. HIV Res. 5: [10] Wong J.H., Ng T.B., Legowska A. et al. (2011) Antifungal action of human cathelicidin fragment (LL13-37) on Candida albicans. Peptides 32: [11] Yim S., Dhawan P., Ragunath C. et al. (2007) Induction of cathelicidin in normal and CF bronchial epithelial cells by 1,25- dihydroxyvitamind(3). J. Cyst. Fibros. 6: [12] Sorensen O., Cowland J.B., Askaa J. et al. (1997) An ELISA for hcap-18, the cathelicidin present in human neutrophils and plasma. J. Immunol. Methods 206: [13] Nelson A., Hultenby K., Hell E. et al. (2009) Staphylococcus epidermidis isolated from newborn infants express pilus-like structures and are inhibited by the cathelicidin-derived antimicrobial peptide LL37. Pediatr. Res. 66: [14] Langrish C.L., Buddle J.C., Thrasher A.J. et al. (2002) Neonatal dendritic cells are intrinsically biased against Th-1 immune responses. Clin. Exp. Immunol. 128: [15] Suen Y., Lee S.M., Qian J. et al. (1998) Dysregulation of lymphokine production in the neonate and its impact on neonatal cell mediated immunity. Vaccine 16: [16] Starner T.D., Agerberth B., Gudmundsson G.H. et al. (2005) Expression and activity of b-defensins and LL-37 in the developing human lung. J. Immunol. 174: [17] Bals R., Wang X., Zasloff M. et al. (1998) The peptide antibiotic LL-37/hCAP-18 is expressed in epithelia of the human lung where it has broad antimicrobial activity at the airway surface. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: [18] Schaller-Bals S., Schulze A., Bals R. (2002) Increased levels of antimicrobial peptides in tracheal aspirates of newborn infants during infection. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 165: [19] Bals R., Goldman M.J., Wilson J.M. (1998) Mouse b-defensin 1 is a salt sensitive antimicrobial peptide present in epithelia of the lung and urogenital tract. Infect. Immunol. 66: [20] Morrison G.M., Davidson D.J., Kilanowski F.M. et al. (1998) Mouse b-defensin 1 is a functional homolog of human b-defensin 1. Mamm Genome 9: [21] Huttner K.M., Kozak C.A., Bevins C.L. (1997) The mouse genome encodes a single homolog of the antimicrobial peptide human b-defensin 1. FEBS Lett. 413: [22] Harder J., Meyer-Hoffert U., Teran L.M. et al. (2000) Mucoid Pseudomonas aeruginosa, TNF-alpha, and IL-1$, but not IL-6, induce human b-defensin-2 in respiratory epithelia. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 22:

6 Ludzka katelicydyna LL-37 białko przeciwmikrobowe i jego rola w układzie odporności wrodzonej u noworodków 211 [23] O Neil D.A., Porter E.M., Elewaut D. et al. (1999) Expression and regulation of the human b-defensins hbd-1 and hbd-2 in intestinal epithelium. J. Immunol. 163: [24] Agerberth B., Wigzell H., Gudmundsson G.H. (2000) The human antimicrobial and chemotactic peptides LL-37 and a-defensins are expressed by specific lymphocyte and monocyte populations. Blood 96: [25] Byfield F.J., Kowalski M., Cruz K. et al. (2011) Cathelicidin LL- 37 increases lung epithelial cell stiffness, decreases transepithelial permeability, and prevents epithelial invasion by Pseudomonas aeruginosa. J. Immunol. 187(12): [26] Pickens W.L., Warner R.R., Boissy Y.L. et al. (2000) Characterization of human vernix: water content, morphology and elemental analysis. J. Investig. Dermatol. 115: [27] Hoath S., Pickens W. (2003) The biology of vernix. [W:] Neonatal skin: structure and function.(hoath S.B., Maibach H.) New York: Marcel Dekker. [28] Medzhitov R., Janeway C. Jr. (2000) Innate immunity. N. Engl. J. Med. 343: [29] Tollin M., Bergsson G., Kai-Larsen Y. et al. (2005) Vernix caseosa as a multi-component defence system based on polypeptides, lipids and their interactions. Cell Mol. Sci. 62(19-20): [30] Mandic Havelka A., Yektaei-Karin E., Hultenby K. et al. (2010) Maternal plasma level of antimicrobial peptide LL37 is a major determinant factor of neonatal plasma LL37 level. Acta Paediatr. 99(6): [31] Baggiolini M., Loetscher P., Moser B. (1995) Interleukin-8 and the chemokine family. Int. J. Immunopharmacol. 17: [32] Newburg D.S., Walker W.A. (2007) Protection of the neonate by the innate immune system of developing gut and of human milk. Pediatr. Res. 61: 2-8. [33] Kai-Larsen Y., Bergsson G., Gudmundsson G.H. et al. (2007) Antimicrobial components of the neonatal gut affected upon colonization. Pediatr. Res. 61: [34] Marchini G., Ulfgren A.K., Lore K. (2001) Erythema toxicum neonatorum: an immunohistochemical analysys. Pediatr. Dermatol. 18: [35] Sandgren S., Wittrup A., Cheng F. et al. (2004) The human antimicrobial peptide LL-37 transfers extracellular DNA plasmid to the nuclear compartment of mammalian cells via lipid rafts and proteoglycan-dependent endocytosis. J. Biol. Chem. 279: [36] Lande R., Gregorio J., Facchinetti V. et al. (2007) Plasmacytoid dendritic cells sense self-dna coupled with antimicrobial peptide. Nature 449: [37] Karwan-Płońska A., Oknińska A. (2004) Analysis of pregnancy and labor course in patients after preterm premature rupture of membranes. Ginekol. Pol. 75(9): [38] Wu Y.W. (2002) Systematic review of chorioamnionitis and cerebral palsy. Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8: [39] Jobe A.H., Ikegami M. (2001) Antenatal infection/inflammation and postnatal lung maturation and injury. Respir. Res. 2: [40] Hancock R.E., Patrzykat A. (2002) Clinical development of cationic antimicrobial peptides: from natural to novel antibiotics. Curr. Drug Targets Infect. Disord. 2: [41] Zasloff M. (2002) Antimicrobial peptides in health and disease. N. Engl. J. Med. 347: J Malwina Kuźniak Katedra i Klinika Neonatologii Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego Poznań, ul. Polna 33 malkuzniak@gmail.com Human cathelicidin LL-37 an antimicrobial peptide and its role in innate immunity of neonates Antimicrobial proteins and peptides are important part of innate immune system. They act as the first-line defense of the organism against different pathogens: bacteria, viruses and fungi. They are present as early as in the prenatal period in amniotic fluid and vernixcaseosa. They come partly from the transplacental transport and in part, they are synthesized by the fetus and newborn in the answer to chorioamnionitis. This article focuses on the characteristics of one of the antimicrobial proteins human cathelicidin LL37/hCAP18. Cathelicidin is stored as inactive proforms in granules of specific leukocytes and is expressed in epithelial cells, especially in organs with large surface having direct contact with outside environment (respiratory and alimentary tract). It destroys cells of pathogenic microorganisms, but it also exerts immunomodulatory effects on chemotaxis of leukocytes, T-cells, mastocytes, induces differentiation of dendritic cells, suppression of apoptosis of neutrophils, angiogenesis and wound repairing. Through all these effects it links innate and adaptive immunity. Previous studies made in population of human newborns have shown, that human cathelicidin is an inducible protein that is produced in the answer to infection even by premature neonates. Further studies are necessary to determine the possibility of stimulation of synthesis of cathelicidin and other antimicrobial peptides in pregnancies with high risk of premature labour or treatment with exogenic peptides acting as part of the immunity. Key words: newborn, human cathelicidin, innate immunity