(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2008/44 EP B1 (13) T3 (51) Int. Cl. A61P31/18 C07D498/04 A61K31/519 ( ) ( ) ( ) (54) Tytuł wynalazku: Dwupierścieniowe związki heterocykliczne jako inhibitory integrafy HIV (30) Pierwszeństwo: US P US P US (43) Zgłoszenie ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2007/06 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 04/2009 (73) Uprawniony z patentu: Bristol-Myers Squibb Company, Princeton, US (72) Twórca (y) wynalazku: PL/EP T3 NAIDU B. Narasimhulu, Durham, US BANVILLE Jacques, St-Hubert, CA BEAULIEU Francis, Laprairie, CA CONNOLLY Timothy P., Portland, US KRYSTAL Mark R., Westport, US MATISKELLA John D., Wallingford, US OUELLET Carl, Boucherville, CA PLAMONDON Serge, Ste-Catherine, CA REMILLARD Roger, Napierville, CA SORENSON Margaret E., Meriden, US UEDA Yasutsugu, Clinton, US (74) Pełnomocnik: Jan Wierzchoń&Partnerzy Biuro Patentów i Znaków Towarowych Sp.j. rzecz. pat. Twardowska Aleksandra Warszawa skr. poczt. 709 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 EP B1 8780/08 Dwupierścieniowe związki heterocykliczne jako inhibitory integrazy HIV Odniesienie do pokrewnych zgłoszeń [001] Niniejsze zgłoszenie zastrzega pierwszeństwo z tymczasowego zgłoszenia numer US 60/ złożonego 20 sierpnia 2004 i 60/ złożonego 28 maja Tło wynalazku [002] Wirus ludzkiego niedoboru odporności (HIV) został zidentyfikowany jako czynnik etiologiczny odpowiedzialny za zespół nabytego niedoboru odporności (AIDS), śmiertelną chorobę charakteryzującą się niszczeniem układu immunologicznego i niezdolnością do zwalczania zagrażających życiu zakażeń oportunistycznych. Najnowsze statystyki (UNAIDS: Raport w sprawie światowej epidemii HIV / AIDS, grudzień 1998), wskazują, że aż 33 miliony ludzi na całym świecie jest zakażonych tym wirusem. Oprócz dużej liczby osób już zakażonych, wirus nadal się rozprzestrzenia. Szacunki z 1998 roku wskazują na blisko 6 milionów nowych zakażeń tylko w tym roku. W tym samym roku nastąpiło około 2,5 miliona zgonów związanych z zakażeniem wirusem HIV i AIDS. [003] Istnieje obecnie wiele leków przeciwwirusowych dostępnych do zwalczania zakażenia. Te leki można podzielić na trzy klasy w oparciu o wirusowe białka, które są ich celem i sposób ich działania. W szczególności, sakwinawir, indinawir, rytonawir, nelfinawir i amprenawir są konkurencyjnymi inhibitorami proteazy aspartylowej, wytwarzanej przez wirus HIV. Zydowudyna, didanozyna, stawudyna, lamiwudyna, zalcytabina i abakawir są nukleozydowymi inhibitorami odwrotnej transkryptazy, które zachowują się jak substrat naśladujący hamowanie syntezy wirusowego cdna. Newirapina, delawirdyna i efawirenz są nie nukleozydowymi inhibitorami odwrotnej transkryptazy, które hamują syntezę wirusowego cdna za pomocą mechanizmu hamowania nie kompetytywnego (lub nie konkurencyjnego). Jeśli stosowane same, te leki są skuteczne w ograniczaniu replikacji wirusa. Efekt jest jednak tylko tymczasowy, ponieważ wirus łatwo rozwija oporność na wszystkie znane środki. Jednakże terapia skojarzona okazała się bardzo skuteczna w redukcji zarówno wirusa, jak i tłumieniu pojawienia się oporności u wielu pacjentów. W USA, gdzie terapia skojarzona jest powszechnie dostępna, liczba zgonów związanych z wirusem HIV zmalała (Palella, F.J.; Delany, K.M.; Moorman, A. C.; Loveless, M.O.; Furher, J.; Satten, G.A.; Aschman, D.J.; Holmberg, S.D.N. Engl. J. Med. 1998, 338, ). [004] Niestety, nie wszyscy pacjenci są wrażliwi i wielu z nich nie poddaje się tej terapii. W rzeczywistości około 30-50% pacjentów ostatecznie nie poddaje się terapii skojarzonej. Niepowodzenie leczenia w większości przypadków jest spowodowane przez pojawienie się oporności wirusowej. Oporność wirusowa z kolei jest spowodowana przez szybki obrót HIV-1

3 - 2 - w trakcie zakażenia w połączeniu z wysoką szybkością mutacji wirusowych. W tych okolicznościach niekompletne stłumienie wirusowe, spowodowane przez niewystarczającą siłę leków, słabą zgodność wynikającą ze złożonego trybu podawania leku, jak również istotne farmakologiczne bariery dla ekspozycji, stanowią podatny grunt dla pojawienia się oporności. Bardziej niepokojące są ostatnie wyniki, które sugerują, że replikacja na niskim poziomie postępuje nawet wtedy, jeśli stężenie w osoczu wirusa spadło poniżej wykrywalnych poziomów (<50 kopii / ml) (Carpenter, C.C.; Cooper, D.A., Fischl, M.A.; Gatell, J.M.; Gazzard, B.G.; Hammer, S.M., Hirsch, M.S; Jacobsen, D.M; Katzenstein, D.A.; Montaner, J.S; Richman, D.D; Saag, M.S; Schechter, M.; Schooley, R.T.; Thompson, M.A.; Vella, S.; Yeni, P.G.; Volberding, P.A. JAMA 2000, 283, ). Wyraźnie istnieje potrzeba poszukiwania nowych środków przeciwwirusowych, korzystnie skierowanych na inne enzymy wirusowe, w celu obniżenia wskaźnika oporności i nawet dalszego stłumienia replikacji wirusa. [005] Trzy enzymy umożliwiają namnażanie się wirusa HIV: odwrotna transkryptaza, proteaza aspartylowa i integraza. Wszystkie trzy są docelowo stosowane do leczenia zakażenia wirusem HIV i AIDS. Integraza HIV katalizuje insercję wirusowego cdna do genomu komórki gospodarza, która jest decydującym etapem w cyklu życiowym wirusa. Inhibitory integrazy HIV należące do klasy związków diketo-kwasowych zapobiegały integracji i hamowały replikację wirusa HIV-1 w komórkach (Hazuda i współpracownicy, Science 2000, 287, 646). A niedawno, inhibitory integrazy HIV uzyskały akceptację do wykorzystania w badaniach klinicznych w leczeniu zakażenia wirusem HIV i AIDS (Neamati Expert. Opin.Ther. Patents 2002, 12, 709, Pais i Burke Drugs Fut. 2002, 27, 1101). [006] Wynalazek obejmuje związki o wzorze I, w tym ich farmaceutycznie dopuszczalne sole i solwaty, ich kompozycje farmaceutyczne i ich zastosowanie w hamowaniu integrazy HIV i leczenie tych zarażonych wirusem HIV lub AIDS. [007] Jednym z aspektów wynalazku są związki o wzorze I w którym: R 1 oznacza C 1-6 (Ar 1 )alkil; C 1-6 (Ar 1 )(CON(R 8 )(R 9 ))alkil, C 1-6 (Ar 1 )(CO 2 R 14 )alkil, C 1-6(Ar 1 )hydroksyalkil, lub C 1-6 (Ar 1 ) oksyalkil; R 2 oznacza wodór, C 1-6 alkil, lub OR 14 ; R 3 oznacza wodór, halo, hydroksy, cyjano, C 1-6 alkil, C 3-7 cykloalkil, C 5-7 cykloalkenyl, C 1-6haloalkil, C 1-6 alkoksy, C 1-6 alkilotio, C 1-6 haloalkoksy, N(R 8 )(R 9 ), NHAr 2, N(R 6 )SO 2 R 7, N(R 6 )COR 7, N(R 6 )CO 2 R 7, OCOR 7, OCO 2 R 7, OCON(R 8 )(R 9 ), OCH 2 CO 2 R 7,

4 - 3 - OCH 2 CON(R 8 )(R 9 ), COR 6, CO 2 R 6, CON(R 8 )(R 9 ), SOR 7, S(=N)R 7, SO 2 R 7, SO 2 N(R 6 )(R 6 ), PO(OR 6 ) 2, C 2-4 (R 12 )alkinyl, R 13, Ar 2, lub Ar 3 ; R 4 oznacza wodór, halo, hydroksy, cyjano, C 1-6 alkil, C 1-6 alkoksy, C 1-6 haloalkil, C 1-6 haloalkoksy lub N(R 6 )(R 6 ); R 5 oznacza wodór, halo, hydroksy, cyjano, C 1-6 alkil, C 1-6 alkoksy, C 1-6 haloalkil, C 1-6 haloalkoksy lub N(R 6 )(R 6 ); R 6 oznacza wodór, C 1-6 alkil lub C 3-7 cykloalkil; R 7 oznacza C 1-6 alkil lub C 3-7 cykloalkil; R 8 oznacza wodór, C 1-6 alkil, C 1-6 hydroksyalkil, C 1-6 (C 1-6 alkoksy)alkil lub C 1-6 (C 1-6dialkiloamino)alkil; R 9 oznacza wodór, C 1-6 alkil, C 1-6 hydroksyalkil, C 1-6 (C 1-6 alkoksy)alkil lub C 1-6 (C 1-6dialkiloamino)alkil; lub N(R 8 )(R 9 ) połączone razem oznacza azetydynyl, pirolidynyl, (R 10 )-piperydynyl, N-(R 11 )- piperazynyl, morfolinyl, tiomorfolinyl, lub dioksotiazynyl; R 10 oznacza wodór, C 1-6 alkil lub C 1-6 hydroksyalkil; R 11 oznacza wodór, C 1-6 alkil, C 3-7 cykloalkil, COR 6, lub CO 2 R 6 ; R 12 oznacza wodór, hydroksy, N(R 6 )(R 6 ), SO 2 R 7, OSO 2 R 7, lub dioksotiazynyl; oznacza azetydynonyl, pirolidynonyl, walerolaktamyl, kaprolaktamyl, maleimido, oksazolidonyl, lub dioksotiazynyl, i jest podstawiony 0-1 podstawnikami, wybranymi z grupy obejmującej hydroksymetyl, acetoksymetyl, i aminometyl; R 13 R 14 oznacza wodór lub C 1-6 alkil; Ar 2 oznacza tetrazolil, triazolil, oksadiazolil, tiadiazolil, pirazolil, imidazolil, oksazolil, tiazolil, izoksazolil, izotiazolil, furanyl, tienyl, pirolil, pirymidynyl, pirazynyl, pirydynyl, hydroksypirydynyl, chinolinyl, izochinolinyl, lub indolil, i jest podstawione 0-2 podstawnikami

5 - 4 - wybranych z grupy obejmującej halo, cyjano, benzyl, C 1-6 alkil, C 1-6 alkoksy, N(R 8 )(R 9 ), CON(R 8 )(R 9 ), CO 2 R 6, CONHSO 2 N(R 6 )(R 6 ), CONHSO 2 N(R 6 )(fenyl), i CONHSO 2 N(R 6 )(halofenyl); Ar 3 oznacza fenyl podstawiony 0-2 podstawnikami, wybranymi z grupy obejmującej halo, cyjano, hydroksy, C 1-6 alkil, C 1-6 alkoksy, (C 1-6 alkoksy)metyl, C 1-6 haloalkil, C 1-6 haloalkoksy, N(R 8 )(R 9 ), CON(R 6 )(R 6 ), i CH 2 N(R 8 )(R 9 ), lub oznacza dioksolanylofenyl; i X-Y-Z oznacza C(R 14 ) 2 OC(R 14 ) 2, C(R 14 ) 2 OC(R 14 ) 2 C(R 14 ) 2, lub C(R 14 ) 2 OC(R 14 ) 2 C(R 14 ) 2 C(R 14 ) 2 ; lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sól lub solwat. [008] Kolejnym aspektem wynalazku jest związek o wzorze I, w którym R 1 oznacza C 1-6 (Ar 1 ) alkil. [009] Kolejnym aspektem wynalazku jest związek o wzorze I, w którym R 1 oznacza [0010] Kolejnym aspektem wynalazku jest związek o wzorze I, w którym R 1 oznacza [0011] Kolejnym aspektem wynalazku jest związek o wzorze I, w którym R 2 oznacza wodór. [0012] Kolejnym aspektem wynalazku jest związek o wzorze I, w którym R 3 oznacza wodór, halo, N(R 8 )(R 9 ), N(R 6 )COR 7, OCON(R 8 )(R 9 ), CON(R 8 )(R 9 ), SOR 7, SO 2 R 7, SO 2 N(R 6 )(R 6 ), PO(OR 6 ) 2, R 13, lub Ar 2. [0013] Kolejnym aspektem wynalazku jest związek o wzorze I, w którym X-Y-Z oznacza C(R 14 ) 2 OCH 2, C(R 14 ) 2 OCH 2 CH 2 lub C(R 14 ) 2 OCH 2 CH 2 CH 2. [0014] Kolejnym aspektem wynalazku jest związek o wzorze I, w którym X-Y-Z oznacza CH 2 OCH 2, C(CH 3 )HOCH 2, C(CH 3 ) 2 OCH 2, CH 2 OCH 2 CH 2, C(CH 3 )HOCH 2 CH 2, C(CH 3 ) 2 OCH 2 CH 2, CH 2 OCH 2 CH 2 CH 2, C(CH 3 )HOCH 2 CH 2 CH 2 lub C(CH 3 ) 2 OCH 2 CH 2 CH 2 [0015] Dla związku o wzorze I, jakikolwiek zakres R 1, R 2, R 3, R 4, R 5, R 6, R 7, R 8, R 9, R 10, R 11, R 12, R 13, R 14, Ar 1, Ar 2, Ar 3 i X-Y-Z może być stosowany niezależnie z jakimkolwiek zakresem jakiegokolwiek innego podstawnika. [0016] "Alkil," "alkoksy," "hydroksyalkil" i terminy pokrewne dla ugrupowania alkilowego obejmują proste i rozgałęzione konfiguracje. Termin taki jak "C 1-6 (R)alkil" oznacza prostą lub rozgałęzioną grupę alkilową 1 do 6 węgli podstawioną podstawnikiem R. "Haloalkil" i "halofenyl" obejmują wszystkie permutacje chlorowcowanych grup alkilowych lub fenylowych, od monohaloalkilu do perhaloalkilu. "Aryl" oznacza układ pierścienia aromatycznego i obejmuje układy karbocykliczne i heterocykliczne. Niektóre podstawniki są

6 - 5 - dwuwartościowe, takie jak X-Y-Z. Podstawniki dwuwartościowe asymetryczne, mogą być przyłączone w każdej z dwóch konfiguracji. [0017] "C 1-6 (Ar) 1 oksyalkil" oznacza Ar 1 przyłączony do tlenu. [0018] "Dioksolanylofenyl" oznacza: [0019] "Dioksotiazynyl" oznacza: [0020] Wynalazek obejmuje wszystkie postacie soli dopuszczalnej farmaceutycznie związków. Sole dopuszczalne farmaceutycznie to te, w których przeciwjony nie przyczyniają się znacząco do aktywności fizjologicznej lub toksyczności związków i jako takie funkcjonują jako ekwiwalenty farmakologiczne. Sole te mogą być otrzymane według typowych metod organicznych, wykorzystujących komercyjnie dostępne odczynniki. Niektóre anionowe postacie soli obejmują octan, acystran, besylan, bromek, chlorek, cytrynian, fumaran, glukoronian, bromowodorek, chlorowodorek, jodowodorek, jodek, mleczan, maleinian, mesylan, azotan, pamoan, fosforan, bursztynian, siarczan, winian, tosylan, i ksynafonian (xinofoate). Niektóre kationowe postacie soli obejmują amoniową, glinową, benzatynową, bizmutową, wapniową, cholinową, dietyloaminową, dietanoloaminową, litową, magnezową, megluminową, 4-fenylocykloheksyloaminową, piperazynową, potasową, sodową, trometaminową i cynkową. [0021] Wynalazek obejmuje również wszystkie solwatowane postacie związków, szczególnie hydraty. Solwaty nie przyczyniają się znacząco do aktywności fizjologicznej lub toksyczności związków i jako takie funkcjonują jako ekwiwalenty farmakologiczne. Solwaty mogą tworzyć się w ilościach stechiometrycznych lub mogą tworzyć się z dowolnym rozpuszczalnikiem lub kombinacja obu. Jednym z rodzajów solwatu jest hydrat, i niektóre postacie uwodnione obejmują monohydrat, hemihydrat, i dihydrat. [0022] Niektóre ze związków wynalazku istnieją w postaciach stereoizomerycznych. Wynalazek obejmuje wszystkie postacie stereoizomeryczne związków, w tym enancjomery i diastereoizomery. Przykład enancjomerów jest pokazany poniżej. Sposoby otrzymywania i rozdziału stereoizomerów są znane w dziedzinie.

7 - 6 - [0023] Wynalazek obejmuje wszystkie postacie tautomeryczne związków. Przykład pary tautomerycznej jest pokazany poniżej. Metody syntetyczne [0024] Związki według niniejszego wynalazku można otrzymać różnymi sposobami znanymi w dziedzinie, obejmującymi te z poniższych schematów i te z części konkretnych praktycznych realizacji. Zmienne przedstawione na schematach syntetycznych są oddzielone od i nie powinny być mylone ze zmiennymi w zastrzeżeniach lub w pozostałej części opisu. Zmienne w schematach są przeznaczone jedynie dla zilustrowania sposobu otrzymania pewnych związków niniejszego wynalazku. [0025] Niektóre związki mogą być syntezowane z odpowiednio podstawionych heterocykli I-1, według schematu I, gdzie R a i P mogą służyć jako grupy zabezpieczające (patrz Greene, TW i Wutz, Protective Groups in Organic Synthesis, drugie wydanie, 1991, John Wiley and Sons, Nowy Jork). Jeśli P oznacza benzyl lub podstawiony benzyl to może być usunięty przez hydrogenolizę (H 2 -Pd/C) lub hydrolizę kwasową (kwas trifluorooctowy) dając produkt pośredni I-2. I-2 można poddać transaminowaniu do I-4 w reakcji z aminą I-3. W szeregu przypadków reakcję można przeprowadzić przez ogrzewanie I-3 i I-2 razem w obecności zasady. Alternatywnie, mogą być wykorzystane standardowe amidowe odczynniki sprzęgające do utworzenia wiązania amidowego. Jeśli R a jest niższą grupą alkilową, R a może być usunięte w warunkach hydrolizy estru, takich jak traktowanie NaOH, LiOH lub KOH dając odpowiedni kwas karboksylowy I-5. Alternatywnie, R a może być usunięte na drodze podstawienia nukleofilowego przy użyciu NaI. Jeśli R a jest benzylem lub podstawionym benzylem, R a może być usunięty przez hydrogenolizę. Produkt pośredni I-5 może być sprzęgany za pomocą odczynników tworzących wiązanie amidowe, takich jak BOP, DCC, EDCI, PyBrop, PyBop lub innych odczynników (patrz March, J. Advanced Organic Chemistry, czwarte wydanie 1992 John Wiley & Sons, Nowy Jork). Uzyskany produkt pośredni I-6 może być odbezpieczony jak opisano dla produktu pośredniego I-1.

8 - 7 - Schemat I. (P = grupa zabezpieczająca) R a = alkil, aryl, benzyl [0026] Na Schemacie II związek pośredni II-3 można otrzymać za pomocą sposobów podobnych do tych opisanych w Sunderland, J.S.; Botta, M.; Aime, S.; Raymond, K.N. Inorg. Chem. (2001), 40, , w którym II-1 i II-2 są skondensowane, dając związek pośredni II-3. Ta reakcja jest zazwyczaj prowadzona w obecności zasady, takiej jak wodorek sodu (NaH), etanolan sodu (EtONa) lub heksametylodisilazan litu (LiHMDS). Korzystając ze sposobów opisanych w odnośniku, II-3 może być skondensowany z odpowiednio podstawioną amidyną II-4 tworząc II-5. Podstawnik B może być grupą opuszczającą, taką jak-halo (Cl, Br lub 1) lub może być przekształcony w grupę opuszczającą w odpowiednich warunkach, takich jak przez utworzenie odpowiedniego estru metylosulfonowego. Jeśli podstawnik B jest grupą metylo-siarczkową to może być traktowany jodometanem do utworzenia produktu pośredniego dimetylosulfoniowego, który jest aktywowany w kierunku ataku nukleofilowego dla zamknięcia pierścienia. Schemat II.

9 - 8 - [0027] Na Schemacie III, produkt pośredni II-3 może być skondensowany z cykliczną amidyną celem uzyskania produktu pośredniego I-1. Produkt pośredni III-1 można otrzymać stosując znane sposoby (patrz Patai, i S. Rappoport, Z. Chemistry of Amidines and Imidates, Tom 2, 1991, John Wiley & Sons, Nowy Jork). Schemat III. [0028] Na schemacie IV, nitryl IV-1, posiadający potencjalną grupę opuszczającą B, można poddać reakcji z hydroksyloaminą tworząc produkt pośredni IV-2. Ten produkt pośredni można poddać reakcji z odpowiednio zabezpieczonym alkinem tworząc IV-3, który może ulec przegrupowaniu tworząc produkt pośredni IV-4, zgodnie z metodami literaturowymi (Culbertson, T.P. Journal of Heterocyclic Chemistry, 1979, 16, ). Schemat IV. [0029] Jak przedstawiono na Schemacie V, 2-(metylotio)-etanol może być alkilowany odpowiednim kwasem α-halooctowym (V-1), gdzie X jest grupą opuszczającą, taką jak Cl, Br, OTS, OMS lub OTF, dostarczając produkt pośredni V-2. Postępując w ten sposób kwas karboksylowy może być przekształcony do odpowiednich pochodnych amidyn za pomocą znanych metod syntetycznych (Geilen i współpracownicy, Tetrahedron Letters 2002, 43, ). Jak opisano powyżej, amidynę można następnie poddać reakcji z produktem pośrednim V-5, w obecności zasady (na przykład etanolanu sodu), otrzymując produkt pośredni V-6. Metylowanie eteru siarczkowego można osiągnąć działając na V-6 jodometanem i uzyskaną pochodną sulfoniową (V-7) poddać działaniu zasady tworząc bicykliczną formę V-8. Ten produkt pośredni można wykorzystać w syntezie związków końcowych z wykorzystaniem sposobów opisanych na Schemacie I.

10 - 9 - Schemat V [0030] Na schemacie VI, 3-metylotiopropanal jest przekształcony w dioksolan-vi-1 przy użyciu dobrze znanej chemii. Podziałanie trimetylosililocyjankiem (TMSCN), w obecności jodku cynku (ZnI 2 ) prowadzi do produktu pośredniego VI-2. Reakcja z amoniakiem dostarcza amidynę VI-3, która jest wykorzystywana w syntezie pirymidynonu VI-4, zgodnie ze sposobami opisanymi w poprzednich schematach. Dalsze działanie z CH 3 SO 2 Cl i trietyloaminą (Et 3 N) daje w wyniku odpowiedni bicykliczny produkt pośredni VI-5. Zakończenie syntezy może być przeprowadzone jak pokazano na Schemacie I.

11 Schemat VI [0031] Inny sposób zilustrowano na Schemacie VII. Ta ścieżka syntetyczna zaczyna się od odpowiednio podstawionego ketonu, który można przekształcić do odpowiedniego nitrylowego produktu pośredniego VII-1. Ten z kolei można poddać reakcji z 2-chloroetanolem do wytworzenia związku VII-2, który można poddać reakcji z hydroksyloaminą i diestrem acetylenowym otrzymując produkt pośredni VII-4. Ogrzewanie produktu pośredniego może dostarczyć produkt pośredni VII-5. Syntezę odpowiednich pochodnych amidowych można przeprowadzić według schematu I.

12 Schemat VII [0032] Na schemacie VIII, benzylowanie grupy hydroksylowej VII-5, jako sposób zabezpieczenia grupy funkcyjnej, można przeprowadzić przy użyciu bromku benzylu w warunkach zasadowych (na przykład K 2 CO 3 lub NaH). Zmydlanie grupy estrowej VIII-1 może dostarczyć VIII-2, które można poddać sprzęganiu z odpowiednio podstawionymi aminami (R 1 R 2 NH) stosując dobrze znane odczynniki tworzące wiązanie amidowe, takie jak heksafluorofosforan benzotriazolo-1-iloksy-tris-pirolidyno-fosfoniowy (PyBOP ) lub heksafluorofosforan O-(7-azabenzotriazol-1-ilo)-N, N, N ', N'-tetrametylouroniowy (HATU). Alternatywnie, można utworzyć odpowiedni chlorek kwasowy, na drodze reakcji z chlorkiem oksalilu, a następnie reakcję z odpowiednią aminą celem utworzenia wiązania amidowego. Usunięcie grupy benzylowej może być dokonane w różnych warunkach, w tym poddanie działaniu CF 3 CO 2 H lub H 2 (Pd-C).

13 Schemat VIII [0033] W jeszcze innym sposobie, niektóre związki niniejszego wynalazku mogą być syntezowane według schematu IX. Na schemacie IX pirymidynon IX-3 może być otrzymany za pomocą sposobów podobnych do tych opisanych w poprzednich schematach. Taki produkt pośredni można przeprowadzić w produkt końcowy na różnych drogach. W jednej nich grupa hydroksylowa może być benzoilowana dostarczając produkt pośredni IX-4, który można następnie poddać działaniu K 2 CO 3, aby uzyskać zamknięcie pierścienia w celu utworzenia bicyklicznej formy IX-5. Alternatywnie, bezpośrednie potraktowanie IX-3 K 2 CO 3 może dostarczyć produkt pośredni IX-6. Produkty pośrednie IX-5, IX-6 mogą być wykorzystywane w syntezie produktów końcowych za pomocą sposobów opisanych w Schemacie I.

14 Schemat IX [0034] Na schemacie X, IX-3 może być wykorzystane do syntezy benzylowanego produktu pośredniego X-1. Ten produkt pośredni można przeprowadzić w produkt końcowy stosując sposoby analogiczne do tych, opisanych na schemacie VIII. Schemat X

15 [0035] Syntezę chlorowodorku (2-(aminometylo)-5-fluorofenylo)(morfolino)-metanonu zilustrowano na Schemacie XI Schemat XI [0036] Na schemacie XII, bicykliczny produkt pośredni XII-1, otrzymany według sposobów opisanych powyżej, można poddać zmydleniu przy użyciu dobrze znanych sposobów. Otrzymany kwas karboksylowy XII-3 może być sprzęgany z aminą XII-2 przy użyciu standardowych odczynników i sposobów stosowanych do tworzenia wiązania amidowego. Usunięcie grupy benzylowej na drodze hydrogenolizy lub hydrolizy kwasowej dostarcza produktów końcowych. Schemat XII

16 [0037] Alternatywną drogę do związków podobnych do tych przedstawionych na Schemacie XII przedstawiono na Schemacie XIII. Na tym schemacie grupa estrowa XIII-1 może być hydrolizowana i otrzymany kwas karboksylowy sprzęgany z 2-(aminometylo)-5- fiuorobenzoesanem metylu. Druga reakcja hydrolizy może dostarczyć XIII-4, które może być sprzęgane z drugą aminą. Po usunięciu grupy benzylowej otrzymuje się produkty końcowe. Schemat XIII [0038] W jeszcze innym sposobie, Schemat XIV przedstawia przykłady obejmujące syntezę sulfonamidu, wychodzącą z chlorku 5-fluoro-2-metylobenzeno-1-sulfonylu.

17 Schemat XIV [0039] Dalszą ilustrację sposobów wykorzystywanych do syntezy niektórych związków wynalazku przedstawiono na Schemacie XV. Metylowanie 5-(2-bromo-5-fluorofenylo)-1Htetrazolu dostarcza mieszaninę XV-1 i XV-2, które mogą być rozdzielone i każdy ze związków przeprowadza się do odpowiednich produktów końcowych. Schemat XV

18 [0040] Niektóre analogi diazyryny i diazyrydyny można zsyntezować według schematu XVI. Schemat XVI [0041] Niektóre przykłady wynalazku można zsyntezować według sposobów przedstawionych na Schematach XVII-XX.

19 Schemat XVII Schemat XVIII

20 Schemat XIX Schemat XX [0042] Na Schemacie XXI, 2-bromo-benzonitryl lub 2-bromo-4-fluoro-benzonitryl może być sprzęgany z odpowiednim amidem dostarczając XXI-1. Redukcja grupy nitrylowej dostarcza XXI-2, które może być wykorzystane w syntezie produktu końcowego za pomocą sposobów opisanych w poprzednich schematach. W większości przypadków, związek XXI-1 nie musi być wydzielony, ale może być wprowadzony bezpośrednio do reakcji sprzęgania tworząc XXI-3.

21 Schemat XXI [0043] Przykłady i sposoby opisane na Schemacie XXII są podobne do tych opisanych na schemacie XXI. Schemat XXII [0044] Schematy XXIV i XXV dalej ilustrują sposoby użyteczne do syntezy niektórych związków wynalazku.

22 Schemat XXIV

23 Schemat XXV [0045] Na schemacie XXVI, produkt pośredni XXVI-1 może być wykorzystany do syntezy produktów pośrednich XXVI-2 na drodze sprzęgania katalizowanego palladem. Te produkty pośrednie można dalej modyfikować otrzymując niektóre związki według niniejszego wynalazku. Schemat XXVI [0046] Inny sposób jest zilustrowany na Schemacie XXVII.

24 Schemat XXVII [0047] Na schemacie XXVIII, związek XXVIII-1 może być przekształcony w odpowiednią pochodną metylosulfonową, XXVIII-2, która może być następnie poddana działaniu azydku sodu dostarczając XXVIII-3. Ten związek z kolei może służyć jako produkt pośredni do dalszych przekształceń jak pokazano na schemacie. Schemat XXVIII

25 [0048] Niektóre przykłady niniejszego wynalazku mogą być syntezowane według sposobów zilustrowanych na Schematach XXIX-XXXVIII. Schemat XXIX Schemat XXX

26 Schemat XXXI Schemat XXXII

27 Schemat XXXIII Schemat XXXIV Schemat XXXV

28 Schematy XXXVI Schemat XXXVII

29 Schemat XXXVIII Metody biologiczne [0049] Aktywność hamowania integrazy HIV. Aby ocenić in vitro aktywność hamowania integrazy HIV, 5 pmoli substratu DNA znakowanego biotyną związano z 100 μg streptawidyny powlekanych perełkami PVT SPA (Amersham Pharmacia Biotech). Rekombinowaną integrazę (0,26 ng) inkubowano z perełkami przez 90 minut w temperaturze 37 C. Niezwiązany enzym został usunięty przez przemywanie kompleksu, następnie addycję inhibitorów i 0,1 fmol P33 znaczonego docelowego DNA. Reakcja została zatrzymana przez dodanie EDTA do końcowego stężenia 10 mm. Próbki zostały zliczone w TopCountNXT (Packard) i CPM wykorzystywano jako miarę integracji. Warunki reakcji były jak opisano w A. Engelman i R. Craigie, J Virol., 69, (1995). Sekwencję substratu i docelowego DNA opisano w Nucleic Acid Research 22, (1994). Wyniki przedstawiono w Tablicy 1. Aktywność równa A dotyczy związku posiadającego IC 50 = 0,002 do 0,10 μm, podczas gdy B i C oznaczają związki posiadające odpowiednio IC 50 = 0,1 do 1,0 i IC 50 1,0 μm. Tablica 1 Przykład Aktywność 1 A 2 A 3 A 4 A 5 A 6 A 7 A 8 A 9 A

30 A 11 A 12 A 13 A 14 A 15 A 16 A 17 A 18 A 19 A 20 A 21 A 22 B 23 A 24 B 25 B 26 A 27 A 28 A 29 A 30 A 31 A 32 A 33 A 34 A 35 A 36 A 37 A 38 A 39 A 40 A 41 A 42 A 43 A 44 A 45 A 46 A 47 A 48 A 49 A

31 A 51 A 52 A 53 A 54 A 55 A 56 A 57 A 58 A 59 A 60 A 61 A 62 A 63 A 64 A 65 A 66 A 67 A 68 A 69 A 70 A 71 A 72 A 73 A 74 A 75 A 76 A 77 A 78 A 79 A 80 A 81 A 82 A 83 C 84 A 85 A 86 A 87 A 88 A 89 A

32 A 91 A 92 A 93 A 94 A 95 A 96 A 97 A 98 A 99 A 100 A 101 A 102 A 103 A 104 B 105 A 106 A 107 A 108 A 109 A 110 A 111 A 112 A 113 A 114 A 115 A 116 A 117 A 118 A 119 A 120 A 121 A 122 A 123 A 124 A 125 A 126 A 127 A 128 A 129 A

33 A 131 B 132 A 133 B 134 A 135 A 136 A 137 A 138 A 139 A 140 A 141 A 142 A 143 A 144 B 145 C 146 A 147 A 148 B 149 A 150 A 151 A 152 A 153 A 154 A 155 A 156 A 157 A 158 A 159 B 160 A 161 A 162 A 163 A 164 A 165 A 166 B 167 A 168 A 169 A

34 A 171 A 172 A 173 A 174 A 175 A 176 A 177 A 178 A 179 A 180 A 181 A 187 A 188 A 189 A 190 A 191 A 192 A 193 A 194 A 195 A 196 A 197 A 198 A 199 A 200 A 201 A 202 A 203 A 204 A 205 A 206 A 207 A 208 A 209 A 210 A 211 A 212 A 213 A 214 C

35 A 216 A 217 A 218 A 219 A 220 A 221 A 222 A 223 A 224 A 225 A 226 A 227 A 228 A 229 A 230 A 231 A 232 A 233 A 234 A 235 A 236 A 237 A 238 A 239 A 240 A 241 A 242 A 243 A 244 A 245 A 246 A 247 A 248 A 249 A 250 A 251 A 252 B 253 C 254 A

36 A 256 B 257 A 258 A 259 A 260 A 261 A 262 A 263 A 264 A 265 A 266 A 267 A 268 A 269 A 270 A 271 A 272 A 273 A 274 A 275 A 276 A 277 A 278 A 279 A 280 A 281 A 282 A [0050] Hamowanie replikacji HIV. Skonstruowano rekombinowany wirus NL-Rluc, w którym sekcję genu nef z NL4-3 zastąpiono genem lucyferazy Renilla. Wirus NL-RLuc otrzymano na drodze ko-transfekcji dwóch plazmidów, pnlrluc i pvsvenv. Plazmid pnlrluc zawiera NL-Rluc DNA sklonowane do puc18 w miejscu PvuII, podczas gdy pvsvenv zawiera gen dla VSV G białka, związanego z LTR promotorem. Transfekcje wykonano dla stosunku 1: 3 pnlrluc do pvsvenv na komórkach 293T, używając zestawu LipofectAMINE PLUS z Invitrogen (Carlsbad, CA) według instrukcji wytwórcy, i wygenerowany pseudotyp wirusa zmiareczkowano w komórkach MT-2. [0051] Wrażliwość wirusów na związki określono poprzez inkubację w obecności serii rozcieńczeń związku. Efektywne 50% stężenie (EC50) obliczono stosując wykładniczą postać równania efektu medianowego gdzie (Fa) = 1/[,1+ (ED 50 /stężenie leku) m ] (Johnson VA, Byington RT. Infectivity Test. W Techniques in HIV Research, wyd. Aldovini A, Walker BD.

37 Nowy Jork: Stockton Press.1990). Przeciwwirusową aktywność związków oceniano w trzech rodzajach surowicy, 10% FBS, 15mg/ml ludzkiej surowicy albumina/10% FBS lub 40% ludzkiej surowicy/5% FBS, a wyniki z co najmniej 2 doświadczeń zostały wykorzystane do obliczenia wartości EC50. Wyniki przedstawiono w Tablicy 2. Aktywność równa A dotyczy związku posiadającego EC 50 = 0,003 do 0,10 μm, natomiast B i C oznaczają związki odpowiednio z EC 50 = 0,1 do 1,0 μm i EC 50 > 1,0 μm. Tablica 2. Przykład Aktywność 1 B 2 A 3 C 4 A 5 A 6 A 7 A 8 A 9 A 10 A 11 A 12 A 13 A 14 A 15 A 16 A 17 A 18 A 19 A 20 A 21 A 22 B 23 A 24 C 25 C 26 A 27 A 28 B 29 A 30 A 31 A 32 A

38 33 A 34 A 35 A 36 A 37 B 38 A 39 A 40 A 41 A 42 A 43 A 44 A 45 A 46 A 47 A 48 B 49 A 50 A 51 A 52 A 53 B 54 A 55 A 56 A 57 A 58 A 59 B 60 A 61 B 62 A 63 A 64 C 65 A 66 B 67 A 68 C 69 A 70 B 71 B 72 B

39 73 A 74 A 75 A 76 B 77 A 78 A 79 B 80 B 81 A 82 A 83 C 84 A 85 A 86 A 87 A 88 A 89 A 90 A 91 A 92 A 93 A 94 A 95 A 96 A 97 A 98 A 99 A 100 A 101 A 102 A 103 B 104 B 105 A 106 A 107 A 108 A 109 A 110 A 111 A 113 A

40 114 A 115 A 116 A 117 A 118 A 119 A 120 A 121 A 122 A 123 A 124 A 125 A 126 A 127 A 128 A 129 A 130 A 132 A 133 B 134 A 135 A 136 A 137 B 138 A 139 A 140 A 141 C 142 B 144 C 146 A 147 B 148 B 149 B 150 B 151 B 152 B 153 B 154 B 155 B 156 B

41 157 A 158 A 159 A 160 B 161 B 162 A 163 B 164 B 165 A 166 C 167 B 168 A 169 A 170 A 171 B 172 B 173 A 174 A 175 B 176 A 177 A 178 A 179 B 180 C 181 A 187 B 188 B 189 A 190 A 191 B 192 B 193 C 194 B 195 B 196 A 197 C 198 B 199 B 200 A 201 B

42 202 A 203 A 204 A 205 A 206 A 207 A 208 A 209 B 210 A 211 A 212 A 213 A 214 B 215 A 216 A 217 A 218 A 219 A 220 A 221 A 222 A 223 A 224 B 225 A 226 A 227 B 228 B 229 A 230 A 231 A 232 A 233 A 234 A 235 A 236 B 237 A 238 A 239 A 240 A 241 A

43 A 243 A 244 A 245 A 246 A 247 A 248 A 249 A 250 A 251 A 252 C 253 C 254 A 255 A 256 B 257 A 258 A 259 A 260 A 262 A 263 B 265 B 266 A 267 A 268 A 270 A 273 B 279 A 281 A 282 A Badania kompozycji [0052] Przykład 19 demonstruje synergistyczną lub addytywno-synergistyczną aktywność przeciwwirusową HIV, jeśli używany w połączeniu z szeregiem innych środków przeciwwirusowych, jak opisano poniżej. [0053] Wirusy i linie komórkowe. Linię komórek-t, MT-2, otrzymano dzięki AIDS Research and Reference Reagent Program. Komórki MT-2 hodowano w podkulturze dwa razy w tygodniu w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej z 10% płodową surowicą bydlęcą, 2 mm L- glutaminą, i 10 mm HEPES buforem ph 7,5. Wirus HIV-1 303B jest molekularnym klonem pochodzącym ze szczepu NL4-3 z HIV-I, który uzyskano z NIH AIDS Research and Reference Reagent Program. W kombinacji z enfuwirtydem został wykorzystany wirus NL36G. Ta

44 pochodna NL4-3 ma naturalnie występującą mutację oporności enfuwirtydu w gp41 (36D) zmienioną do wrażliwego fenotypu (D36G). Roztwory podstawowe wirusa przygotowano przez transfekcję komórek 293T z pro-wirusowym klonem DNA przy użyciu LipofectAMINE PLUS (Invitrogen), zgodnie z instrukcją wytwórcy. Trzy dni po transfekcji, wirus został zebrany i wprowadzony raz do komórek MT-2 przed miareczkowaniem w komórkach MT-2. [0054] Odczynniki chemiczne. Przykład 19, atazanawir, didanozynę, stawudynę, efawirenz i enfuwirtyd (T-20) były syntezowane przez Bristol-Myers Squibb z zastosowaniem opublikowanych lub znanych reakcji. Aniprenawir, indinawir, nelfinawir, newirapinę, lopinawir, lamiwudynę, rytonawir, tenofowir, sakwinawir, delawirdynę i abakawir wyodrębniono z komercyjnych preparatów dostępnych na receptę i oczyszczono stosując opublikowane lub znane powszechnie metody. Tenofowir testowano jako fumaran disopoksylu tenofowiru. Zydowudynę i zalcytabinę zakupiono z Sigma i emtrycytabinę z Moravek Biochemicals. [0055] Testy wrażliwości i cytotoksyczności leku. Do testu wrażliwości leku, komórki MT-2 zostały zakażone wirusem HIV 1-303B (lub NL36G), dla MOI 0,001 i wysiane na 96- studzienkowych płytkach mikro-titracyjnych (2,5 x 10 5 komórek / ml) zawierających seryjne rozcieńczenia badanych związków. Kombinacje leku zostały utworzone dla proporcji leków 1:1, 1: 2,5 i 2,5: 1 razy wartość EC 50 ustalonej dla każdego z leków we wcześniejszych eksperymentach. Każda proporcja leków składała się ze zbioru 3-krotnych seryjnych rozcieńczeń, i była wykonana z ośmioma lub więcej replikami na oddzielnych wielostudzienkowych płytkach. Zakażone wirusem HIV komórki były inkubowane w temperaturze 37 C w 5% CO 2, i pięć dni po zakażeniu, stopień replikacji wirusa zmierzono poprzez określenie żywotności komórek przy użyciu testu CellTiter 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Test (Promega). Maksymalna ochrona komórek była zazwyczaj ujawniona w próbkach traktowanych z najwyższym stężeniem leków. W teście żywotności komórek, związek tetrazoliowy MTS (3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-5-(3-karboksymetoksyfenylo)-2-4- sulfofenylo-2h-tetrazol) dodaje się do komórki, dzięki czemu enzymy w aktywnych metabolicznie komórkach przekształcają go w zabarwiony produkt formazan, który ilościowo oznaczono przez odczyt absorbancji przy 490nm. Test cytotoksyczności wykonywano równolegle z eksperymentami kombinacji. Tutaj, niezakażone komórki były poddane działaniu tych samych kombinacji leków, i po pięciu dniach analizowane pod względem żywotności komórek przy użyciu testu MTS. [0056] Analiza efektów kombinacji leków. Dla określenia wartości indeksu kombinacji (CI), leki rozcieńczono w stałej proporcji i analizowano wiele z proporcji. Seryjne rozcieńczenia leku obejmowały zakres stężeń w pobliżu wartości EC 50 każdego związku tak, aby równoważne działania przeciwwirusowe leków mogły być porównane. Znormalizowane odpowiedzi z każdej terapii są dopasowywane do czteroparametrowego modelu logistycznego o wspólnym minimum i maksimum we wszystkich terapiach. Pojęciowo to równanie można zapisać jako

45 gdzie dla j = 1, 2, 3, 4, lub 5. [0057] W tym równaniu, Fa oznacza "frakcję zaatakowaną" i stanowi frakcję wirusa, który został unieczynniony. Na przykład, Fa 0,75 oznacza, że replikacja wirusa była zahamowana o 75% w stosunku do kontroli bez leków. EC 50 reprezentowane przez C 1 w powyższym równaniu jest stężeniem leku, które jak się oczekuje zmniejsza ilość wirusa o 50%, i B i są parametrami, które odzwierciedlają nachylenie krzywej stężenie-odpowiedź. W tym teście, A jest dolnym plateau wspólnym dla wszystkich krzywych, D jest wspólnym górnym plateau, B j jest parametrem "nachylenia" dla terapii j, i C j jest stężeniem, które wytwarza efekt równy średniej A i D dla terapii j. Terapie 1 i 2 odnoszą się do monoterapii 1 i 2, odpowiednio. Terapie 3, 4, i 5 odpowiadają trzem terapiom skojarzonym. Wartości EC 50 dla każdego z leków oznaczono z eksperymentów z pojedynczym lekiem, przy użyciu powyższego wzoru. Równanie zostało dopasowane za pomocą metody nieliniowej regresji (Proc. Nlin) w wersji 8.2 PC SAS (SAS Institute Inc.). [0058] Aby ocenić przeciwwirusowy wpływ traktowania różnymi kombinacjami leków obliczono wskaźniki kombinacji (CI) według Chou i Rideout. Wskaźnik kombinacji obliczono jako [0059] W tym równaniu [Dm] 1 i [Dm] 2 są stężeniami leków, które wytworzyłyby indywidualnie określony poziom efektu, natomiast [D] 1, [D] 2 są stężeniami leków w kombinacji, która wytworzyłaby taki sam poziom efektu. [0060] Teoretycznie sugerowana jest addytywność, jeżeli CI jest równe jeden, synergia jeśli CI jest mniejsze niż jeden, i antagonizm, jeśli CI jest większe niż jeden. Rozległe doświadczenie z badaniami kombinacji wskazuje jednak na to, że występują nieodłączne zmienne laboratoryjne, które muszą być wzięte pod uwagę w interpretacji CI. Najkorzystniej zakres może być skonstruowany tak, że zawiera prawdopodobnie wartości dla CI, ze względu na szum w danych. W niniejszym badaniu, te zakresy są podane w nawiasach obok każdego punktu oszacowania CI. Na przykład, jeśli podawane jest CI "0,52 (0,36, 0,69)" oznacza to, że najlepsze oszacowanie CI jest 0,52 ale ze względu na szum w danych, wartości od 0,36 do 0,69 są również rozsądnymi wartościami dla CI. Ten zakres 0,36 do 0,69 całkowicie wypada poniżej wartości 1,0, a więc wszystkie prawdopodobne wartości dla CI są mniejsze niż 1,0. Z tego względu dla tej kombinacji może być wywnioskowane synergistyczne zachowanie. Jeżeli zakres wypada w całości powyżej 1,0 wydedukujemy zachowanie antagonistyczne. Jeżeli zakres miałby obejmować 1,0 wydedukujemy addytywność.

46 [0061] W przeprowadzaniu eksperymentów kombinacji, EC 50 dla przykładu 19 i każdego związku porównawczego ustalono w trakcie każdego badania, i stosowano w kolejnych analizach danych. Określone wartości są zgodne z wcześniej opublikowanymi danymi i są przedstawione w Tablicy 3. Tablica 3. Aktywność przeciw wirusowi HIV związków w badaniach kombinacji dwóch leków Związek EC 50 (µm) Najwyższe stężenie leku (µm) Przykład 19 0,022 2,5 Zydowudyna 0,012 2,5 Didanozyna 10,7 100 Stawudyna 0, Lamiwudyna 0, Abakawir 1,04 30 Tenofovir 0,018 2,5 Emtrycytabina 0, Zalcytabina 0, Efawirenz 0,0016 0,2 Newirapina 0,095 5 Delawirdyna 0,043 5 Rytonawir 0,048 2,5 Indynawir 0,026 2,5 Nelfinawir 0,022 2,5 Sakwinawir 0,011 2,5 Amprenawir 0,062 2,5 Atazanawir 0,010 1 Lopinawir 0,017 2,5 Enfuwirtyd 0,061 2,2 [0062] Dwulekowe kombinacje Przykładu 19 z nukleozydowymi inhibitorami odwrotnej transkryptazy. Osiem nukleozydowych inhibitorów RT (didanozyna, stawudyna, zydowudyna, lamiwudyna, abakawir, zalcytabina, emtrycytabina, fosforan nukleozydowy, tenofowir) zostało połączonych z Przykładem 19 w zakresie stężeń w pobliżu wartości EC 50 każdego związku, tak aby równoważne działania przeciwwirusowe leków można porównać. Wszystkie prognozy zostały obliczone z wykorzystaniem SAS Proc. NLIN, i dwu-parametrowej logistyki. Dane przedstawiono w Tablicy 4 jako wskaźniki kombinacji i asymptotycznych przedziałów ufności dla inhibitorów RT w różnych stosunkach molowych. [0063] Cztery nukleozydowe inhibitory RT; didanozyna, stawudyna, abakawir i emtrycytabina, wykazują przeciwwirusowe efekty synergistyczne w połączeniu z Przykładem 19 na wszystkich efektywnych poziomach i we wszystkich stosunkach molowych. Pozostałe cztery inhibitory RT: zydowudyna, lamiwudyna, tenofovir i zalcytabina wszystkie mają wskaźniki kombinacji sugerujące zachowanie synergistyczne z Przykładem 19. Jednakże, górne zakresy przedziałów ufności dla niektórych skutecznych poziomów są większe niż 1, tak że ogólne działanie tych

47 związków z Przykładem 19 jest klasyfikowane jako synergistyczne do addytywnego. Nie zaobserwowano istotnego antagonizmu aktywności przeciw-hiv. Nie stwierdzono zwiększonej cytotoksyczności dla najwyższych badanych stężeń którejkolwiek z kombinacji leków, jak określono za pomocą testu redukcji XTT. Tablica 4. Kombinacje dwulekowe z użyciem Przykładu 19 i nie nukleozydowych inhibitorów odwrotnej transkryptazy. Stosunek molowy (EC 50 proporcja) a Zydowudyna Wskaźniki kombinacji dla % zahamowania HIV (Przedział ufności) 50% 75% 90% 1:1 (1:1) 0,59 (0,49, 0,69) 0,56(0,41, 0,70) 0,54 (0,36, 0,70) 2:5 (1:2,5) 0,65 (0,56, 0,75) 0,73 (0,59, 0,86) 0,81 (0,57, 1,06) 5:2 (2,5:1) 0,72 (0,61,0,83) 0,83 (0,64,1,02) 0,96(0,63, 1,30) Didanozyna 1:1000 (1:1) 0,58 (0,53, 0,63) 0,47 (0,35, 0,60) 0,39 (0,22, 0,56) 1:2500 (1:2,5) 0,56 (0,51, 0,62) 0,46 (0,40, 0,52) 0,38 (0,32, 0,44) 1:400 (2,5:1) 0,50 (0,46, 0,54) 0,49 (0,44, 0,53) 0,48 (0,42, 0,54) Stawudyna 1:6 (1:1) 0,52 (0,43, 0,61) 0,46 (0,36, 0,56) 0,42 (0,26, 0,57) 1:15 (1:2,5) 0,60 (0,48, 0,71) 0,60 (0,46, 0,74) 0,61 (0,40, 0,83) 5:12 (2,5:1) 0,70 (0,57, 0,84) 0,63 (0,48, 0,79) 0,58 (0,37, 0,81) Lamiwudyna 1:6 (1:1) 0,80 (0,63, 0,98) 0,80 (0,55,1,05) 0,81 (0,42, 1,21) 1:15 (1:2,5) 1,09 (0,88, 1,31) 1,00 (0,72, 1,27) 0,92 (0,52,1,33) 5:12 (2,5:1) 0,94 (0,80, 1,08) 0,84 (0,65, 1,03) 0,75 (0,49, 1,02) Abakawir 1:30 (1:1) 0,68 (0,59, 0,76) 0,67 (0,56, 0,79) 0,67 (0,49, 0,84) 1:75 (1:2,5) 0,87 (0,77, 0,97) 0,74 (0,63, 0,85) 0,63 (0,50, 0,77) 1:12 (2,5:1) 0,86 (0,76, 0,96) 0,82 (0,68, 0,96) 0,79 (0,58, 0,99) Tenofovir 1:1 (1:1) 0,66 (0,57, 0,75) 0,54 (0,45, 0,62) 0,43 (0,33, 0,53) 2:5(1:2,5) 0,68 (0,59, 0,77) 0,60 (0,48, 0,72) 0,52 (0,36, 0,69) 5:2(2,5:1) 0,90 (0,77, 1,04) 0,84 (0,67,1,01) 0,79 (0,55, 1,03) Zalcytabina 1:4 (1:1) 0,61 (0,48, 0,73) 0,56 (0,39, 0,73) 0,53 (0,28, 0,79) 1:10 (1:2,5) 0,55 (0,44, 0,66) 0,40 (0,31, 0,49) 0,30 (0,18, 0,42) 5:8 (2,5:1) 0,80 (0,62, 0,97) 0,82(0,58, 1,07) 0,86(0,46, 1,26) Emtrycytabina 1:8 (1:1) 0,31 (0,27, 0,36) 0,23(0,18, 0,28) 0,18(0,12, 0,24) 1:20 (1:2,5) 0,31(0,26,0,37) 0,23(0,19,0,29) 0,17(0,12, 0,28)

48 - 47-5:16 (2,5:1) 0,33 (0,28,0,38) 0,25 (0,20, 0,30) 0,19(0,13,0,25) a b Stosunek Przykładu 19 do związku porównawczego Niższa granica asymptotycznego przedziału ufności większa niż 1 wskazuje antagonizm, górna granica niższa niż 1 wskazuje synergizm, a wartość 1 zawarta w przedziale wskazuje addytywność. Przedziały ufności 95% podano w nawiasach, i stanowią one miarę zmienności w danych. [0064] Dwulekowe kombinacje Przykładu 19 z nienukleozydowymi inhibitorami odwrotnej transkryptazy. Trzy nienukleozydowe inhibitory RT połączono z Przykładem 19 w zakresie stężeń w pobliżu wartości EC 50 każdego związku, jak opisano powyżej dla nukleozydowych inhibitorów RT. Dane przedstawiono w Tablicy 5 jako wskaźniki kombinacji i asymptotyczne przedziały ufności w różnych stosunkach molowych. Spośród trzech, newirapina wykazuje silne efekty synergistyczne w kombinacji z Przykładem 19. Synergizm jest widoczny dla wszystkich skutecznych stężeń i dla wszystkich stosunków molowych. Sustiva i newirapina wykazują również wskaźniki kombinacji wskazujące na synergizm dla wszystkich najbardziej skutecznych stężeń i dla wszystkich stosunków molowych. Jednakże, w niektórych przypadkach, górny zakres asymptotycznego przedziału ufności jest większy niż 1, tak że nie można wykluczyć efektu addytywnego. Nie zaobserwowano zwiększonej cytotoksyczności dla najwyższych testowanych stężeń którejkolwiek z kombinacji leków, co sugeruje potencjalną skuteczność terapeutyczną kombinacji Przykładu 19 z nie nukleozydowmi inhibitorami RT. Tablica 5. Dwulekowe kombinacje wykorzystujące Przykład 19 i nienukleozydowe inhibitory odwrotnej transkryptazy Stosunek molowy Wskaźniki kombinacji dla % zahamowania HIV b (Przedział ufności) (EC 50 proporcja) a Efawirenz 50% 75% 90% 5:2(1:1) 0,83 (0,75, 0,92) 0,76 (0,64, 0,88) 0,70 (0,54, 0,85) 1:1 (1:2,5) 0,95 (0,86, 1,04) 0,93 (0,85, 1,02) 0,93 (0,79, 1,06) 25:4 (2,5:1) 1,01 (0,92, 1,10) 0,96 (0,83, 1,10) 0,94 (0,73, 1,14) Newirapina 1:2 (1:1) 0,72 (0,62, 0,82) 0,69 (0,55, 0,83) 0,66 (0,46, 0,87) 1:5 (1:2,5) 0,76 (0,64, 0,87) 0,81 (0,64, 0,97) 0,87 (0,59, 1,15) 5:4 (2,5:1) 0,73 (0,62, 0,83) 0,68 (0,55, 0,81) 0,64 (0,45, 0,84) Delawirdyna 1:2 (1:1) 0,76 (0,64, 0,89) 0,60 (0,47, 0,74) 0,48 (0,31, 0,64) 1:5 (1:2,5) 0,68 (0,58, 0,77) 0,44 (0,32, 0,54) 0,28 (0,17, 0,39) 5:4 (2,5:1) 0,80 (0,68, 0,92) 0,53 (0,42, 0,63) 0,35 (0,25, 0,45) a Stosunek Przykładu 19 do związku porównawczego b Niższa granica asymptotycznego przedziału ufności większa niż 1 wskazuje antagonizm, górna granica niższa niż 1 wskazuje synergizm, a wartość 1 zawarta w przedziale wskazuje addytywność. Przedziały ufności 95% podano w nawiasach, i stanowią one miarę zmienności w danych.

49 Dwulekowe kombinacje Przykładu 19 z inhibitorami proteazy wirusa HIV. [0065] Ocenę Przykładu 19 dla terapii skojarzonej leków z inhibitorami proteazy przeprowadzono stosując indynawir, amprenawir, nelfinawir, lopinawir, sakwinawir, rytonawir i atazanawir. Wyniki z badania kombinacji tych dwóch leków zestawiono w Tablicy 6. Ponownie, wskaźniki kombinacji obserwowane dla Przykładu 19 oraz wszystkich inhibitorów proteazy na prawie wszystkich skutecznych poziomach oraz stosunki molowe wskazują na zależność synergistyczną. Jest to szczególnie prawdziwe w odniesieniu do sakwinawiru i atazanawiru, gdzie przedział ufności jest poniżej jednego dla wszystkich stężeń i skutecznych poziomów. Tymczasem, górny zakres przedziału ufności jest wyższy niż jeden tylko w jednej sytuacji dla rytonawiru, indynawiru i lopinawiru, tak że addytywna zależność z Przykładem 19 nie może być wykluczona. Ponadto, górny zakres przedziału ufności dla nelfinawiru i amprenawiru jest nieco większy niż 1 w kilku sytuacjach, sugerując efekt synergistycznoaddytywny dla tych związków z Przykładem 19. Nie zaobserwowano cytotoksyczności dla najwyższych stężeń stosowanych w którymkolwiek z tych testów antywirusowych kombinacji. Tablica 6. Dwulekowe kombinacja wykorzystująca Przykład 19 i inhibitory proteazy Stosunek molowy Wskaźniki kombinacji dla % zahamowania HIV b (Przedział ufności) (EC 50 proporcja) a 50% 75% 90% Indinawir 1:1 (1:1) 0,86 (0,80, 0,92) 0,71 (0,62, 0,81) 0,60 (0,46, 0,73) 2:5 (1:2,5) 0,92 (0,84, 0,99) 0,84 (0,76, 0,92) 0,77 (0,66, 0,89) 5:2 (2,5:1) 0,94 (0,87, 1,02) 0,79(0,71, 0,87) 0,67 (0,57, 0,77) Nelfinawir 1:1(1:1) 0,79 (0,73, 0,86) 0,75 (0,67, 0,82) 0,71 (0,56, 0,84) 2:5(1:2,5) 0,97 (0,89, 1,06) 0,87 (0,79, 0,95) 0,78 (0,68, 0,88) 5:2(2,5:1) 1,09 (1,00, 1,18) 0,98 (0,89, 1,08) 0,90 (0,76,1,03) Sakwinawir 1:1(1:1) 0,77 (0,70, 0,84) 0,67 (0,58, 0,75) 0,58 (0,47, 0,69) 2:5 (1:2,5) 0,43 (0,38, 0,48) 0,51(0,42,0,59) 0,59 (0,44, 0,74) 5:2(2,5:1) 0,81 (0,72, 0,89) 0,77 (0,66, 0,89) 0,74 (0,57, 0,91) Amprenawir 1:1(1:1) 0,83 (0,67, 1,00) 0,84 (0,61, 1,08) 0,89 (0,50, 1,23) 2:5 (1:2,5) 0,84 (0,69, 0,99) 0,77 (0,58, 0,96) 0,75 (0,46, 1,04) 5:2 (2,5:1) 0,90 (0,77, 1,04) 0,62 (0,50, 0,74) 0,44 (0,30, 0,57) Atazanawir 5:2 (1:1) 0,87 (0,79, 0,96) 0,67 (0,55, 0,80) 0,52 (0,37, 0,67) 1:1 (1:2,5) 0,65 (0,51, 0,78) 0,45 (0,31, 0,58) 0,31 (0,19, 0,44) 25:4 (2,5:1) 0,78 (0,69, 0,86) 0,60 (0,54, 0,67) 0,47 (0,40, 0,54)

50 Lopinawir 1:1 (1:1) 0,74 (0,67, 0,82) 0,77 (0,66, 0,88) 0,84(0,65,1,02) 2:5 (1:2,5) 0,77 (0,66, 0,88) 0,56 (0,36, 0,75) 0,41 (0,19, 0,64) 5:2 (2,5:1) 0,76 (0,69, 0,83) 0,62 (0,55, 0,70) 0,54 (0,47, 0,61) Rytonawir 1:1 (1:1) 0,80 (0,67, 0,93) 0,57 (0,41, 0,73) 0,44 (0,23, 0,65) 2:5 (1:2,5) 0,73 (0,59, 0,88) 0,64 (0,48, 0,80) 0,61 (0,38, 0,85) 5:2 (2,5:1) 0,92 (0,72,1,11) 0,72 (0,50, 0,93) 0,59 (0,32,0,87) a Stosunek Przykładu 19 do związku porównawczego b Niższa granica asymptotycznego przedziału ufności większa niż 1 wskazuje antagonizm, górna granica niższa niż 1 wskazuje synergizm, a wartość 1 zawarta w przedziale wskazuje addytywność. Przedziały ufności 95% podano w nawiasach, i stanowią one miarę zmienności w danych. [0066] Dwulekowe kombinacje Przykładu 19 z Enfuwirtydem. Enfuwirtyd (T-20) jest inhibitorem fuzji gp41 HIV i pierwszym zatwierdzonym tej klasy inhibitorem. Wyniki przedstawione w Tablicy 7 wskazują, że kombinacja Przykładu 19 z T-20 jest synergistyczna. Nie zaobserwowano znaczącej cytotoksyczności dla najwyższego stężenia kombinacji leków. Tablica 7. Badanie dwu-lekowej kombinacji Przykładu 19 z Enfuwirtydem Stosunek molowy Wskaźniki kombinacji dla % zahamowania HIV b (EC 50 proporcja) a (Przedział ufności) 50% 75% 90% Enfuwirtyd 5:44 (1:1) 0,68 (0,59, 0,77) 0,59 (0,48, 0,70) 0,52 (0,37, 0,67) 1:22 (1:2,5) 0,75 (0,65, 0,85) 0,60 (0,49, 0,70) 0,48 (0,34, 0,61) 25:88 (2,5:1) 0,76 (0,65, 0,86) 0,73 (0,59, 0,86) 0,71 (0,50, 0,92) a Stosunek Przykładu 19 do związku porównawczego b Niższa granica asymptotycznego przedziału ufności większa niż 1 wskazuje antagonizm, górna granica niższa niż 1 wskazuje synergizm, a wartość 1 zawarta w przedziale wskazuje addytywność. Przedziały ufności 95% podano w nawiasach, i stanowią one miarę zmienności w danych. Kompozycja farmaceutyczna i sposoby zastosowania [0067] Związki według niniejszego wynalazku inhibują integrazę HIV. Inhibitory integrazy HIV należące do klasy związków diketokwasowych zapobiegały wirusowej integracji i hamowały replikację HIV-1 w komórkach (Hazuda i współpracownicy Science 2000, 287, 646). Ostatnio inhibitory integrazy HIV zostały przyjęte do badań klinicznych w leczeniu zakażenia wirusem HIV i AIDS (Neamati Expert. Opin. Ther. Patents 2002, 12, 709, Pais i Burke Drugs Fut. 2002, 27, 1101).

51 [0068] Zgodnie z tym, innym aspektem wynalazku jest sposób leczenia zakażenia HIV u pacjenta, obejmujący podawanie terapeutycznie skutecznej ilości związku o wzorze I, lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli lub solwatu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. [0069] Innym aspektem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca terapeutycznie skuteczną ilość związku o wzorze I, lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól lub solwat z co najmniej jednym innym środkiem stosowanym do leczenia AIDS lub zakażenia HIV, wybranym z grupy obejmującej nukleozydowe inhibitory odwrotnej transkryptazy HIV, nie nukleozydowe inhibitory odwrotnej transkryptazy HIV, inhibitory proteazy HIV, inhibitory fuzji HIV, inhibitory przyłączania HIV, inhibitory CCR5, inhibitory CXCR4, inhibitory pączkowania lub dojrzewania HIV i inhibitory integrazy HIV i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. [0070] Kolejnym aspektem wynalazku jest kompozycja, w której środkiem jest nukleozydowy inhibitor odwrotnej transkryptazy HIV. [0071] Kolejnym aspektem wynalazku jest kompozycja, w której nukleozydowy inhibitor odwrotnej transkryptazy HIV jest wybrany z grupy obejmującej abakawir, didanozynę, emtrycytabinę, lamiwudynę, stawudynę, tenofowir, zalcytabinę i zydowudynę lub ich farmaceutycznie dopuszczalną sól lub solwat. [0072] Kolejnym aspektem wynalazku jest kompozycja, w której środkiem jest nie nukleozydowy inhibitor odwrotnej transkryptazy HIV. [0073] Kolejnym aspektem wynalazku jest kompozycja, w której nie nukleozydowy inhibitor odwrotnej transkryptazy HIV jest wybrany z grupy obejmującej delawirdynę, efawirenz, i newirapinę lub ich farmaceutycznie dopuszczalną sól lub solwat. [0074] Kolejnym aspektem wynalazku jest kompozycja, w której środkiem jest inhibitor proteazy wirusa HIV. [0075] Kolejnym aspektem wynalazku jest kompozycja, w której inhibitor proteazy wirusa HIV jest wybrany z grupy obejmującej amprenawir, atazanawir, indynawir, lopinawir, nelfmawir, rytonawir, sakwinawir i fozamprenawir lub ich farmaceutycznie dopuszczalną sól lub solwat. [0076] Kolejnym aspektem wynalazku jest kompozycja, w której środkiem jest inhibitor fuzji HIV. [0077] Kolejnym aspektem wynalazku jest kompozycja, w której inhibitorem fuzji HIV jest enfuwirtyd lub T-1249, lub ich farmaceutycznie dopuszczalna sól lub solwat. [0078] Kolejnym aspektem wynalazku jest kompozycja, w której środkiem jest inhibitor przyłączania HIV. [0079] Kolejnym aspektem wynalazku jest kompozycja, w której środkiem jest inhibitor CCR5. [0080] Kolejnym aspektem wynalazku jest kompozycja, w której inhibitor CCR5 jest wybrany z grupy obejmującej Sch-C, Sch-D, TAK-220, PRO-140 i UK , lub ich farmaceutycznie dopuszczalna sól lub solwat.