(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (1) T3 Int.Cl. G01N 33/74 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 11/37 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Sepraza jako marker nowotworowy () Pierwszeństwo: EP EP (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr /3 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 12/02 (73) Uprawniony z patentu: F. Hoffmann-La Roche AG, Basel, CH (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 WOLFGANG ROLLINGER, Polling, DE JOHANN KARL, PEISSENBERG, DE JAREMA PETER KOCHAN, Towaco, US MARKUS ROESSLER, Germering, DE MICHAEL TACKE, Muenchen, DE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Agnieszka Żebrowska-Kucharzyk PRZEDSIĘBIORSTWO RZECZNIKÓW PATENTOWYCH PATPOL SP. Z O.O. SKR. POCZT Warszawa 1 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 1 2 3 Opis [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wspomagającego ocenę nowotworu. Ujawnia on zastosowanie ludzkiego białka aktywującego fibroblasty (FAP/sepraza) jako uniwersalnego markera różnych typów raka. Sepraza wspomaga ocenę raka oskrzeli lub raka płuc (LC) bądź raka okrężnicy, np. niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) lub raka jelita grubego (CRC), a prawdopodobnie także i innych rodzajów nowotworów. Takimi szczególnymi rodzajami raka są np. rak przełyku, rak głowy i szyi, rak żołądka, rak przewodu żółciowego, rak trzustki, rak nerki, rak szyjki macicy, rak jajnika, rak piersi, rak pęcherza moczowego, rak endometrium lub rak prostaty. Dodatkowo, dotyczy on sposobu użytecznego do oceny nowotworu w płynnej próbce pochodzącej od osobnika, który to sposób polega na pomiarze seprazy we wspomnianej próbce. Pomiar seprazy może być na przykład wykorzystywany we wczesnym wykrywaniu raka lub w monitorowaniu pacjentów, którzy przechodzą operację. [0002] Pomimo postępów w zakresie wykrywania i leczenia, rak pozostaje wciąż zasadniczym wyzwaniem dla systemu ochrony zdrowia publicznego. Cechą charakterystyczną komórek nowotworowych jest to, że wytwarzają one białka markerowe związane z nowotworem. Białka związane z nowotworem są obecne zarówno w tkankach, jak i w płynach ustrojowych osobnika, u którego obecne są komórki nowotworowe. Ich poziomy są zazwyczaj niskie na wczesnych etapach procesu rakotwórczego i rosną wraz z postępem choroby, natomiast jedynie w nielicznych przypadkach obserwuje się białka, których poziom obniża się w trakcie progresji choroby. Czułe metody wykrywania tych białek stanowią korzystne i obiecujące podejście w diagnostyce raka, w szczególności w fazie wczesnego rozpoznania raka. Najpowszechniej występującymi rodzajami raka są rak piersi (BC), rak płuc (LC) i rak jelita grubego (CRC). [0003] Najważniejszymi strategiami terapeutycznymi w przypadku guzów litych są: a) chirurgiczna resekcja guza, b) chemioterapia, c) leczenie z zastosowaniem czynników biologicznych, takich jak przeciwciała antynowotworowe lub antyangiogenne oraz d) kombinacja powyższych metod. [0004] Chirurgiczna resekcja guzów jest powszechnie akceptowanym leczeniem pierwszego rzutu w przypadku guzów litych znajdujących się we wczesnym stadium. Większość nowotworów wykrywana jest jednak dopiero wtedy, gdy zaczynają dawać objawy tj., gdy pacjenci znajdują się już raczej w późnym stadium progresji choroby. [000] Klasyfikacja według stadiów zaawansowania raka jest klasyfikacją choroby pod kątem zasięgu, progresji i ciężkości przypadku. Grupuje ona pacjentów chorych na raka w sposób umożliwiający podanie uogólnionego rokowania i wybór leczenia. [0006] Różne stadia CRC klasyfikowano zazwyczaj według skali Dukesa, która obejmuje stadia od A do D. Obecnie najczęściej stosowanym systemem klasyfikacji anatomicznego zasięgu raka jest klasyfikacja TNM. Stanowi ona zaaprobowany międzynarodowy jednolity system klasyfikacji według stadiów zaawansowania. Istnieją trzy podstawowe zmienne: T (zasięg guza pierwotnego), N (status regionalnych węzłów chłonnych) i M (obecność lub brak przerzutów odległych). Kryteria TNM publikowane są przez UICC (Międzynarodowa Unia na rzecz Walki z Rakiem), Sobin, L.H., Wittekind, Ch. (Eds): TNM Classification of Malignant Tumours, edycja VI, 02). Z chwilą określenia statusu według TNM, pacjenci grupowani są zgodnie ze stadium choroby, które oznaczane jest cyframi rzymskimi od I do IV, przy czym IV oznacza stadium najbardziej 1

3 1 2 zaawansowane. Klasyfikacja TNM i stadia choroby według UICC odpowiadają sobie, jak to pokazano w Tabeli poniżej pochodzącej z: Sobin L.H. i Wittekind (eds.) supra. Wzajemne powiązania klasyfikacji TNM i stadiów choroby według UICC [0007] stadium choroby według UICC klasyfikacja T klasyfikacja N klasyfikacja M Stadium 0 Tis N0 M0 Stadium I T1, T2 N0 M0 Stadium IIA T3 N0 M0 Stadium IIB T4 N0 M0 Stadium IIIA T1, T2 N1 M0 Stadium IIIB T3, T4 N1 M0 Stadium IIIC Którekolwiek z T N2 M0 Stadium IV Którekolwiek z T Którekolwiek z N M1 [0008] Jest to szczególnie istotne, gdyż wczesne zdiagnozowanie raka, np. CRC, jest równoznaczne ze znacznie lepszymi rokowaniami. W przypadku CRC, nowotwory złośliwe jelita grubego powstają z łagodnych nowotworów, tj. z gruczolaka. Dlatego najlepsze rokowania mają ci pacjenci, u których chorobę zdiagnozowano na etapie stadium gruczolaka. Pacjenci zdiagnozowani na tak wczesnym stadium jak stadium Tis, N0, M0 lub T1-3, N0, M0, wówczas, gdy są leczeni prawidłowo, mają więcej niż 90% szans na przeżycie lat od rozpoznania w porównaniu do -letniego okresu przeżycia w przypadku jedynie % pacjentów zdiagnozowanych w chwili, gdy obecne są już przerzuty w miejscach odległych od ogniska pierwotnego. [0009] Stosowane obecnie metody wykrywania, włączając metody obrazowania, takie jak promieniowanie rentgenowskie X lub obrazowanie przy pomocy magnetycznego rezonansu jądrowego, mogą być w teorii metodami przynajmniej częściowo odpowiednimi do zastosowania jako ogólne narzędzie do badań przesiewowych. Są one jednak bardzo kosztowne, a ich koszt nie jest przystępny dla systemów opieki zdrowotnej w takim stopniu, aby mogły być one powszechnie i generalnie stosowane do szeroko zakrojonych badań przesiewowych dużej liczby osobników, a zwłaszcza osobników bez jakichkolwiek objawów związanych z nowotworem. [00] W związku z powyższym, celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie prostej i korzystnej pod względem kosztów procedury oceny guzów dla, na przykład, identyfikacji osób podejrzanych o posiadania raka. W tym celu, pożądane jest opracowanie ogólnego markera nowotworowego, który byłby wykrywalny w płynach ustrojowych, np. krwi lub surowicy lub osoczu albo panel takich markerów. [0011] Obecnie w medycynie klinicznej stosuje się szereg markerów nowotworowych surowicy. Na przykład najbardziej wiodącymi markerami LC są rozpuszczalny fragment cytokeratyny 19 (CYFRA 21-1), o masie cząsteczkowej kda, antygen karcynoembrionalny (CEA), neuronoswoista enolaza (NSE) oraz antygen raka płaskonabłonkowego (SCC). Niemniej jednak żaden z nich nie spełnia kryteriów czułości i specyficzności, które są wymagane dla uznanie ich za narzędzie do badań przesiewowych (Thomas, L., Labor und Diagnose (00) TH Books Verlagsgesellschaft, Frankfurt nad Menem, Niemcy). [0012] Mając na uwadze fakt, by nowy marker diagnostyczny mógł być użyteczny klinicznie jako samodzielny marker, powinien on być porównywalny lub lepszy od innych markerów znanych w stanie techniki. Ewentualnie, nowy marker powinien gwarantować poprawę, odpowiednio jeśli chodzi o czułość 2

4 1 2 3 i/lub specyficzność diagnozowania, zarówno wówczas, gdy jest stosowany samodzielnie jak też wtedy, gdy jest stosowany w połączeniu z jednym lub kilkoma innymi markerami. Czułość i/lub specyficzność diagnostyczną testu najlepiej jest ocenić na podstawie krzywych ROC (ang. receiver-operating characteristics), które zostaną opisane szczegółowo poniżej. [0013] Najczęściej wykorzystywanymi w rutynowych badaniach klinicznych źródłami próbek są pełna krew, surowica lub osocze. Identyfikacja markera nowotworowego dla wczesnego stadium, która może pomóc w wiarygodnym wykrywaniu raka lub zapewnić wczesną informację dotyczącą rokowań, może prowadzić do sposobu, który byłby niezwykle użyteczny w diagnozowaniu i prowadzeniu leczenia tej choroby. W związku z tym, w medycynie klinicznej wciąż istnieje pilna potrzeba poprawy oceny nowotworu in vitro, a w szczególności oceny LC. Jest to szczególnie ważne dla poprawy wczesnego diagnozowania raka, np. LC, ponieważ szanse przeżycia pacjentów zdiagnozowanych wcześniej są znacznie wyższe w porównaniu z tymi, którzy zostali zdiagnozowani w rozwiniętym stadium choroby. [0014] Niedawno omówiono kliniczną użyteczność biochemicznych markerów w raku płuc (Duffy, M.J., Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 38 (01) ). [001] Aktualnie za najlepszy z obecnie znanych markerów nowotworowych raka płuc uznawany jest CYFRA Mimo, iż nie jest on narządowo specyficzny, znajdowany jest głównie w tkance płucnej. Czułość markera CYFRA 21-1 wobec raka płuc opisywana jest w zakresie między 46-61%, przy specyficzności wynoszącej 9% względem innych łagodnych chorób płuc. Zwiększone poziomy CYFRA 21-1 w surowicy związane są również ze stwierdzonymi przypadkami niezłośliwych chorób wątroby, niewydolnością nerek i inwazyjnym rakiem pęcherza moczowego. Badanie poziomu CYFRA 21-1 zalecane jest w monitorowaniu prowadzonym w ramach leczenia pooperacyjnego. [0016] CEA należy do grupy antygenów karcynoembrionalnych wytwarzanych zazwyczaj w trakcie embriogenezy. CEA nie jest narządowo specyficzny i przede wszystkim jest wykorzystywany do monitorowania raka jelita grubego. Oprócz zmian o charakterze nowotworowym, wzrost poziomów CEA w surowicy jest również związany z kilkoma łagodnymi chorobami, takimi jak marskość wątroby, zapalenie oskrzeli, zapalenie trzustki i choroby autoimmunologiczne. Przy specyficzności względem łagodnych chorób płuc wynoszącej 9%, jego czułość względem raka płuc opisuje się jako 29-44%. Korzystnym zastosowaniem CEA jest terapia monitorowania raka płuc. [0017] NSE jest markerem nowotworowym SCLC. W ogólności, zwiększone poziomy NSE w surowicy są wykrywane w związku z obecnością neuroektodermalnych i neuroendokrynnych nowotworów. Zwiększone poziomy w surowicy wykrywa się również u pacjentów z łagodnymi chorobami płuc i chorobami mózgu, takimi jak zapalenie opon mózgowych lub innymi chorobami zapalnymi mózgu oraz urazowymi obrażeniami głowy. Podczas gdy czułość w przypadku SCLC wynosi 9%, specyficzność opisywana jest jako 60-87%, natomiast wydajność badania NSE w wykrywaniu NSCLC jest słaba (czułość 7-2%). NSE zalecane jest w terapii monitorowania SCLC. [0018] W odniesieniu do profili markerów i mając na uwadze poprawę diagnostyki raka płuc, ujawniono [Schneider, J., i wsp., Int. J. Clin. Oncol. 7 (02) 14-11] sposób wykorzystujący oparte na logice rozmytej algorytmy klasyfikacji dla połączonych surowiczych poziomów CYFRA 21-1, NSE i białka C-reaktywnego (CRP), które jest ogólnym markerem stanu zapalnego. Autorzy wskazali czułość jako wynoszącą 92% przy specyficzności wynoszącej 9%. Jednakże, w badaniu tym podano, że przykładowo czułość CYFRA 21-1, jako pojedynczego markera nowotworowego, wynosi 72% przy specyficzności 9%, co stanowi wartość znacznie wyższą niż te opisywane w wielu innych badaniach. Duffy, M.J., w Critical Reviews w Clinical 3

5 1 2 3 Laboratory Sciences 38 (01) , opisali czułość zawierającą się pomiędzy 46% a 61%. Ta niezwykle wysoka wydajność osiągnięta przez Schneidera i wsp., budzi jednak pewne wątpliwości i może być wynikiem szeregu okoliczności. Po pierwsze, grupa pacjentów kontrolnych wydaje się być młodsza w porównaniu do grupy pacjentów, tj. grupy nie są dopasowane pod względem wieku oraz grupa pacjentów obejmuje zbyt wielu pacjentów w późnym stadium choroby. Po drugie, a co jest nawet bardziej istotne, wydajność algorytmu sprawdzana jest na próbkach pobranych z zestawów testowych, które wykorzystywano wcześniej do określenia rozmytych kwalifikatorów logicznych. Stąd też kwalifikatory te dostarczają informację wyłącznie specyficzne dla tego zbioru i nie nadają się do stosowania dla niezależnego zestawu przeznaczonego do analizy. W normalnych okolicznościach oczekuje się, że ten sam algorytm zastosowany dla większego, niezależnego i dobrze zrównoważonego zestawu do walidacji doprowadzi do znacznie obniżonej ogólnej wydajności. [0019] Celem twórców niniejszego wynalazku było zbadanie, czy można zidentyfikować biochemiczny marker, który może być wykorzystany w ocenie choroby nowotworowej. W szczególności twórcy niniejszego wynalazku zbadali, czy można zidentyfikować biochemiczny marker do oceny w płynach ustrojowych różnych rodzajów nowotworów, takich jak rak płuc, rak piersi, rak okrężnicy, rak prostaty i rak nerki. W bardzo korzystnym aspekcie niniejszego wynalazku przebadano identyfikację biochemicznego markera do oceny raka płuc (LC) lub raka jelita grubego (CRC). [00] Ku swojemu zaskoczeniu twórcy stwierdzili, że zastosowanie seprazy jako markera może przynajmniej częściowo rozwiązać niektóre problemy związane z markerami, które są obecnie znane w stanie techniki. [0021] W stanie techniki: Iwasa i wsp., Cancer Letters 227 (0) , w przypadku raka jelita grubego sepraza wykazuje zwiększoną ekspresję związaną z przerzutami do węzłów chłonnych. [0022] Niniejszy wynalazek odnosi się do sposobu oceny in vitro raka płuc, raka okrężnicy, raka przełyku, raka głowy i szyi, raka żołądka lub raka przewodu żółciowego, który obejmuje pomiar w próbce surowicy lub osocza stężenia i/lub aktywności seprazy i/lub jej fragmentów oraz zastosowanie wyniku pomiaru, szczególnie oznaczonego stężenia i/lub aktywności, do oceny nowotworu. [0023] Niespodziewanie stwierdzono, że obniżone stężenie i/lub aktywność seprazy i/lub jej fragmentów w badanej próbce testowej związane jest z ryzykiem wystąpienia i/lub obecnością raka. Ponadto stwierdzono dodatkowo, że sepraza jest markerem, który nie jest specyficzny dla jednego rodzaju raka, ale jest markerem dla różnych rodzajów raka, tj. ogólnym markerem nowotworowym. Ponieważ sepraza wydaje się raczej być specyficzna względem procesów rakotwórczych, nowy marker nowotworowy sepraza posiada ogromny potencjał, aby być użytecznym w medycynie klinicznej w przypadku rozmaitych rodzajów nowotworów. [0024] Sposób według niniejszego wynalazku jest odpowiedni do oceny wielu różnych rodzajów raka. Obniżone stężenia i/lub aktywność seprazy lub jej fragmentów znajdujących się w próbce, w porównaniu do zwykłych kontroli, zidentyfikowano odpowiednio na przykład w określonych typach raka takich jak rak płuc, rak okrężnicy, rak przełyku, rak głowy i szyi, rak żołądka, rak przewodu żółciowego, rak trzustki, rak nerki, rak szyjki macicy, rak jajnika, rak piersi, rak pęcherza moczowego, rak endometrium i rak prostaty. [002] Zgodnie z korzystnym wykonaniem wynalazku, w próbce mierzone jest stężenie i/lub aktywność seprazy dla dokonania oceny in vitro określonych rodzajów raka, takich jak rak płuc, rak okrężnicy, rak przełyku, rak głowy i szyi, rak żołądka, rak przewodu żółciowego, rak trzustki, rak nerki, rak szyjki macicy, rak jajnika lub rak piersi. 4

6 1 2 3 [0026] Zgodnie z innym korzystnym wykonaniem wynalazku, w próbce mierzone jest stężenie i/lub aktywność seprazy dla dokonania oceny in vitro raka, takiego jak rak płuc, rak okrężnicy, rak przełyku, rak głowy i szyi, rak żołądka, rak przewodu żółciowego, rak trzustki lub rak nerki. [0027] Zgodnie z innym korzystnym wykonaniem wynalazku, w próbce mierzone jest stężenie i/lub aktywność seprazy dla dokonania oceny in vitro raka, takiego jak rak płuc, rak okrężnicy, rak przełyku, rak głowy i szyi, rak żołądka lub rak przewodu żółciowego. [0028] Zgodnie z innym korzystnym wykonaniem wynalazku, w próbce mierzone jest stężenie i/lub aktywność seprazy dla dokonania oceny in vitro raka, takiego jak rak płuc (LC) lub rak jelita grubego (CRC). [0029] Zgodnie z innym korzystnym wykonaniem wynalazku, w próbce mierzone jest stężenie i/lub aktywność seprazy dla dokonania oceny in vitro raka, takiego jak rak płuc (LC). [00] Jedno z wykonań niniejszego wynalazku odnosi się do szeroko zakrojonych badań przesiewowych populacji mających na celu rozróżnienia osób, które prawdopodobnie są wolne od chorób nowotworowych od osób, które mogłyby zostać zaklasyfikowane jako przypadki "podejrzane". Dalej, ta druga grupa osób może więc być poddana dalszym procedurom diagnostycznym, np. przy pomocy metod obrazowania lub innych odpowiednich sposobów. [0031] Kolejne wykonanie obecnego wynalazku odnosi się do poprawy paneli markerów nowotworowych, które są odpowiednie do ogólnego diagnozowania raka lub paneli markerów nowotworowych, które są odpowiednie do diagnozowania konkretnych typów nowotworu, np. raka płuc lub raka jelita grubego. [0032] Niniejszy wynalazek dotyczy również sposobu oceny nowotworu in vitro z zastosowaniem biochemicznego markera, który to sposób obejmuje pomiar w próbce stężenia i/lub aktywności seprazy oraz jednego lub większej liczby markerów specyficznych dla raka oraz wykorzystanie wyników pomiaru, w szczególności pomiaru stężenia, do oceny nowotworu. Korzystnymi markerami do zastosowania w kombinacji z seprazą są z jednej strony markery, które są ogólnymi markerami nowotworowymi (tj. markery, które nie są specyficzne dla pojedynczego typu nowotworu) lub z drugiej strony, specyficzne markery nowotworowe (markery, które są specyficzne dla pojedynczego typu nowotworu). Korzystnymi markerami, np. do oceny raka, takiego jak rak płuc lub rak okrężnicy, są CYFRA-21-1, CEA, NSE, CA19-9, CA12, PSA, ASC, S0A12 i NNMT. Markery te można zastosować indywidualnie lub w jakiejkolwiek innej kombinacji z seprazą. [0033] Jeżeli rak oceniany jest zgodnie ze sposobem według niniejszego wynalazku, jeden lub więcej innych markerów odpowiednich dla danego raka jest korzystnie wybrany z grupy składającej się z CYFRA-21-1, CEA, NSE, CA19-9, CA12, PSA, ASC, S0A12 i NNMT. [0034] W związku z tym, zgodnie z korzystnym wykonaniem niniejszy wynalazek odnosi się również do zastosowania do oceny raka, np. raka płuc i/lub raka okrężnicy, panelu składającego się z markera seprazy oraz co najmniej jednego innego markera nowotworowego, np. CYFRA-21-1, CEA, NSE, CA19-9, CA12 PSA, ASC, S0A12 i NNMT. [003] Korzystnie, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu oceny in vitro raka, takiego jak rak płuc lub rak okrężnicy, z wykorzystaniem biochemicznych markerów, który to sposób składa się z pomiaru w próbce stężenia i/lub aktywności seprazy i/lub jej fragmentów oraz jednego lub większej liczby innych markerów nowotworowych, np. jednego lub większej liczby innych markerów raka płuc lub raka okrężnicy oraz wykorzystania wyników pomiaru, w szczególności pomiaru stężeń, do oceny raka. Korzystne jest, gdy jeden lub większa liczba innych markerów wybrana jest z grupy składającej się z CYFRA 21-1, CEA, NSE, CA19-9, CA12, PSA, ASC, S0A12 i NNMT.

7 1 2 3 [0036] W korzystnym wykonaniu niniejszy wynalazek odnosi się także do zastosowania składającego się co najmniej z seprazy i CYFRA 21-1 panelu markerów do oceny raka, zwłaszcza do oceny LC lub raka okrężnicy, w szczególności do oceny NSCLC lub raka jelita grubego. [0037] Niniejszy wynalazek odnosi się również do zastosowania składającego się co najmniej z seprazy i CEA panelu markerów do oceny raka, zwłaszcza do oceny LC lub raka okrężnicy, w szczególności do oceny NSCLC lub raka jelita grubego. [0038] Niniejszy wynalazek odnosi się także do zastosowania składającego się co najmniej z seprazy i SCC panelu markerów do oceny raka, zwłaszcza do oceny LC lub raka okrężnicy, w szczególności NSCLC lub raka jelita grubego. [0039] Niniejszy wynalazek odnosi się również do zastosowania polipeptydu seprazy i/lub jego fragmentów do oceny nowotworu, przy czym wskazaniem obecności raka jest obniżone stężenie i/lub aktywność seprazy i/lub jej fragmentów. [00] Niniejszy wynalazek dotyczy również zastosowania seprazy do oceny kilku określonych rodzajów raka, np. raka płuc, raka jelita grubego, raka przełyku, raka głowy i szyi, raka żołądka, raka przewodu żółciowego, raka trzustki, raka nerki, raka szyjki macicy, raka jajników, raka piersi, raka pęcherza moczowego, raka endometrium lub raka prostaty. [0041] Niniejszy wynalazek odnosi się także do zastosowania do oceny nowotworu przeciwciała skierowanego przeciwko polipeptydowi seprazy i/lub jego fragmentom, przy czym wskazaniem obecności raka jest obniżone stężenie i/lub aktywność seprazy i/lub jej fragmentów. [0042] Niniejszy wynalazek dotyczy również zastosowania do oceny nowotworu odczynnika do pomiaru enzymatycznej aktywności polipeptydu seprazy i/lub jego fragmentów, przy czym wskazaniem obecności raka jest obniżone stężenie i/lub aktywność seprazy i/lub jej fragmentów. [0043] Niniejszy wynalazek dostarcza także zestawu do realizacji sposobu według niniejszego wynalazku, który to zestaw zawiera co najmniej odczynniki niezbędne dla specyficznego pomiaru polipeptydu seprazy i/lub jego fragmentów oraz jeden lub większą liczbę innych markerów nowotworowych. [0044] Niniejszy wynalazek dostarcza także zestawu do realizacji sposobu według niniejszego wynalazku, który to zestaw zawiera co najmniej odczynniki niezbędne dla specyficznego pomiaru seprazy i jeden lub większą liczbę markerów nowotworowych, np. markerów raka płuc, raka jelita grubego, raka przełyku, raka głowy i szyi, raka żołądka, raka przewodu żółciowego, raka trzustki, raka nerki, raka szyjki macicy, raka jajników, raka piersi, raka pęcherza moczowego, raka endometrium lub raka prostaty, jak opisano powyżej, gdzie te inne markery mogą być zastosowane osobno lub w postaci kombinacji. [004] Niniejszy wynalazek dostarcza również zestawu do realizacji sposobu według niniejszego wynalazku, który to zestaw zawiera co najmniej odczynniki niezbędne dla specyficznego pomiaru odpowiednio seprazy i CYFRA 21-1 oraz opcjonalnie odczynniki wspomagające wykonanie pomiaru. [0046] Niniejszy wynalazek dostarcza również zestawu do realizacji sposobu według niniejszego wynalazku, który to zestaw zawiera co najmniej odczynniki niezbędne dla specyficznego pomiaru odpowiednio seprazy i CEA oraz opcjonalnie odczynniki wspomagające wykonanie pomiaru. [0047] Niniejszy wynalazek dostarcza również zestawu do realizacji sposobu według niniejszego wynalazku, który to zestaw zawiera co najmniej odczynniki niezbędne dla specyficznego pomiaru odpowiednio seprazy i SCC oraz opcjonalnie odczynniki wspomagające wykonanie pomiaru. [0048] W korzystnym wykonaniu niniejszy wynalazek odnosi się do sposobu oceny nowotworu in vitro obejmującego pomiar stężenia i/lub aktywności (a) polipeptydu seprazy i/lub jego fragmentów oraz (b) 6

8 1 2 3 opcjonalnie jednego lub większej liczby innych markerów nowotworowych w próbce oraz (c) wykorzystanie wyniku pomiaru z etapu (a) i opcjonalnie z etapu (b) do oceny nowotworu, przy czym na obecność raka wskazuje obniżone stężenie i/lub aktywność seprazy i/lub jej fragmentów. [0049] Termin "pomiar" korzystnie obejmuje jakościowy, półilościowy lub ilościowy pomiar polipeptydu seprazy w próbce. W korzystnym wykonaniu pomiar jest pomiarem półilościowym, tj. określa się czy stężenie i/lub aktywność seprazy znajduje się powyżej lub poniżej wartości progowej. Specjalista w dziedzinie będzie świadomy, że w teście dającym wynik w postaci odpowiedzi "tak" (obecność) lub "nie" (brak), czułość testu jest zazwyczaj ustawiona tak, aby była równa wartości progowej. Wartość progowa może być ustalona przykładowo w oparciu o badanie grupy zdrowych osobników. Korzystnie wartość progowa ustawiona jest tak, aby zapewnić specyficzność wynoszącą 90%, korzystna jest także wartość progowa ustawiona tak, aby zapewnić specyficzność wynoszącą 9% lub też korzystna jest wartość progowa ustawiona ta, aby zapewnić specyficzność wynoszącą 98%. Wartość poniżej wartości progowej może na przykład wskazywać na obecność nowotworu. W szczególności wartość poniżej wartości progowej może na przykład wskazywać na obecność raka płuc, raka okrężnicy, raka przełyku, raka głowy i szyi, raka żołądka, raka przewodu żółciowego, raka trzustki, raka nerki, raka szyjki macicy, raka jajnika, raka piersi, raka pęcherza moczowego, raka endometrium lub raka prostaty. W dalszym korzystnym wykonaniu pomiar seprazy jest pomiarem ilościowym. W dalszych wykonaniach stężenie i/lub aktywność seprazy skorelowane jest z zasadniczym pytaniem diagnostycznym, jak np. stadium choroby, postęp choroby lub odpowiedź na leczenie. [000] Ludzka sepraza (inaczej białko aktywujące fibroblasty (FAP)) jest 170 kda glikoproteiną błonową wykazująca aktywność żelatynazy i dipeptydylopeptydazy. Składa się ona z dwóch identycznych monomerycznych podjednostek (Baza danych Uni Prot KB, nr dostępowy P 27487) charakteryzujących się sekwencją przedstawioną w SEKW. ID. NR 1 (Ryc. 3). Monomer seprazy obejmuje 766 aminokwasów i posiada obserwowaną masę cząsteczkową wynoszącą 97 kda (SDS-PAGE) (Pineiro-Sanchez i wsp., J. Biol. Chem. 272 (1997) ; Park i wsp., J. Biol. Chem. 274 (1999) ). Forma rozpuszczalna seprazy jest enzymem tnącym antyplazminę APCE ((Lee i wsp., Blood 3 (04) ; Lee i wsp., Blood 7 (06) ). N-końcowa sekwencja aminokwasowa APCE odpowiada resztom seprazy, dla której przewiduje się, że pierwsze 6 reszt na N-końcu znajduje się w cytoplazmie fibroblastu, po czym następuje reszt domeny transbłonowej, a następnie 734 reszt zewnątrzkomórkowej C-końcowej domeny katalitycznej ((Goldstein i wsp., Biochim. Biophys. Acta (1997) 11-19; Scanlan i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) ). [001] Piñeiro-Sánchez i wsp. (supra) stwierdzili, że zwiększona ekspresja seprazy koreluje z inwazyjnym fenotypem ludzkich komórek czerniaka i komórek nowotworowych. Henry i wsp. [Clin. Cancer Res. 13 (07) ] opisują, że pacjenci z ludzkim rakiem okrężnicy posiadający wysoki poziom zrębowej seprazy są bardziej podatni na agresywny postęp choroby i potencjalny rozwój przerzutów lub nawrót. [002] Tak więc, żaden z powyższych dokumentów ze stanu techniki nie sugeruje, że obniżone stężenie i/lub aktywność polipeptydu seprazy i/lub jego fragmentów w płynach ustrojowych mogłoby być wskazaniem obecności raka. [003] Nieoczekiwanie twórcy niniejszego wynalazku stwierdzili, że oznaczenie stężenia i/lub aktywności, np. aktywności enzymatycznej polipeptydu seprazy i/lub jego fragmentów, szczególnie APCE w płynie ustrojowym, pozwala na ocenę nowotworu, np. raka płuc, raka okrężnicy, raka przełyku, raka głowy i szyi, raka żołądka, raka przewodu żółciowego, raka trzustki, raka nerki, raka szyjki macicy, raka jajnika, raka 7

9 1 2 3 piersi, raka pęcherza moczowego, raka endometrium lub raka prostaty. Co było nawet bardziej zaskakujące, stwierdzono, że obniżone stężenie i/lub aktywność seprazy i/lub jej fragmentów w próbce w porównaniu do normalnych kontroli jest wskazaniem występowania ryzyka lub obecność raka. [004] Stosowany w niniejszym opisie każdy z następujących terminów ma znaczenie opisane w obecnym fragmencie dokumentu. [00] Przedimki "a" i "an" stosowane w niniejszym dokumencie w angielskiej wersji językowej odnoszą się do jednego lub więcej niż jednego (tj. co najmniej jednego) gramatycznego dopełnienia tego przedimka. Dla przykładu "marker" oznacza jeden marker lub więcej niż jeden marker. Termin "co najmniej" stosowany jest, aby wskazać, że opcjonalnie obecnych może być jeden lub więcej kolejnych obiektów. Dla przykładu, panel markerów składający się z co najmniej (markerów) seprazy i CYFRA 21-1 może opcjonalnie zawierać jeden lub więcej innych markerów. [006] Wyrażenie "jeden lub więcej" oznacza od 1 do 0, korzystnie od 1 do, korzystne są również 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9,, 12 lub 1. [007] Stosowany w niniejszym opisie termin "marker" lub "marker biochemiczny" odnosi się do cząsteczki stosowanej jako cel dla analizy próbki testowej od pacjenta. Przykładami takich cząsteczek docelowych są białka lub polipeptydy. Zakłada się, że białka lub polipeptydy, stosowane w niniejszym wynalazku jako markery, obejmują naturalnie występujące warianty wspomnianego białka, jak również fragmenty wspomnianego białka, w szczególności immunologicznie wykrywalne fragmenty. Immunologicznie wykrywalne fragmenty zawierają korzystnie co najmniej 6, 7, 8,, 12, 1 lub kolejnych aminokwasów wspomnianego polipeptydu markera. Specjalista z dziedziny dostrzegłby, że białka uwalniane przez komórki lub te obecne w macierzy zewnątrzkomórkowej mogą być uszkodzone, np. podczas stanu zapalnego, oraz mogą ulec degradacji lub zostać pocięte na takie fragmenty. Niektóre markery syntezowane są w formie nieaktywnej, która następnie może być aktywowana w wyniku proteolizy. Specjalista z dziedziny dostrzeże, że białka lub ich fragmenty mogą również występować jako część kompleksu. W rozumieniu niniejszego wynalazku, jako marker może być również stosowany taki kompleks. Warianty polipeptydu markera kodowane są przez ten sam gen, natomiast mogą różnić się punktem izoelektrycznym (=PI) lub masą cząsteczkową (=MW), bądź obydwoma parametrami, np. w wyniku alternatywnego procesowania mrna lub pre-mrna. Aminokwasowa sekwencja wariantu jest identyczna do 9% lub więcej z odpowiadającą mu sekwencją markera. Ponadto, lub jako alternatywa, polipeptyd markera lub jego wariant może posiadać posttranslacyjną modyfikację. Nieograniczającymi przykładami posttranslacyjnych modyfikacji są glikozylacja, acylacja i/lub fosforylacja. Sepraza: [008] Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, wyrażenie "polipeptyd seprazy i/lub jego fragmenty" odnosi się do polipetydów w postaci monomeru, multimeru, w szczególności dimeru. Ponadto termin "polipeptyd seprazy i/lub jego fragmenty" w szczególności odnosi się do rozpuszczalnych form seprazy i/lub jej fragmentów, szczególnie enzymu tnącego antyplazminę (APCE), jak również do seprazy i/lub fragmentów seprazy obecnych w formie kompleksu z innym polipeptydem. [009] Polipeptydy seprazy, a zwłaszcza rozpuszczalne postaci polipeptydów seprazy i/lub ich fragmentów, korzystnie wykrywane są w odpowiednich próbkach, szczególnie w płynach ustrojowych. Korzystne są próbki płynów ustrojowych, takie jak krew, osocze, surowica, plwociny, mocz, kał itp. Korzystne jest, gdy próbka pochodzi od osobnika, którym jest człowiek, np. pacjent chory na nowotwór lub osoba zagrożona nowotworem lub podejrzana o posiadanie nowotworu. 8

10 1 2 3 [0060] Zgodnie z niniejszym wynalazkiem określane jest stężenie i/lub aktywność polipeptydu seprazy i/lub jego fragmentów. W jednym wykonaniu, marker separaza jest specyficznie mierzony w próbce przy użyciu specyficznego czynnika wiążącego. [0061] Specyficznym czynnikiem wiążącym jest na przykład receptor dla seprazy, lektyna wiążąca seprazę lub przeciwciało skierowane przeciwko seprazie. Specyficzny czynnik wiążący charakteryzuje się powinowactwem wobec odpowiadającej mu cząsteczki docelowej wynoszącym co najmniej 7 l/mol. Specyficzny czynnik wiążący korzystnie charakteryzuje się powinowactwem wobec odpowiadającej mu cząsteczki docelowej wynoszącym 8 l/mol lub korzystne jest również powinowactwo wynoszące 9 l/mol. Specjalista z dziedziny dostrzeże, że termin specyficzny stosowany jest w celu wskazania, że inne obecne w próbce cząsteczki biologiczne nie wiążą się w sposób istotny do czynnika wiążącego specyficznego dla seprazy. Korzystnie, poziom wiązania do cząsteczki biologicznej, innej niż cząsteczka docelowa, charakteryzuje się powinowactwem wiązania, które wynosi odpowiednio co najwyżej tylko % lub mniej, tylko % lub mniej, tylko 2% lub mniej lub tylko 1% lub mniej powinowactwa do cząsteczki docelowej. Korzystny czynnik wiążący będzie spełniał oba powyższe minimalne kryteria dla powinowactwa, jak również dla specyficzności. [0062] Korzystnym czynnikiem wiążącym jest przeciwciało wiążące seprazę. Pojęcie przeciwciało odnosi się do przeciwciała poliklonalnego, przeciwciała monoklonalnego, wiążących antygen fragmentów takich przeciwciał, pojedynczych łańcuchów przeciwciał, jak również do genetycznych konstruktów składających się z domeny wiążącej przeciwciała. [0063] Zastosowany może być każdy fragment przeciwciała spełniający powyższe kryteria dla specyficznego czynnika wiążącego. Przeciwciała wytwarzane są przy pomocy procedur znanych w stanie techniki, np. takich, które opisano w publikacji Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays, 11, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, cała książka, szczególnie strony 43-78). Ponadto, specjalista z dziedziny będzie świadomy istnienia sposobów wykorzystujących immunosorbenty, które mogą być stosowane do specyficznej izolacji przeciwciał. W ten sposób możliwe jest zwiększenie jakości poliklonalnych przeciwciał i tym samym ich wydajności w testach immunologicznych (Tijssen, P., supra, strony 8-11). [0064] W przypadku osiągnięć ujawnionych w niniejszym wynalazku można zastosować królicze przeciwciała poliklonalne. Jest oczywistym, że stosowane mogą być również przeciwciała poliklonalne pochodzące od różnych innych gatunków, np. szczurów lub świnek morskich, jak również przeciwciała monoklonalne. W związku z tym, że przeciwciała monoklonalne można wytwarzać w każdej ilości i posiadają one stałe właściwości, to stanowią one doskonałe narzędzia do opracowywania testu do rutynowych procedur klinicznych. Wytwarzanie oraz zastosowanie przeciwciał monoklonalnych dla seprazy w sposobie według niniejszego wynalazku stanowią odpowiednio jeszcze kolejne korzystne wykonania. Korzystne przykłady przeciwciał odpowiednich do wykrywania seprazy ujawnione są w Piñeiro-Sánchez i wsp., supra, np. przeciwciała D8, D28 i D43. [006] Specjalista z dziedziny doceni, że sepraza została zidentyfikowana jako marker, który jest przydatny w ocenie nowotworu, korzystnie raka płuc lub raka okrężnicy. Dla osiągnięcia wyniku porównywalnego do tego osiąganego według niniejszego wynalazku, można zastosować różne procedury diagnostyki immunologicznej. Na przykład, do wytwarzania przeciwciał mogą być stosowane alternatywne strategie. Strategie te obejmują m.in. wykorzystywanie do immunizacji syntetycznych peptydów stanowiących epitop seprazy. Alternatywnie, można zastosować immunizację DNA, znaną także jako szczepienie DNA. 9

11 1 2 3 [0066] Do przeprowadzenia pomiaru, uzyskana od osobnika próbka inkubowana jest ze specyficznym czynnikiem wiążącym seprazę, w warunkach odpowiednich do formowania się kompleksu czynnika wiążącego z seprazą. Warunki takie nie muszą być określone, ponieważ specjalista z dziedziny bez żadnego wkładu twórczego może łatwo zidentyfikować takie odpowiednie warunki inkubacji. Ilość kompleksu czynnika wiążącego z seprazą jest mierzona i zastosowana do oceny raka, korzystnie raka płuc. Dla specjalisty z dziedziny będzie oczywistym, że istnieją liczne metody pomiaru ilości kompleksu specyficznego czynnika wiążącego z seprazą, z których wszystkie opisane są szczegółowo w odpowiednich podręcznikach [por. np. Tijssen, P., supra, lub Diamandis, E.P. i Christopoulos, T.K. (eds.), Immunoassay, Academic Press, Boston (1996)]. [0067] Korzystnie, sepraza wykrywana jest testem typu "kanapka". W takim teście, pierwszy specyficzny czynnik wiążący jest stosowany do wychwytywania seprazy z jednej strony, a drugi specyficzny czynnik wiążący, który jest wyznakowany, stosowany jest do wychwytywania seprazy z drugiej strony tak, aby możliwa była jego bezpośrednia lub pośrednia detekcja. Specyficznymi czynnikami wiążącymi stosowanymi w teście typu "kanapka" mogą być przeciwciała skierowane przeciwko seprazie. Z jednej strony, detekcja może być przeprowadzana za pomocą różnych wychwytujących i znakowanych przeciwciał, tj. przeciwciał, które rozpoznają różne epitopy polipeptydu seprazy. Z drugiej strony, test typu "kanapka" może być również przeprowadzony przy pomocy przeciwciała wychwytującego i znakowanego, które skierowane są przeciwko tym samym epitopom seprazy. W tym wykonaniu wykrywane mogą być jedynie dimeryczne i multimeryczne formy seprazy. [0068] Zgodnie z dalszym wykonaniem niniejszego wynalazku, marker sepraza jest specyficznie mierzony w próbce przy użyciu układu testowego odpowiedniego do detekcji enzymatycznej aktywności seprazy. Enzymatyczną aktywnością może być np. aktywność żelatynazy lub aktywność peptydazy. Aktywność żelatynazy można określić np. przy pomocy zymografii przy użyciu zymogramów żelatyny. Aktywność peptydazy może być na przykład określona przy pomocy testów fluorescencyjnych przy użyciu substratów peptydowych. Testami do pomiaru aktywności seprazy są np. testy opisane przez Lee i wsp. (06), supra. [0069] "Markerem nowotworowym", a w szczególności "markerem raka płuc" i "markerem raka okrężnicy" według niniejszego wynalazku jest dowolny marker, który występując w kombinacji z markerem seprazą dodaje istotne informacje do procesu oceny raka, np. do ogólnej oceny nowotworu lub do oceny określonych rodzajów raka, np. do oceny LC lub CRC. Informacja jest uważana za wartość istotną lub dodaną, jeśli odpowiednio czułość oceny nowotworu, przy danej specyficzności, lub specyficzność oceny nowotworu, przy danej czułości, można poprawić poprzez włączenie wspomnianego markera do kombinacji markerów zawierającej już marker seprazę. W korzystnym wykonaniu oceny nowotworu, poprawa czułości lub specyficzności jest statystycznie istotna przy poziomie istotności wynoszącym odpowiednio p =0.0, 0.02, 0.01 lub niższym. Korzystnie, jeden lub większa liczba innych markerów nowotworowych wybrana jest z grupy składającej się z CYFRA 21-1, CEA, NSE, CA 19-9, CA 12, PSA, ASC, S0A12 i NNMT. [0070] Używane w niniejszym dokumencie określenie "próbka" odnosi się do próbki biologicznej uzyskanej do celów oceny in vitro. W sposobach według niniejszego wynalazku, próbka lub próbka pacjenta korzystnie może zawierać jakikolwiek płyn ustrojowy. Korzystnymi próbkami są pełna krew, surowica, osocze, popłuczyny oskrzelowe lub plwocina, przy czym najkorzystniejsze jest osocze lub surowica. [0071] Wyrażenia "ocenianie raka", w szczególności "ocenianie raka płuc" lub "ocenianie raka jelita grubego" są stosowane w celu wskazania, że sposób według niniejszego wynalazku będzie przykładowo [samodzielnie lub wspólnie z innymi markerami lub zmiennymi, np. kryteriami określonymi przez UICC (patrz

12 1 2 3 powyżej)] pomocny lekarzom przy ustalaniu lub potwierdzaniu obecności lub nieobecności raka, w szczególności LC lub CRC lub będzie stanowić pomoc w rokowaniu w sytuacji wykrycia nawrotu choroby nowotworowej (obserwacji chorych po zabiegu) i/lub w monitorowaniu leczenia, zwłaszcza chemioterapii. [0072] Specjaliści w dziedzinie docenią, że wszelkie tego typu oceny dokonywane są in vitro. Próbka pochodząca od pacjenta jest później usuwana. Próbka pacjenta jest wykorzystywana wyłącznie do diagnostyki in vitro sposobem według wynalazku, a materiał z próbki pacjenta nie jest transferowany z powrotem do ciała pacjenta. Zazwyczaj wspomniana próbka jest próbką płynną, np. próbką pełnej krwi, surowicy lub osocza. [0073] W korzystnym wykonaniu niniejszy wynalazek dotyczy sposobu oceny raka, np. LC lub CRC, in vitro pod kątem markerów biochemicznych, który to sposób obejmuje pomiar w próbce stężenia seprazy i wykorzystanie oznaczonego stężenia i/lub aktywności w ocenie raka, np. LC lub CRC. [0074] Nieoczekiwanie twórcy niniejszego wynalazku są w stanie oznaczyć obniżone stężenie i/lub aktywność markera seprazy w znaczącym odsetku próbek pobranych od chorych na raka, w szczególności od chorych na raka płuc, jelita grubego, przełyku, głowy i szyi, żołądka, dróg żółciowych, trzustki, nerek, szyjki macicy, jajników, piersi, pęcherza moczowego, endometrium lub raka prostaty. Jeszcze bardziej nieoczekiwanie byli oni w stanie wykazać, że obniżenie stężenia i/lub aktywności seprazy w takiej próbce pobranej od danej osoby można wykorzystać w ocenie raka, w szczególności w ocenie wyżej wymienionych chorób nowotworowych. [007] Idealnym scenariuszem diagnozy byłaby sytuacja, w której chorobę wywołałoby pojedyncze zdarzenie lub proces, jak to się dzieje np. w chorobach zakaźnych. We wszystkich innych przypadkach prawidłowa diagnoza może być bardzo trudna, szczególnie kiedy etiologia choroby nie jest w pełni zrozumiała, jak w przypadku wielu typów raka, np. LC. Specjaliści w dziedzinie zdają sobie sprawę, że żaden marker biochemiczny nie jest stuprocentowym markerem diagnostycznym i jednocześnie w stu procentach specyficzny dla danej choroby wywołanej wieloma czynnikami, np. dla LC. Ocena na podstawie markerów biochemicznych, np. CYFRA 21-1, CEA, NSE, lub, jak tu zaprezentowano, seprazy może mieć raczej wartość oceny z pewnym prawdopodobieństwem lub oceny rokowniczej np. co do obecności, braku obecności lub stopnia nasilenia choroby. Dlatego też zazwyczaj w rutynowej diagnostyce klinicznej, dla celów diagnostycznych, w leczeniu i w prowadzeniu tego leczenia różnego rodzaju objawy kliniczne i markery biologiczne są brane pod uwagę w sposób kompleksowy. [0076] Biochemiczne markery mogą być oznaczane indywidualnie bądź też, w korzystnym wykonaniu wynalazku, mogą być mierzone równocześnie z użyciem chipa lub macierzy opartej na technologii kulek. Następnie stężenia biomarkerów są interpretowane w sposób niezależny, np. stosując indywidualny dla każdego znacznika punkt odcięcia, lub w kombinacji. [0077] W dalszym korzystnym wykonaniu ocena raka według niniejszego wynalazku odbywa się sposobem obejmującym pomiar stężenie i/ lub aktywności a) polipeptydu seprazy i/lub jego fragmentów, oraz b) jednego lub więcej innych markerów nowotworowych w próbce, oraz c) wykorzystanie wyników pomiarów np. stężenia punktu a) i b) w ocenie raka. [0078] W ocenie raka marker sepraza będzie stanowił przewagę w jednym lub więcej z następujących aspektów: badaniach przesiewowych, we wsparciu diagnostycznym, rokowaniu, monitorowaniu terapii, takiej jak chemioterapia, radioterapia i immunoterapia. 11

13 1 2 3 Badania przesiewowe: [0079] Badania przesiewowe definiuje się jako systematyczne stosowanie testu do identyfikacji osób np. będących w grupie ryzyka, wykazujących oznaki choroby, np. obecność nowotworu. Korzystnie na badanie przesiewowe populacji składają się badania osób, u których stwierdzono wyższe niż przeciętnie ryzyko zachorowania na raka. Na przykład, badana przesiewowo populacja pod kątem raka płuc składa się z osób, o których wiadomo, że są w grupie podwyższonego ryzyka, takiej jak palacze, byli palacze i pracownicy eksponowani na działanie uranu, kwarcu lub azbestu. [0080] W korzystnym wykonaniu, jako próbki w badaniach przesiewowych w kierunku raka np. raka płuc lub raka jelita grubego, stosuje się płyny ustrojowe, takie jak surowica lub plwocina. [0081] W przypadku wielu chorób żaden będący w krwiobiegu marker biochemiczny nie będzie wystarczająco czuły i specyficzny, aby mógł spełnić kryteria wymagane dla badań przesiewowych. Wydaje się to być również prawdziwe w odniesieniu do raka, w szczególności do raka płuc. Należy oczekiwać, że w badaniach przesiewowych raka trzeba będzie użyć całego panelu zawierającego wiele markerów. Dane ustalone w niniejszym wynalazku wskazują, że marker sepraza będzie stanowić integralną część panelu markerów odpowiednich do badań przesiewowych. Niniejszy wynalazek odnosi się zatem do wykorzystania seprazy jako jednego markera w panelu markerów nowotworowych tj. panelu markerów obejmujących seprazę albo jeden lub więcej dodatkowych markerów do badań przesiewowych raka. W szczególności, wynalazek dotyczy wykorzystania seprazy jako jednego z markerów ogólnego panelu markerów nowotworowych. Taki panel markerów obejmuje marker seprazę i jeden lub więcej dodatkowych markerów, np. ogólne markery nowotworowe i/lub markery dla wyżej wymienionych rodzajów nowotworu. [0082] Sepraza może być również elementem paneli markerów dla pewnych określonych rodzajów nowotworu np. nowotworu płuc, jelita grubego, przełyku, głowy i szyi, żołądka, dróg żółciowych, trzustki, nerek, szyjki macicy, jajników, piersi, pęcherza moczowego, endometrium lub prostaty. [0083] Korzystnie, inne rodzaje nowotworów, które podlegają ocenie z wykorzystaniem panelu markerów zawierającego seprazę to nowotwór płuc, jelita grubego, przełyku, głowy i szyi, żołądka, dróg żółciowych, trzustki lub nerki. [0084] Korzystnie, inne rodzaje nowotworów, które podlegają ocenie za pomocą panelu markerów zawierającego seprazę to nowotwór płuc, jelita grubego, przełyku, głowy i szyi, żołądka lub dróg żółciowych. [008] Korzystnie, inne rodzaje nowotworów, które podlegają ocenie za pomocą panelu markerów zawierającego seprazę to nowotwór płuc lub jelita grubego. [0086] Korzystnie, inne rodzaje nowotworów, które podlegają ocenie za pomocą panelu markerów zawierającego seprazę to nowotwór płuc (LC). [0087] Aktualne dane wskazują ponadto, że niektóre kombinacje markerów będą korzystne w badaniach przesiewowych w kierunku nowotworu. Na przykład, w odniesieniu do korzystnego wykonania badań przesiewowych w kierunku LC lub CRC, niniejszy wynalazek odnosi się również do wykorzystania panelu markerów zawierającego seprazę i CYFRA 21-1 lub panelu markerów zawierającego seprazę i CEA lub panelu markerów zawierającego seprazę i NSE lub panelu markerów zawierającego seprazę i CA 19-9 lub panelu markerów zawierającego seprazę i CA 12 lub panelu markerów zawierającego seprazę i PSA lub panelu markerów zawierającego seprazę i ASC lub panelu markerów zawierającego seprazę i S0A12 lub panelu markerów zawierającego seprazę i NNMT lub panelu markerów zawierającego seprazę i dwa lub więcej markery wybrane z grupy składającej się z CYFRA 21-1, CEA, NSE, CA 19-9, CA 12, PSA, ASC, S0A12 i NNMT. 12

14 1 2 3 Pomoc diagnostyczna: [0088] Markery mogą pomóc zarówno w diagnostyce różnicowej chorób nowotworowych o charakterze łagodnym i złośliwym poszczególnych organów, mogą pomóc odróżnić różne typy histologiczne nowotworu jak i ustalić wartość wyjściową dla markera przed zabiegiem operacyjnym. [0089] Obecnie, ważne sposoby wykrywania raka to radiologia i/lub tomografia komputerowa (TK). Za pomocą tych metod można wizualizować małe guzki, czyli małe regiony podejrzanej tkanki. Jednak wiele z tych guzków - na podstawie TK ponad 90% - stanowią łagodne zmiany tkanek, a tylko mniejsza ich część reprezentuje tkankę zmienioną nowotworowo. Wykorzystanie seprazy jako markera może pomóc w odróżnieniu choroby nowotworowej o charakterze łagodnym od choroby nowotworowej o charakterze złośliwym. [0090] Ze względu na to, że sepraza jako pojedynczy marker może być np. w przypadku LC, lepsza niż inne markery, takie jak CEA lub NSE, należy oczekiwać, że sepraza będzie wykorzystywana jako pomoc diagnostyczna, w szczególności przy ustalaniu wartości wyjściowej przed zabiegiem operacyjnym. Niniejszy wynalazek odnosi się również do wykorzystania seprazy do ustalenia wartości wyjściowej przed operacją nowotworu. Rokowanie: [0091] Wskaźniki prognostyczne można zdefiniować jako kliniczne, patologiczne lub biochemiczne cechy chorych na raka i cechy guzów występujących u tych pacjentów, przewidujące z pewnym prawdopodobieństwem wynik choroby. Ich głównym zastosowaniem jest pomoc w prowadzeniu racjonalnego planu leczenia pacjenta, tj. uniknięcia niedostatecznego leczenia w przypadku choroby o charakterze agresywnym i nadmiernego leczenia w przypadku wolno rozwijającej się choroby. Molina, R., i wsp. Tumor Biol. 24 (03) ewaluowali wartość prognostyczną CEA, CA 12, CYFRA 21-1, SSC i NSE w NSCLC. Okazało się, że w ich badaniach nienormalne poziomy w surowicy markerów NSE, CEA i LDH (dehydrogenaza mleczanowa) oznaczały krótszy okres przeżycia. [0092] Ponieważ sama sepraza znacząco przyczynia się do odróżnienia pacjentów chorych na raka, np. LC lub CRC, od pacjentów zdrowych, należy oczekiwać, że będzie również pomocna w ocenie rokowniczej pacjentów cierpiących na raka, korzystnie LC lub CRC. Przedoperacyjny poziom seprazy najprawdopodobniej będzie połączony z jednym lub kilkoma innymi markerami raka i/lub systemem klasyfikacji według stadiów zaawansowania TNM. W korzystnym wykonaniu sepraza wykorzystywana jest w rokowaniu u pacjentów z LC lub CRC. Monitorowanie Chemioterapii: [0093] Merle, P., i wsp., Int. J. of Biological Markers 19 (04) 3-31 dokonali oceny wahania poziomu CYFRA 21-1 w surowicy u pacjentów z miejscowo zaawansowanym niedrobnokomórkowym rakiem płuc poddanych chemioterapii indukcyjnej. Badacze doszli do wniosku, że wczesne monitorowanie CYFRA 21-1 w surowicy może być przydatnym narzędziem prognostycznym odpowiedzi nowotworu i przeżycia pacjentów w III etapie NSCLC. Ponadto w raportach opisano wykorzystanie CEA w procesie monitorowania leczenia pacjentów z LC (Fukasawa, T., i wsp., Cancer & Chemotherapy 13 (1986) ). Większość z tych badań była retrospektywna i nie była prowadzona na wybranej losowo grupie pacjentów, a badana grupa ta była mała. Podobnie jak w przypadku badań nad CYFRA 21-1, badania nad CEA sugerowały: a) że pacjenci ze zmniejszonym podczas otrzymywania chemioterapii poziomem CEA mieli generalnie lepsze wyniki niż ci pacjenci, których poziomu CEA nie udało się obniżyć oraz b) u niemal wszystkich pacjentów wzrost CEA były związany z postępem choroby. 13

15 1 2 3 [0094] Oczekuje się, że sepraza będzie co najmniej tak dobrym markerem do monitorowania chemioterapii jak odpowiednio CYFRA 21-1 lub CEA. Zatem niniejszy wynalazek odnosi się także do wykorzystania seprazy do monitorowania pacjentów chorych na raka, korzystnie na raka płuc (LC) lub raka jelita grubego (CRC) poddanych chemioterapii. W ramach kontroli terapii w jednym korzystnym wykonaniu pomiary seprazy zostaną połączone z pomiarem co najmniej jednego markera wybranego z grupy składające się z CYFRA 21-1, CEA i/lub NSE i wykorzystane do oceny raka płuc (LC). Kontynuacja leczenia: [009] U dużej grupy pacjentów z LC, którzy przechodzą chirurgiczną resekcję mającą na celu całkowite usuniecie tkanki nowotworowej, w późniejszym czasie rozwija się wznowa lub powstają przerzuty (Wagnera, H., Chest 117 (00) 1-118; Buccheri, G., i wsp., Ann. Thorac. Surg. 7 (03) ). Większość z tych nawrotów wystąpiła w ciągu 2-3 lat po zabiegu chirurgicznym. Ze względu na to, że nawrót choroby/przerzuty późno wykryte są zawsze śmiertelne w skutkach, znacząca część badań skupiła się na procesie nawrotu choroby nowotworowej we wczesnym, potencjalnie możliwym do leczenia stadium rozwoju. [0096] W związku z tym wielu pacjentów chorych na raka, np. pacjentów cierpiących na LC, włącza się w program monitorowania pooperacyjnego, który często obejmuje regularne monitorowanie CEA. Wykazano, że seryjne monitorowanie CEA przez jeden rok po chirurgicznej resekcji wykrywa wczesny etap nawrotu choroby nowotworowej/przerzutów z czułością na poziomie około 29%, ze specyficznością około 97%, nawet przy braku podejrzanych objawów lub oznak (Buccheri, G., i wsp., Ann. Thorac. Surg. 7 (03) ). W związku z tym kontynuacja leczenia pacjentów z LC po zabiegu jest jednym z najważniejszych obszarów wykorzystania odpowiedniego markera biochemicznego. Ze względu na znaczną czułość wykrywania seprazy u badanych pacjentów cierpiących na LC, możliwe jest, że sepraza samodzielnie lub w połączeniu z jednym lub kilkoma innymi markerami będzie ogromna pomocą w czasie kontynuacji leczenia pacjentów cierpiących na LC, zwłaszcza pacjentów po zabiegu operacyjnym. Wykorzystanie panelu markerów obejmującego seprazę i jeden lub więcej innych markerów LC w czasie kontynuacji leczenia po zabiegu chirurgicznym pacjentów cierpiących na LC reprezentuje kolejne korzystne wykonanie niniejszego wynalazku. [0097] Obecny wynalazek w korzystnym wykonaniu odnosi się do użycia seprazy w diagnostyce nowotworu. Korzystnie sepraza jest wykorzystywana w ocenie odpowiednio nowotworu płuc (LC), nowotworu jelita grubego (CRC), przełyku, głowy i szyi, żołądka, przewodów żółciowych, trzustki, nerek, szyjki macicy, jajników, piersi, pęcherza moczowego, ściany macicy i raka prostaty. [0098] W kolejnym korzystnym wykonaniu niniejszy wynalazek odnosi się do użycia seprazy jako markera molekularnego nowotworu, np. ogólnie pojętego nowotworu lub specyficznego rodzaju nowotworu, takiego jak nowotwór płuc, jelita grubego, przełyku, głowy i szyi, żołądka, przewodów żółciowych, trzustki, nerek, szyjki macicy, piersi, pęcherza moczowego, endometrium lub raka prostaty w kombinacji z jednym lub więcej markerami cząsteczkowymi nowotworu. Kolejnymi cząsteczkami o charakterze markera mogą być cząsteczki o charakterze powszechnie używanego markera, które nie są specyficzne dla nowotworu i/lub cząsteczki o charakterze specyficznego dla nowotworu markera np. cząsteczki markera dla nowotworu płuc lub jelita grubego. Sepraza i przynajmniej jeszcze jeden marker są wykorzystywane przy ocenie nowotworu np. płuc lub jelita grubego, w płynnych próbkach otrzymanych od danego osoby. Korzystnie innym wybranym markerem nowotworowym, którego pomiar można połączyć z pomiarem seprazy jest CYFRA 21-1, CEA, NSE, CA12, CA19-9, PSA, ASC, S0A12 i NNMT. W szczególności, korzystnie innymi wybranymi 14

16 1 2 3 markerami LC, których pomiar można połączyć z pomiarem seprazy jest CYFRA 21-1, CEA i/lub NSE. Jeszcze korzystniej panel markerów wykorzystywany do oceny nowotworu np. LC, obejmuje seprazę i co najmniej jeszcze jedną inną cząsteczkę markera wybraną z grupy zawierającej CYFRA 21-1 i CEA. [0099] Specjalista w dziedzinie zdaje sobie sprawę z tego, że istnieje wiele sposobów zastosowania pomiarów jednego lub więcej markerów aby lepiej rozwiązać problem diagnostyczny. W dość prostym, niemniej jednak często efektywnym podejściu osiąga się pozytywny wynik, jeżeli próbka jest pozytywna dla co najmniej jednego z badanych markerów. Może to być np. sytuacja, w której diagnozowana jest choroba infekcyjna lub AIDS. [00] Często jednakże połączenie markerów jest ewaluowane. Korzystnie wartości mierzone dla panelu markerów np. seprazy i CYFRA 21-1 są wartościami matematycznie łączonymi, a otrzymana wartość jest korelowana z postawionym dla danego problemu diagnostycznego pytaniem. Wartości markerów można zestawiać dowolną odpowiednią do tego celu znaną w stanie techniki metodą matematyczną. Dobrze znane matematyczne metody korelacji kombinacji markerów z chorobą wykorzystują metody takie, jak analiza dyskryminacyjna (DA) (tj. liniowa-, kwadratowa-, uregulowana-da), metoda Kernela (tj. SVM), metody nieparametryczne (tj. algorytm K najbliższych sąsiadów), PLS (Cząstkowe Najmniejsze Kwadraty), metody oparte na drzewach (tj. Logika Regresyjną, CART, Metody Lasu Losowego, Metody Boostingu/Baggingu), uogólnione modele liniowe (tj. Regresja Logistyczna), metody analizy głównych składowych (tj. SIMCA), ogólne modele addytywne, metody oparte o rozmytą logikę, sieci neuronalne i metody oparte o algorytmy genetyczne. Specjaliści w dziedzinie nie będą mieli problemu z wyborem metody odpowiedniej do ewaluacji kombinacji markerów według niniejszego wynalazku. Korzystnie metodę zastosowaną do korelacji kombinacji markerów według niniejszego wynalazku z np. nieobecnością lub obecnością LC, wybrano spośród DA (tj. liniowa-, kwadratowa-, uregulowana analiza dyskryminacyjna), metody Kernela (tj. SVM), Metod Nieparametrycznych (tj. algorytm k najbliższych sąsiadów), PLS (cząstkowe najmniejsze kwadraty), metod typu dendrogramu (tj. Logika Regresyjną, CART, Metody Lasu Losowego, Metody Boostingu/Baggingu), uogólnione modele liniowe (tj. Regresja Logistyczna). Szczegóły dotyczące tych metod statystycznych znajdują się w następujących dokumentach: Ruczinski, I., i wsp., J. of Computational and Graphical Statistics, 12 (03) 47-11; Friedman, J. H., J. of the American Statistical Association 84 (1989) 16-17; Hastie, Trevor, Tibshirani, Robert, Friedman, Jerome, The Elements of Statistical Learning, Springer Series in Statistics (01); Breiman, L., Friedman, J.H., Olshen, R.A., Stone, C. J. (1984) Classification and regression trees, California: Wadsworth; Breiman, L., Random Forests, Machine Learning, 4 (01) -32; Pepe, M.S., The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction, Oxford Statistical Science Series 28 (03); and Duda, R.O., Hart, P. E., Stork, D. G., Pattern Classification, Wiley Interscience, 2nd Edition (01). [01] Korzystnym wykonaniem niniejszego wynalazku jest użycie optymalizowanego wielowariacyjnego punktu odcięcia dla podstawowej kombinacji markerów biologicznych i dla odróżnienia stanu A od stanu B, np. stanu choroby od stanu zdrowia. W przypadku tego rodzaju analizy markery nie występują już niezależnie, lecz jako panel markerów. [02] Dokładność metody diagnostycznej jest najlepiej opisana przez jej krzywą ROC (ang. receiveroperating characteristics) (patrz zwłaszcza Zweig, M.H. i Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 61-77). ROC to wykres wszystkich par czułość/specyficzność będący wynikiem stale zmieniającego się progu decyzyjnego nad całym zakresem obserwowanych danych. 1

17 1 2 3 [03] Kliniczna "wydajność" przeprowadzonych testów laboratoryjnych zależy od ich diagnostycznej dokładności, potencjalnej możliwości prawidłowej klasyfikacji obiektów do odpowiednich podgrup klinicznych. Diagnostyczna dokładność mierzy zdolność testu do prawidłowego rozróżnienia dwóch różnych stanów badanych osobników. Takie stany to na przykład stan zdrowia i choroby albo nowotwór łagodny kontra nowotwór złośliwy. [04] W każdym przypadku krzywa ROC przedstawia nakładanie się dwóch rozkładów danych poprzez wykreślenie czułości kontra specyficzność 1 dla pełnego zakresu progów decyzyjnych. Na osi y przedstawiono czułość lub frakcję prawdziwie pozytywną [zdefiniowaną jako (liczba prawdziwie pozytywnych wyników testu)/(liczba prawdziwie pozytywnych wyników testu + liczba fałszywie negatywnych wyników testu)]. Odniesiono to do pozytywnego stanu obecności choroby lub stanu chorobowego. Oblicza się go wyłącznie na podstawie podgrupy będących pod wpływem. Na osi x umieszczono frakcję fałszywie pozytywną lub 1-specyficzność [zdefiniowaną jako (liczba fałszywie pozytywnych wyników testu)(liczba prawdziwie negatywnych wyników testu + liczba fałszywie pozytywnych wyników testu)]. Jest to wskaźnik specyficzności i jest obliczany całkowicie na podstawie grupy ulegającej wpływom. Ze względu na to, że prawdziwie- i fałszywie- pozytywne frakcje obliczane są całkowicie oddzielnie wykorzystując wyniki testu z dwóch różnych grup, wykres ROC jest niezależny od dominacji choroby w próbie. Każdy punkt na wykresie ROC reprezentuje parę czułość/1-specyficzność odpowiadającą danemu progowi decyzyjnemu. Test z doskonałą dyskryminacją (brak nakładania się w dwóch rozkładach wyników) charakteryzuje się wykresem ROC, który przechodzi przez górny lewy róg, gdzie frakcja prawdziwie pozytywna wynosi 1,0 lub 0% (doskonała czułość), a frakcja fałszywie pozytywna wynosi 0 (doskonała specyficzność). Teoretyczny wykres dla testu bez dyskryminacji (identyczne rozkłady wyników dla dwóch grup) jest przekątną pod kątem 4 biegnącą od dolnego lewego kąta do górnego prawego kąta. Większość wykresów lokuje się miedzy wymienionymi ekstremami. (Jeśli wykres ROC lokuje się całkowicie pod przekątną przebiegającą pod kątem 4, łatwo temu zaradzić poprzez zmianę kryterium dla "pozytywny" z "większy niż na "mniejszy niż" lub na odwrót.) Jakościowo, im bliżej górnego lewego rogu znajduje się wykres tym wyższa jest jego całkowita dokładność. [0] Korzystnym sposobem określenia dokładności diagnostycznej testu laboratoryjnego jest wyrażenie tej dokładności jedna liczbą. Taki ogólny parametr np. jest tzw. "całkowitym błędem" lub alternatywnie "polem powierzchni pod krzywą = AUC". Najbardziej powszechną miarą jest pole znajdujące się pod wykresem ROC. Umownie, pole to jest zawsze > 0, (jeśli nie jest, można odwrócić zasadę podejmowania decyzji w taki sposób, żeby była). Wartości wahają się między 1.0 (idealne oddzielenie badanych wartości z dwóch grup) i 0. (żadne widoczne różnice w rozkładzie między dwoma grupami testowanych wartości). Powierzchnia nie zależy wyłącznie od określonej części wykresu, takiej jak znajdujący się najbliżej przekątnej punkt lub wrażliwość na poziomie 90% specyficzności, ale od całego wykresu. Jest to ilościowe, opisowe wyrażenie tego jak wykres ROC jest blisko perfekcji (obszar = 1,0). [06] W korzystnym wykonaniu niniejszy wynalazek odnosi się do sposobu polepszenia dokładności diagnozowania nowotworu, np. LC lub CRC w porównaniu do "zdrowych kontroli" poprzez pomiar w próbce stężenia co najmniej seprazy i CYFRA 21-1 i opcjonalnie odpowiednio CEA i/lub NSE i korelacji wyznaczonych stężeń z obecnością lub brakiem raka, np. LC lub CRC, poprawy będącej wynikiem większej ilości pacjentów prawidłowo sklasyfikowanych jako chorych na nowotwór np. LC lub CRC kontra "zdrowe kontrole" w porównaniu do klasyfikacji z wykorzystaniem pojedynczego badanego markera. 16

18 1 2 3 [07] W korzystnym sposobie według niniejszego wynalazku określone jest co najmniej stężenie biomarkerów odpowiednio seprazy i CYFRA 21-1, a kombinacja markerów jest wykorzystywana do oceny nowotworu, np. LC lub CRC. [08] W kolejnym korzystnym sposobie według niniejszego wynalazku określone jest co najmniej stężenie biomarkerów odpowiednio seprazy i CEA, a kombinacja markerów jest wykorzystywana do oceny nowotworu, np. LC lub CRC. [09] W korzystnym sposobie według niniejszego wynalazku określone jest co najmniej stężenie biomarkerów odpowiednio seprazy i CYFRA 21-1i CEA, a kombinacja markerów jest wykorzystywana do oceny nowotworu, np. LC lub CRC. [01] W kolejnym korzystnym sposobie według niniejszego wynalazku określone jest co najmniej stężenie biomarkerów odpowiednio seprazy, CYFRA 21-1 i CEA, a kombinacja markerów jest wykorzystywana do oceny nowotworu, np. LC lub CRC. [0111] W jeszcze kolejnym korzystnym sposobie według niniejszego wynalazku określone jest co najmniej stężenie biomarkerów odpowiednio seprazy i CYFRA 21-1i NSE, a kombinacja markerów jest wykorzystywana do oceny nowotworu, np. LC lub CRC. [0112] Poniższe przykłady, odniesienia, lista sekwencji i ryciny podano, aby pomóc w zrozumieniu niniejszego wynalazku, którego prawdziwy zakres jest przedstawiony w dołączonych zastrzeżeniach. Rozumie się, że zmian w przedstawionych procedurach można dokonywać bez odchodzenia od ducha wynalazku. Opis Figur [0113] Figura 1 Figura 1 pokazuje rozkład wartości stężenia seprazy w surowicy pacjentów chorych na raka jelita grubego (CRC), w surowicy zdrowych kontrolnych pacjentów i zdrowych kontroli. Figura 2 Figura 2 pokazuje rozkład wartości stężenia seprazy w surowicy pacjentów chorych na raka płuc (LC) i zdrowych kontroli. Figura 3 Figura 3 przedstawia sekwencję aminokwasową ludzkiej seprazy (SEKW. ID. NR 1). Przykład 1 [0114] Wykorzystano szczurze monoklonalne przeciwciała skierowane przeciwko cząsteczkom specyficznie wiążącym seprazę (klony D8, D28, D43) (Pineiro-Sanchez, M.-L., i wsp., J. Biol. Chem., 272 (1997) ). Biotynylacja szczurzego przeciwciała IgG [011] Monoklonalne szczurze IgG (klon D28 lub D43) doprowadzono do stężenia mg/ml w mm NaH 2 PO 4 /NaOH, ph 7,, mm NaCl. Do ml roztworu IgG dodano 0 µl biotynylowanego imidu kwasu N- hydroksybursztynowego (3,6 mg/ml w DMSO). Po minut w temperaturze pokojowej, próba została rozdzielona chromatograficznie na złożu Superdex 0 ( mm Na 2 PO 4 /NaOH, ph 7,, mm NaCl). Zebrano frakcje zawierające biotynylowane IgG. Znakowanie szczurzego przeciwciała IgG digoksygeniną. [011] Monoklonalne szczurze IgG (klon D28 lub D43) doprowadzono do stężenia mg/ml w mm 2 PO 4 /NaOH, ph 7,, mm NaCl. Do ml IgG dodano 0 µl roztworu estru digoksygeniny-3-o- 17

19 1 2 3 metylokarbonylo-ε-kwasu-n-hydroksybursztynowego (Roche Diagnostics, Mannheim, Niemcy, Nr Kat ) (3,8 mg/ml w DMSO). Po minut w temperaturze pokojowej, próbę rozdzielono chromatograficznie na złożu Superdex 0 ( mm NaH 2 PO 4 /NaOH, ph 7,, mm NaCl). Zebrano frakcje zawierające IgG znakowane digoksygeniną. Przykład 2 Test ELISA do pomiaru seprazy w surowicy i osoczu krwi ludzkiej. [0117] Do wykrywania seprazy w surowicy krwi ludzkiej lub osoczu opracowano test typu ELISA kanapkowa. W pierwszej wersji testu porcje skierowanego przeciwko seprazie przeciwciała monoklonalnego D28 sprzężonego z biotyną i przeciwciała D8 sprzężonego z digoksygeniną (patrz Przykład 1) wykorzystano do wychwytywania i wykrywania antygenu (format D28 x D8). W drugiej wersji testu porcje skierowanego przeciwko seprazie przeciwciała monoklonalnego D43 (Przykład 1) sprzężonego odpowiednio z biotyną i digoksygeniną wykorzystano do wychwytywania i wykrywania antygenu (format D43 x D43). [0118] Próbki (7 µl) zmieszano z µl odczynnika o charakterze przeciwciała zawierającego 0,37 µg każdego z przeciwciał D28-biotyna i D8-digoksygenina lub alternatywnie przeciwciał D43-biotyna i D43- digoksygenina w buforze fosforanowym do inkubacji ( mm, 0 mm winianu sodu, mm EDTA, 0.0% fenolu, glikol 0,1% 000, 0,1% Tween, 0,2% BSA, 0,1% wołowe IgG, a 0,02% -bromo--nitro-1,3- dioksan i doprowadzono do ph 7,4). [0119] Po inkubacji prowadzonej przez 2 godziny, 2x0 µl mieszaniny przeniesiono do oddzielnych pokrytych streptawidyną dołków na płytce mikrotitracyjnej i inkubowano przez kolejne godziny. Płytki przemywano trzykrotnie buforem fosforanowym ( mm Tris, mm NaCl 0,0% Tween ). [01] w kolejnym kroku dołki płytki inkubowano z mu/ml przeciwciała skoniugowanego z digoksygeniną (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Niemcy, Nr Katalogowy ) w Uniwersalnym Buforze do Koniugacji (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Niemcy, Numer Katalogowy ) przez 60 min i przemywano jak poprzednio. [0121] Dołki płytki inkubowano następnie przez 1 godzinę z 0 ul roztworu substratu TMB (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Niemcy, Numer Katalogowy 13442). Reakcje kolorymetryczną zatrzymano dodając 2N kwas siarkowy (0 µl), a kolor niebieski zmieniono na żółty. [0122] OD mierzono przy długości fali nm w czytniku ELISA. [0123] Wszystkie inkubacje prowadzono w temperaturze pokojowej. Próbki surowicy krwi ludzkiej lub osocza wstępnie rozcieńczono buforem do inkubacji do 0,1%. W celu kalibracji jako standard użyto pulę surowic. Pule surowic rozcieńczono buforem do inkubacji do 0,09/0,18/0,27/0,36/0,4% aby przeprowadzić kalibrację z odpowiednio arbitralnie podanymi wartościami 0,03/0,06/0,363/0,12/0,1 U/ml. [0124] Równanie krzywej kalibracyjnej obliczono poprzez liniową analizę regresji wykorzystując do przeliczania odczyty absorbancji konwertowane do odpowiadających im wartościom stężenia. Aby otrzymać stężenie odpowiedniej próbki wynik mnożono przez współczynnik rozcieńczeń. PRZYKŁAD 3. Badania populacji CRC. [012] w pierwszym badaniu wykorzystano próbki pochodzące od 49 świetnie scharakteryzowanych pacjentów z rakiem jelita grubego (klasyfikacja UICC podana w Tabeli 1). 18

20 Tabela 1 Badania CRC: Rozkład próbek we wszystkich stadiach rozwoju UICC. Stadium rozwoju według UICC Liczba próbek UICC I 8 UICC II 8 UICC III 1 UICC IV 4 Nie sklasyfikowane 14 Łączna liczba próbek CRC 49 [0126] Próbki z Tabeli 1 poddano ewaluacji i porównano do kontrolnych próbek otrzymanych od 0 osób zdrowych i nie cierpiących na żadną znaną chorobę nowotworową (= kontrola kohorty). Przykład 4 Badania populacji chorych na LC [0127] Drugie badanie całkowicie niezależne od pierwszego skupiło się na niedrobnokomórkowym raku płuc (NSCLC). Dokładniej, badaniu poddano pacjentów cierpiących na najważniejsze rodzaje NSCL, gruczolakoraka i raka płaskonabłonkowego. Tabela 2a opisuje rozkład rodzaju i stadium rozwoju kohorty raka. Tabela 2a Badania LC: Rodzaj i stadium rozwoju próbek LC Rodzaj raka Numeracja próbek UICC I or II UICC III or IV Gruczolakorak Rak płaskonabłonkowy Łączna liczba próbek NSCLC 60 [0128] Kohortę kontrolną w tym badaniu zdefiniowano jako kohortę obejmującą próbki pochodzące od 1 palących i niepalących jak opisano w Tabeli 2b. Każdą osobę poddano spirometrycznemu testowi funkcji płuc (Miller, R. i wsp., Eur. Respir. J. 26 (0) ) zostało przeprowadzone z każdą badaną osobą. Próbki włączano do kontroli kohorty tylko wtedy, kiedy wyniki badania mieściły się w normie. Tabela 2b Badania LC: Skład kontroli kohorty Stadium według UICC Numeracja próbek Palacze Byli palacze 6 Niepalący 24 Przykład Sepraza odróżnia pacjentów chorych na raka od "zdrowych kontroli". 19